KR20160058992A - 위령선 추출물을 함유하는 치매 예방 또는 치료 또는 인지능 개선용 조성물 - Google Patents
위령선 추출물을 함유하는 치매 예방 또는 치료 또는 인지능 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 위령선(Clematis mandshurica) 80% 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방용 또는 치매 치료용 또는 인지능 개선용 조성물에 관한 것으로, 아세틸콜린에스테라제 억제를 활성화시키고, 신경 영양인자(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 및 상위 전사인자(cAMP-response-element-binding protein, CREB)의 발현을 활성화시켜 치매 예방 또는 치매 치료 또는 인지능 개선효과를 발휘한다.
Description
본 발명은 위령선(Clematis mandshurica) 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방용 또는 치매 치료용 또는 인지능 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인지능 개선 및 뇌신경세포 보호 활성능을 지니는 위령선 80% 메탄올(methanol) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
치매는 기억력 장애, 판단력 상실 등 정신 기능에 전반적인 장애가 나타나는 것을 특징으로 하며, 인간의 삶을 황폐하게 하는 질환이다. 우리나라 65세 이상 노인에게서 치매 유병율은 약 8% 정도인데, 현재 우리나라 노인 인구 약 430만 명 중 약 35만 명 정도가 치매 질환을 앓고 있을 것으로 추정된다 (서울특별시 치매센터).
인구의 급속한 고령화가 진행됨에 따라 치매 환자의 수가 급격히 증가할 것으로 예상되어 치매에 따른 대책 마련이 시급한 실정이다. 게다가 노인 진료비가 계속 늘고 있는 가운데 2010년 노인 치매 진료비가 전년대비 32% 급증한 것으로 나타났다. 건강보험심사 평가원은 2010년 진료비통계지표를 발표하면서 2010년 65세 이상 노인 진료비가 13조 7847억 원으로 전년 대비 14.5% 증가했으며, 그 가운데 알츠하이머병인 치매의 진료비가 2903억 원으로 32.2% 증가해 가장 높은 증가율을 기록했다고 밝혔다.
치매의 종류 중 71%로 가장 큰 부분을 차지하고 있는 알츠하이머(Alzheimers disease, AD)는 아직까지 발병 원인이 정확하게 밝혀지지 않았지만, 알츠하이머병 환자의 뇌조직을 관찰해보면, 콜린성 신경의 손상이 심각하게 일어난 것을 확인할 수 있다. 이와 같이 알츠하이머병의 원인을 콜린성 신경의 손상에 맞추어 설명하는 설을 콜린 가설(Cholinergic Hypothesis in Alzheimers disease)이라 하며, 최근 아세틸콜린(achetylcholine)의 기능 저하를 유도하기 위해 아세틸콜린에스터라제(achetylcholinesterase)의 활성을 저해시키려는 시도가 많이 이루어지고 있다.
현재, 알츠하이머병의 치료제로 사용되는 약물은 아세틸콜린에스터라제(achetylcholinesterase) 저해제로서, 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastimine) 및 갈란타민(galantamine) 등이 있다. 이 중 갈란타민(galantamine)은 가장 최근에 미국 식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)의 승인을 받아 사용되고 있는데, 아세틸콜린의 분해를 막아 시냅스에서의 아세틸콜린 농도를 유지시킴으로써 저하된 인지기능을 개선시키는 효과를 나타낸다. 하지만, 갈란타민은 독성과 부작용으로 인해 안전성이 의심되고 있으며, 이와 같은 부작용은 소비자의 신뢰도를 떨어뜨리고 있는 실정이다. 따라서, 더욱 안전하고, 효능이 우수한 천연 기능성 소재 개발이 요구되고 있다.
한편, 위령선(Clematis mandshurica)은 미나리재비과에 속하는 식물로 신경통, 근육통, 편두통 등의 치료제로 사용되어 왔으며, 혈압강하, 평활근 흥분, 이뇨작용, 혈당강하작용, 진통, 항균작용에 대해 보고되어 있다.
위령선 관련 특허로는, 대한민국 등록특허 제10-0721508호(발명의 명칭: 위령선 추출물을 함유하는 당뇨병, 당뇨합병증, 인슐린저항성 및 그로 인한 인슐린저항성 증후군의 예방 및 치료용 약학 조성물)에, 위령선 추출물을 포함하는 당뇨병, 당뇨합병증, 인슐린 저항성 및 그로 인한 인슐린 저항성 증후군의 예방 및 치료용 조성물에 대해 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-0857896호(발명의 명칭: 위령선 추출물을 함유하는 알러지 개선용 조성물)에는, 위령선 추출물의 사포닌 풍부 분획을 유효성분으로 포함하는 알러지 개선 효과가 뛰어난 조성물에 대해 개시되어 있다.
본 발명은 위령선(Clematis mandshurica) 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방용 또는 치매 치료용 또는 인지능 개선용 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1형태로 위령선(Clematis mandshurica) 메탄올(methanol) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방용 또는 인지능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 위령선 메탄올(methanol) 추출물은 바람직하게 70~90% 메탄올 추출물인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 80% 메탄올 추출물인 것이 좋다. 또한, 상기 메탄올 추출물은 바람직하게 초음파 추출한 것이 좋다.
본 발명의 식품 조성물은 다양한 제형으로 제조하기 위해 제형 베이스 및 부형제를 첨가할 수 있다. 제형의 예로는, 곡류, 카페인 음료, 일반 음료, 유제품, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 차, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합체 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 제2형태로 위령선 메탄올(methanol) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방용 또는 치매 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 위령선 메탄올(methanol) 추출물은 바람직하게 70~90% 메탄올 추출물인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 80% 메탄올 추출물인 것이 좋다. 또한, 상기 메탄올 추출물은 초음파 추출한 것이 좋다.
본 발명의 약학 조성물은 일 예로 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 μg 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 또는 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
한편, 본 발명에서 "유효성분으로 함유한다"는 의미는 치매 예방 또는 치매 치료 또는 인지능 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 발명의 위령선 메탄올 추출물이 조성물에 첨가되는 것을 의미한다.
본 발명의 위령선(Clematis mandshurica) 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 아세틸콜린에스테라제 억제를 활성화시키고, 신경 영양인자(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 및 상위 전사인자(cAMP-response-element-binding protein, CREB)의 발현을 활성화시켜 치매 예방 또는 치매 치료 또는 인지능 개선효과를 발휘한다.
도 1은 수중 미로 실험에서 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 탈출 대기 시간(escape latency time) 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 2는 수중 미로 실험에서 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 플랫폼 제거 후, 플랫폼 구역에 머무르는 시간을 나타낸 결과 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 3은 수동 회피 실험에서 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 지체시간(latency time)을 측정한 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 4는 수동 회피 실험에서 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군과 위령선 50% 에탄올 추출물 투여군의 지체시간(latency time)을 측정한 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 5는 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 아세틸콜린에스테라제 억제 활성을 측정한 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 6은 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 신경 영양인자(BDNF) 발현 활성화 측정 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 7은 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 상위 전사인자(CREB) 발현 활성화 측정 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 8은 뇌신경 세포 보호 활성 측정을 위한 MTT 분석법의 결과 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 2는 수중 미로 실험에서 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 플랫폼 제거 후, 플랫폼 구역에 머무르는 시간을 나타낸 결과 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 3은 수동 회피 실험에서 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 지체시간(latency time)을 측정한 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 4는 수동 회피 실험에서 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군과 위령선 50% 에탄올 추출물 투여군의 지체시간(latency time)을 측정한 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 5는 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 아세틸콜린에스테라제 억제 활성을 측정한 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 6은 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 신경 영양인자(BDNF) 발현 활성화 측정 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 7은 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 상위 전사인자(CREB) 발현 활성화 측정 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
도 8은 뇌신경 세포 보호 활성 측정을 위한 MTT 분석법의 결과 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 위령선 80% 메탄올 추출물 제조]
실온에서 80% 메탄올 60 L에 위령선 6 kg을 침지시켰다. 침지 후, 90분씩 3회 초음파 추출하여 위령선 80% 메탄올 추출물을 제조하였다.
[실험예 1: 수중 미로 실험(Morris water maze test)]
본 실험예에서는 공간 기억력 개선 효과를 측정하기 위해 수중 미로 실험을 진행하고자 하였다.
실험을 진행하기 전, 실험용 쥐(ICR mouse, 5주령, 수컷)를 대한 바이오링크(충북 음성군, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 사육실은 온도 22±2℃, 습도 50±10%를 유지시키고, 명암은 12시간(09:00~21:00)을 주기로 조절하였다. 사육실내에서 일주일 동안 사료와 물의 제한 없이 자유 공급하며 실험용 쥐를 적응시켰다.
실험군은 대조군(control), 스코폴라민(scopolamine) 투여군, 도네페질(donepezil) 투여군 및 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군으로 임의로 나누었고, 각 군당 7마리씩 구성하였다.
수중 미로 실험을 진행하기 120분 전, 대조군(control)이 되는 실험쥐에는 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)만을 투여하였고, 양성대조군인 도네페질(donepezil) 투여군에는 0.5% CMC에 농도 1 mg/kg의 도네페질을(donepezil)을 녹인 후, 투여하였다. 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군은 상기 실시예 1의 80% 메탄올 추출물을 50, 100, 200 mg/kg 각 농도로 맞추어 금속제 경구 투여용 존대를 이용하여 각각 경구 투여하였다. 동물 행동 실험 30분 전에 기억 손상을 유도하기 위해, 스코폴라민(scopolamine) 투여군, 도네페질(donepezil) 투여군 및 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군에, 식염수에 녹인 스코폴라민(scopolamine, 1 mg/kg)을 피하 투여시켰다. 이때, 대조군(control)은 생리식염수만을 투여하였다.
스코폴라민(scopolamine) 투여 후, 직경 90 cm 와 높이 40 cm의 수중미로풀(water maze pool) 안에 20±1℃의 물을 채우고 흰 우유를 섞어 불투명하게 하여 플랫폼(platform)이 보이지 않게 하였다. 풀(Pool)을 4구역으로 정확히 나누고, 그 중 한 구역의 중간에 플랫폼(직경 10 cm, 높이 26 cm)을 수면아래 1 cm에 위치하도록 하였고, 실험기간 동안 고정하였다. 4일 동안 실험(trial) 사이에 20분씩 간격을 두었고, 2번 반복실험을 하였다. 입수 지점은 매일 구역별로 위치를 달리하였고, 실험 첫날은 적응 실험을 위하여 60초 동안 플랫폼 없이 수영을 하도록 하였다. 측정 실험은 2일째부터 진행하였으며, 실험용 쥐가 플랫폼에 도달하면 10초 동안 플랫폼에 머물게 하였다. 실험은 120초 동안 진행하였고, 플랫폼을 찾지 못하면 실험을 중단하였다. 중단 후에는 10초 동안 실험용 쥐를 플랫폼에 올려놓고, 위치를 기억 시킨 후, 5일째에 프로브 테스트(probe test)를 진행하였다.
프로브 테스트(probe test)를 진행하기 위해 플랫폼을 제거한 상태에서 실험용 쥐를 1분 동안 수영하게 하였고, 테스트는 1분 동안 플랫폼이 위치한 구역에서 수영한 시간(s)을 측정하여 기록하였다.
실험결과, 200 mg/kg 농도의 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 탈출 대기 시간(escape latency time)이 가장 크게 감소하였으며, 이러한 결과는 스코폴라민(scopolamine)을 투여하지 않은 대조군(control)과 유의적으로 유사한 수치를 나타냈다 (도 1). 도 1은 수중 미로 실험에서 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 탈출 대기 시간(escape latency time) 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
또한, 프로브 테스트(probe test)에서는 플랫폼 제거 후, 플랫폼 구역에 머무르는 시간이 스코폴라민(scopolamine)을 투여군보다 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군에서 길었다 (도 2). 도 2는 수중 미로 실험에서 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 플랫폼 제거 후, 플랫폼 구역에 머무르는 시간을 나타낸 결과 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
[비교예 1: 위령선 50% 에탄올 추출물 제조]
실온에서 50% 에탄올 14 L에 위령선 건조중량 2 kg을 침지시켰다. 침지 후, 4시간 동안 환류하면서 추출하였고, 이를 2회 반복하여 위령선 50% 에탄올 추출물을 제조하였다.
[실험예 2: 수동 회피 실험(passive avoidance test)]
본 실험예에서는 실험용 쥐의 기억력 증진 효과를 측정하기 위해 수동 회피 실험을 진행하고자 하였다.
실험을 진행하기 전, 실험용 쥐(ICR mouse, 5주령, 수컷)를 대한 바이오링크(충북 음성군, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 사육실은 온도 22±2℃, 습도 50±10%를 유지시키고, 명암은 12시간(09:00~21:00)을 주기로 조절하였다. 사육실내에서 실험용 쥐를 일주일 동안 사료와 물의 제한 없이 자유 공급하며 적응시켰다.
실험군은 대조군(control), 스코폴라민(scopolamine) 투여군, 도네페질(donepezil) 투여군, 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군 및 위령선 50% 에탄올 추출물 투여군으로 임의로 나누었고, 각 군당 7마리씩 구성하였다.
수동 회피 실험을 진행하기 120분 전, 대조군(control)이 되는 실험쥐에는 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)만을 투여하였고, 양성대조군인 도네페질(donepezil) 투여군에는 0.5% CMC에 농도 1 mg/kg의 도네페질(donepezil)을 녹인 후, 투여하였다. 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군은 상기 실시예 1의 80% 메탄올 추출물을 50, 100, 200 mg/kg 각 농도로 맞추어 금속제 경구 투여용 존대를 이용하여 각각 경구 투여 하였고, 위령선 50% 에탄올 추출물 투여군은 상기 비교예 1의 위령선 50% 에탄올 추출물을 200 mg/kg 농도로 하여 경구 투여하였다.
동물 행동 실험 30분 전에 기억 손상을 유도하기 위해 스코폴라민(scopolamine) 투여군, 도네페질(donepezil) 투여군, 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군 및 위령선 50% 에탄올 추출물 투여군에, 식염수에 녹인 스코폴라민(scopolamine, 1 mg/kg)을 피하 투여시켰다. 이때, 대조군(control)은 생리식염수만을 투여하였다.
수동 회피 상자는 두 개의 상자로 구성하였고, 전기 충격을 가하기 위한 스테인레스 막대를 깔아 두었다. 상자 사이에는 실험용 쥐가 이동할 수 있는 자동문을 설치하였으며, 실험용 쥐의 상자 적응을 위해 어두운 한쪽 상자에 1분간 머무르게 한 후, 불빛과 소음을 일으키면 가운데 문이 열리고, 실험용 쥐가 회피 상자로 이동하게 하였다. 실험용 쥐를 다시 어두운 상자에 넣은 후, 20초 후에 다시 불빛과 소음을 일으켰을 때, 실험용 쥐가 회피 상자로 들어가고 2초 뒤 전기충격(0.1 mA/10 g body)을 주었다.
24시간 후, 같은 방법을 통해 동일한 실험을 진행하였고, 실험용 쥐가 회피 박스로 이동하는 시간을 지체시간(step through latency)으로 측정하여 기억력을 평가하였다. 불빛과 소음을 일으킨 후, 180초 동안 움직임이 없으면 실험을 중단하였다.
이때, 획득 실험(Acquisition trial)은 본 실험에 앞서 마우스가 수동 회피 장치에 적응하는 단계에 측정한 것이며, 이 경우의 지체시간(latency time)은 모든 실험군에서 유사하게 나타났다. 본 실험(Test trial)결과, 200 mg/kg 농도의 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 지체시간(latency time)이 가장 크게 증가하였으며, 스코폴라민(scopolamine)을 투여하지 않은 대조군(control)과 유의적으로 유사한 수치를 나타냈다. 이러한 결과는, 본 발명의 위령선 80% 메탄올 추출물이 기억력 향상에 영향을 미치는 것을 보여주었다 (도 3). 도 3은 수동 회피 실험에서 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 지체시간(latency time)을 측정한 그래프이다.
한편, 비교예 1의 위령선 50% 에탄올 추출물 투여군과 본 발명의 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군을 비교한 경우에도, 본 발명의 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 지체시간이 더 긴 것으로 나타났다 (도 4). 도 4는 수동 회피 실험에서 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군과 위령선 50% 에탄올 추출물의 지체시간(latency time)을 측정한 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
[실험예 3: 아세틸콜린에스테라제 억제 활성 측정]
본 실험예에서는 상기 실험예 1 내지 실험예 2의 동물 실험에서 사용된 각 실험군 쥐의 해마를 적출하여 아세틸콜린에스테라제 억제 활성을 측정하고자 하였다.
각 실험군 쥐의 해마에 포스페이트 완충액(phosphate buffer)을 넣고 균질화 한 후, 원심분리를 통해 상징액을 취하였다. 상징액과 1 mM 아세틸콜린 아이오다이드(acetylcholine iodide), 3 mM DTNB(5,5'-dithio-bis(2-nitrobenxoic acid))를 혼합한 후, 412 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, 위령선 80% 메탄올 추출물은 스코폴라민(scopolamine)에 의해 증가된 아세틸콜린에스테라제 활성을 억제하였고, 그 중 50 mg/kg 농도의 위령선 80% 메탄올 추출물이 가장 큰 감소를 보였다 (도 5). 도 5는 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 아세틸콜린에스테라제 억제 활성을 측정한 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
[실험예 4: 신경 영양인자(BDNF) 발현 및 상위 전사인자(CREB) 발현 측정]
본 실험예에서는 상기 실험예 1 내지 실험예 2의 동물 실험에서 사용된 각 실험군 쥐의 해마를 적출하여 신경 영양인자(BDNF) 발현 및 상위 전사인자(CREB) 발현을 측정하고자 하였다.
각 실험군 쥐의 해마에 단백질분해효소 억제제(protease inhibitors)가 포함된 차가운 RIPA 완충용액을 넣어 균질화 한 후, 원심분리를 통해 상징액을 얻어, -80℃에서 보관하였고, 단백질양은 브래드포드 법(Bradford method)을 이용하여 측정하였다.
40 ㎍의 단백질이 포함된 상징액을 14% SDS-PAGE 겔을 통해 분리하였으며, 폴리피닐덴디플루오리드 막(PVDF membrane)에 전사하고 5 % 탈지유(skim milk)로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. 막에 BDNF(1:1000 희석), CREB(1:1000 희석), pCREB(1:500 희석) 및 베타-액틴(1:2000 희석)의 1차 항체를 접종시킨 후, 4℃에서 하루동안 반응시켰다. 반응 후, 2차 항체(BDNF는 goat-anti-rabbit IgG-HRP의 1:2000 희석액, pCREB는 donkey-anti-goat IgG-HRP의 1:2000 희석액 및 CREB와 β-actin은 goat-anti-mouse IgG-HRP의 1:2000 희석액) 접종 후, 상온에서 막을 1시간 동안 반응 시켰다. 단백질 밴드는 이씨엘(ECL) 용액를 이용하여 발색하였다.
상위 전사인자(CREB)는 활성화되면 pCREB 형태로 전환되면서 뇌의 기억 관련 기능을 활성화시켜 기억력을 향상시키는데, 실험결과 위령선 80% 메탄올 추출물은 신경 영양인자(BDNF)와 pCREB의 양을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 6, 도 7). 도 6은 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 신경 영양인자(BDNF) 발현 활성화 측정 그래프이고, 도 7은 농도별 (50, 100, 200 mg/kg) 위령선 80% 메탄올 추출물 투여군의 상위 전사인자(CREB) 발현 활성화 측정 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
[실험예 5: 뇌신경세포 보호 활성 측정]
본 실험예에서는 뇌신경 세포 보호 활성 측정을 위해 MTT 분석법을 실시하고자 하였다.
서울대학교로부터 실험용 쥐의 해마 유래 세포주인 HT22 세포를 분양받아 배양하였다. HT22 세포는 10% (v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), NaHCO3 (2 mg/ml) 및 15 mM 헤페스(hepes)가 포함된 동물세포배양 배지(DMEM 배지)에 5% CO2 배양기 내에서 37℃에서 배양하였다. 배양된 HT22 세포를 48 웰 플레이트에 3×104 세포/웰(cell/well)을 시딩(seeding)한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 글루타메이트(glutamate) 처리 전, 1, 10 ,100 ㎍/ml의 세가지 농도의 위령선 80% 메탄올 추출물과 양성대조군(Trolox 50μM)을 첨가하였고, 1시간 배양 후, 글루타메이트(glutamate)를 처리하였다. 24시간 37℃에서 배양 후 MTT용액을 첨가하였고, 3시간 후 DMSO로 용해한 후, 엘리사 리더(ELISA reader)를 사용하여 570 nm에서 흡광도 측정을 하였다.
실험결과, 위령선 80% 메탄올 추출물은 글루타메이트(glutamate)에 의한 산화적 스트레스에 대해 유의적으로 뇌신경 세포를 보호하였다. 그 중에서도 100 ㎍/ml 농도의 위령선 80% 메탄올 추출물이 가장 높은 보호활성을 나타냈다 (도 8). 도 8은 뇌신경 세포 보호 활성 측정을 위한 MTT 분석법의 결과 그래프이다 (*р＜0.05, **р＜0.01, ***р＜0.001).
Claims (6)
- 위령선(Clematis mandshurica) 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방용 또는 인지능 개선용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 위령선(Clematis mandshurica) 메탄올 추출물은,
80% 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 치매 예방용 또는 인지능 개선용 식품 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 80% 메탄올 추출물은,
초음파 추출한 것을 특징으로 하는 치매 예방용 또는 인지능 개선용 식품 조성물.
- 위령선(Clematis mandshurica) 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방용 또는 치매 치료용 약학 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 위령선(Clematis mandshurica) 메탄올 추출물은
80% 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 치매 예방용 또는 치매 치료용 약학 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 80% 메탄올 추출물은,
초음파 추출한 것을 특징으로 하는 치매 예방용 또는 치매 치료용 약학 조성물.
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