CN117561003A - 包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物的用于保护肝的组合物 - Google Patents

包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物的用于保护肝的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包含猪胎盘水解物和酸水解物的混合物的用于保护肝的组合物；以及用于预防、改善或治疗由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的组合物，本发明的组合物对于保护肝具有显著的效果，尤其对于预防、改善或治疗由酒精引起的肝损伤具有显著的效果，因此可以有用地用于药物领域以及食品领域。

Description

包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物的用于保护肝的组 合物
技术领域
本发明涉及一种包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物的用于保护肝的组合物。
背景技术
肝脏为人体器官中体内代谢最活跃的器官，由如过量摄取包含脂肪成分的食物或酒精、病毒感染、各种药物等有害物质、营养不良等多种原因引起急性或慢性疾病，可能导致脂肪肝、肝炎、黄疸、肝硬化、肝癌等。尤其，通过食物摄取过多的脂肪或过量饮酒会导致脂肪肝，其在肝组织中积累脂质，在此情况下，血清中的天冬氨酸转氨酶(aspartatetransaminase，AST)、丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)等会增加。
另一方面，胎盘由血绒毛膜组成，维持胎儿与母体组织之间的接触，同时向胎儿提供必要的氧气以及营养素。并且，其在清除胎儿生成的废物方面发挥重要作用。胎盘中包含胎儿的生长所需的各种营养物质以及激素等，猪胎盘广泛用于成人，尤其是用于缓解更年期症状以及美容目的。众所周知，胎盘中包含必需氨基酸、褪黑素、RNA、DNA等核酸成分、作为抗氧化酶的超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)、透明质酸、抗氧化剂、细胞因子、胎盘肽、胰岛素样生长因子、表皮生长因子(EGF)以及衰老细胞激活因子(SCAF)等生长因子以及细胞因子类，因此有助于恢复疲劳以及增强免疫力等。并且在哺乳类的胎盘中，猪胎盘的蛋白质结构与人胎盘具有高度的同源性，据报道，猪胎盘为生物活性细胞因子的根源，其作为蛋白质、各种营养素、DNA以及RNA的重要成分参与细胞的分化以及胎儿的发育。由于这些特性，猪胎盘被应用于食品以及药品等。但是，目前还缺乏可以有效预防或改善由酒精引起的肝损伤、药物中毒、宿醉等的猪胎盘组合物的研究。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供一种用于保护肝的保健功能性食品组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
本发明的再一目的在于，提供一种用于预防或改善由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的保健功能性食品组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
本发明的另一目的在于，提供一种用于保护肝的药物组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
本发明的还有一目的在于，提供一种用于预防或治疗由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的药物组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种用于保护肝的保健功能性食品组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
并且，本发明提供一种用于预防或改善由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的保健功能性食品组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
在本发明一实施例中，上述猪胎盘酶水解物可以包含由选自由序列1至序列3组成的组中的氨基酸序列组成的一种以上肽。
在本发明一实施例中，上述猪胎盘酶水解物和酸水解物可以以1:0.1～10的重量比混合，优选地，可以以1:0.5～5、1:0.6～5、1:0.7～5、1:0.8～5、1:0.9～5、1:1～5、1:1～4、1:1～3、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5的重量比混合，但不限于此。
在本发明一实施例中，可以通过用蛋白质水解酶处理来制备上述猪胎盘酶水解物，上述蛋白质水解酶可以选自由木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、菠萝蛋白酶以及碱性蛋白酶组成的组中，但不限于此。
在本发明一实施例中，可以通过用酸(acid)处理来制备上述猪胎盘酸水解物，上述酸(acid)可以为盐酸、硫酸、乙酸或柠檬酸，但不限于此。
在本发明一实施例中，上述肽可以以0.1ppm～100ppm的浓度，优选地，可以以1～25ppm的浓度包含在猪胎盘酶水解物中。
在本发明一实施例中，相对于保健功能性食品组合物的总重量，上述猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物的含量可以为1～20重量百分比。并且，上述肽可以以0.001ppm～20ppm的浓度包含在整个上述组合物中。
在本发明一实施例中，上述组合物可以减少血清中碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase，AST)或丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)的水平。
并且，本发明提供一种用于保护肝的药物组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
并且，本发明提供一种用于预防或治疗由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的药物组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
在本发明一实施例中，相对于药物组合物的总重量，上述猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物含量可以为5～30重量百分比。并且，上述肽可以以0.005ppm～30ppm的浓度包含在整个上述组合物中。
发明的效果
本发明的组合物对于保护肝具有显著的效果，尤其，对于预防、改善或治疗由酒精引起的肝损伤具有显著的效果，因此可以有用地用于药物领域以及食品领域。
附图说明
图1示出猪胎盘酶水解物以及酸水解物的HPLC(高效液相色谱)图谱的结果。
图2示出猪胎盘酶水解物的LC/MS色谱图结果。
图3示出猪胎盘酶水解物以及肽(VVVE)的色谱图结果。
图4示出猪胎盘酶水解物以及肽(VVVE)的MS/MS图谱的结果。
图5示出猪胎盘酶水解物以及肽(DGLHLR)的色谱图结果。
图6示出猪胎盘酶水解物以及肽(DGLHLR)的MS/MS图谱的结果。
图7示出猪胎盘酶水解物以及肽(DDFNPSVH)的色谱图结果。
图8示出猪胎盘酶水解物以及肽(DDFNPSVH)的MS/MS图谱的结果。
图9示出在给药猪胎盘酶水解物、酸水解物或猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物后测定肝组织中醇脱氢酶(ADH)的活性度的结果(Normal：正常对照组；酒精(Alcohol)：阴性对照组；水飞蓟素(Silymarin)：阳性对照组；L：猪胎盘混合物的低剂量组；M：猪胎盘混合物的中剂量组；H：猪胎盘混合物的高剂量组；E-form：猪胎盘酶水解物给药组；以及A-form：猪胎盘酸水解物给药物)。
图10示出在给药猪胎盘酶水解物、酸水解物或猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物后测定肝组织中乙醛脱氢酶(ALDH)的活性度的结果(Normal：正常对照组；酒精(Alcohol)：阴性对照组；水飞蓟素(Silymarin)：阳性对照组；L：猪胎盘混合物的低剂量组；M：猪胎盘混合物的中剂量组；H：猪胎盘混合物的高剂量组；E-form：猪胎盘酶水解物给药组；以及A-form：猪胎盘酸水解物给药物)。
具体实施方式
作为最佳实施方式，本发明提供一种用于保护肝的保健功能性食品组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
并且，作为最佳实施方式，本发明提供一种用于预防或改善由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的保健功能性食品组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
本发明的实施方式
本发明提供一种用于保护肝的保健功能性食品组合物；以及用于预防或改善由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的保健功能性食品组合物，上述组合物包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
上述猪胎盘酶水解物可以包含由选自由序列1至序列3组成的组中的氨基酸序列组成的一种以上肽。
上述肽可以以0.1ppm～100ppm的浓度，优选地，可以以1～25ppm的浓度包含在猪胎盘酶水解物中。
本发明的术语“猪胎盘酶水解物”是指通过用蛋白质水解酶处理猪胎盘来制备的。
上述蛋白质水解酶可以选自由木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、菠萝蛋白酶以及碱性蛋白酶组成的组中，但不限于此。
本发明的术语“猪胎盘酸水解物”是指通过用酸处理猪胎盘来制备的。
上述酸可以为盐酸、硫酸、乙酸或柠檬酸，但不限于此。
上述猪胎盘酶水解物和酸水解物可以以1:0.1～10的重量比混合，优选地，可以以1:0.5～5、1:0.6～5、1:0.7～5、1:0.8～5、1:0.9～5、1:1～5、1:1～4、1:1～3、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5的重量比混合，但不限于此。
本发明的保健功能性食品组合物可以包括所有通常含义的食品，可以与功能性食品、保健功能性食品等本领域公知的术语互换使用。
本发明的术语“保健功能性食品”是指使用对人体具有有益功能性的原料或成分制备以及加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体以及丸等形式的食品。其中，“功能性”是指获得如调节人体的结构以及功能所需的营养素或生理作用等保健用途的有益效果。本发明的保健功能性食品可以通过本领域常用的方法来制备，当进行上述制备时，可以通过添加本领域通常添加的原料以及成分来制备。并且，上述保健功能性食品的剂型也可以不受限制地制备，只要其是被认可为保健功能性食品的剂型即可。不同于普通药物，本发明的保健功能性食品组合物的优点在于，由于以食品为原料，因此没有长期服用药物时可能产生的副作用等，并且由于携带方便，因此可以作为辅助剂摄取，其用于增强由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的预防或改善效果。
在本发明的保健功能性食品组合物中，相对上述组合物的总重量，上述有效成分(猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物)的含量可以为1％～20％(重量百分比)，但并不必需限定于此，可以根据预防、保健或治疗等各使用目的适当地确定有效成分的混合量。
保健功能性食品的剂型可以为任何普通食品或饮料形式，而不仅是散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂形式。。
上述食品的种类没有特别的限制，可以添加上述物质的食品的例子包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、零食类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋类在内的乳制品、各种浓汤、饮料、茶、饮剂、酒精饮料以及复合维生素等，可以包括所有通常含义的食品。
通常，当制备食品或饮料时，相对于100重量份的原料，可以添加15重量份以下的上述有效成分，优选地，可以添加10重量份以下的量。然而，在出于保健以及卫生目的或调节健康的目的而长期摄取的情况下，上述量可以为上述范围以下，并且由于本发明使用来源于天然物的分馏物，不存在安全性问题，因此可以使用上述范围以上的量。
在本发明的功能性食品中，饮料可以像普通饮料一样包含各种调味剂或天然碳水化合物作为附加成分。上述天然碳水化合物可以为如葡萄糖、果糖等单糖、如麦芽糖、蔗糖等双糖、如糊精、环糊精等多糖以及如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。可以使用如索马甜、甜叶菊提取物等天然甜味剂或如糖精、阿斯巴甜等合成甜味剂等作为甜味剂。每100mL的本发明的饮料中，上述天然碳水化合物的比例可以为约0.01～0.04g，优选地，可以为约0.02～0.03g。
除上述以外，本发明的保健功能性食品组合物可以包含各种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、用于碳酸饮料的碳酸化剂。除此以外，本发明的保健功能性食品组合物可以包含用于制备天然果汁、果汁饮料以及蔬菜饮料的果肉。可以单独或混合使用这些成分。这种添加剂的比例没有限制，但基于100重量份的本发明的功能性食品组合物，通常在0.01～0.1重量份的范围内选择。
并且，本发明提供一种包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分的用于保护肝的药物组合物；以及用于预防或改善由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的药物组合物。
本发明的药物组合物对有效成分的含量没有特别的限制，只要包含上述有效成分即可，但优选地，相对于上述组合物的总重量，上述有效成分的含量可以为5～30重量百分比。但是，不限于此。并且，上述肽可以以0.005ppm～30ppm的浓度包含在整个上述组合物中。在此情况下，当肽的浓度小于上述浓度范围时，存在难以发挥优选的预防或治疗效果的问题，当其大于上述浓度范围时，预期效果的变化可能很小。
本发明的药物组合物可以按照常规方法分别配制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶等口服剂型、外用剂、栓剂以及无菌注射溶液等形式使用，可以包含在药物组合物的制备中常用的合适的载体、赋形剂或稀释剂，以进行配制。
上述载体或赋形剂或稀释剂可以为包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁以及矿物油等在内的各种化合物或混合物。
当配置时，可以使用常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来进行制备。
用于口服给药的固体制剂可以通过在上述组合物中混合一种以上如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等赋形剂来制备。并且，除了简单的赋形剂以外，还可以使用如硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。
用于口服给药的液体制剂包括混悬液、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，除了常用的水、液体石蜡等稀释剂以外，可以包含如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等赋形剂。
用于肠胃外给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水溶性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、栓剂。可以使用丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油等植物油、如油酸乙酯等可注射的酯类等作为非水溶性溶剂以及混悬剂。可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等作为栓剂的基质。
本发明的药物组合物的优选给药量根据患者的状态、体重、疾病的严重程度、药物形式、给药途径以及期间而异，但可以由本领域的普通技术人员适当地选择。然而，为了优选的效果，可以每天给药0.0001mg/kg至2000mg/kg，优选地，可以给药0.001mg/kg至2000mg/kg。给药可以每天给药1次，还可以分多次给药。但是，本发明的范围不限于上述给药量。
本发明的药物组合物可以通过各种途径给药到大鼠、小鼠、家畜、人类等哺乳动物。给药的所有方法，例如，可以通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑室内(intracerebroventricular)注射来给药。
以下，将通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1.制备猪胎盘酶水解物
将猪胎盘在解冻机中解冻后，在嫩肉机中放入用自来水去除异物的猪胎盘进行嫩化，使得容易去血。然后用0.9％的NaCl清洗数次以去除猪胎盘中的血液，并利用搅拌机破碎猪胎盘，使得容易进行水解。在如上制备的猪胎盘中添加3％的蛋白水解酶(木瓜蛋白酶)并水解20小时。水解完成后，通过加热使蛋白水解酶失活，并使上述猪胎盘水解物与助滤剂接触后进行过滤以及吸附纯化。然后，在猪胎盘水解物滤液中添加1.2倍(w/w)的乙醇并放置15～20小时，然后利用过滤器去除未充分水解的糖、蛋白质以及杂质等。浓缩滤液后，利用0.1～2％的活性炭进行吸附纯化，然后利用过滤器按照过滤的方法去除使用过的活性炭。将去除活性碳的纯化猪胎盘酶水解物用0.2μm的过滤器进行除菌过滤并对除菌过滤液进行灭菌。最终得到高纯度的胎盘提取物。
实施例2.制备猪胎盘酸水解物
将猪胎盘在解冻机中解冻后，在用自来水去除异物的100kg的猪胎盘中添加70kg的35％(v/w)盐酸，并在110℃的温度下分解22小时后过滤。然后，将过滤的分解物进行浓缩后添加氢氧化钠以中和至pH6～7，然后利用活性炭进行吸附纯化。利用过滤器按照过滤的方法去除使用过的活性炭。将去除活性碳的纯化猪胎盘酸水解物用0.2μm的过滤器进行除菌过滤并对除菌过滤液进行灭菌。
实施例3.分析猪胎盘酶水解物以及酸水解物
本发明人进行用于分析所制备的猪胎盘酶水解物以及酸水解物的氮含量、氨基酸含量以及HPLC图谱的实验，以确认猪胎盘酶水解物以及猪胎盘酸水解物的特性。
结果，表现出酶水解物的氨基酸含量为约40％，酸水解物的氨基酸含量为约80％(表1)。即，确认到与酶水解物相比，酸水解物中的氨基酸含量更多。并且，如图1所示，猪胎盘酶水解物与酸水解物的HPLC图谱也表现出不同(图1)。
表1分析猪胎盘酶水解物以及酸水解物
区分 总氮(mg/mL) 氨基酸(mg/mL) 氨基酸(％) 肽(％)
酶水解物 5.30 13.68 41.1 58.9
酸水解物 5.67 31.72 81.2 18.8
计算公式
肽(％)＝100％-氨基酸％
实施例4.确认猪胎盘酶水解物的肽以及分析肽功效
4.1.猪胎盘酶水解物的质量色谱法(mass chromatography)
将实施例1中得到的猪胎盘酶水解物加入100μl的试样中并添加500μl的甲醇(MeOH)进行涡旋后离心，并将600μl的上清液转移至新试管中进行真空干燥。然后，在干燥的样品中添加水至100μl后通过MicroQ-TOF III质量色谱仪(MicroQ-TOF III massspectrometer，布鲁克·道尔顿公司(Bruker Daltonics)，255748德国(Germany))系统以及ms/ms电离分析对滤液进行序列分析。
分析条件
-流动相：
A流动相：H2O/FA＝100/0.2(v/v)
B流动相：乙腈/甲酸(Acetonitrile/FA)＝100/0.2(v/v)
表2质量色谱法(Mass chromatography)分析条件
上述分析的结果，总共分析17种肽，在uniprot数据库(uniprot data base)中确认到5种肽作为猪来源肽(peptide)(表3)。
表3
猪胎盘酶水解物的肽序列
然后，在本发明中，通过确认所确认的5种猪来源肽的峰大小以及组态间再现性，从而选择3种猪来源肽作为指标物质(图2以及表4)。
表4
猪胎盘酶水解物指标成分的肽序列
No. m/z RT(分钟) 电荷(Charge) 序列(Sequence) 水解物中的含量(ppm)
PEP-1 445.27 9.4 1 VVVE(序列1) 10-19ppm
PEP-2 355.70 14.3 2 DGLHLR(序列2) 4-10ppm
PEP-3 465.71 15.3 2 DDFNPSVH(序列3) 10-21ppm
由Anygen公司(www.anygen.com)合成与从上述猪胎盘酶水解物中确认的肽具有相同的质量(mass)以及ms/ms电离形式的肽，然后进行实验。
经确认，上述PEP-1、PEP-2以及PEP-3肽在水解物中的含量为1ppm至25ppm。
4.2.验证肽
进行肽验证试验，以通过验证上述PEP-1，PEP-2，PEP-3肽来确认由Anygen公司合成的肽与猪胎盘酶水解物中存在的肽一致。
对于PEP-1，通过2种方法进行肽的验证。第1种方法为分析猪胎盘酶水解物以及肽(VVVE)的色谱图。确认猪胎盘水解物(A)、肽(VVVE)(B)以及在猪胎盘水解物中渗加(spiking)合成肽(C)的色谱图。结果，猪胎盘水解物与合成肽被鉴定为相同的峰。由此，确认到肽与猪胎盘水解物中存在的成分一致(图3)。第2种方法为确认猪胎盘酶水解物以及肽(VVVE)的MS/MS图谱。结果，猪胎盘水解物的MS/MS图谱与肽(VVVE)的MS/MS图谱一致，因此确认到肽与猪胎盘水解物中存在的成分一致(图4)。
对于PEP-2，第1种方法为分析猪胎盘酶水解物以及肽(DGLHLR)的色谱图。确认猪胎盘水解物(A)、肽(DGLHLR)(B)以及在猪胎盘水解物中渗加(spiking)合成肽(C)的色谱图。结果，确认到猪胎盘水解物与合成肽的峰相同。由此，确认到肽与猪胎盘水解物中存在的成分一致(图5)。并且，验证肽的第2种方法为确认猪胎盘酶水解物以及肽(DGLHLR)的MS/MS图谱。结果，猪胎盘水解物的MS/MS图谱与肽(DGLHLR)的MS/MS图谱一致，因此确认到肽与猪胎盘水解物中存在的成分一致(图6)。
对于PEP-3，第1种方法为分析猪胎盘酶水解物以及肽(DDFNPSVH)的色谱图。确认猪胎盘水解物(A)、肽(DDFNPSVH)(B)以及在猪胎盘水解物中渗加(spiking)合成肽(C)的色谱图。结果，确认到猪胎盘水解物与合成肽的峰相同。由此，确认到肽与猪胎盘酶水解物中存在的成分一致(图7)。并且，验证肽的第2种方法为确认猪胎盘酶水解物以及肽(DDFNPSVH)的MS/MS图谱。结果，猪胎盘酶水解物的MS/MS与肽(DDFNPSVH)的MS/MS图谱一致，因此确认到肽与猪胎盘水解物中存在的成分一致(图8)。
4.3.评价肽的HepG2细胞毒性
培养HepG2肝癌细胞系，然后添加不同浓度的3种合成肽并进行MTT(溴化噻唑蓝四氮唑(methylthiazol tetrazolium bromide)，西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))，以确认细胞存活率。在24孔板(BD，Falcon公司)的各孔中适量(1×105/孔)接种(seeding)细胞并用不同浓度的试样处理，然后在37℃的培养箱中培养24小时后确认细胞存活率。利用MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))反应4小时，然后添加400μl的DMSO以溶解不溶性甲臜(formazan)晶体，并利用ELISA酶标仪(帝肯(TECAN)，Infinite M200 pro)测定570nm波长处的吸光度。
确认3种肽的细胞毒性的结果，PEP-1、PEP-2以及PEP-3直到10μg/ml均表现出无毒性(表5)。
4.4.肽的肝细胞保护能
将作为肝癌细胞系的HepG2细胞以1×105/孔的量接种于24孔板中。然后，为了确认3种合成肽的肝细胞保护能力，用不同浓度的肽处理并培养23小时，然后用10mM的t-BHP的处理并培养90分钟以损伤肝细胞。添加MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))反应4小时，然后添加400μl的DMSO以溶解不溶性甲臜(formazan)晶体，并利用ELISA酶标仪(帝肯(TECAN)，Infinite M200 pro)测定570nm波长处的吸光度。
结果，PEP-2以及PEP-3在10μug/ml的浓度下分别表现出26％以及20％的高肝细胞保护能力(表5)。
4.5.测定肽的肝功能检测指标AST
为了确认AST，各孔(1×105/孔)中用不同浓度的3种合成肽处理并培养23小时，然后用20mM的t-BHP处理并培养3小时。然后，取上清液并利用天冬氨酸转氨酶(AST or SGOT)活性比色测定试剂盒(Aspartate transaminase(AST or SGOT)Activity ColorimetricAssay Kit，BIOVISION公司；K753-100)进行测定。并且，去除上清液以进行细胞定量，并利用MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))反应4小时，然后添加400μl的DMSO以溶解不溶性甲臜(formazan)晶体，并利用ELISA酶标仪(帝肯(TECAN)，Infinite M200 pro)测定570nm波长处的吸光度。
结果，PEP-2、PEP-3分别在10μg/ml的浓度下表现出最显著的AST抑制能力，其数值分别表现为34％以及14％(表6)。如肝细胞保护能力的结果，确认到PEP-2表现出最优异的功效。
4.6.测定肽的肝功能检测指标ALT
为了确认ALT，各孔(1×105/well)中用不同浓度的3种合成肽处理并培养23小时，然后用20mM的t-BHP处理并培养3小时。然后，取上清液并利用丙氨酸转氨酶(ALT or SGPT)活性比色/荧光测定试剂盒(Alanine transaminase(ALT or SGPT)ActivityColorimetric/Fluorometric Assay Kit，BIOVISION公司；K752-100)进行测定。并且，去除上清液以进行细胞定量，并利用MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))反应4小时，然后添加400μl的DMSO以溶解不溶性甲臜(formazan)晶体，并利用ELISA酶标仪(帝肯(TECAN)，Infinite M200 pro)测定570nm波长处的吸光度。
结果，确认到PEP-2具有优异的ALT抑制能力。表现出最大功效的浓度为1μg/ml，其数值表现为34％(表5)。
表5猪胎盘来源肽的肝健康改善效果试验
实施例5.评价猪胎盘酶水解物以及酸水解物的体外(in-vitro)肝脏(liver)改善功效
本发明人测定用猪胎盘酶水解物以及酸水解物处理人肝癌细胞系后的细胞存活率以进行猪胎盘酶水解物以及酸水解物的细胞毒性实验。简单来说，在细胞培养皿(flask)中培养HepG2人肝癌细胞系后，当达到80％汇合(confluence)时以1.5×105个细胞数量接种于24孔板(well plate)中。培养48小时后，用不同浓度的各试验物质处理并进一步培养24小时。然后，利用MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))反应4小时，然后添加400μl的DMSO以溶解不溶性甲臜(formazan)晶体，并利用ELISA酶标仪(帝肯(TECAN)，InfiniteM200pro)测定570nm波长处的吸光度。
结果，确认到猪胎盘酶水解物以及酸水解物直到0.5mg/ml的总氮浓度下表现出无毒性(表6)。
并且，本发明人进行实验用于确认猪胎盘酶水解物以及酸水解物是否具有肝保护效果。简单来说，在细胞培养皿(flask)中培养HepG2人肝癌细胞系后，当达到80％汇合(confluence)时以1.5×105个细胞数量接种于24孔板(well plate)中。培养48小时后，用不同浓度的各试验物质处理并培养23小时。然后，用叔丁基过氧化氢(tert-Butylhydroperoxide，t-BHP，10mM)与样品同时处理细胞1小时30分钟。同时处理1小时30分钟后，通过MTT确认与由t-BHP损伤的肝损伤处理组相比的肝细胞保护能力。
结果，确认到在用t-BHP处理肝细胞的情况下，由于产生大量的ROS而导致损伤肝细胞。然而，在用猪胎盘酶水解物处理的情况下，在0.05mg/ml的总氮浓度下保护约40％的肝细胞，猪胎盘酸水解物在0.05mg/ml的总氮浓度下具有保护约21％的效果(表6)。
并且，本发明人进行实验用于确认猪胎盘酶水解物以及酸水解物抑制肝毒性的效果。在细胞培养皿(flask)中培养HepG2人肝癌细胞系后，当达到80％汇合(confluence)时以1.5×105个细胞数量接种于24孔板(well plate)中。培养48小时后，用不同浓度的各试验物质处理并培养23小时。23小时后，用t-BHP(20mM)同时处理细胞3小时，3小时后得到上清液并利用AST以及ALT活性试剂盒(activity kit)确认作为肝损伤指标的天冬氨酸转氨酶(aspartate transminase，AST)以及丙氨酸转氨酶(alanine transminase，ALT)的量。并且，通过用MTT溶液处理来确认并校正细胞数量。
结果，确认到在用0.1mg/ml的总氮浓度的猪胎盘酶水解物处理的情况下，抑制91％的AST，并在用0.1mg/ml的总氮浓度的猪胎盘酸水解物处理的情况下，具有抑制93％的AST的效果。并且，经确认，在用0.1mg/ml的总氮浓度的猪胎盘酶水解物处理的情况下，具有抑制23％的ALT的效果，相反，在用猪胎盘酸水解物处理的情况下没有任何变化(表6)。
表6
评价猪胎盘酶水解物以及酸水解物的肝功能改善功效
实施例6.分析猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物特性
本发明人以1:1、1:2、1:3、1:4的重量比混合猪胎盘酶水解物和酸水解物后进行分析氮含量以及氨基酸含量的实验，以确认以不同比例混合猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物的特性。
结果，确认到猪胎盘酸水解物的混合比例越高，氨基酸的含量越增加(表7)。在后续实验中，选择重量比为1:3的猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物，并在低、中、高浓度的各种浓度下进行功效评价。
表7
分析猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物
区分 总氮(mg/mL) 氨基酸(mg/mL) 氨基酸(％) 肽(％)
酶+酸(1:1) 5.47 15.73 59.4 40.6
酶+酸(1:2) 5.52 17.54 65.8 34.2
酶+酸(1:3) 5.58 18.10 66.4 33.6
酶+酸(1:4) 5.61 18.62 68.2 31.8
计算公式
肽(％)＝100％-氨基酸％
实施例7.评价猪胎盘酶水解物、酸水解物以及猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物对酒精性肝损伤的体内(in vivo)功效
7.1.制备试样
通过喷雾干燥猪胎盘酶水解物、酸水解物以及酶水解物和酸水解物的混合物来制备粉末试样。对此，分析粉末试样的氮含量以及氨基酸含量，以确认粉末试样的特性(表8)。
表8
猪胎盘酶水解物、酸水解物以及酶水解物和酸水解物的混合物
区分 总氮(mg/mL) 氨基酸(mg/mL) 氨基酸(％) 肽(％)
酶水解物 46.79 125.25 42.5 57.5
酸水解物 35.70 197.38 81.2 18.8
酶和酸水解物(1:3)的混合物 39.27 176.27 64.0 36.0
计算公式
肽(％)＝100％-氨基酸％
7.2.饲养动物
在本发明中，购入7～8周龄的SD种白鼠(约250gm)后，进行1周的检疫以及驯化期间来观察体重变化以及一般健康状态，然后使用健康的个体。实验期间，除了第1组以外的所有组均自由摄取辐射灭菌的大鼠(rat)酒精饮食(Lieber Decarlie酒精液体饲料(Lieber Decarlie Liquid Ethanol Diet))4周，在第4周额外每周2次(周二/周四)口服给药酒精，未单独供给饮用水。饲养室温度保持在23±2℃，相对湿度保持在40～60％，每小时通风10～12次。并且，通过调节光使得光周期/暗周期为12小时。
7.3.酒精饮食(Lieber DeCalie酒精液体饲料(Lieber DeCalie Liquid EthanolDiet))的配制方法
酒精饮食的配制方法如下：1)将所需重量的粉末饲料(132.28g)以及67ml的酒精加入添加有821ml的水的烧杯中；2)加入足够的水后充分搅拌，使得没有结块；3)加入水至标记的1L部分；4)充分搅拌饲料后在搅拌机中混合30秒钟；以及5)使用饲管(FeedingTube，120ml)。
当利用常规饲料桶装液体饮食时，由于溢出或容易粘在动物身上而可能导致损失量大。并且，由于与空气接触的面积变大而导致易挥发的酒精挥发或其饮食容易氧化，因此可能对实验造成很大影响。因此，本实验中使用液体饮食饲喂桶。
7.4.试验组
试验组如下。
(1)正常对照组
(2)阴性对照组：酒精饮食(4周自由进食)+30％的酒精(1.4g/kg，PO)第4周额外给药2次
(3)阳性对照组：水飞蓟素(silymarin，100mg/kg/天(day)，PO)(Yang et al，2015)+30％的酒精(1.4g/kg，PO)第4周额外给药2次
(4)猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物(1:3)的高剂量组：2952mg/kg/天(day)，PO+酒精饮食(4周自由进食)+30％的酒精(1.4g/kg，PO)第4周额外给药2次
(5)猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物(1:3)的中剂量组：1771mg/kg/天(day)，PO+酒精饮食(4周自由进食)+30％的酒精(1.4g/kg，PO)第4周额外给药2次
(6)猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物(1:3)的低剂量组：590mg/kg/天(day)，PO+酒精饮食(4周自由进食)+30％的酒精(1.4g/kg，PO)第4周额外给药2次
(7)猪胎盘酶水解物的高剂量组：2511mg/kg/天(day)，PO+酒精饮食(4周自由进食)+30％的酒精(1.4g/kg，PO)第4周额外给药2次
(8)猪胎盘酸水解物的高剂量组：3282mg/kg/day，PO+酒精饮食(4周自由进食)+30％的酒精(1.4g/kg，PO)第4周额外给药2次
7.5.对酒精性肝损伤的肝功能改善功效
本发明人预饲养试验动物约1周，然后按照方案进行4周的实验。将试验试样每天配制成固定浓度的剂量口服给药1次，按照规定的配制方法配制酒精饮食每天供给使自由进食。第4周以规定剂量额外口服给药2次。试验4周后，禁食12小时后通过从心脏采血来进行放血，并以3000rpm离心血液后利用酒精试剂盒以及乙醛试剂盒对血清进行定量以比较分析血液中浓度。并且，从心脏采血用于肝毒性评价的血液后置于肝素管中，并以10000rpm离心10分钟后测定肝酶水平以评价肝毒性。取一部分组织评价肝组织变化以及肝脏中ADH及ALDH酶活性。所有结果均通过学生t检验(Student’s t-test)以及方差检验(ANOVAtest)验证并以平均值与标准偏差表示试验组之间的显著性。
在本发明中，试图通过测定血清指标中代表肝疾病的ALP、ALT、AST以及代表肝的合成能力的白蛋白及总蛋白质量来验证猪胎盘对包括肝炎症以及肝的合成能力在内的整体肝脏状态的功效。将对各血清指标的测定值示于表9中。
结果，血清白蛋白(albumin)作为与总蛋白质量(total protein)一起表示肝合成能力的指标，各组的指标未表现出显著的差异。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)主要分布于肝脏、骨组织、肠道、白细胞等中，水平的增加主要由肝脏以及骨组织引起。经确认，在本发明中，与阴性对照组相比，当给药试验物质(水飞蓟素、猪胎盘提取物)时表现出ALP减少的趋势，尤其在猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物的中剂量组；以及猪胎盘酶水解物中显著减少。
ALT以及AST为表示肝功能的代表性转氨酶(aminotransferase)。经确认，与正常对照组相比，在给药酒精的阴性对照组中的ALT水平增加约3.5倍，当给药试验物质(水飞蓟素，猪胎盘提取物)时，与阴性对照组相比ALT水平减少。尤其，当给药猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物时以剂量依赖性地减少，并且ALT水平在高剂量的猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物中最显著地减少。
并且，与正常对照组相比，在给药酒精的阴性对照组中，AST水平由于肝毒性显著增加，试验物质中，除了高剂量的酶水解物以外的所有试验组中的AST水平显著减少。尤其，经确认，当给药猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物时，AST水平与ALT相同地以剂量依赖性地减少。
表9猪胎盘提取物对酒精性肝损伤的血清生化检测
并且，测定肝组织中作为酒精代谢酶的ADH的活性度的结果，与正常对照组(0.37)相比，在给药酒精的阴性对照组(0.85)中的ADH活性增加(图9)。并且，ADH的活性按水飞蓟素>低剂量猪胎盘混合物>中剂量猪胎盘混合物>高剂量猪胎盘混合物的顺序表现出减少的趋势。结果，与猪胎盘酶水解物以及酸水解物的单独处理组相比，当给药混合物时ADH的活性更减少。但是，在给药酸水解物的组中酶活性显著增加(图9)。
并且，测定肝组织中作为酒精代谢酶的ALDH的活性度的结果，与正常对照组相比，在给药酒精的阴性对照组中的ALDH活性度增加，并且在给药水飞蓟素或猪胎盘提取物的组中，由酶诱导作用而导致增加的ALDH活性总体减弱(图10)。猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物以剂量依赖性地抑制酒精的酶诱导作用，在猪胎盘混合物的高剂量组中最明显地抑制ALDH的活性(图10)。猪胎盘酶水解物以及酸水解物的效果几乎相似(图10)。与单独处理组相比，在混合物的情况下更加抑制ALDH的活性。
制备例1.制备保健功能性食品组合物
在将猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物(以1:3的重量比混合)分别以100mg/100ml(0.1重量百分比)或15000mg/100mL(15重量百分比)的浓度溶于蒸馏水中的溶液中，添加低聚糖(2重量百分比)、白糖(2重量百分比)以及食盐(0.5重量百分比)并加入水以调整剩余量，然后均匀混合并进行瞬间杀菌以制备保健功能性饮料。
制备例2.制备药物组合物
将1mg的猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物(以1:3的重量比混合)溶于5ml的蒸馏水或生理盐水中并灭菌后制备成注射剂。或者，将其在小瓶中冷冻干燥后制备成粉末制剂。将100mg的猪胎盘水解物、100mg的玉米淀粉、100mg的乳糖、2mg的硬脂酸镁填充到明胶胶囊中以制备胶囊剂。
序列表
<110> 友生物工程株式会社
<120> 包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物的用于保护肝的组合物
<130> PCT2021-009
<141> 2023-12-20
<150> KR 10-2020-0178858
<151> 2020-12-18
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEP-1 (肽-1)
<400> 1
Val Val Val Glu
1
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEP-2 (肽-2)
<400> 2
Asp Gly Leu His Leu Arg
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEP-3 (肽-3)
<400> 3
Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val His
1 5

Claims (7)

1.一种用于保护肝的保健功能性食品组合物，其特征在于，包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
2.一种用于预防或改善由酒精引起的肝损伤、药物中毒或宿醉的保健功能性食品组合物，其特征在于，包含猪胎盘酶水解物和酸水解物的混合物作为有效成分。
3.根据权利要求1所述的用于保护肝的保健功能性食品组合物，其特征在于，上述猪胎盘酶水解物包含由选自由序列1至序列3组成的组中的氨基酸序列组成的一种以上肽。
4.根据权利要求1所述的用于保护肝的保健功能性食品组合物，其特征在于，通过用蛋白质水解酶处理来制备上述猪胎盘酶水解物。
5.根据权利要求1所述的用于保护肝的保健功能性食品组合物，其特征在于，通过用酸处理来制备上述猪胎盘酸水解物。
6.根据权利要求5所述的用于保护肝的保健功能性食品组合物，其特征在于，上述酸为盐酸、硫酸、乙酸或柠檬酸。
7.根据权利要求1所述的用于保护肝的保健功能性食品组合物，其特征在于，以1:0.1～10的重量比混合上述猪胎盘酶水解物和酸水解物。
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