CN116178491A - 具有美白和抗氧化功效的珍珠肽、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽技术领域，公开了一种具有美白和抗氧化功效的马氏珠母贝珍珠肽、其制备方法和应用，所述珍珠肽为短肽的混合物，所述珍珠肽以马氏珠母贝珍珠层粉为原料，按比例加入水以及复合离子液，采用高温高压物理改性后，依次经过菠萝蛋白酶和中心蛋白酶复合降解、灭酶、离心、分离纯化并鉴别得到。本发明制备的马氏珠母贝珍珠肽，具有美白和清除自由基的功效，本发明为化妆品领域提供了一种新型的生物活性肽，同时提高了珍珠层粉在生物医药和食品领域的应用价值。

Description

具有美白和抗氧化功效的珍珠肽、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于多肽制备技术领域，具体涉及一种具有美白和抗氧化功效的珍珠肽制备和应用。
背景技术
珍珠层为外套膜组织细胞分泌形成的、存在珍珠贝壳里面一层灰白色具有光泽的珍珠质，将其磨成细粉得珍珠层粉。珍珠层和珍珠是同质同源，研究表明，珍珠层粉的主要成分与珍珠粉的成为极为接近，其主要成分为无机成分、有机质成分和水，无机成分含量为90%-96%，有机质含量约为2.0%-7.0%，水的含量约为0.2% -2.0%。珍珠层粉在化妆品领域常被用作价格昂贵的珍珠粉的替代品，具有相似的功效。珍珠自古是美白养颜佳品，《本草纲目》记载珍珠“珍珠味咸甘寒无毒，镇静安神、令人润泽好颜色、除面斑、止泻、解痘疗毒、令光泽洁白”等多种功效。现代医学研究进一步验证珍珠及珍珠层粉具有如明目、安定、解毒、美白等功效。目前，其作为美白祛斑产品的重要成分，已被国家食药局化妆品原料目录收录。
珍珠蛋白及其酶解活性肽是珍珠的美白功效的主要成分。珍珠层蛋白质的主要成分为壳角蛋白，其与有机质与无机质结合牢固，相互交联形成较强的网络状结构，且壳角蛋白结构较为复杂，氢键、疏水健、二硫键等相互作用导致其肽链卷曲紧密，难溶于水，无法直接利用，且存在不易降解、提取小分子肽低等问题。酶解制备珍珠肽活性肽是实现珍珠蛋白高值化利用的手段之一。因此，如何高效降解珍珠层蛋白，开发具有高效美白活性的珍珠活性肽，在皮肤相关生物医药领域具有广泛地应用前景，且将进一步地产生巨大的经济价值。
目前，珍珠层功效成分的开发应用工艺方法主要有：传统水提、酸解提取及直接酶解等。传统水提法无法有效利用珍珠不溶性蛋白；酸解提取法虽能够有效降解壳角蛋白，但大多降解成氨基酸，且功能成分受到破坏；而直接酶解法存在效率低、小分子肽得率低，成本较高等弊端。同时，目前未见从马氏珠母贝珍珠层粉提取酪氨酸酶抑制肽和抗皮肤光老化肽的相关报道。
另外，现有技术中，一般都是通过液相色谱对小分子肽进行层析分离，不仅分离纯化条件复杂，而且分离效率低，成本高，不能够应用于产业化生产。
发明内容
有鉴于此，为进一步高效利用海水珍珠层粉蛋白资源并挖掘新的功能活性，本发明提供一种具有美白活性和抗氧化功效的马氏珠母贝珍珠肽制备方法。
本方面提供如下的技术方案：
一种具有美白和抗氧化功效的珍珠肽，其特征在于，包括以下多肽：
NPPMP1：Thr-Phe-Ser-Gly-Asn-Tyr-Pro；
NPPMP2：Gly-Gly-Phe-Gly-Asn-Trp；
NPPMP3：Ala-Thr-Phe-Asp-Ala-Ile；
NPPMP4：Leu-Lys-Gly-His-Glu-Asp-Leu；
NPPMP5：His-Ser-Ser-Ala-His-Ser；
NPPMP6：Gly-Gly-Ser-Phe-Ser-Val-Arg；
所述珍珠肽为马氏珠母贝珍珠肽。
本发明还提供一种上述珍珠肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.马氏珠母贝珍珠层粉按比例加入蒸馏水后，加入复合离子液，经高温高压处理后，按照合适比例加入复合蛋白酶酶解，灭酶后离心得到上清液；
S2.步骤S1的上清液，经脱色后，采用超滤膜截留小分子组分，经真空浓缩、冻干即可得到小分子马氏珠母贝珍珠肽。
进一步的，步骤S1中，所述复合离子液包括以下重量份数组分：大豆多糖39-57、十二烷基硫酸钠15-22、天冬氨酸18-24、谷氨酸11-19。
进一步的，步骤S1中，所述复合离子液的添加量为珍珠层粉质量的23-35%。
本发明采用的复合离子液中：
大豆多糖是以大豆或大豆粕为原料，经脱脂、提取、脱色、纯化、干燥等工艺生产的水溶性多糖类物质，可抑制脂类氧化和稳定酸性饮料中的蛋白质，可以改善食品的食用品质、加工特性和外观特性。水溶性大豆多糖黏性低，可制成高浓度溶液，其溶液的黏度几乎不受盐类影响。大豆多糖有分散性、稳定性、乳化性和黏着性等多种功能。
十二烷基硫酸钠是一种无毒的阴离子表面活性剂，其生物降解度>90%，与阴离子、非离子复配伍性好，具有良好的乳化、发泡、渗透、分散的性能，可以破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键。
天冬氨酸、谷氨酸为酸性氨基酸。
本发明的复合离子液，能够在物理改性的条件下，各组分的协效复配，通过天冬氨酸与谷氨酸配合与碳酸钙发生反应，形成可溶的钙离子，并在十二烷基硫酸钠的作用下，防止沉淀的产生，在大豆多糖的作用下，形成稳定的反应体系，防止可逆反应的发生。在高温高压条件下，复合离子液与马氏珠母贝珍珠层粉的内部结构发生反应，渗透到有机质与无机质之间的网络状结构并与之作用，松绑有机质与无机质之间的结合，并对壳角蛋白内部的氢键、疏水健、二硫键等具有一定的破坏作用，使得珍珠层粉的角壳蛋白在后续酶解中能够更充分的降解为具有生物活性的小分子肽，实现珍珠层粉的高值化利用。
进一步的，步骤S1中，以马氏珠母贝珍珠层粉按照1：3-1：5比例加入蒸馏水，控制处理压力0.20-0.25MPa、反应温度115-121℃，物理改性处理20-30 min。
本发明中，高温条件有利于反应物的分解和自由基的形成,提高了化学反应速率。高压条件下,当气泡破裂产生高压的同时,还伴随强烈的冲击波,对于有固体参加的非均相体系起到了很好的冲击作用,导致分子间强烈的相互碰撞和聚集。通过高温、高压的作用，为在一般条件下难以实现或不可能实现的化学反应提供了特别的反应条件。
进一步的，步骤S1中，酶解选用的复合酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶菠萝蛋白酶的组合，采用同步酶解，菠萝蛋白酶的添加量为0.10-0.30 g/100g、中性蛋白酶菠萝蛋白酶的添加量为0.2-0.6 g/100g，调节pH为6.0-7.0，温度为45-60℃，酶解4-7 h后，100℃灭酶处理20 min后，离心取上清液。
通过复合酶解反应，既能够提高酶解的效率和小分子活性物质的得率，同时提取到的小分子活性肽具有高活性和针对性，赋予其特定的生物活性。
进一步的，步骤S2中，采用活性碳和硅藻土联合脱色，过滤后，滤液进一步采用超滤膜截留分子量小于3000 Da的组分。
本发明的创新点在于：通过复合离子液的加入，在高温高压条件下，一方面可以增加小分子活性物质的释放率，另一方面，可以通过添加量控制小分子活性肽段的成分占比，使其在某些生物活性功能方面更加突出，可以满足不同应用场景的需求。
本发明还提供一种上述珍珠肽在制备清除自由基、抑制酪氨酸酶产品中的应用。
本发明中，通过复合离子液干预与高温高压前处理结合的方式，能够有效提高酶解制备可溶性小分子肽的含量，与现有技术的普通酶解制备相比，水解度明显提升；并且，复合酶解能显著提高水解不溶性蛋白的效率。
申请人通过大量创造性试验发现，合理的前处理方式和蛋白酶的组合，对降解不溶性珍珠蛋白起关键作用，能够解决现有技术中海水珍珠层蛋白水溶性差、利用难等技术问题。
另外，通过本发明复合离子液的干预，在相同制备条件下，可以获得稳定的特定序列珍珠肽的组合物，控制各序列的占比在预期范围，目标产物通过超滤膜截留的方式即可获得，可以保证产物具有目标的生物活性。通过此可有效解决现有技术中小分子肽分离纯化条件复杂，成本高，分离效率低，不能够实现产业化生产的问题。
本发明制备得到的马氏珠母贝珍珠肽，具有较高的酪氨酸酶抑制活性，同时具有清除自由基的功效，且安全性高、无毒副作用，可以解决现有技术中曲酸和熊果苷等传统酪氨酸酶抑制剂可能存在毒副作用的技术问题。
采用本发明的制备方法，既有效提高马氏珠母贝贝壳废弃物的附加值，提高了海水珍珠层粉在化妆品、生物医药和食品领域的应用价值。
附图说明
图1 马氏珠母贝珍珠肽分离鉴定的LC-MS总离子图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种具有美白和抗氧化功效的珍珠肽，其特征在于，包括以下多肽：
NPPMP1：Thr-Phe-Ser-Gly-Asn-Tyr-Pro；
NPPMP2：Gly-Gly-Phe-Gly-Asn-Trp；
NPPMP3：Ala-Thr-Phe-Asp-Ala-Ile；
NPPMP4：Leu-Lys-Gly-His-Glu-Asp-Leu；
NPPMP5：His-Ser-Ser-Ala-His-Ser；
NPPMP6：Gly-Gly-Ser-Phe-Ser-Val-Arg；
所述珍珠肽为马氏珠母贝珍珠肽。
实施例2
一种实施例1珍珠肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将经过清洗干燥后的马氏珠母贝珍珠层粉（200-400目），按比例加入蒸馏水后，加入复合离子液，经高温高压处理后，按照合适比例加入复合蛋白酶酶解，灭酶后离心得到上清液；
S2.步骤S1的上清液，经脱色后，采用超滤膜截留小分子组分，经真空浓缩、冻干即可得到小分子马氏珠母贝珍珠肽。
进一步的，步骤S1中，所述复合离子液包括以下重量份数组分：大豆多糖45、十二烷基硫酸钠18、天冬氨酸21、谷氨酸15。
进一步的，步骤S1中，所述复合离子液的添加量为珍珠层粉质量的27%。
进一步的，步骤S1中，以马氏珠母贝珍珠层粉按照1：4比例加入蒸馏水，控制处理压力0.22MPa、反应温度120℃，物理改性处理25min。
进一步的，步骤S1中，酶解选用的复合酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶菠萝蛋白酶的组合，采用同步酶解，菠萝蛋白酶的添加量为0.20 g/100g、中性蛋白酶菠萝蛋白酶的添加量为0.4g/100g，调节pH为6.5，温度为50℃，酶解5 h后，100℃灭酶处理20 min后，离心取上清液。
进一步的，步骤S2中，采用活性碳和硅藻土联合脱色，过滤后，滤液进一步采用超滤膜截留分子量小于3000 Da的组分。
实施例3
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，步骤S1中，所述复合离子液的添加量为珍珠层粉质量的23%。
实施例4
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，步骤S1中，所述复合离子液的添加量为珍珠层粉质量的30%。
实施例5
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，步骤S1中，所述复合离子液的添加量为珍珠层粉质量的35%。
实施例6
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，步骤S1中，所述复合离子液包括以下重量份数组分：大豆多糖41、十二烷基硫酸钠17、天冬氨酸19、谷氨酸13。
实施例7
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，步骤S1中，所述复合离子液包括以下重量份数组分：大豆多糖55、十二烷基硫酸钠20、天冬氨酸23、谷氨酸17。
实施例8
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，步骤S1中，所述复合离子液包括以下重量份数组分：大豆多糖39、十二烷基硫酸钠15、天冬氨酸18、谷氨酸11。
进一步的，步骤S1中，以马氏珠母贝珍珠层粉按照1：3比例加入蒸馏水，控制处理压力0.20MPa、反应温度121℃，物理改性处理20 min。
进一步的，步骤S1中，酶解选用的复合酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶菠萝蛋白酶的组合，采用同步酶解，菠萝蛋白酶的添加量为0.10 g/100g、中性蛋白酶菠萝蛋白酶的添加量为0.2g/100g，调节pH为7.0，温度为45℃，酶解6 h后，100℃灭酶处理20 min后，离心取上清液。
实施例9
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，步骤S1中，所述复合离子液包括以下重量份数组分：大豆多糖57、十二烷基硫酸钠22、天冬氨酸24、谷氨酸19。
进一步的，步骤S1中，以马氏珠母贝珍珠层粉按照1：5比例加入蒸馏水，控制处理压力0.25MPa、反应温度118℃，物理改性处理30 min。
进一步的，步骤S1中，酶解选用的复合酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶菠萝蛋白酶的组合，采用同步酶解，菠萝蛋白酶的添加量为0.30 g/100g、中性蛋白酶菠萝蛋白酶的添加量为0.6 g/100g，调节pH为6.0，温度为60℃，酶解4h后，100℃灭酶处理20 min后，离心取上清液。
对比例1
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，不添加复合离子液。
对比例2
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，所述复合离子液中，不含有大豆多糖。
对比例3
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，所述复合离子液中，不含有十二烷基硫酸钠。
对比例4
本实施例提供一种与实施例2相同的珍珠肽的制备方法，所不同的是，所述复合离子液中，不含有天冬氨酸、谷氨酸。
实验效果测试
将实施例2制备的珍珠肽分别进行还原烷基化处理作为样品，通过液质联用（LC-MS/MS）分析，得到质谱原始结果的raw文件，使用Xcalibur软件得到总离子流色谱图（图1）。质谱数据经过软件PEAKS Studio 8.5分析，鉴别出得分较高的肽序列，进一步以酪氨酸酶（PDB:2Y9X）作为受体，小分子肽作为配体，采用Autodock Vina 软件实施分子对接，得到结合能最低的美白活性肽序列，见下表。采用面积归一化法（测量肽各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率）计算各活性肽的相对含量；结果如下表所示。
Figure 679634DEST_PATH_IMAGE001
采用同样方法，计算实施例3-5制备的珍珠肽中各活性肽的相对含量；结果如下表所示。
Figure 371647DEST_PATH_IMAGE002
抗氧化活性；
按照现有技术试剂盒产品（）说明进行操作。ABTS、DPPH自由基清除率均按下计算：
Figure 311921DEST_PATH_IMAGE003
式中：
A0——空白对照吸光值；
A1——样品与ABTS（DPPH）反应后的吸光值；
A2——样品吸光度值。
将实施例2-5和对比例1-4制备的小于3000 Da的珍珠肽配制成10.0 mg/mL的溶液，分别测试ABTS、DPPH自由基清除能力，结果如下表所示。
Figure 287836DEST_PATH_IMAGE004
美白活性（酪氨酸酶抑制活性）；
酪氨酸酶抑制活性是美白活性评定的体外活性之一，可用于反映其对黑色素生成的抑制能力。参照T/GDCA 006-2021的规定进行。在96孔板加入L-酪氨酸溶液、实施例2-5和对比例1-4制备的小于3000 Da的珍珠肽配制成的10.0 mg/mL溶液、PBS缓冲液，37 ℃水浴10 min，加入20 μL酪氨酸酶溶液，37 ℃混匀反应5 min± 5 s后立刻放入酶标仪进行测定。将L-酪氨酸换成L-多巴,重复上述操作。单、双酚酶活性抑制率按下式计算：
Figure 920943DEST_PATH_IMAGE005
式中：
Y——酪氨酸酶活性抑制率，%；
Ad——样品反应孔吸光度；
Ac——样品本底孔吸光度；
Ab——溶剂反应孔吸光度平均值；
Aa——溶剂本底孔吸光度平均值。
将抑制率曲线拟合得到回归方程并计算活性肽的IC50值，按下式换算成曲酸当量值。
Figure 615098DEST_PATH_IMAGE006
式中：
D——曲酸当量值，mg/mg；
C——受试样品的IC50值，mg/mL；
C0——曲酸的IC50值，mg/mL。
分别测试对L-酪氨酸和L-多巴的抑制率，结果如下表所示。
Figure 93484DEST_PATH_IMAGE007
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过任一现有技术实现。

Claims (8)

1.一种具有美白和抗氧化功效的珍珠肽，其特征在于，包括以下多肽：
NPPMP1：Thr-Phe-Ser-Gly-Asn-Tyr-Pro；
NPPMP2：Gly-Gly-Phe-Gly-Asn-Trp；
NPPMP3：Ala-Thr-Phe-Asp-Ala-Ile；
NPPMP4：Leu-Lys-Gly-His-Glu-Asp-Leu；
NPPMP5：His-Ser-Ser-Ala-His-Ser；
NPPMP6：Gly-Gly-Ser-Phe-Ser-Val-Arg；
所述珍珠肽为马氏珠母贝珍珠肽。
2.一种权利要求1所述珍珠肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.马氏珠母贝珍珠层粉按比例加入蒸馏水后，加入复合离子液，经高温高压处理后，按照合适比例加入复合蛋白酶酶解，灭酶后离心得到上清液；
S2.步骤S1的上清液，经脱色后，采用超滤膜截留小分子组分，经真空浓缩、冻干即可得到小分子马氏珠母贝珍珠肽。
3.根据权利要求2所述的珍珠肽的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述复合离子液包括以下重量份数组分：大豆多糖39-57、十二烷基硫酸钠15-22、天冬氨酸18-24、谷氨酸11-19。
4.根据权利要求3所述的珍珠肽的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述复合离子液的添加量为珍珠层粉质量的23-35%。
5.根据权利要求3或4所述的珍珠肽的制备方法，其特征在于，步骤S1中，以马氏珠母贝珍珠层粉按照1：3-1：5比例加入蒸馏水，控制处理压力0.20-0.25MPa、反应温度115-121℃，物理改性处理20-30 min。
6.根据权利要求5所述的珍珠肽的制备方法，其特征在于，步骤S1中，酶解选用的复合酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶菠萝蛋白酶的组合，采用同步酶解，菠萝蛋白酶的添加量为0.10-0.30 g/100g、中性蛋白酶菠萝蛋白酶的添加量为0.2-0.6 g/100g，调节pH为6.0-7.0，温度为45-60℃，酶解4-7 h后，100℃灭酶处理20 min后，离心取上清液。
7.根据权利要求2所述的珍珠肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，采用活性碳和硅藻土联合脱色，过滤后，滤液进一步采用超滤膜截留分子量小于3000 Da的组分。
8.根据权利要求1所述的珍珠肽的制备方法，其特征在于，一种权利要求1-7 任一项所述珍珠肽在制备清除自由基、抑制酪氨酸酶产品中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117143173A (zh) * 2023-10-31 2023-12-01 好棣(山东)生物科技有限公司 一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法

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