KR102216388B1 - 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따라 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법이 제공된다. 상기 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 기존의 냉동 치료, 방사선 치료, 화학 치료가 가지고 있던 문제점인 부작용 내지 독성의 위험에 대한 우려가 없을 뿐만 아니라, 효과적인 표적화 항암치료 용도로 사용될 수 있다.

Description

동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating cancer, including a pericarp extract of camellia}

본 발명은 항암 효과를 갖는 동백 과피 추출물의 제조와 이를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 종래에 잘 알려져 있지 않던 동백 과피 추출물 및 이의 발효물의 항암 활성을 확인하여 이를 이용한 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

두경부암은 입술, 구강, 코, 하인두, 후두, 갑상선과 경부의 연부조직 등 얼굴과 목의 거의 모든 부위에 발생하는 암을 말하며, 비교적 발병률이 높은 암에 해당한다. 이는 환경학적, 영양학적 및 병리학적 등 다양한 요인에 의하여 발병하는 것으로 알려져 있고, 주로 음주와 흡연, 식습관, 인간유두종바이러스(human papilloma virus, HPV)가 위험인자로 알려져 있다. 두경부암 중 구강편평세포암이 발병하면 궤양, 소괴, 균열, 적색반, 과립양상 등 매우 다양한 임상 증상이 발견된다.

구강암은 육안으로 쉽게 판별이 가능하여 조기발견이 가능함에도 불구하고 5년 생존율이 30%에 불과하며, 하인두에 발생할 경우 2차암의 병변도 빈발하여 더욱 예후가 좋지 않다.

구강암의 치료에는 수술적 치료, 방사선 요법 및 화학 요법 등의 비수술적 치료가 수행되고 있으나, 모든 치료 요법에 부작용이 따르는 실정이다.

냉동 요법은 부종, 수포, 진물, 가피, 동통, 감염 및 출혈, 조직괴사 등의 부작용이 있고, 방사선 요법은 홍반, 색소침착, 건조성 또는 습윤성 피부박리 및 모세 혈관 확장증 등의 부작용이 있다. 또한, 화학 요법은 구역, 구토, 구내염, 설사 및 골수기능장애 등의 부작용이 있다.

최근 천연물로부터 추출한 유효 성분을 이용하여 항암 효능에 대한 많은 연구가 수행되고 있고, 실제로 이러한 연구를 통해 항암에 대한 효과가 입증되고 있으며, 천연 추출물의 효능에 대한 작용 기전의 연구도 활발히 진행되고 있다. 천연물로부터 생리 활성 유효 물질 탐색이 활발히 진행되면서, 새로운 치료제 또는 건강 보조식품으로서 실용화 가능성을 높이고 있다.

동백은 식물분류학적으로 물레나무목 차나무과 동백나무속 동백나무(Camellia japonica L)이다. 동백꽃에는 두바키사포닌(Tubakisaponin), 올레익산(Oleic　acid), 리놀레익산(Linoleic　acid), 팔미틱산(Palmitic　acid), 스테아릭산(Stearic　acid) 등의 성분이 함유되어 있어 지혈, 소종 등의 효능이 있다고 알려져 있으며, 동백 열매에서 채유되는 불건성유인 동백 기름은 올레산의 트리글리세리드가 주성분이며 과거 머릿기름으로 애용되어 왔다. 하지만 동백 과피는 동백 꽃이나 열매 등 다른 기관과 달리 그 효능과 용도가 거의 알려지지 않았으나, 본 발명자들은 항암효과를 갖는 물질을 탐색하는 과정에서 천연물인 동백 열매의 효능을 검증하여 건조된 동백 과피의 발효 추출물을 제조하였고, 상기 발효 추출물이 정상세포에서는 독성이 없으면서 구강암 및 다양한 암세포의 생장을 효과적으로 억제할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명과 관련된 문헌을 살펴보면, 종래 동백 과피에 대한 연구가 활발하지 않아, 동백 과피를 활용에 대한 종래 한국 등록 특허 제 10-1065356호(발명의 명칭: 동백박(동백종실 껍질 분말) 및 그 추출물의 이용)에서는 동백박의 활용으로 비만 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 피부 보습용 화장료 조성물을 개시하고 있을 뿐, 동백박의 항암효과에 관련된 내용을 개시하고 있는 것은 아니었다.

또한 동백의 추출물을 발효시킨 것과 관련하여서도, 종래 한국 특허 공개 공보 제 10-2019-0091161호 (발명의 명칭: 동백씨 발효 추출물을 포함하는 모발 상태 개선용 화장료 조성물)에서 동백씨 또는 동백씨의 추출물을 혼합 발효 균주로 발효시켜 제조한 동백씨 발효 추출물을 유효성분으로 포함하여 손상된 모발의 수분 휘발 억제 및 보습력 개선 효과와, 손상된 모발의 강도 증진 효과를 발휘하는 화장료 조성물에 대해 개시하고 있을 뿐, 동백씨 발효 추출물의 항암 효과에 관련된 내용을 개시하고 있는 것은 아니었다.

상기 선행문헌과 본 발명은 소재의 선정 면에서 동백 열매 껍질, 동백 과피 추출물이라는 유사점이 있으나, 상기 선행문헌은 암을 저해하는 기술에 대해서는 구체적으로 개시하고 있지 않아 본 발명과는 상이한 기술이며 동백 과피 추출물의 항암효과에 대해서는 종래 공지된 바가 없었다.

등록특허 제10-1723588호 특허공개공보 제10-2019-0091161호

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명의 목적은 암세포의 세포자멸사를 유도하고, 암세포를 특이적으로 표적화함으로써, 악성종양이나 암, 특히 구강암 또는 피부암을 근본적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 구현예는 균주를 접종하여 발효시킨 동백(Camellia japonica L) 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, ‘동백 추출물’은 다양한 기관, 예컨대 과실, 잎, 꽃, 줄기 및 뿌리 등으로부터 추출하여 얻는 것을 의미하며, 바람직하게는 동백 열매 또는 동백 잎, 더 바람직하게는 동백 과피로부터 추출하여 얻은 것일 수 있다. .

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 황국균(Aspergillus　oryzae), 흑국균(Aspergillus niger), 홍국균(Monascus purpureus), 맥주 효모균 (Saccharomyces　cerevisiae), 포도주효모균 (S.　ellipsoides)　또는 기타 발효에 사용될 수 있는 균주로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되며, 바람직하게는 전분 분해 능력과 단백질 분해 능력이 우수한 황국균인 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 황국균은 학문적 분류에 의하면　자낭균문의 국균속 황국균(Aspergillus　oryzae)으로 누룩곰팡이의 대표균에 해당하여　청주, 일본식　된장,　간장류　제조에 사용되는　누룩 제조　곰팡이이다. 생육 적온은 37℃이며, 다당체 분해효소를 대량 분비한다. 통상적인 환경에서는　분생포자를 만드는 무성생식으로 증식하지만, 불리한 환경에서는 자낭포자를 만드는 유성생식으로 증식한다. 황국균은 전분 분해효소인 아밀라아제 (amylase)나 단백질 분해효소인 아스파르틱 프로티나아제 (aspartic proteinase), 지방산 분해효소인 triglyceride lipase 등의 효소 단백질 생산에 널리 사용되고 있으며, 일반적으로는 약 30℃에서는 아밀라아제의 생성이 잘되고 40℃에서는 프로테아제의 생성이 잘되는 특징이 존재한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주의 접종 농도는 0.01 내지 5 w/v%일 수 있으며, 바람직하게는 0.05 내지 3 w/v%, 더 바람직하게는 0.2 내지 2.5 w/v%, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 1w/v%일 수 있다. 0.01 w/v % 미만에서는 발효 균주 번식에 소요되는 시간이 장기간 요구되며, 5 w/v % 초과에서는 균주 간 경쟁작용에 의해 발효가 효율적으로 진행되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동백 추출물의 발효 조건으로 발효 온도는 10 내지 80℃℃이며, 발효시간은 6 내지 120시간인 것을 특징으로 한다.

상기 동백 추출물 발효 조건에서 발효 온도는 10 내지 80℃이며, 바람직하게는 15 내지 60℃, 더 바람직하게는 30 내지 40℃이다. 10℃ 미만에서는 발효 균주의 번식 개시 온도에 도달하지 않아 원하는 발효 효과를 얻을 수 없으며, 80℃ 초과에서는 발효 균주가 번식 활성이 감소하고 사멸되어 원하는 발효 효과를 얻을 수 없다.

상기 동백 추출물 발효 조건에서 발효 시간은 6 내지 120시간이며, 바람직하게는 12 내지 100시간이며, 더 바람직하게는 48 내지 72시간이다. 6시간 미만에서는 발효 균주의 번식 개시에 필요한 시간 미만이므로 발효가 충분히 일어나지 않고, 120시간 초과에서는 과발효로 인해 본 발명 조성물의 함암 활성이 오히려 감소한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동백 과피를 건조하지 않은 상태에서 그대로 추출할 수 있고, 생과피 추출물은 별도로 발효하지 않아도 항암 활성을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동백 과피를 균주 접종 전에 건조하여 추출할 수 있는데, 동백 과피를 균주 접종전에 건조시 수분이 포함된 생과피에 비해 발효가 잘되고 장기간 보관이 가능하다는 장점이 존재하고, 20~45℃에서, 2일 이상 건조한 동백 과피를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동백 과피 추출 용매로는 물, 바람직하게는 정제수, 증류수를 추출 용매로 하여 추출할 수 있다. 물 이외에도 주정 등으로 추출이 가능하고 이는 항암효과도 있으나, 주정으로 추출시 정상세포에 대한 독성을 나타내기 때문에, 항암효과 및 표적세포에만 작용하는 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동백 과피를 50 내지 800 μg/mL, 바람직하게는 100 내지 650 μg/mL, 더 바람직하게는 125 내지 500μg/mL 로 추출한다. 농도가 50 μg/mL 미만인 추출물을 암세포에 처리시 암세포 사멸 효과가 충분히 나타나지 않고, 800 μg/mL 초과인 추출물 사용시 800 μg/mL이하인 추출물과 암세포 사멸 효과가 거의 유사하여 조성물의 생산성이 감소한다.

조성물의 농도는 표적 암세포에 따라 달라질 수 있으며, 구강암 세포 등에 처리시에는 100μg/mL이상으로 추출될 수 있고, 피부암 세포 등에 처리시에는 300μg/mL 이상으로 추출될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물이 적용될 수 있는 구체적인 질환으로는 예를 들어 구강암, 대장암, 유방암, 폐암, 피부암, 위암 및 간암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 편평상피암 또는 피부암이고, 더 바람직하게는 두경부편평상피암 또는 피부암이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 제형이 경구제, 외용제 또는 주사제 중 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 정상세포에 독성을 나타내지 않아 기존의 냉동, 방사선, 화학 치료 요법이 가지고 있던 문제점인 부작용 내지 독성의 위험에 대한 우려가 없다.

또한, 본 발명의 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 정상세포에는 영향을 주지 않으며 FaDu 세포 또는 A431 세포 등의 암세포을 특이적으로 사멸시킬 수 있다.

보다 구체적으로는 암세포 성장을 억제시키는 효능, 암세포의 캐스페이즈(caspase)의 발현을 촉진하는 효능, 암세포의 분절 PARP의 발현을 촉진하는 효능으로 표적세포의 세포 자살(apoptosis)를 유도하여 암세포 사멸 효과가 표적 세포만을 특이적으로 사멸시킬 수 있다.

이에 더하여, 구강암에서 높게 발현하는 유전자 중 하나이며 암세포의 침해력(aggressiveness)과 연관된 암 유전자 표지자인 IGFBP2를 특이적으로 억제하는 작용을 하기 때문에 상기 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 새로운 형태의 표적화 항암치료 용도로 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1의 동백 과피 추출물을 생산 과정을 나타내는 다이어그램이다.
도 2a는 본 발명의 실시예 1의 조성물과 비교예 1의 조성물을 처리한 경우 구강암세포주 FaDu의 세포사멸 실험 결과를 나타낸 그래프이며, 도 2b는 실시예 1 및 비교예 1 내지 4의 조성물을 처리한 구강암세포주 FaDu의 세포사멸 실험 결과를 나타낸 그래프이다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
도 3a는 본 발명의 실시예 1의 조성물과 비교예 1의 조성물을 처리한 경우의 정상세포 293T세포에 대한 독성 실험 결과이며, 도 3b는 비교예 5의 조성물을 처리한 경우의 정상세포 293T세포에 대한 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예1의 조성물을 농도별로 처리한 구강암세포(FaDu)에서 효소 발현 정도를 Western blot으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 1의 조성물을 피부암세포주 A431에 처리하였을 때 세포사멸 실험 결과를 나타낸 그래프이다

이하, 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하고자 하는 바, 다음 실시예 등에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1. 발효 동백 과피 추출물의 제조]

9월 중에 전라남도 완도군 군외면 삼두리에서 채취한 동백 열매를 채취하여 세척 후 과피를 잘게 세절한 후 건조기를 이용하여 30℃에서 5일간 건조하였다.

상기 건조된 과피를 파쇄기를 이용하여 분말화 시킨 후 삼각 플라스크에 40mL 증류수와 동백 건과피 분말 2g을 넣어주고 입구를 호일로 느슨하게 봉하였다.

상기 물과 혼합된 샘플을 멸균기에서 121℃, 15lb psi, 15분간 가열하여 고압 멸균한 후 상온에서 30℃ 이하가 될 때까지 식혀주었다.

상기 멸균된 샘플을 멸균기에 있는 신속냉각 기능을 이용하거나 상온에 방치하여 25~30℃로 냉각하였다.

이후 황국균 (㈜충무발효, 제품명: 황국, 1kg) 분말을 0.08g 넣어 주고 혼탕배양기에서 30℃, 120rpm, 72시간 동안 발효시켰다.

발효된 시료를 원심분리를 통해 침전시킨 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 -70℃ 초저온 냉동고에서 1일 냉동시킨 후 동결건조기를 이용하여 동결 건조하였다

실시예 1의 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 제조 방법은 도 1에 도식화하였다.

[실시예 2. 발효 동백 과피 추출물의 제조]

황국균 분말을 첨가 후 혼탕배양기에서 35℃, 120rpm, 72시간 동안 발효시킨 점을 제외하고, 실시예 1의 제조방법과 동일하게 제조되었다.

[실시예 3. 동백 생과피 추출물의 제조]

9월 중에 전라남도 완도군 군외면 삼두리에서 채취한 동백 열매를 채취하여 세척 후 과피를 잘게 세절하고 파쇄기를 이용하여 분말화 시켰다. 삼각 플라스크에 40mL 증류수와 동백 생과피 분말 2g을 넣어주고 입구를 호일로 느슨하게 봉하였다.

상기 물과 혼합된 샘플을 멸균기에서 121℃, 15lb psi, 15분간 가열하여 고압 멸균한 후 상온에서 30℃ 이하가 될 때까지 식혀주었다. 상기 멸균된 샘플을 멸균기에 있는 신속냉각 기능을 이용하거나 상온에 방치하여 25~30℃로 냉각하여 동백 생과피 추출물을 제조하였다.

비교예 1 내지 6은 하기 표 1에 표기된 사항을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 제조되었다.

	발효여부	발효 균주	동백 잎/ 과피	추출용매
비교예 1	X	-	건조 동백 과피	물
비교예 2	O	맥주효모 1g	건조 동백 과피	물
비교예 3	X	-	건조 동백 잎	물
비교예 4	O	황국균 0.08g	건조 동백 잎	물
비교예 5	O	황국균 0.08g	건조 동백 과피	주정(에탄올)
비교예 6	X	-	냉동 보관 과피	물

[실험예]

실험자료의 통계학적 검정

모든 실험성적은 Mean±standard deviation으로 나타내었고, 각 실험 군 간의 유의성 검정은 Graphpad prism 5.0을 이용하여 tukey t-test를 하였으며, p-value가 0.05 (p<0.05)미만의 경우에서 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

[실험예 1. 구강/피부암 세포주 대한 세포 독성 실험]

1. 실험방법

48 well plate에 well당 사람 하인두 편평암세포 Fadu (KCLB NO, 30043) 또는 피부암 세포주 A431를 8X10⁴ 넣고 배양조건(Minimum essential medium, 37℃, CO₂ 배양기)에서 배양한 다음 날 실시예 및 비교예의 각 추출물을 다양한 농도로 각각 첨가하고 배양하였다. 24시간 후에 각 well에 50mg/mL MTT 시약을 50ul씩 넣어주고 4시간 반응시킨 후 배양액을 제거하였다. 각 well에 DMSO를 300ul씩 넣어주고 formazan을 녹인 후 96 well에 200ul씩 각각 옮기고 microplate reader기를 이용하여 570nm에서 측정하였다.

2. 실험 결과

(1) 발효 여부, 균주에 따른 구강암 세포주 FaDu 세포 독성 실험

FaDu 세포 생존도(Cell viability, 단위: %)

추출물 농도 (μg/mL)	특징	0	125	250	500
실시예 1	30℃, 건과피+황국균	100	79.44 (p<0.05)	45.15 (p<0.001)	14.29 (p<0.001)
실시예 2	35℃, 건과피+황국균	100	74.45 (p<0.01)	68.16 (p<0.001)	31.06 (p<0.001)
비교예 1	건과피	100	110.4	125.2	100.5
비교예 2	건과피+맥주효모	100	147.98	148.3	146.5
비교예 3	건잎	100	125.1	120.1	108.8
비교예 4	건잎+황국균	100	91.97	87.32	96.56

동백 건조 과피 추출물의 발효 여부와 균주에 따라 항암활성에 차이가 발생한다. 실시예 1, 2의 황국균으로 발효한 동백 건조 과피 추출물은 추출 농도 125 μg/mL 이상에서 구강암세포(FaDu)에 항암효과를 나타내고 추출물 농도가 높아질수록 FaDu 세포 생존율이 급격하게 감소하며 125 μg/mL 이상의 농도에서 모두 대조군 대비 통계적 유의성을 나타내었다.

반면, 비교예 1 내지 4의 추출물은 추출물 농도에 무관하게 구강암세포(FaDu)에서 항암 효과를 보이지 않거나, 오히려 FaDu 세포가 최대 약 50%정도 왕성하게 생장하는 결과를 나타낸다.

미발효 동백 과피 추출물인 비교예 1과 실시예 1의 구강암세포 FaDu 사멸률을 도 2a에 나타내었다. 실시예 1의 조성물을 처리한 실험군은 모두 Fadu 세포의 세포 생존율이 유의적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 Fadu 세포의 세포 생존율은 추출물의 처리 농도에 의존적으로 나타났으며, 특히 250μg/mL로 처리한 경우 비교예 1의 세포생존율이 오히려 120% 이상으로 증가한 것에 비하여 실시예 1의 세포 생존율이 약 40%로 감소하는 것으로 나타나, 약 80%의 세포가 사멸되는 현저한 효과를 나타냈다.

(2) 동백 과피 가공방법에 따른 구강암 세포주 FaDu 세포 독성실험

FaDu 세포 생존도(Cell viability, 단위: %)

추출물 농도 (μg/mL)	특징	0	62.5	125	250
실시예 3	생과피	100	82.88	43.49	45.12
비교예 1	건과피	100	110.4	125.2	100.5
비교예 6	냉동보관 과피	100	111.84	91.37	127.36

동백 과피 가공방법에 따라 추출물의 항암활성에 차이가 발생한다. 실시예 3의 생과피 추출물은 62.5 μg/mL 이상에서 구강암세포(FaDu)에 항암효과를 나타내며, 125 μg/mL이상에서 약 55%의 세포 사멸 효과를 나타낸다. 반면, 비교예 1 및 비교예 6의 추출물은 추출물 농도에 무관하게 FaDu세포에서 항암 효과를 보이지 않거나, 오히려 FaDu 세포의 생장도가 높아지는 결과를 나타낸다.

(3) 피부암 세포주 A431 세포에 대한 세포 독성 실험 결과

실시예 1의 추출물을 처리한 피부암세포주 A431의 사멸률을 도 5에 나타내었다. 실시예 1의 조성물을 500μg/mL의 농도로 처리 시, 약 60%의 세포가 사멸하여(P<0.001) A431 세포 생존율이 유의적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다.

상기와 같이 동백 과피 추출물의 구강암 세포주에 대한 항암 능력이 매우 뛰어나 효과적인 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있을 것이예상된다.

[실험예 2. 정상세포 293T 세포 독성 실험]

1. 실험방법 - 세포독성실험

48 well plate에 well당 정상세포 293T를 8X10⁴를 넣고 배양한 다음 날 동백 건과피 발효 추출물을 다양한 농도로 각각 첨가하고 배양하였다. 24시간 후에 각 well에 50mg/mL MTT 시약을 50ul씩 넣어주고 4시간 반응시킨 후 배양액을 제거하였다. 각 well에 DMSO를 300ul씩 넣어주고 formazan을 녹인 후 96 well에 200ul씩 각각 옮기고 microplate reader기를 이용하여 570nm에서 측정하였다.

2. 실험 결과

(1) 발효 여부에 따른 정상세포 293T의 세포 생존력

실시예 1 또는 비교예 1의 추출물을 처리한 정상세포 293T의 세포 생존력을 도 3a의 그래프에 나타내었다.

도 3a에서 알 수 있듯이, 정상세포(293T)에서 황국 발효 전 후의 동백 건조 과피 추출물은 모두 정상세포에 독성을 나타내지 않았으며 세포 생존율은 추출물 농도에 무관하였다. 실시예 1의 발효 동백 과피 추출물은 농도에 무관하게 정상세포에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.

따라서, 이러한 본 발명의 발효 동백 과피 추출물의 특성으로 인해 본 발명의 조성물은 정상세포에는 영향을 미치지 않고 암세포를 특이적으로 사멸시키는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

(2) 추출 용매에 따른 정상세포 293T의 세포 생존력

주정으로 추출한 비교예 5를 처리한 정상세포 293T의 세포 생존력을 도 3b에 나타내었다.

물로 추출한 실시예 1의 조성물 처리시 정상세포 사멸이 발생하지 않는 것에 비해 주정으로 추출한 비교예 5의 추출물 처리시 125ug/ml 이상의 농도에서 정상세포 293T가 48~50% 사멸하여 정상세포에 독성이 나타나는 것을 알 수 있었다. 따라서 주정으로 추출한 비교예 5의 추출물은 표적세포에 특이적으로 작용하는 암의 예방, 개선 치료를 위한 조성물로 적합하지 않음을 알 수 있었다.

[실험예 3. 효소 활성도 실험]

1. 실험방법 - Western blot analysis

100 cm 세포 배양 접시에 1.6 × 10⁶개의 FaDu 세포를 접종하여 배양한 후, 다음 날 0.125, 0.25와 0.5 mg/mL의 동백 건과피 황국 발효 추출물을 처리하여 24 시간 동안 반응시킨 뒤, 부유세포 및 배양 접시에 붙어있는 세포를 모두 수확하였다. 수확한 세포에서 total protein을 분리하기 위해 RIPA buffer를 이용하여 얼음 위에서 30분간 반응 후, 13,000 × g에서 15분간 원심 분리하였다. 상등액을 취하여 얻은 total protein은 Pierce^TM BCA Protein Assay Kit을 이용하여 정량하였다. 40 μg 단백질을 5X sample buffer와 혼합하여 100℃에서 5분간 변성시킨 뒤, 목적으로 하는 단백질의 사이즈에 맞게 8%에서 15% SDS polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동한 후, PVDF membrane으로 이동시켰다. Membrane은 5% blocking solution (5% skim milk in TBS containing 0.1% Tween-20)에서 1시간 동안 상온에서 blocking하고, 일차 항체인 total과 cleaved Caspase-9, Caspase-8, Caspase-3 total과 cleaved PARP는 1:1,000으로 희석하고, β-actin은 1:5000으로 희석하여 4℃에서 overnight 반응하였다. 이후, 1x TBST로 5분씩 네 번 세척한 다음, horseredish peroxidase가 접합된 이차 항체로(1:5,000) 2시간 반응 한 다음 1X TBST로 5분씩 네 번 세척하였다. 결과 분석은 ECL kit를 이용하여 Fusion solo imaging system을 통해 protein band를 가시화하였다.

2. 실험결과

(1) 도 4에 Western blot analysis 결과를 도시하였다.

도 4으로부터 황국균 발효동백 추출물의 농도가 증가할수록 Caspase가 활성화되어 Caspase 8,9 자체의 발현은 감소하나, 활성화 형태인 Cleaved-Caspase 9의 발현이 증가하고 Caspase-3를 활성화한다. 활성화된 caspase-3(Cleaved-Caspase 3)는 Cleaved-PARP 발현이 높아지게 하여 DNA repair를 억제하고, 세포 자살을 유도하는 황국균 발효동백 추출물의 항암 기전을 나타낸다.

(2) 유전자 발현 수준을 정량적으로 측정한 결과를 표 4에 나타내었다.

유전자명	농도별 추출물 처리시 유전자 발현 수준/ 대조군 유전자 발현 수준
	125 ug/ml	250 ug/ml	500 ug/ml
IGFBP2	0.597	0.517	0.657
Caspase 3	1.407	2.378	3.285

실시예 1의 조성물을 FaDu 세포에 처리시, 대조군에 비하여 구강암에서 높게 발현하는 암 유전자 표지자인 IGFBP2발현을 절반 수준으로 낮춰 IGFBP2를 특이적으로 억제하는 작용을 하고, caspase 3 발현을 1.4~3.3배 증가시켜, 암세포 자살을 유도하기 때문에 상기 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물은 표적화 항암치료에 효과적인 조성물이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

1. 동백 과피 추출물을 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 동백 과피 추출물은 물을 용매로 하여 추출하고,
   상기 동백 과피 추출물을 균주를 접종하여 발효시킨 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 황국균, 흑국균, 홍국균, 포도주 효모균, 맥주 효모균로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 균주의 접종 농도는 0.01 내지 5 중량%인 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 동백 과피 추출물의 발효 조건으로서 발효 온도는 10 내지 70℃이며, 발효 시간은 6 내지 120 시간인 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 동백 과피 추출물은 동백 생과피를 건조하여 추출하는 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 동백 과피 추출물의 농도는 50~800μg/mL인 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 암은 구강암, 대장암, 유방암, 폐암, 피부암, 위암, 간암으로 이루어지는 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
10. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 경구제, 외용제, 주사제 중 선택되는 어느 하나로 제형화되는 것을 특징으로 하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
    
    

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