KR20090113526A

KR20090113526A - 고구밸리 감자에서 추출된 단백질 추출물 또는 펩타이드를함유하는 항암용 약학조성물

Info

Publication number: KR20090113526A
Application number: KR1020080039285A
Authority: KR
Inventors: 임학태; 김윤수; 우천석; 황원남; 이우종; 박윤경; 함경수; 김진영
Original assignee: (주)포테이토밸리; 조선대학교산학협력단; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2008-04-28
Publication date: 2009-11-02
Also published as: KR100963094B1

Abstract

본 발명은 신품종 감자인 고구밸리 감자에서 추출된 단백질 추출물 또는 이로부터 분리된 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 고구밸리 감자의 단백질 추출물 또는 펩타이드는 사람의 피부암 및 위암세포의 억제 활성이 뛰어나며, 또한 독성면에서 매우 안전하여 항암용 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

고구밸리, 감자, 펩타이드, 단백질, 항암활성

Description

고구밸리 감자에서 추출된 단백질 추출물 또는 펩타이드를 함유하는 항암용 약학조성물{Pharmaceutical composition for the anticancer comprising the extracted protein or peptide from Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley}

본 발명은 감자의 신품종인 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv. Gogu valley)에서 추출된 단백질 추출물 또는 이로부터 분리된 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학조성물에 관한 것이다.

우리나라는 1982년 이후 뚜렷한 선진국형 질병구조를 보이고 있다. 특히 심각한 대기 오염, 농약, 흡연, 화학제품, 잘못된 식생활(유해 식품 첨가물, 기름에 튀긴 인스턴트 식품, 과도한 지방질 음식의 섭취), 쫓기는 시간 속의 스트레스 등 수많은 발암원인에 노출되어 있다. 이러한 여러 가지 요인으로 인한 암은 단일질병으로는 가장 많은 사망원인으로 사회적인 문제점으로 등장하고 있다.

각종 유해 물질이 체내에 축적되면 이것이 결국 혈액을 오염시키게 된다. 음식물의 소화작용과 대사과정에서 발생되는 유해산소(활성산소)의 생성으로 인해 세 포의 변위가 발생하는데 이렇게 하여 발생된 손상된 세포의 덩어리가 암이다. 암은 제멋대로 자라고 정상조직을 파괴하는, 백해무익의 이상 조직으로서, 악성종양이라 부른다.

종양에는 양성과 악성의 2가지 종류가 있는데, 양성종양은 계속 자랄 뿐, 생명에는 크게 지장이 없으며, 수술만 하면 재발없이 치유된다. 그러나 악성 종양인 암은 신체의 어느 조직에서나 발생할 수 있으며, 암세포는 일반적으로 인접한 조직에 침투하여 파괴하고, 점점 순환계를 침범하여 암 발생부위로부터 멀리 떨어진 신체의 다른 부위로 전이되어 결국 숙주(예를 들면 사람)를 죽게 한다.

암은 우선 크게 고형 종양과 혈액암으로 나뉜다. 백혈병과 임파종 등의 혈구세포에 생긴 암을 혈액암이라 하며, 전체 암의 약 5%를 차지한다. 나머지는 장기나 피부에 발생한 고형암이다. 후자는 다시 장기에 따라 분류한다. 예컨대 위암, 간암의 식으로 부르는 것이 그것이다. 발생한 조직에 따라서도 분류한다. 고형 암중 가장 많은 것이 상피(장관이나 기도, 요로를 덮고 있는 세포)조직에서 발생한 상피암이다. 선(샘) 상피에서 발생하면 선암이라고 한다. 일부는 근육이나 뼈 등에서 발생하며, 이를 육종이라 한다. 예컨대 위의 선상피에 암이 발생했을 때 위 선암이라 하며, 위의 근육부위에 암이 발생했을 때 위 육종이라고 한다.

암을 현미경으로 본 형태에 따라 모양이 양순해 보이면 분화도가 좋은, 혹은 분화도가 낮은(분화도 1) 암이라 하며, 예후가 좋다. 정반대로 위험해 보이면 분화도가 나쁜, 혹은 높은(분화도 3) 암이라고 하며, 예후가 나쁘다. 분화도가 2인 중간 형이 가장 많다. 조기 발견된 암은 대부분 분화도가 좋은 암들이다.

암은 단계별로 발생하며 시간 경과에 따라 더 악성으로 진행이 된다. 발병 단계에 따라 암을 분류할 수 있으며, 이를 발전시킨 개념이 병기(stage)이다. 암이 되기 전의 단계를 전암병변이라 한다. 전암병변 중 일부는 형태가 완전한 암과 똑 같으나 상피 내에만 머물러 있으며, 이를 상피내암, 혹은 0기 암이라고 한다.

암중 가장 초기 암은 1기암으로서 침윤 정도가 경미하며, 2기암은 발생한 장기 내에 머물러 있으나 정상 조직을 뚜렷하게 침범한 경우이고, 3기암은 발생한 장기를 거의 관통하거나 주변 장기를 침범한 경우이고, 4기암은 임파선이나 원위 장기로 전이된 경우이다.

암의 치료법에는 크게 국소 치료법과 전신 치료법이 있으며, 선택은 암의 병기와 환자의 전신 상태, 환자의 소망과 치료하는 의사의 판단에 따라 치료법이 결정된다. 국소 치료법은 원발 암을 절제 내지 파괴하는 치료이며, 병기가 낮은 암, 특히 1-2기암일 때에 뚜렷한 가치가 있다. 여기에는 피부 절개하에 암을 그 암덩어리가 있는 장기와 주변 임파선까지 포함해서 함께 절제하는 소위 근치적 절제술이 가장 많이 시술된다. 한편 최근에는 내시경이나 레이저, 동결장비 등의 기구를 이 용하여 암만 절제하고, 장기는 살리는 소위 보존적 수술요법도 최근에는 유행하고 있다. 국소암의 절제술 후 미세 전이암이 발견되거나, 분화도가 나쁠 때에는 다음의 전신 치료법이 추가된다. 전신 치료법은 전신으로 퍼진 전이 암을 치료하는 것이며, 4기나 3기암에서 선택된다. 여기에는 항암 화학요법과 면역요법, 유전자요법, 세포요법 등이 포함된다.

가장 널리 시도되어 온 것이 항암 화학요법으로, 이는 정상세포와 암세포 간의 약에 대한 감수성의 차를 이용하여 정상세포에 대한 독성은 비교적 적고, 암세포에 대해서는 보다 선택적으로 작용하지만, 정상세포도 어느 정도의 손상을 받기 때문에 부작용이 나타나게 된다. 항암제는 분열이 빠른 세포에는 어디라도 작용하는 성질이 있기 때문에 빨리 분열하는 암세포에만 작용하는 것이 아니라 정상세포인 골수ㆍ위장관ㆍ모근세포도 역시 분열이 빠르므로 항암제의 영향을 받게 된다.

따라서 이런 항암제의 공통된 부작용으로 일시적인 혈구 감소, 구역질, 구토, 설사, 식욕감퇴 및 탈모 등이 나타나게 된다. 그리고 다른 문제점은 암이 흔히 항암 화학제에 내성을 보인다는 것이다. 오늘날 항암제로 치유 가능한 암은 혈액암과 일부 소아암, 고환암 밖에 없으며, 나머지 폐암이나 위암, 간암 등 대다수의 성인 고형암은 약 3분의 1에서 암용적이 줄어들고 생존이 다소 연장되는 효과밖에 없어 발암물질의 생성을 억제 할 수 있는 의약 및 건강기능식품의 개발이 요구되어 왔다.

감자는 남미 안데스지방이 원산지로서 구황작물로 유용한 작물이다. 감자는 생육기간이 짧고 단위 면적 당 생산량이 비교적 높고 환경적응성도 비교적 강하기 때문에 세계 130여개 나라에서 재배되고 있는 벼, 밀가루, 옥수수 다음으로 가는 세계 4대 식량작물 중의 하나이다. 감자는 일부 국가에서는 주식으로서도 중요할 뿐 만 아니라, 쌀과 보리 같은 다른 작물에 비해 저 칼로리면서 비타민 C, B₁, B₂, 니아신 등의 영양소가 거의 채소에 가깝기 때문에 다양한 가공제품을 만드는데 이용하기 위하여 감자의 일반적인 영양학적인 분석과, 항산화활성과 같은 생리활성에 대한 연구들이 많이 되어 있으며, 음식문화가 서구화됨에 따라서 감자의 소비는 더 한층 증가하는 추세에 있다. 이러한 소비 증가에 따라서 좀더 건강지향적인 감자 품종의 개발이 필요하게 되었다.

최근의 국제농업환경의 변화로 식량전쟁 또는 종자전쟁에 대한 압박이 더욱더 가해지고 있으며, 식량이 미래의 무기가 될 것이기 때문에 각국은 식량작물과 관련된 품종권 보호에 총력을 기울이고 있는 상황이다. 한국 또한 2002년에 국제식물신품종 보호연맹인 UPOV 에 가입하였고, 품종보호기간도 국가별로 약간씩 다르지만 최소 18년에서 35년에 걸친 품종보호 제도가 법제화 되었다.

이러한 상황에서 본 발명자들은 다양한 기능성 감자 신품종 개발하여 국가 품종으로 등록(국립종자관리원, 신품종 15종 및 출원 4 품종)하고 외국 감자 품종들(수미/미국품종 Superior, 대지/일본품종 大地, 대서/미국품종 Atlantic)을 대체하고 있을 뿐만 아니라, 미국, 캐나다, 프랑스, 러시아, 몽골, 중국, 카자스탄, 인도 등지에서 시험재배를 진행시키고 있다.

감자는 민간에서 많은 종류의 질환에 유용하게 사용되고 있는 것으로 전해진다. 본 발명자들은 감자를 개량하여 신품종 감자를 개발한 바 있으며, 본 발명자들에 의하여 개발된 신품종 감자는 각각의 신품종마다 그 효능을 달리하고 있다. 즉, 본 발명자들에 의하여 개발된 감자 신품종 중에서 대한민국 등록특허공보 제628417호에 신품종 밸리감자(보라밸리, 쥬스밸리, 다솜밸리, 고구밸리)가 인체 장기능 강화에 효능이 있음이 공지되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제654231호에는 고구밸리 품종의 감자(Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley)에서 분리된 펩타이드가 항균작용이 탁월한 것이 공지되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제654232호에는 골든밸리 품종의 감자(Solanum tuberosum L cv. Golden Valley)에서 분리된 펩타이드가 항균작용이 우수한 것이 공지되어 있다. 또한 대한민국 등록특허공보 제583192호에는 보라밸리 품종의 감자(Solanum tuberosum L., cv Bora valley) 추출물의 항산화제가 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제709238호에는 보라색 감자(Solanum tuberosum L., cv Bora valley)의 에탄올 추출물이 비만세포가 분화되는 것을 차단하고 비만세포로 분화하는 렙틴(leptin) 단백질을 감소시킴으로써 비만억제 작용을 갖는다는 것이 공지되어 있다.

한편, 대한민국 공개특허공보 제2001-29185호에는 감자가 고혈압, 심장병, 변비증, 간염 및 기타 미생물을 억제하여 항박테리아 작용, 항암작용이 있음을 기재하고 있으나, 그 효능에 대하여는 전혀 알 수 없다.

본 발명자들에 의해 개발된 신품종 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv Gogu valley)는 국립종자관리원에 품종보호출원(출원번호:2002-13)해서 2004년에 국가품종으로 등록(등록번호: 1097)된 붉은색 표피의 감자 신품종으로서, 일반 감자보다 생으로 먹기 편리하고, 저장성이 뛰어나서 오랫동안 두어도 썩지 않는 특징을 가진다.

본 발명자들은 상기 신품종 감자인 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv Gogu valley)의 용도를 연구하던 중에 대한민국 공개특허공보 제2001-29185호에 감자가 항암작용을 갖는다는 기재와는 달리 일반 감자는 유의성이 있는 항암작용을 거의 나타내지 않으나, 고구밸리 감자에서 추출된 단백질 추출물 또는 이로부터 분리된 펩타이드는 암세포의 증식을 억제하는 작용이 매우 커서 항암용 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신품종인 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv Gogu valley)에서 추출된 단백질 추출물 또는 이로부터 분리된 펩타이드의 신규한 의약적 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley)에서 추출된 단백질 추출물 또는 이로부터 분리된 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에서 암세포 억제 활성 기능을 갖는 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley) 추출물은 고구밸리 감자에 단백질 추출 버퍼(buffer)를 첨가하여 추출한 고구밸리 감자의 단백질 추출물을 함유하는 것을 의미한다. 상기 고구밸리 감자 추출물은 고구밸리 감자에 단백질 추출 버퍼(buffer)로 추출함으로서 제조되는 것으로서 동결건조하여 분말 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley)의 괴경을 액체질소를 이용하여 분말로 분쇄하는 단계, 상기 분말을 10 mM 트리스-염산, 1.5 M 리튬 클로라이드(10mM Tris-HCl, 1.5 M LiCl pH7.2)의 완충용액으로 고 구밸리 감자의 단백질을 추출하는 단계, 상기 추출물을 원심분리하여 추출물의 상층액 분획을 회수하는 단계, 상기 분획을 크로마토그래피 및 투석을 이용하여 분리 및 정제하는 단계로 이루어진 제조방법에 의해 펩타이드를 제조할 수 있다.

구체적으로는 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley)에 단백질 추출 버퍼(buffer)를 첨가하여 단백질들을 추출한 후 이온-교환 크로마토그래피, 분자량 10,000 이하로 절단하여 분자량 10,000 이하의 시료(도 2의 3번 레인)를 얻고 이를 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 실시하여 아세토나이트릴(acetonitrile) 농도 20-25%의 분획(도 3)을 얻고, 다시 한번 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 실시하여 서열번호 1로 표시되는 펩타이드인 5번 피크(peak)(여기서는 이를 '피티-파이브(PT-5)'라 한다)와 서열번호 2로 표시되는 펩타이드인 6번 피크(peak)(여기서는 이를 '피티-식스(PT-6)'라 한다)를 수득한다.

따라서 본 발명에서 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley)에서 분리된 펩타이드는 분자량 10,000 이하의 펩타이드 또는 이로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 펩타이드와 서열번호 2로 표시되는 펩타이드를 의미한다.

상기 서열번호 1로 표시되는 펩타이드는 펩타이드 서열의 유사성을 검색한 결과 솔라니움 라이코퍼시콤(토마토의 엽산 스트레스 숙성 단백질), 솔라니움 튜버로솜 (과일-숙성 단백질)그리고 솔라니움 치스마니애(물 결핍 스트레스 단백질)과 상동성을 보였으며, 서열번호 2로 표시되는 펩타이드는 쿠니츠-유형 단백질 효소 억제제(kunitz-type protease inhibitor)또는 세린 단백질 억제제(serine protease inhibitor)의 씨-말단(c-terminal)부분과 상동성을 보였다.

본 발명의 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley) 단백질 추출물 및 펩타이드는 사람의 피부암 세포주인 지-361(G-361) 및 사람 위암세포인 에이지에스(AGS)에 대하여 높은 항암활성을 나타낸다.

본 발명은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직한 투여 경로는 경구투여이다. 또한, 제제화 할 경우에는 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 미결정셀룰로스, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 콜로이드성이산화규소, 규산칼슘, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있으며, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 또한, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 연고제, 외용액제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

더불어, 본 발명에 따른 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley)의 단백질 추출물 또는 펩타이드의 투여량과 복용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 성인 기준으로 단백질 추출물의 경우 1mg ~ 500mg/kg으로 투여될 수 있으며, 펩타이드는 0.001 ~ 100mg/kg을 1일 1회 내지 수회에 나누어 복용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L. cv. Gogu valley)의 펩타이드는 세포독성 시험 결과 무독한 것으로 밝혀졌다. 이러한 안전성 실험을 통하여 본 발명에 따른 고구밸리 감자의 단백질 추출물 또는 이로부터 분리된 펩타이드는 인체에 악영향을 미치지 않을 것으로 판단된다.

본 발명에 따른 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv Gogu valley)의 단백질 추출물 또는 이로부터 분리된 펩타이드는 사람의 피부암 및 위암세포의 억제 활성이 뛰어나며, 또한 독성면에서 매우 안전하여 항암용 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하에서는 본 발명의 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명에 의한 고구밸리 감자 단백질 추출

공지의 방법(Ana Segura et al, Mol Plant Micro Interact., 12(1): 16-23, 1999)을 응용하여 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv. Gogu valley)의 괴경 20 Kg을 액체질소가 첨가된 상태에서 막자사발을 이용하여 분말로 분쇄한 후, 10 mM 트리스-염산, 1.5 M 리튬 클로라이드(10mM Tris-HCl, 1.5 M LiCl pH7.2)의 단백질 추출 완충용액에 첨가하여 고구밸리 감자의 단백질을 추출하였다. 상기 추출액을 원심분리기(12,000rpm)에서 30분 동안 원심분리 후 상층액을 모아 투석막(분자량 1,000)을 사용하여 25 mM 트리스-염산, 10 mM 소듐 클로라이드, 1 mM 이디티에이(25mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7.50) 완충용액으로 4℃에서 투석을 시행하여 고구밸리 감자의 단백질을 추출 분리하였다.

<실시예 2> 본 발명에 의한 고구밸리 감자 단백질로부터 펩타이드 분리

1. 고구밸리 감자의 단백질 추출

상기 실시예 1과 동일한 방법에 의해 고구밸리 감자로부터 단백질을 추출하였다.

2. 분자량 10,000 이하 펩타이드 분리

가) 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatograhy)

투석에 의해 상기 25 mM 트리스-염산, 10 mM 소듐 클로라이드, 1 mM 이디티에이(25mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7.50) 완충용액으로 평형화된 총 단백질을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 수행하였다. 디이에이이(DEAE) 수지를 사용하여 수지에 결합하지 않는 단백질 부분만을 선택적으로 모은 후, 투석막(분자량 1,000)을 사용하여 20mM 암모니움 아세테이트(20mM ammonium acetate pH 6.0) 완충용액으로 4℃에서 2차 투석을 시행하였다.

나) 분자량 10,000 이하로 절단

이온 교환 수지 크로마토그래피와 투석을 거쳐 추출된 총 단백질 중 분자량 10,000의 크기를 가진 센트리콘(centricon)을 사용하여 분자량 10,000 이상의 펩타이드와 분자량 10,000 이하의 펩타이드로 절단(cutting)하였다.

다) 전기영동에 의한 단백질 분리 확인

단백질의 분리를 확인하기 위해 트라이신 에스디에스 페이지(Tricine SDS-PAGE)를 수행하였다. 시료와 표준 단백질을 16.5% 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)에 주입하였다. 전기영동 후 젤을 코마지 브라이언트 블루지-250(coomassie brilliant blue G-250)으로 염색하였고, 10% 초산(acetic acid)으로 탈색하여 단백질의 밴드를 확인하였다. 분자량 표준 단백질로는 초저분자량 범위인 삼탄당인산염 이성화효소(26.6kDa,Triosephosphate isomerase), 미오글로빈(17kDa, Myoglobin), 알파 락트 알부민(14.2 kDa, α-Lactalbumin) 아프로티닌 6.5kDa Aprotinin), 인슐린 체인 비(3.5kDa, Insulin chain B), 브라디키닌(1kDa, Bradykinin)을 이용하여 단백질의 분자량을 확인하고 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 고구밸리 감자로 단백질 추출을 한 후 이온-교환 크로마토그래피, 분자량 10,000 이하로 절단 한 결과 분자량이 작은 펩타이드들이 농축되는 것을 확인할 수 있었다.

라) 역상 크로마토그래피(RP-HPLC) 정제

상기 분자량 10,000 이하로 분리된 펩타이드를 18개의 탄소로 이루어진 역상 컬럼 (Vydac, 4.6×250 mm)을 사용하여 역상 크로마토그래피 장치에 의해 정제하여 역상 고속 크로마토 그래피(도 2)를 실시하고 이에 얻은 분획들을 전기영동하였다 (도 3).

정제된 펩타이드를 0.1% TFA가 포함된 아세토나이트릴(actronitrile) 완충액의 농도 증가(10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-60%)에 의해 각 구획의 펩타이드들을 용출하여 아세토나이트릴(actronitrile) 완충액의 농도 증가(10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-60%)별 펩타이드를 수득하였다.

<실시예 3> 항암 활성이 높은 펩타이드 분리 및 아미노산의 서열 결정

1) 펩타이드의 분리

상기 실시예 2에서 항암 활성이 가장 높은 20-25%의 아세토나이트릴(acetonitrile)농도 분획을 다시 한번 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 실시하여 1번부터 11번까지 각 피크(peak)의 펩타이드를 분리하였다.

도 5는 20~30%의 아세토나이트릴(acetonitrile)기울기의 프로그램으로 샘플을 주입하여 얻어진 피크의 프로파일이며, 도 6은 전기영동 사진이다.

2) 아미노산 서열의 결정

피티-파이브(PT-5)와 피티-식스(PT-6)로 명명한 분획 5번과 6번의 아미노산 서열을 분석하기 위하여 에드만 데그레데이션(edman degration)방법을 행하여 피티-파이브(PT-5)에서 약 7 kDa의 분자량을 갖는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드 분 획과 피티-식스(PT-6)에서 약 5 kDa의 분자량을 갖는 서열번호 2로 표시되는 펩타이드 분획을 얻었다.

염기 상태에서 단백질의 엔(N)-말단 아미노 그룹에 피아이티씨(PITC)가 결합하여 피티씨(PTC)-폴리펩타이드가 형성된다. 엔(N)-말단 피티씨(PTC)-잔기의 펩타이드 결합을 산 가수분해하여 절단한다. 그 결과 엔 마이너스일 (n-1)펩타이드와 에이티제트(ATZ)-아미노산이 형성된다. 불안정한 아미노산인 에이티제트(ATZ)-아미노산을 보다 안정한 형태인 피티에이치(PTH)-아미노산으로 바꾸어준다. 최종산물인 피티에이치 (PTH)-아미노산을 에이치피엘씨(HPLC)를 이용하여 분석한다. 그 결과 피티-파이브(PT-5)는 솔라니움 라이코퍼시콤(토마토의 엽산 스트레스 숙성 단백질), 솔라니움 튜버로솜 (과일-숙성 단백질)그리고 솔라니움 치스마니애(물 결핍 스트레스 단백질)과 상동성을 보였다. 그리고 피티-식스(PT-6)는 쿠니츠-유형 단백질 효소 억제제(kunitz-type protease inhibitor)또는 세린 단백질 억제제(serine protease inhibitor)의 씨-말단(c-terminal)부분과 상동성을 보였다.

<비교예 1> 일반감자 단백질 추출물의 제조

실시예 1과 동일한 방법으로 일반감자로부터 단백질을 추출하여, 냉동 감압 건조하여 건조분말을 얻었다.

<실험예 1> 고구밸리 감자에서 추출된 단백질의 함암 활성 측정 1

가. 실험재료 및 실험 세포주

실험재료로는 상기 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 감자의 단백질 추출물을 사용하였고, 실험 세포주는 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 일정한 조건(온도:37℃, 이산화탄소:5%)하에서 충분하게 자란 사람 피부암 세포인 지-361(G-361)과 사람 위암세포인 에이지에스(AGS)를 준비하였다.

나. 실험방법

세포주를 96-웰 플레이트 (96 well plate) 각 웰당 2 X 10³가 되도록 희석하여 암세포를 포함한 메디아 알피엠아이-1641(RPMI-1640) 100 마이크로리터를 플레이트에 분주한 후 37℃ 배양기에서 세포주가 부착할때까지 배양하였다. 세포주가 부착이 된 후 실시예 1, 실시예 2에서 얻어진 아세토나이트릴(actronitrile) 완충액의 농도 증가(10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-60%)에 의해 용출한 후 각 구획의 펩타이드 및 비교예 1에서 제조된 감자의 단백질 추출물을 각 웰당 100 마이크로 그람씩 넣고, 37℃ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 그리고 각각의 웰에 50 마이크로 그람의 3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸리움 부로마이드(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)용액을 넣고 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 각 웰의 흡광도를 엘라이자 리더 (ELISA reader)를 이용하여 570 나오미터(nm)에서 그 발색정도를 측정하고 표 1 및 표 2에 나타내었다.

다. 실험결과

사람의 피부암 세포주인 지-361(G-361)과 사람 위암세포인 에이지에스(AGS) 두 세포주가 본 발명에 의한 실시예 1에서 제조된 고구밸리 감자로부터 얻은 단백질 추출물 및 실시예 2에서 얻어진 펩타이드에 의해 억제됨을 확인하였다.

상기 표 1 및 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 1은 사람의 피부암 및 위암세포에 대하여 억제 효과를 나타내어 항암 활성을 가짐을 알 수 있으나, 일반 감자인 비교예 1은 민간요법으로 구전되어 오고 있는 항암 효과와는 달리 거의 효과를 나타내지 못함을 알 수 있다.

그러므로 신품종인 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv. Gogu valley)에서 추출된 단백질 추출물은 일반 감자와는 달리 항암 활성에 매우 효과가 뛰어난 것임을 확인 할 수 있다.

<실험예 2> 고구밸리 감자에서 추출된 단백질의 함암 활성 측정 2

실시예 2에서 얻어진 20-25%의 아세토나이트릴(acetonitrile)농도 분획을 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 통하여 얻은 각 피크를 실험예 1과 같은 방법으로 위암세포인 에이지에스(AGS)세포주에서 활성 측정을 하여 도 7에 나타내었다.

도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 약 7 kDa의 분자량을 갖는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드 분획(5번)과 약 5 kDa의 분자량을 갖는 서열번호 2로 표시되는 펩타이드 분획(6번)에서 높은 항암 활성을 보였다.

< 실험예 3> 세포독성 측정

가. 실험재료 및 실험 세포주

상기 실시예 2에서 제조된 역상 고속 액체 크로마토그래피를 실시한 후 얻은 분획을 실험재료를 사용하였고, 실험 세포주는 일정한 조건(온도 : 37℃, 이산화탄소 : 5%)하에서 충분하게 자란 사람의 정상 각질형성 세포주(HaCaT)를 준비하였다.

나. 실험방법

세포수를 96-웰 플레이트 각 웰당 2 X 103가 되도록 희석하여 정상세포를 포함한 메디아 디엠이엠(DMEM) 100 마이크로리터를 플레이트에 분주한 후 37℃ 배양기에서 세포주가 부착할 때까지 배양하였다. 세포주가 부착이 된 후 정제한 펩타이드 용액을 각 웰당 100 마이크로 그람씩 넣고, 37℃ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 그리고 각각의 웰에 50 마이크로 그람의 엠티티(MTT, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)용액을 넣고 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 각 웰의 흡광도를 엘라이자 리더(ELISA reader)를 이용하여 570 나노미터(nm)에서 그 발색정도를 측정하여 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 알 수 있는바와 같이, 본 발명에 의한 고구밸리 감자의 단백질 추출물 또는 이로부터 분리되는 펩타이드는 사람의 정상세포에는 독성을 보이지 않아 이러한 인체에 악영향을 미치지 않을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명에 의한 고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv. Gogu valley)의 실물 사진을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 의한 고구밸리 감자의 단백질 추출물 중 분자량이 작은 펩타이드만을 분리하기 위한 각 단계의 트라이신 전기영동 사진이다.

1번 레인 : 고구밸리 감자로부터 추출한 총 단백질

2번 레인 : 이온-교환 크로마토그래피를 통해 얻어진 시료

3번 레인 : 분자량 10,000 이하로 절단한 후의 펩타이드를 나타낸다.

도 3은 본 발명에 의한 고구밸리 감자의 단백질 추출물 중 최종적으로 얻어진 분자량이 작은 펩타이드를 가지고 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 실시한 결과를 나타낸 사진이다.

(a) : 아세토나이트릴의 10-15% 농도,

(b) : 아세토나이트릴의 15-20% 농도,

(c) : 아세토나이트릴의 20-25% 농도,

(d) : 아세토나이트릴의 25-30% 농도,

(e) : 아세토나이트릴의 30-60% 농도를 나타낸다.

도 4는 본 발명에 의한 고구밸리 감자에서 추출한 단백질 및 펩타이드를 가 지고 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 시행하여 얻어진 각 구획을 전기영동 한 사진이다. 아세토나이트릴(acetonitrile)의 농도에 따라 1번 10-15%, 2번 15-20%, 3번 20-25%, 4번 25-30%, 5번 30-60%를 나타낸다.

도 5는 아세토나이트릴(acetonitrile)농도 20-25%의 구획을 다시 한번 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 실시하여 얻어진 프로파일(profile)이다.

도 6은 아세토나이트릴(acetonitrile)농도 20-25%의 구획을 다시 한번 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 실시하여 얻어진 각 피크(peak)1번부터 11번을 전기영동한 사진이다.

도 7은 아세토나이트릴(acetonitrile)농도 20-25%의 구획을 다시 한번 역상 초고속 액체 크로마토그래피를 실시하여 얻어진 각 피크(peak)로 위암 세포에 대한 항암 활성을 측정한 결과 그래프이다.

도 8는 아세토나이트릴(acetonitrlie)농도 20-25%를 역상 초고속 액체 크로마토그래피에 주입하여 얻어진 피크(peak)중 5번의 즉 피티-파이브(PT-5)의 아미노산 서열 분석 결과이다.

도 9는 아세토나이트릴(acetonitrlie)농도 20-25%를 역상 초고속 액체 크로 마토그래피에 주입하여 얻어진 피크(peak)중 6번의 즉 피티-파이브(PT-6)의 아미노산 서열 분석 결과이다.

<110> Potato Valley Inc. KNU-Industry Cooperation Foundation Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Pharmaceutical composition for the anticancer comprising the extracted protein or peptide from Solanum tuberosum L cv. Gogu Valley <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <400> 1 Thr Val Ala Ala Gly Ala Tyr Ala Leu His 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <400> 2 Ser Asp Asp Gln Phe Cys Leu Lys Val Gly 1 5 10

Claims

고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv. Gogu valley)에서 추출된 단백질 추출물을 함유하는 항암용 약학조성물.
제 1 항에 있어서, 암은 피부암 또는 위암인 항암용 약학조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 액제, 정제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 시럽제, 연고제 또는 주사제 중에서 선택되는 제형에 의해 제제화 됨을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
고구밸리 감자(Solanum tuberosum L., cv. Gogu valley)의 단백질 추출물에서 분리된 분자량 10,000 이하를 갖는 펩타이드를 함유하는 항암용 약학조성물.
제 4 항에 있어서, 분자량 10,000 이하를 갖는 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토나이트릴(actronitrile) 완충액의 20-25% 농도 증가에 의해 용출된 구획 의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 아세토나이트릴(actronitrile)의 20-25% 농도 증가에서 용출된 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 아세토나이트릴(actronitrile)의 20-25% 농도 증가에서 용출된 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 피부암 또는 위암인 항암용 약학조성물.
제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 액제, 정제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 시럽제, 연고제 또는 주사제 중에서 선택되는 제형에 의해 제제화 됨을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.