CN108872587B - 一种筛选蛋白混合物中活性多肽的方法 - Google Patents

一种筛选蛋白混合物中活性多肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种筛选蛋白混合物中活性多肽的方法。该方法包括：1)对蛋白混合物的二级质谱数据进行从头测序；2)根据步骤1)所得到的从头测序结果中各多肽组分的相对强度、可信度、离子匹配情况及特定氨基酸含量，筛选出所述蛋白混合物中可能存在的活性组分；3)将步骤2)得到的活性组分进行固相合成，得到多肽单体；4)比较步骤3)得到的多肽单体的液质图谱与所述蛋白混合物的液质图谱，确定所述蛋白混合物中活性多肽。本发明提供的筛选蛋白混合物中活性多肽的方法能够合理有效地筛选出蛋白混合物中潜在的活性多肽组分，尤其适用于核桃粕水解物。

Description

一种筛选蛋白混合物中活性多肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽筛选技术领域，更具体地，涉及一种筛选蛋白混合物中活性多肽的方法。
背景技术
目前，鉴定蛋白混合物中多肽组分的方法主要分为以下三种：第一种是通过提取分离纯化的方法，得到高纯度的多肽单体后，使用多肽N端测序技术确定多肽序列。该方法需要使用分子筛、离子色谱、高效液相色谱等分离技术对蛋白混合物中各多肽组分进行分离纯化，步骤繁琐，耗时长。且各种分离纯化方法的分辨率有限，对于成分复杂的蛋白混合物难以实现目标活性组分与其他组分的完全分离，因此一般只能同时研究蛋白混合物中一个或少数几个多肽组分。第二种是对蛋白混合物进行HPLC-MS/MS检测，得到多肽组分的二级质谱信息。使用蛋白质组测序的方法，将二级质谱信息与现有蛋白质组数据库信息进行匹配与解析，确定多肽序列。该方法需要有蛋白质来源物种的基因组学数据库或蛋白质组学数据库。此外，蛋白混合物的制备工艺必须有确切的酶切位点，因此适用范围受限。第三种是使用从头测序的方法对蛋白混合物的HPLC-MS/MS图谱进行解析，得到各多肽组分的序列。该方法无需特定物种的蛋白质组学数据库，通过计算机运算得到多肽的结构信息。通过从头测序的方法。从头测序得到的结果数据量庞大且会存在一些与真实情况不符的错误。因此，需要建立一种科学合理的方法在测序结果中筛选出更容易检测、更具有结构代表性、真实存在的多肽组分，以缩小范围，再进行活性筛选。
核桃(Juglans regia L.)具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化等多种生理活性。核桃制油剩余的核桃粕中蛋白含量在30％以上，核桃粕水解物是由核桃粕经蛋白酶水解得到的产物，含有丰富的活性多肽。研究表明，核桃粕水解物具有很好的抗氧化、增强学习与记忆、降血压、抗肿瘤等活性。目前对核桃粕水解物的功效研究较多，但是产生这些功效的物质基础研究甚少。大部分研究仅仅将核桃粕水解物整体，也就是包含活性肽、多酚等物质的混合物作为研究对象，而并未对其中各个多肽组分的生物活性深入研究。此外，由于缺乏科学的质控指标，使得核桃粕水解物产品的质量控制造成了困难。多肽是核桃粕水解物的主要成分之一，已被证明具有增强学习与记忆的作用。因此，对核桃粕水解物中多肽的组成进行鉴定既有利于获得具有较高生物学活性的单体，又有利于更科学地制定核桃粕水解物的质量标准。
由于目前没有公开的核桃基因组学数据库或蛋白质组学数据库，且核桃粕水解物组分繁多，因此核桃粕水解物中多肽组分的鉴定适用前述的第三种方法，是建立活性多肽筛选方法的合适研究对象。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种筛选蛋白混合物中活性多肽的方法。该方法包括以下步骤：
1)对蛋白混合物的二级质谱数据进行从头测序；
2)根据步骤1)所得到的从头测序结果中各多肽组分的相对强度、可信度、离子匹配情况及特定氨基酸含量，筛选出所述蛋白混合物中可能存在的活性组分；其中，所述特定氨基酸为所述蛋白物混合物中的主要氨基酸；
3)将步骤2)得到的活性组分进行固相合成，得到多肽单体；
4)比较步骤3)得到的多肽单体的液质图谱与所述蛋白混合物的液质图谱，确定所述蛋白混合物中活性多肽。
本发明提供的方法可以合理有效地筛选出未知蛋白混合物中的活性多肽。
其中，步骤2)中特定氨基酸是指在蛋白混合物中的主要氨基酸，若是在蛋白混合物中有4种氨基酸的含量较高，那么可以将这4种氨基酸即为该蛋白混合物的主要氨基酸。在步骤2)中特定氨基酸的含量即为这4种氨基酸各自的含量。在核桃粕水解物中，谷氨酸(E)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)和甘氨酸(G)这四种氨基酸在核桃蛋白中含量最高，那么对于核桃粕水解物的筛选来说，特定氨基酸含量即为谷氨酸(E)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)和甘氨酸(G)这四种氨基酸各自的含量值。
在本发明一个优选实施方式中，所述步骤2)具体为：
21)根据步骤1)所得到的从头测序结果，筛选出相对强度或可信度从大到小排名靠前的多肽组分；
22)根据步骤21)中得到的多肽组分在所述从头测序结果中的相对强度、可信度、离子匹配情况及特定氨基酸含量，筛选出所述蛋白混合物中可能存在的活性组分。
其中，在步骤21)中，通常选用相对强度或可信度从大到小排名前10～15的多肽组分。
其中，所述步骤22)具体为：根据步骤21)中得到的多肽组分在所述从头测序结果中的相对强度、可信度、离子匹配情况及特定氨基酸含量，建立筛选打分方法，筛选出所述蛋白混合物中可能存在的活性组分；
所述筛选打分方法具体为：
对所述多肽组分在所述从头测序结果中的相对强度取对数，对最大值和最小值分别赋予不同分值，将其它对数值与最大值或最小值进行对比，以获得每种多肽组分的相对强度项分数A；
对所述多肽组分在所述从头测序结果中的可信度赋予不同分值，以获得每种多肽组分的可信度项分数B；
对所述多肽组分在所述从头测序结果中的离子匹配情况赋予不同分值，以获得每种多肽组分的离子匹配程度项分数C；
将所述多肽组分中每种多肽组分中含有特定氨基酸残基的个数除以总氨基酸残基个数，对最大值和最小值分别赋予不同分值，将其它值与最大值或最小值进行对比，以获得每种多肽组分的特定氨基酸含量项分数D；
分别赋予相对强度项分数A、可信度项分数B、离子匹配程度项分数C、特定氨基酸含量项分数D以不同的权重，计算总得分。
其中，总氨基酸残基个数是每种多肽组分中氨基酸残基个数。
其中，对相对强度数值取对数，各批次中对数值最大的记100分，最小的记60分，将其余多肽组分的对数值与最大值或最小值进行对比，按比例进行打分，获得相对强度项的分数A。
其中，对可信度最大的记100分，最小的记60分，将其余多肽组分的数值与最大值或最小值进行对比，按比例进行打分，获得可信度项的分数B。
其中，对离子匹配非常完整或较好的记100分，较为完整记95分，其余情况记60分，获得离子匹配程度项的分数C。若是质谱图中的离子峰均可解析，能够准确推断出序列的结构信息即为对离子匹配非常完整或较好，记为100分。若是根据质谱图中显示的峰推断出的结构可能存在几种类似的情况即为较为完整，记95分；若是序列太短、有的峰无法解释、连续性较差、缺少峰信息即为其余情况，记60分。
将各多肽中含有特定氨基酸残基的个数除以总氨基酸残基个数，获得特定氨基酸的含量，将各批次中特定氨基酸含量的最大值记100分，最小值记80分，将其余多肽组分的含量数值与最大值或最小值进行对比，按比例进行打分，获特定氨基酸含量项的分数D。
在本发明一个优选实施方式中，分别赋予相对强度项分数、可信度项分数、离子匹配程度项分数、特定氨基酸含量项分数以10～70％、10～30％、10～30％和10～30％的权重，优选以40％、20％、20％和20％的权重。
在本发明一个优选实施方式中，所述步骤1)具体为：
将蛋白混合物中的二级质谱数据转换为.raw格式的谱图，使用pNovo 3.0软件进行从头测序分析，pBuild 2.0软件生成从头测序结果。
本发明的方法适用于所有蛋白混合物中活性多肽的筛选，更适用于筛选核桃粕水解物中的活性多肽。
对于核桃粕水解物，其二级质谱数据优选使用液相色谱柱为C18柱、质谱为ESI正离子模式的液质联用系统采集得到。
其中，液质联用系统的参数优选为：流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液，按5％流动相B至95％流动相B进行梯度洗脱；柱温为30-40℃，流速为0.1-0.5mL/min；进样体积5-20μL，DAD检测；质谱使用ESI正离子模式，质量扫描范围m/z＞100。
其中，质谱使用ESI正离子模式，离子源喷射电压：3.5kV；毛细管温度：300℃；鞘气(N2)流速：40arb；辅助气(N2)流速：10arb。碰撞气：氦气；质量扫描范围m/z 100-2000。
在本发明一个优选实施方式中，所述步骤1)从头测序的参数设置如下：最大遗漏酶切位点为3；母离子误差为±20ppm；碎片离子误差为±20ppm；限定式搜索修饰为Fixed:Carbamidomethyl。
本发明还提供了由上述方法筛选得到的活性多肽。
当蛋白混合物为核桃粕水解物，其中用本发明的方法筛选得到的活性多肽包括如下一种或多种序列的多肽：VQLVDDNGDNVFDWV，如SEQ ID NO.1所示；VEGNLQVLRPR，如SEQ IDNO.2所示；HNLDTQTESDV，如SEQ ID NO.3所示；EQEEEESTGRMK，如SEQ ID NO.4所示；AGNDGFEYVTLK，如SEQ ID NO.5所示；QQRQQQGL，如SEQ ID NO.6所示；AELQVVDHLGQTV，如SEQID NO.7所示；LRHRADTQTESDV，如SEQ ID NO.8所示；LAGNPHQQQQN，如SEQ ID NO.9所示；EAQFGQQHVSGAGQ，如SEQ ID NO.10所示；QQERHHGQQQ，如SEQ ID NO.11所示；LGLLPSFSNAPR，如SEQ ID NO.12所示；WSREEQELEDR，如SEQ ID NO.13所示；ADAFNVDTETA，如SEQ ID NO.14所示。
本发明还提供了由上述方法或上述方法得到的多肽在制备药品或保健品或化妆品中的应用。
本发明提供的筛选蛋白混合物中活性多肽的方法能够合理有效地筛选出蛋白混合物中潜在的活性多肽组分，尤其适用于核桃粕水解物。本发明提供的方法可用于进行多肽结构与活性之间关系的深入研究，或者作为潜在的新药进行进一步的开发。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种筛选核桃粕水解物-9003中活性多肽的方法，该方法具体步骤如下：
其中，核桃粕水解物-9003为使用Alcalase和Protamex复合蛋白酶在pH5.0、50℃下水解2小时，离心过滤。然后进行超滤，收集分子量在1000Da至10000Da的组分。
(1)核桃粕水解物-9003的液质检测：配制5mg/mL的核桃粕水解物溶液，注入HPLC-MS/MS检测。
具体液质方法为：将C18色谱柱(100×3mm,1.7μm)装载于液质联用系统上；流动相为0.1％甲酸水溶液-乙腈，5％～95％流动相梯度洗脱；柱温设置为30℃；流速为0.3mL/min；进样体积20μL，DAD检测。质谱使用ESI正离子模式，离子源喷射电压：3.5kV；毛细管温度：300℃；鞘气(N2)流速：40arb；辅助气(N2)流速：10arb。碰撞气：氦气；质量扫描范围m/z100-2000。
(2)核桃粕水解物-9003的从头测序：将(1)中得到的二级质谱数据，进行从头测序解析。参数设置如下：最大遗漏酶切位点为3；母离子误差为±20ppm；碎片离子误差为±20ppm；限定式搜索修饰为Fixed:Carbamidomethyl。经解析得到核桃粕水解物-9003中共有1536个多肽组分。
(3)核桃粕水解物-9003中活性多肽的筛选：首先，将从头测序结果中相对强度或可信度打分排名靠前15的多肽筛选出来，共筛选得到30个多肽组分。再根据从头测序结果中这30个多肽组分的相对强度、可信度、离子匹配情况及特定氨基酸含量，建立筛选打分方法，筛选出可能存在的活性组分。具体筛选标准为：对相对强度数值取对数，各批次中对数值最大的记100分，最小的记60分，将其余多肽组分的对数值与最大值或最小值进行对比，按比例进行打分，获得相对强度项的分数A。同法，各批次中可信度最大的记100分，最小的记60分，将其余多肽组分的数值与最大值或最小值进行对比，按比例进行打分，获得可信度项的分数B。对离子匹配非常完整或较好的记100分，较为完整记95分，其余情况记60分，获得离子匹配程度项的分数C。将各多肽中含有特定氨基酸残基的个数除以总氨基酸残基个数，获得特定氨基酸的含量，将各批次中特定氨基酸含量的最大值记100分，最小值记80分，将其余多肽组分的含量数值与最大值或最小值进行对比，按比例进行打分，获特定氨基酸含量项的分数D。最后分别赋予相对强度项分数A、可信度项分数B、离子匹配程度项分数C、特定氨基酸含量项分数D以40、20％、20％和20％的权重，计算总得分。
根据此筛选标准对30个已选多肽组分进行打分，筛选出分数排名前12的多肽组分(见表1)，作为核桃粕水解物-9003中可能存在的活性组分。
表1核桃粕水解物-9003筛选打分表
(4)核桃粕水解物-9003中活性多肽的确定：将步骤(3)中筛选得到的可能存在的活性组分，固相合成得到纯度高于95％的多肽单体。配制5mg/mL的的活性多肽溶液，分别注入HPLC-MS/MS检测。具体检测方法同步骤(1)。
(5)通过比对活性多肽与核桃粕水解物-9003的液质图谱可得，多条真实存在于核桃粕水解物-9003的活性多肽，结构式分别为VQLVDDNGDNVFDWV(如SEQ ID NO.1所示)、VEGNLQVLRPR(如SEQ ID NO.2所示)、HNLDTQTESDV(如SEQ ID NO.3所示)、EQEEEESTGRMK(如SEQ ID NO.4所示)、AGNDGFEYVTLK(如SEQ ID NO.5所示)、QQRQQQGL(如SEQ ID NO.6所示)及AELQVVDHLGQTV(如SEQ ID NO.7所示)、LRHRADTQTESDV(如SEQ ID NO.8所示)。
实施例2
本实施例提供了一种筛选核桃粕水解物-9002中活性多肽的方法，本实施例与实施例1不同的是所用的核桃粕水解物工艺不同，批号为9002。其它步骤及参数与实施例一相同。
其中，核桃粕水解物-9002为使用Alcalase和Protamex复合蛋白酶在pH5.5、55℃下水解2小时，离心过滤。然后进行超滤，收集分子量在1000Da至10000Da的组分。
经从头测序解析，得到核桃粕水解物-9002中共有2212个组分。根据筛选标准筛选出分数排名前12的多肽组分(见表2)，作为核桃粕水解物-9002中可能存在的活性组分。经HPLC-MS/MS检测验证后，可得QQRQQQGL(如SEQ ID NO.6所示)、AVLDLSNHANQLD(如SEQ IDNO.7所示)、LAGNPHQQQQN(如SEQ ID NO.9所示)、EAQFGQQHVSGAGQ(如SEQ ID NO.10所示)、EQEEEESTGRMK(如SEQ ID NO.4所示)、AELQVVDHLGQTV(如SEQ ID NO.7所示)及QQERHHGQQQ(如SEQ ID NO.11所示)七条真实存在于核桃粕水解物-9002的活性多肽。
表2核桃粕水解物-9002筛选打分表
实施例3
本实施例提供了一种筛选核桃粕水解物-9001中活性多肽的方法，本实施例与实施例1不同的是所用的核桃粕水解物工艺不同，批号为9001。其它步骤及参数与实施例一相同。
其中，核桃粕水解物-9001为使用Alcalase和Protamex复合蛋白酶在pH5.0、60℃下水解4小时，离心过滤。然后进行超滤，收集分子量在1000Da至10000Da的组分。
经从头测序解析，得到核桃粕水解物-9001中共有1630个组分。根据筛选标准筛选出分数排名前10的多肽组分(见表3)，作为核桃粕水解物-9001中可能存在的活性组分。经HPLC-MS-MS检测验证后，可得5条真实存在于核桃粕水解物-9001的活性多肽。结构式分别为AVLDLSNHANQLD(如SEQ ID NO.7所示)、AGNDGFEYVTLK(如SEQ ID NO.5所示)、LGLLPSFSNAPR(如SEQ ID NO.12所示)、WSREEQELEDR(如SEQ ID NO.13所示)及ADAFNVDTETA(如SEQ ID NO.14所示)。
表3核桃粕水解物-9001筛选打分表
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 一种筛选蛋白混合物中活性多肽的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Leu Val Asp Asp Asn Gly Asp Asn Val Phe Asp Trp Val
1 5 10 15
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Glu Gly Asn Leu Gln Val Leu Arg Pro Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
His Asn Leu Asp Thr Gln Thr Glu Ser Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Gln Glu Glu Glu Glu Ser Thr Gly Arg Met Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Gly Asn Asp Gly Phe Glu Tyr Val Thr Leu Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gly Leu
1 5
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Glu Leu Gln Val Val Asp His Leu Gly Gln Thr Val
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Leu Arg His Arg Ala Asp Thr Gln Thr Glu Ser Asp Val
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Ala Gly Asn Pro His Gln Gln Gln Gln Asn
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Ala Gln Phe Gly Gln Gln His Val Ser Gly Ala Gly Gln
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Gln Glu Arg His His Gly Gln Gln Gln
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Leu Gly Leu Leu Pro Ser Phe Ser Asn Ala Pro Arg
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Trp Ser Arg Glu Glu Gln Glu Leu Glu Asp Arg
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Asp Ala Phe Asn Val Asp Thr Glu Thr Ala
1 5 10

Claims (11)

1.一种筛选蛋白混合物中活性多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对蛋白混合物的二级质谱数据进行从头测序；
2)根据步骤1)所得到的从头测序结果中各多肽组分的相对强度、可信度、离子匹配情况及特定氨基酸含量，筛选出所述蛋白混合物中可能存在的活性组分；其中，所述特定氨基酸为所述蛋白混合物中的主要氨基酸；
3)将步骤2)得到的活性组分进行固相合成，得到多肽单体；
4)比较步骤3)得到的多肽单体的液质图谱与所述蛋白混合物的液质图谱，确定所述蛋白混合物中活性多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：
21)根据步骤1)所得到的从头测序结果，筛选出相对强度或可信度从大到小排名10～15的多肽组分；
22)根据步骤21)中得到的多肽组分在所述从头测序结果中的相对强度、可信度、离子匹配情况及特定氨基酸含量，筛选出所述蛋白混合物中可能存在的活性组分。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤22)具体为：根据步骤21)中得到的多肽组分在所述从头测序结果中的相对强度、可信度、离子匹配情况及特定氨基酸含量，建立筛选打分方法，筛选出所述蛋白混合物中可能存在的活性组分；
所述筛选打分方法具体为：
对所述多肽组分在所述从头测序结果中的相对强度取对数，对最大值和最小值分别赋予不同分值，将其它对数值与最大值或最小值进行对比，以获得每种多肽组分的相对强度项分数；
对所述多肽组分在所述从头测序结果中的可信度赋予不同分值，以获得每种多肽组分的可信度项分数；
对所述多肽组分在所述从头测序结果中的离子匹配情况赋予不同分值，以获得每种多肽组分的离子匹配程度项分数；
将所述多肽组分中每种多肽组分中含有特定氨基酸残基的个数除以总氨基酸残基个数，对最大值和最小值分别赋予不同分值，将其它值与最大值或最小值进行对比，以获得每种多肽组分的特定氨基酸含量项分数；
分别赋予相对强度项分数、可信度项分数、离子匹配程度项分数、特定氨基酸含量项分数以不同的权重，计算总得分。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，分别赋予相对强度项分数、可信度项分数、离子匹配程度项分数、特定氨基酸含量项分数以10～70％、10～30％、10～30％和10～30％的权重。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：
将蛋白混合物中的二级质谱数据转换为.raw格式的谱图，使用pNovo 3.0软件进行从头测序分析，pBuild 2.0软件生成从头测序结果。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物为核桃粕水解物。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物为核桃粕水解物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核桃粕水解物的二级质谱数据使用液相色谱柱为C18柱、质谱为ESI正离子模式的液质联用系统采集得到。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述核桃粕水解物的二级质谱数据使用液相色谱柱为C18柱、质谱为ESI正离子模式的液质联用系统采集得到。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1)从头测序的参数设置如下：最大遗漏酶切位点为3；母离子误差为±20ppm；碎片离子误差为±20ppm；限定式搜索修饰为Fixed:Carbamidomethyl。
11.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)从头测序的参数设置如下：最大遗漏酶切位点为3；母离子误差为±20ppm；碎片离子误差为±20ppm；限定式搜索修饰为Fixed:Carbamidomethyl。
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