KR100996247B1 - 태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장 질환 개선용조성물 - Google Patents

Abstract

태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장 질환 개선용 조성물이 개시되어 있다.

본 발명의 태반 추출물은 위장 질환의 일 요인인 위산을 억제하고 헬리코박터 파일로리 균의 콜로니 형성을 효과적으로 억제하여 위염, 위궤양과 같은 위장 질환의 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

태반, 위염, 위 궤양

Description

태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장 질환 개선용 조성물 {Composition comprising Placenta extract as an effective component for improving gastrointestinal disease}

본 발명은 태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장 질환 개선용 조성물에 관한 것이다.

위염(gastritis) 및 위궤양(gastric ulcer)은 위산과 펩신의 작용으로 상부 소화관이 손상을 받아 발생한 결손이 위점막근층 이하까지 침범한 상태를 말한다. 이러한 위염 및 위궤양은 세계적으로 발생 빈도가 높은 질환 중의 하나로 미국 성인 인구의 반 이상과 우리나라를 비롯한 많은 개발 도상 국가 성인의 90% 이상이 H. pylori에 감염되어 있다고 알려져 있다 (Scrip, 1993, 1820, 18).

이 질환의 특징은 급성인 경우 궤양 발생 후 정신적, 육체적 안정, 식이요법, 약물요법 등으로 치료될 수 있으나, 일정기간 내에 재발될 확률이 높으므로 완치된다고 할 수 없으며 만성궤양으로 진행되어 위장관의 출혈, 유문부 협착, 천공 등의 합병증을 나타내기도 한다(Jeen,Y.T. 와 Hyun,J.H. 1991). 위염 및 위궤양은 한 가지 원인에 의해 발생하는 것이 아니고 여러 가지 인자들이 복합적으로 작용한다. 1963년 Shay와 Sun (Shay 등,1945)은 위점막 손상은 공격 인자와 방어 인자의 균형이 깨어짐으로써 야기된다고 주장하여 현재까지 이 “Balance theory"가 받아들여지고 있다. 또한 1983년의 Dr. Warren과 Marshall에 의해 Helicobacter pylori(H. pylori)가 분리 동정됨에 따라 위염, 위궤양 및 십이지장궤양의 병태생리에 대한 새로운 사실이 밝혀지게 되었다.

과거의 항궤양제 연구는 주로 공격 인자를 억제하는 약리작용을 중심으로 이루어져 왔으나 위궤양을 염산의 생산과 분비만을 조절하여 치료하였을 경우에는 재발빈도가 높기 때문에 위궤양의 완전한 치료를 위해서는 새로운 약물의 개발이 요구된다. 최근 소화성궤양의 병인성 인자로 Helicobacter pylori라는 그람음성간균이 지목되고 있으며 이 병원성 미생물은 neutrophil을 매개하여 활성 산소 라디칼을 생성하고 이때 강력한 활성을 지닌 hydroxyl radical이 소화관 조직의 점막 세포를 공격하여 막의 과산화지질을 생성하게 함으로써 조직 손상이 야기된다는 사실이 새로이 밝혀졌다.

한편, 태반은 필수 아미노산, 멜라토닌, RNA, DNA 등의 핵산 성분, 항산화 효소인 SOD(Super Oxide Dismutase), 히알루론산(Hyaluronic acid), 항산화제, 면역보조인자(cytokine), 태반펩타이드, 인슐린유사성장촉진인자(insulin-like-growth factor), 표피성장촉진인자(EGF, Epidermal Growth Factors) 및 독특한 노 쇠세포활성인자(SCAF, Senescent Cell Acdivating Factors) 등의 성장인자와 사이토카인 류가 포함되어 있어 피로회복, 면역증강 등에 유용한 것으로 알려져 건강기능식품 원료로 주목받고 있다.

본 발명자 등은 태반 추출물의 유효성분 분석과 함께, 이를 소화기 계통, 특히 위장 질환에 적용시킬 수 알아보기 위하여, in vivo 및 in vitro 시험을 통해 위 기능 개선에 대한 효능을 검증함으로써 태반 추출물의 위장 질환 개선용 용도를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장 질환 개선용 조성물을 제시함으로써 태반 추출물의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 위장 질환 개선용 건강식품 및 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에 따르면,

태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장 질환 개선용 조성물을 제시할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 위장 질환 개선용 약학 조성물을 제시할 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 위장 질환 개선용 건강식품을 제시할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 태반 추출물의 태반 원료로서는 사람, 양, 소, 개, 돼지 등 포유류의 태반이면 크게 제한되지 않지만, 바람직하게는 돼지 태반을 사용할 수 있다. 돼지 태반은 회수가 용이하고 많은 양을 확보할 수 있는 장점이 있을 뿐만 아니라, 포유류의 태반 중에서도 인태반의 분자 구조와 놀라울 정도로 흡사한 것으로 밝혀졌기 때문이다.

본 발명의 태반 추출물을 제조하기 위해서는, 우선 태반을 수거하여야 하는데, 구체적으로 수의사의 검증을 거친 돼지의 정상 태반을 냉동고(-20℃ 이하)에 입고시켜 수거한다. 상기 냉동된 태반을 톱밥 크기(2 내지 5 mm)로 파쇄하여 세척기에 넣고 소금물로 세척한 후 탈수한다. 냉동된 태반을 그대로 사용하지 않고, 해동한 후 세절하여 사용하면 후속 공정에서 오염 문제가 발생할 수 있어 바람직하지 않다.

이어, 상기 세척하여 탈수된 돼지 태반 20 내지 30 중량%에 리파아제 1 내지 5 중량% 및 잔량의 정제수를 넣어 39 내지 45℃에서 5 내지 10시간, 바람직하게는 7 내지 8시간 동안 지질 분해 반응시킨다.

상기 태반 함량 및 리파아제 함량의 범위는 지질분해 효율의 측면에서 바람직한 범위로 선택되었다. 상기 반응 시간과 온도는 지질분해효율 및 단가를 고려하여 바람직한 범위로 선택되었다.

상기 지질 분해 반응 후에는 식물성 유화제를 1 내지 5 중량%, 바람직하게는 2 중량% 첨가하여 1.5 내지 3시간 교반시킨 후 상등액(이하, '상등액 1'이라 칭함) 과 태반 잔사물을 분리한다.

이어 상기 태반 잔사물 30 내지 40 중량%에 단백분해효소 0.5 내지 5 중량% 및 잔량의 물을 첨가하여 28 내지 40℃에서 12 내지 20시간, 바람직하게는 15 내지 17시간 반응시킨다. 상기 단백분해효소는 미생물, 식물 또는 동물에서 유래한 것으로, 크게 제한은 없으나, 파파인이 바람직하다.

상기 태반 잔사물 함량 및 단백분해효소 함량의 범위는 가수분해 효율을 고려하여 바람직한 범위로 선택되었다. 상기 가수분해반응은 12 내지 20 시간, 바람직하게는 15 내지 17시간 반응시키는 것이 좋다. 12시간 미만으로 반응시키는 경우에는 가수분해 반응이 충분히 일어나지 않으며, 20시간 초과하여 반응시키는 경우에는 원하는 가수분해 효율에 필요한 시간 이상이 되어 생산 단가가 높아져 비경제적이다.

상기 반응 온도는 28 내지 40℃가 바람직하며, 30 내지 35℃가 보다 바람직하다. 28℃ 미만으로 반응시키는 경우에는 가수분해 반응이 제대로 일어나지 않을 수 있고, 40℃ 초과하는 경우에는 효소가 불활성화될 수 있다.

상기 가수분해반응 산물을 원심분리하여 상등액(이하, '상등액 2'라 칭함)을 회수하고 상등액 1과 상등액 2를 혼합하여 본 발명의 돼지 태반 추출물을 제조한다.

본 발명의 태반 추출물은, 상등액 1 및 2의 혼합 이후 85 내지 100℃로 가열함으로써 가수분해 반응을 종결시키는 과정을 더 포함할 수 있다. 이 과정은 예를 들어, 95℃에서 30분간 수행될 수 있다.

또한, 활성탄을 첨가하여 교반시킴으로써 냄새를 제거할 수도 있고, 필터를 이용한 여과 과정을 거칠 수도 있으며 식용안정제인 트레할로스를 투입하여 반응물의 안정을 꾀할 수도 있다. 이들 공정들은 선택 또는 조합하여 행하는 것이 가능하다.

여과 과정에서는 0.1 내지 10 ㎛ 필터를 사용하여 1회 이상 여과를 수행하는 것이 바람직하다. 필터의 기공 사이즈가 0.1 ㎛ 미만인 경우에는 필터가 초정밀하여 초고가이므로(한외여과) 경제성이 떨어지는 문제가 있고, 10 ㎛를 초과하는 경우는 최종 산물에 부유물이 생겨 상품성이 현저히 떨어지는 문제가 있다.

상기 여과를 통해 얻어진 본 발명의 태반 추출물은 질소 총량을 재고, 아미노산 분석을 실시하였다. 표 1에 그 결과를 나타내었다.

완제품을 생산하기 위해서는 본 발명의 추출물을 병에 충진하기 위해 용기를 200℃에서 2시간 멸균하고 멸균된 용기에 본 발명의 추출물을 충진한 뒤, 121℃에서 15분간 고압증기멸균을 수행하여 포장할 수 있다.

본 발명의 태반 추출물은 예를 들어,

i) 냉동된 돼지 태반을 2～5 mm 크기로 파쇄하는 단계;

ii) 상기 파쇄된 돼지 태반에 물 및 리파아제를 첨가하여 39 내지 45℃에서 5 내지 10시간 반응시키는 단계;

iii) 단계 ii)의 반응액에 유화제를 첨가한 뒤 교반하여 상등액을 회수하는 단계;

iv) 단계 iii)의 잔사물에 단백분해효소와 물을 첨가하여 28 내지 40℃에서 12 내지 20시간 반응시켜 상등액을 회수하는 단계; 및

v) 단계 iii)과 iv)의 상등액을 혼합하는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명자 등은 이와 같이 제조된 태반 추출물의 위장 질환 개선 효과를 검증하고자 하였다.

위염(gastritis) 및 위궤양(gastric ulcer)은 위산과 펩신의 작용으로 상부 소화관이 손상을 받아 발생한 결손이 위점막근층 이하까지 침범한 상태를 말한다. 과거의 항궤양제 연구는 주로 공격 인자를 억제하는 약리작용을 중심으로 이루어져 왔으나 위궤양을 염산의 생산과 분비만을 조절하여 치료하였을 경우에는 재발빈도가 높기 때문에 위궤양의 완전한 치료를 위해서는 새로운 약물의 개발이 요구된다. 최근 소화성 궤양의 병인성 인자로 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)라는 그람 음성 간균이 지목되고 있다.

본 발명자들은 본 발명의 돼지 태반 추출물을 위염, 위궤양과 같은 위장 질환에 적용시킬 수 있는지 알아보기 위하여 in vitro 상에서 제산력 시험, 헬리코박터 파일로리 균에 대한 콜로니 형성 억제능 시험을 수행하였다.

제산력 시험에서 검체들의 pH 변화는 위염과 같은 상태의 위액을 제조하여 시료를 가하고 처리한 후 측정한 NaOH 소비량으로 결정하였는데, 여기서 본 발명의 돼지 태반 추출물은 50%의 억제력을 갖고 있음을 확인하였다(표 3). 처리 방식의 변화에 따른 시료(실시예 2 내지 4)의 테스트 결과 각각 19.8, 12.5, 21.2%의 제산력이 있음이 확인되었다. 이는 본 발명의 태반 추출물이 위산을 중화시키는 능력을 갖고 있음을 의미한다.

검체 모두에 대해 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 항균실험을 실시한 결과, 50 μg/mL까지는 콜로니의 수가 감소되었고 100 ug/mL의 농도에서는 콜로니의 생성이 완전히 억제된 것을 확인할 수 있었다(표 4).

따라서, 본원 발명의 태반 추출물은 위산을 효과적으로 억제하고, 위 궤양의 일 요인인 헬리코박터 파일로리 균의 콜로니 형성을 효과적으로 억제함으로서 위염이나 위궤양과 같은 위장 질환의 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 상기 태반추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 위장 질환 개선용 약학 조성물을 제시할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 태반 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 태반 추출물에 추가로 다른 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 0.1~10 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1~3㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 태반 추출물을 마우스에 경구 투여시 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성 시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1g/㎏ 이상인 것으로 나타나 안전한 물질로 판명되었다.

본 발명의 조성물은 위장 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 위장 질환 개선용 건강식품을 제시할 수 있다.

본 발명의 조성물은 위장 질환의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있 다. 본 발명의 태반 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 태반 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 추출물이 원료에 대하여 100 중량% 이하, 바람직하게는 50 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물 의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.1~20g, 바람직하게는 약 1~10g 이다.

상기 성분 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.05~50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 태반 추출물은 위산과 헬리코박터 파일로리 균의 형성을 효과적으로 억제하여 위장 질환 개선용 약학 조성물이나 건강식품 등의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다. 여기에 기재 되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예 1:

냉동된 돼지 태반을 파쇄기(일성2축파쇄기 ISM-410, 일성리싸이클링(주))로 톱밥 크기(2～5 mm)로 파쇄하여 세척기에 넣고 소금물로 세척하였다. 상기 세척하여 탈수된 태반 25 중량%에 리파제 2 중량%(Lot# 18525, 2,000 U/mg, Sigma-Aldrich) 및 물 73 중량%을 첨가하여 43℃에서 8시간 반응시켰다.

이어, 식물성 유화제(친환경 녹차유화제인 녹차농축액, 영농조합법인 해록)를 2중량% 첨가하여 2시간 동안 65℃에서 교반시켰다. 이것을 원심분리하여 상등액 1과 태반 잔사물을 분리하고, 상기 태반 잔사물 35 중량%에, 파파인(Lot# 1095981, 30 U/mg, Sigma-Aldich) 3중량% 및 62중량%의 물을 첨가하고 35℃에서 16시간 반응시킨 뒤, 원심분리하여 상등액 2를 분리하였다. 상기 상등액 1과 상등액 2를 혼합하여 95℃에서 30분간 가열하고, 65℃에서 0.4%의 활성탄을 넣어 교반하면서 냄새를 제거한 뒤 1 ㎛ 필터 및 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 순차적으로 여과하였다.

상기 여과를 통해 고형물질이 제거된 조성물은 질소 총량을 재고(최종 질소 총량은 2.06 mg/ml 이었다), 아미노산 분석을 실시하였다(표 1 참조). 질소 총량은 한국식품의약품안정청(KFDA)에서 규정한 태반의 투입량을 말하는 것으로, 이 값이 같으면 최초 태반의 투입량이 같은 것으로 볼 수 있다.

실시예 2:

실시예 1의 추출물을 동결건조한 분말 5g을 증류수 30ml에 녹인 후 30 분간 초음파 추출한 뒤 0.22 ㎛ 필터에 여과하여 상층액을 동결건조하였다.

실시예 3:

실시예 1의 추출물을 동결건조한 분말 5g을 증류수 30ml에 녹인 후 1 시간 초음파 추출한 뒤 0.22 ㎛ 필터에 여과하여 상층액을 동결건조하였다.

실시예 4:

실시예 1의 추출물을 동결건조한 분말 5g을 증류수 30ml에 녹인 후 1.5 시간 초음파 추출한 뒤 0.22 ㎛ 필터에 여과하여 상층액을 동결건조하였다.

시험예 1 : 성분 분석 및 정량시험

1-1: 아미노산 분석

본 발명의 실시예 1의 아미노산 정량은 Waters사의 AccQ-Tag Chemistry Package를 이용하여 수행하였다. 이 방법은 펩타이드와 단백질 가수분해 아미노산을 분석하기 위한 precolumn 유도체화 방법이다.

그 결과를 표 1에 나타내었는데, 이에 따르면, 본 발명의 방법에 의한 태반 추출물은 여러 아미노산을 높은 농도로 함유하는 것을 알 수 있다.

[표 1]

아미노산	리파제 + 단백분해효소추출(실시예 1)
L - Aspartic acid	2.16
L - Serine	0.84
L - Glutamic acid	2.54
Aminoacetic acid	3.86
L - Arginine	1.54
L - Threonine	0.78
L - Alanine	2.04
L - Proline	2.51
L - Valine	1.03
L - Lysine	0.94
L - Leucine	1.21

이하, 1-2 내지 1-5의 시료는 실시예 1의 추출물을 동결건조한 분말 5g을 증류수 30ml에 녹인 후 30분간 초음파 추출한 뒤 0.22 ㎛ 필터에 걸러 동결건조한 것을 사용하였다.

1-2: 우론산 정량 ( Carbazole assay )

우론산은 당의 알데히드기 또는 카르복실기를 가진 당유도체로 인체의 해독에 중요한 역할을 함과 동시에 히아루론산, 코드로이친 황산 등의 점질 다당류의 구성성분으로 중요하다.

D-glucuronic acid lactone을 standard 로 사용하여 carbazole 반응에 의해 530 nm에서 UV spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료는 증류수에 녹여 Cabazole 반응에 의해 530 nm에서 UV spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하고 D-glucuronic acid lactone에 대한 함유량으로 계산하여 함량을 정하였다.

1-3: 글리코사미노글리칸 정량 ( Carbazole assay )

GAG는 결합조직 중 복합 단백질의 대부분을 차지하는 단백당의 구성성분이며, 현재 관절염 치료제의 지표 물질로 관심이 증대되고 있다.

NZP chondroitin sulfate를 standard로 사용하여 carbazole 반응에 의해 530 nm에서 UV spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료는 증류수에 녹여 carbazole 반응에 의해 530 nm에서 UV spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하고 NZP chondroitin sulfate에 대한 함유량으로 계산하여 함량을 정하였다.

1-4: 시알산 정량 ( Warren assay )

시알산은 당단백질이나 당지질의 구성당으로 잘 알려져 있는 아미노당으로 특히 악하선의 뮤신에 많이 함유되어 있으며, 인플루엔자에 의한 혈구 응집작용이 저해되어 면역기능을 돕는 감염방어인자로서 중요한 생리적 의의가 있다.

N-acetylneuraminic acid를 standard로 사용하여 Warren 방법에 의해서 549 nm에서 UV spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료는 80℃에서 1시간 0.1 N 황산으로 가수분해한 후에 Warren 방법에 의해서 549 nm에서 UV spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하고 N-acetylneuraminic acid에 대한 함유량으로 계산하여 함량을 정하였다.

1-5: 효소에 의한 콘드로이친 황산( Chondroitin sulfate )과 히아루론산( Hyaluronic acid )의 분해

콘드로이친 황산은 연골, 혈관벽, 힘줄 등의 결합조직을 구성하는 황산화 뮤코다당류이다. 생체 안에서는 단백질과 결합하여 콜라겐과 함께 세포간 물질의 주 성분을 이룬다. 히아루론산은 생명체를 이루는 기본적인 구성물질로 피부를 만드는 중심물질이다. 특히 피부세포들을 엮어주는 역할을 하고, 피부의 수분을 유지시키는 성분으로서 자기보다 214배 큰 물분자를 끌어들이는 특성을 가지고 있어 피부에 수분이 오랜 시간 지속되게 해 준다.

Proteus vulgaris에서 유래한 Chondroitinase ABC (C2905, Sigma)를 50 mM Tris-HCl 60 mM Sodium acetate buffer (pH 8.0)에 녹여서 1U/ml 되게 하였다. NZP CS를 standard로 사용하여 standard와 sample을 10 mg/ml로 녹여서 buffer와 섞어 enzyme을 30 mU넣어 37℃에서 12시간 반응하여 chondroitin sulfate의 함유량을 분석하였다.

Strepromyces hyalurolyticus에서 유래한 Hyaluronidase (H1136, Sigma) 62 U을 사용하여 Hyaluronic acid를 standard로 사용하여 standard와 sample을 10 mg/ml되게 50 mM Sodium phosphate buffer (pH 7.1) containing 0.15 M NaCl에 녹여 Hyaluronidase 62 U을 넣어 60℃에서 12시간 반응하여 hyaluronic acid의 함유량을 분석하였다.

반응확인은 SAX-HPLC column을 gradient NaCl 0M~2M (pH 3.5)로 AKTA Purifier (Amersham Phaimacia)에 연결하여 유속은 1ml/min로 유지하면서 UV 232 nm에서 검출하였다.

[표 2] 단위 % (w/w)

시료	Sialic acid	GAG	Uronic acid	Chondroitin sulfate	Hyaluronic acid
실시예 1	0.001±0.000	2.109±0.896	0.053±0.04	1.16	2.82

시료의 성분에 대해 분석한 결과 표 2와 같은 결과를 얻었다. 각각은 standard를 100%로 보고, 시료에 함유되어 있는 양을 %로 수치화 하였다. 측정은 콘드로이친 황산과 히아루론산을 제외하고, 모두 3번씩 측정하여 평균값을 구하고 STDEV를 계산하였다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 돼지 태반 추출물에는 시알산, 글리코사미노클리칸, 우론산, 콘드로이친 황산 또는 히아루론산 등 인체 내 유용한 여러 생리활성물질의 함량이 높은 것을 알 수 있다.

시험예 2 : 랫트에 대한 경구투여 급성 독성 실험

본 발명의 추출물이 급성 독성을 갖는지 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 8마리씩의 동물에 본 발명의 실시예 2의 조성물을 1g/㎏/10㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화 등을 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강 장기의 이상 여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상 증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부견소견 등에서도 독성변화는 관 찰되지 않았다. 이상의 결과 본 발명의 조성물은 랫트에서 1g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 적어도 1g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

시험예 3: 제산력 (산 중화 능력) 시험

제산력 시험법은 위산과 반응하여 제산작용을 나타내는 제제의 제산력을 구하는 시험법으로, 대한약전에 명시된 제산력 시험법을 변경하여 0.1 N 염산에 검체(본 발명의 실시예 2 내지 4) 1 mg 취하여 혼합 후 37 ℃의 shaking incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.1 N 수산화나트륨 수용액으로 적정하였다. 지시약으로 메틸오렌지, 양성대조약물로 hydrotalcite를 사용하였다(대한약전 제8개정, 2003). 그 결과를 표 3에 나타낸다. 음성대조군은 위액 조건 즉, 0.1N 염산에 0.1N NaOH로 적정한 것이다. 처리 방식의 변화에 따른 시료(실시예 2 내지 4)의 테스트 결과 각각 19.8, 12.5, 21.2%의 제산력이 있음이 확인되었다. 이는 본 발명의 태반 추출물이 위산을 중화시키는 능력을 갖고 있음을 의미한다.

[표 3]

시료	NaOH 소비량(volume)	억제(%)
음성 대조군	122.67±2.52	-
실시예 2	98.33±6.11	19.8
실시예 3	107.33±6.43	12.5
실시예 4	96.67±2.31	21.2
hydrotalcite	104.67± 2.53	14.7

시험예 4: 헬리코박터 파일로리균에 대한 콜로니 형성 억제능 시험

검체 시료 모두에 대해 10, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 H. pyroli의 콜로니 형성 억제능을 테스트한 결과(표 3), 50 ㎍/mL까지는 colony의 수가 감소되었고, 100 ㎍/mL의 농도에서는 colony의 생성이 완전히 억제되었다(도 1a 참조). 음성대조군은 H. pyroli에 검체 시료를 처리하지 않은 배지이다. 도 1a 내지 도 1e는 콜로니의 형성 정도를 나타낸 것으로서 순서대로 표 4의 -, +, ++, +++, ++++에 상당한다.

본 발명의 태반 추출물은 H. pyroli의 증식을 강력하게 억제함으로써 H. pyroli의 위궤양 및 위암 기전인 carcinogen에 대한 저항성 저하, mucosal hyperproliferation 유발, carcinogenic N-nitroso compound의 증가 등을 완화하고 2차적인 감염의 증상들을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 생각된다.

[표 4]

시료	dose(ug/ml)	콜로니 형성 정도
음성 대조군	-	++++
실시예 2	10	++++
	50	++
	100	-
실시예 3	10	++++
	50	++
	100	-
실시예 4	10	++++
	50	++
	100	-

이상 첨부된 표를 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 발명이 속 하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

도 1a 내지 도 1e는 본 발명의 태반 추출물이 그 농도에 따라 헬리코박터 파일로리균의 콜로니 형성 정도를 억제한 결과를 나타내는 사진으로서, 순서대로 표 4의 -, +, ++, +++, ++++에 해당하는 사진이다.

Claims (5)

1. 태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 파이롤리 억제제.
2. 제1항에 있어서, 상기 태반 추출물은 돼지의 태반으로부터 추출된 것인, 헬리코박터 파이롤리 억제제.
3. 제 1항의 태반 추출물은

   i) 냉동된 돼지 태반을 2～5 mm 크기로 파쇄하는 단계;

   ii) 상기 파쇄된 돼지 태반에 물 및 리파아제를 첨가하여 39 내지 45℃에서 5 내지 10시간 반응시키는 단계;

   iii) 단계 ii)의 반응액에 유화제를 첨가한 뒤 교반하여 상등액을 회수하는 단계;

   iv) 단계 iii)의 잔사물에 단백분해효소와 물을 첨가하여 28 내지 40℃에서 12 내지 20시간 반응시켜 상등액을 회수하는 단계; 및

   v) 단계 iii)과 iv)의 상등액을 혼합하는 단계;

   를 포함하는 제조방법에 의하여 제조되는, 헬리코박터 파이롤리 억제제.
4. 제1항의 헬리코박터 파이롤리 억제제를 포함하는, 위염, 위궤양 또는 십이지장 궤양 예방 및 치료용 약학 조성물.
5. 제1항의 헬리코박터 파이롤리 억제제를 포함하는, 위염, 위궤양 또는 십이지장 궤양의 예방 및 개선에 도움이 되는 건강식품.

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