CN112316114A - 外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途 - Google Patents

外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112316114A
CN112316114A CN202110000661.4A CN202110000661A CN112316114A CN 112316114 A CN112316114 A CN 112316114A CN 202110000661 A CN202110000661 A CN 202110000661A CN 112316114 A CN112316114 A CN 112316114A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
exosome
polypeptide
adipose
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110000661.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112316114B (zh
Inventor
张涛
陈博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongke Tiancheng (Shenzhen) Group Co.,Ltd.
Original Assignee
Tianjin Hanqing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Hanqing Biotechnology Co ltd filed Critical Tianjin Hanqing Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110000661.4A priority Critical patent/CN112316114B/zh
Publication of CN112316114A publication Critical patent/CN112316114A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112316114B publication Critical patent/CN112316114B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00Preparations for care of the skin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途。将本发明提供的修复肽与脂肪干细胞和表皮干细胞外泌体进行组合使用,可以有效的修复糖尿病小鼠的溃疡模型具有显著的促进糖尿病损失的修复,具有较好的应用前景和应用价值。

Description

外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途
技术领域
本发明涉及生物领域,具体的,涉及外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途。
背景技术
创伤所导致的慢性皮肤溃疡是糖尿病患者住院的原因之一,其病情复杂易反复,可导致严重的并发症,治疗相对棘手,治疗方法局限,且发病率逐年上升,是目前临床急于攻克的难题。已知创面愈合是一个复杂而精细的过程,由多种细胞和分子参与。目前研究显示已有超过数百个生理因素与糖尿病创面愈合不良有关,如生长因子降低、血管新生减少、巨噬细胞数目不多及功能受损、胶原沉积异常、角质细胞和成纤维细胞增殖减弱等。
间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSC)是干细胞家族的重要成员,来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现,临床应用于解决多种血液系统疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等,因其具有多向分化潜能、造血支持和免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。Kuo等研究了骨髓来源的问充质干细胞在链脲佐菌素诱导的增强型糖尿病大鼠模型创面愈合中的作用,结果显示与对照组相比较,间充质干细胞治疗组的小鼠创面面积显著减小,且创面完全愈合时间短于对照组,比较差异有统计学意义。组织学分析显示,与对照组相比,间充质干细胞组的局部促炎反应减弱,CD45的表达也有着明显的抑制。免疫组织化学分析指出,治疗组的表皮生长因子、血管内皮生长因子、脯氨酰4-羟化酶的表达与对照组相比显著增加。因此,骨髓问充质干细胞可显著增强糖尿病创面愈合,这为临床寻找有效的治疗方法提供了新的思路。人脐血源性内皮祖细胞(EPCs)因可促进新生血管形成常应用于各种缺血性疾病的治疗。但是,其在糖尿病创面愈合中起到的积极作用及相关机制却鲜有报道。Kim等以链脲佐菌素诱导的糖尿病的裸鼠为模型进行了相关研究,发现EPCs移植组的糖尿病创面中的角质形成细胞和成纤维细胞的增殖比PBS对照组早3d,从而显著加速了创面闭合。
此外,创面的上皮化对创面愈合极为重要,而相关研究表明表皮干细胞对创面上皮化具有重要的作用,说明表皮干细胞对创面愈合有着积极的意义。糖尿病创面中异常分布的表皮干细胞较正常皮肤活性低、数量少,不能有效地使糖尿病创面在普通时间内愈合,提示糖尿病中已有的表皮干细胞在修复创面愈合过程中没能发挥应有的作用。以表皮干细胞为种子细胞,培养组织工程皮肤,促进创面愈合,避免皮片移植时皮源缺乏及供皮区瘢痕等一系列问题。胡葵葵等利用表皮干细胞构建复合皮肤修复裸鼠创面,新生皮肤增殖能力强,生长速度和皮肤质量均较为理想。若以包含有表皮干细胞的复合皮肤或者干细胞膜片修复糖尿病创面,增强其愈合能力,有可能为治疗糖尿病创面提供一个较为理想的方式。
近年来的研究表明,干细胞所发挥的组织修复与再生功能,不仅因其在损伤部位的增殖和分化,很大程度上是由其旁分泌作用实现的。间充质干细胞来源外泌体(MSC-exo)中的RNA 或者蛋白能够发挥细胞归巢作用,并调节细胞的增殖与分化,可以限制损伤、调节免疫反应以及促进细胞损伤后的自我修复和组织再生。Baglio 等分离由人骨髓和脂肪间充质干细胞分泌的外泌体,并通过电子显微镜标记、蛋白分析、RNA 测序等方法,证实人骨髓和脂肪间充质干细胞分泌的外泌体富含特异性miRNA 和tRNA。Quesemberry 等提出,MSC-exo 扮演着干细胞生物学上的关键角色,推测外泌体在促进细胞新生以及组织损伤修复方面有重要作用。但是目前还没有将外泌体用于糖尿病组织修复中应用。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷,提供一种采用脂肪干细胞和表皮干细胞外泌体协同修复肽一起促进糖尿病损伤修复中的应用。
此外,还提供一种能够促进糖尿病损伤修复的多肽的筛选方法及筛选获得的多肽。
具体的,所述修复肽能够特异性的促进人角质细胞以及人正常成纤维细胞的增殖,特别是在高糖环境下的增殖。
进一步的,本发明的修复肽为GTC-15多肽,其序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述的修复肽可以采用化学合成的方法获得。
本发明的目的是提供修复肽在制备皮肤创伤、烧烫伤、慢性创面愈合、放射性溃疡、皮肤细胞修复和新生等方面的产品中的应用。
更进一步的,所述修复是在糖尿病患者的环境下修复的。
跟进一步的,所述的产品优选为医用产品、护肤品或化妆品。
本发明进一步的,所述的产品的制剂类型优选但不局限为片剂、颗粒、溶液、乳剂、霜剂、凝胶、面膜或敷料等。
本发明进一步的,提供一种脂肪干细胞与表皮干细胞外泌体协同GTC-15多肽一起用于治疗糖尿病患者组织损失修复的用途。
本发明进一步的,提供一种脂肪干细胞与表皮干细胞外泌体协同GTC-15多肽一起制备用于治疗糖尿病患者组织损失修复的药物组合物用途。
进一步的,所述药物组合物中进一步的含有药学上可接受的载体。
本发明另一方面提供了包括脂肪干细胞与表皮干细胞外泌体协同GTC-15多肽的药物组合物。所述的药物组合物包含有效量的具有上述结构的多肽化合物和药学可接受的载体,所述的组合物可以根据本领域的公知技术进行制备,例如与常规的药用辅料进行混合,制备成注射剂、注射液,或局部给药的制剂类型例如乳剂、膏剂、霜剂或经鼻给药的剂型等,或具有缓释效果的制剂,例如微球、脂质体等。
本发明所述的“药学可接受的载体”包括任何一种药用辅料,例如填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于:乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如梭甲基纤维素、轻丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水、乙醇等。通常,药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液,例如柠檬酸盐、磷酸盐等;还可以含有抗氧化剂,稳定剂(如氨基酸)、抑菌剂等。
本发明另一方面提供了上述组合物在制备与糖尿病组织损失修复相关的疾病中的应用,所述的糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
本发明提供一种干细胞制剂,各组分浓度为:
脂肪干细胞浓度为1-9×106个/mL;
外泌体的浓度1-5mg/mL;
GTC-15多肽的浓度达到1-5mg/mL;
采用复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水进行溶解。
在本发明提供的实施例中,溶剂为生理盐水。
皮下输注干细胞制剂按照体重以0.01-0.1ml/kg的标准或者以每次50ul的量将本发明干细胞制剂注射到患者皮下。
本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果:
本发明提供的修复肽是一种能够特异性的促进人角质细胞以及人正常成纤维细胞的增殖,特别是在高糖环境下的增殖。而且所述修复肽可以采用化学合成方法或者基因工程方法,所需的生产成本和使用成本更低。将本发明提供的修复肽与脂肪干细胞和表皮干细胞外泌体进行组合使用,可以有效的修复糖尿病小鼠的溃疡模型具有显著的促进糖尿病损失的修复,具有较好的应用前景和应用价值。
附图说明
图1 多肽对二种细胞增殖的效果图
图2 GTC-15多肽对细胞相应基因的PCR检测结果图
图3 外泌体的直径分布图
图4 创面愈合率结果图
图5 各组治疗方式对内皮细胞生长因子的mRNA表达量影响图
具体实施方式
本发明公开了一种防治糖尿病组织损失的组合物及其应用、干细胞制剂,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
实施例1 在高糖环境下促进细胞增殖的多肽的制备
以Hacat人永生化角质形成细胞(货号YCL-0090,益普生物)和NHDF(正常人皮肤成纤维细胞)(货号: HTX2167,深圳市豪地华拓生物科技有限公司)作为靶细胞,在37℃下采用发明人构建的多肽库进行促进细胞增殖的多肽特异性筛选,获得了能够同时在高糖环境下促进二种细胞增殖的多肽共3个,分别命名为GTC-2、GTC-15、GTC-29,由北京中科亚光生物科技有限公司合成该十二肽并标记FITC,多肽纯度>95%。
实施例2 GTC-15多肽活性检测
HaCat人永生化角质形成细胞培养液:用含10%胎牛血清、50mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养液培养细胞,另需加入1%体积10000U/ml-10000μg/ml的青-链霉素溶液。
正常人皮肤成纤维细胞培养液:用含10%胎牛血清、50mmol/L的MEM培养液培养细胞,另加入1%体积的10000U/ml-10000μg/ml的青-链霉素,1%体积的丙酮酸钠,5mML谷氨酰胺。
将保存有HaCat人角质细胞和人正常成纤维细胞的冻存管从液氮中取出后迅速将其置于37℃水浴锅中使其快速融化,等管内液体完全融化后,将吸出的细胞液与4ml完全培养液置于离心管中,离心1000rpm 5分钟,然后用高压灭菌锅的吸管弃上清,用5ml各自相应的培养液将沉淀细胞均匀混匀后并接种于无菌培养皿中培养,次日更换新鲜培养液,继续进行细胞培养。换液:如前所述,HaCat人角质细胞使用的是RPMI1640培养液培养,人正常成纤维细胞使用的是MEM培养液培养。注意在倒置显微镜下观察细胞的生长情况,根据需要每2至3天更换新鲜培养液一次。传代:待细胞会合率达到约80%时,用1至2ml的0.25%的胰酶消化细胞至悬浮状态,然后加入等体积的完全培养液,以1000rpm的速度进行离心,10分钟后取出离心管,弃上清,用新鲜的培养液吹打混匀沉淀的细胞,以适当的比例分皿接种传代。将细胞置于NEST-Dish蜂巢式细胞爬片皿中(46张爬片/皿),将细胞以2.0×104个/ml密度接种于培养皿,当观察到细胞生长稳定后,收集全部爬片。将收集的细胞爬片按所来源于的爬片皿分成3组,反复进行3次检测。每次分为1个空白对照组和1个多肽处理组各3种浓度进行检测,具体过程是:将爬片进行如下的分组:空白对照组(培养液)实验组(多肽)按浓度分为高(100μg/ml)、中(50μg/ml)、低(10μg/ml)3组。每次多肽处理时间为48个小时。将药物处理后的爬片应用于MTT检测。将这样的检测过程反复进行3次,可得出可靠的实验结果。结果如图1所示。
MTT(图1)的检测结果显示,GTC-15多肽在高低中三种浓度下均能够有效的促进二种细胞的增殖,特别是针对皮肤成纤维细胞的增殖效果更明显,在48h内,高浓度的GTC-15多肽最高可以使得皮肤成纤维细胞的OD达到0.39,比对照的0.14显著提高。
实施例3 GTC-15多肽对细胞相应基因的影响PCR检测
将实施例2中HaCat人永生化角质形成细胞对照组和低浓度组处理的细胞二种细胞分别提取RNA进行反转录聚合酶链式反应,反转录体系20µl,含模板RNA;依照TaKaRaRNALAPCRTMKit试剂盒提供说明书进行操作,反应条件为:55℃30分钟,99℃5分钟,5℃5分钟;PCR反应体系为15μl,内含3μl逆转录反应产物,0.9μlMgCl2(25mM),1.2μl PCR反应缓冲液,0.075μlTaq聚合酶,上游引物0.3μl,下游引物0.3μl,以H2O(1‰DEPC)补足体系。PCR 反应条件为:95℃预变性3分钟,95℃变性 1 分钟,58℃退火 55秒,72℃延伸 40 秒,循环 35次,72℃延伸 10 分钟,最后降至 4℃结束反应。具体的引物序列如下:
β-actin:F:5′-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3′,R:5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′
Wnt2:F: 5'-GCCACACGCTGCACCTAAAGC-3',R: 5'-CAATTACCCTAAGGGTGGTAGC-3'
Smad3:F:5′-CATAGGTGCTTTGGGCGTAT-3′,R:5′-GCTGCAAGGTGAAGATGT CA-3′
Survivin:F: 5'-GGCATGGGTGCCCCGACGTTG-3′,R:5'-CAGAGGCCTCAATCCATG GCA-3′,PCR结果如图2所示。
从图2可以看出,Smad3,Wnt2和survivin在转录水平均明显上调。由于Smad3,Wnt2和survivin基因在损伤修复过程中发挥着促进细胞增殖的作用。因此,初步判定所述多肽是通过激活修复通路达到促进细胞增殖的作用。特别是Wnt2的相对表达量可以从70提高达到116左右,survivin可以从110提高到147,促进效果明显。
实施例4 脂肪干细胞的制备
取脂肪组织,PBS清洗3遍,用组织剪将脂肪组织剪成约为1mm3的小块,加入0.1%胶原酶Ⅰ于37℃水浴消化30min后置于离心机中,1200r/min离心5min后留取细胞沉淀,用适量PBS重悬后再次以上述条件离心,弃上清,加入含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,接种于10cm培养皿,细胞浓度为1×109L-1,置于37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱中,48h后换液,观察细胞生长至80%时,加入0.25%胰酶消化后按1︰3传代培养,培养至第3代用于后续实验使用。使用流式细胞仪检测脂肪干细胞表面分子标记取第3代人脂肪干细胞,加入0.25%胰酶消化后制成500μL单细胞悬液,按流式鉴定试剂盒要求分别加入抗人CD90-FITC、CD44-PE、CD105-PerCP、CD73-APC、阴性抗体、阳性抗体各2μL,37℃孵育30min后用PBS清洗3遍,使用流式细胞仪检测。流式细胞仪检测结果显示,超过95%的细胞阳性表达CD73(100%)、CD44(100%)、CD90(99.6%)、CD105(98.7%),而分子标记物CD34、CD45、CD19阴性表达的细胞占99.6%。表明脂肪干细胞分离成功。
实施例5 表皮干细胞外泌体的制备
取包皮皮片,采用DispaseII酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞,Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞。收集处于指数生长期第二三代成纤维细胞的上清液,过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合,并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液,用以人表皮干细胞的体外扩增培养,以角朊细胞作对照。传至第2代,采用免疫组织化学染色检测B1整合素和角蛋白19的表达,发现染色均呈阳性,表明制备得到了表皮干细胞。
取第4代人表皮干细胞,首先用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,待其生长至80%以上时换用无血清的基础培养基继续培养24h,培养过程在37℃,体积分数为5%CO2的恒温温箱中进行;24h后将基础培养基收集至离心管中,0.22μm的过滤器过滤后转移到100ku的超滤浓缩离心管中,4℃条件下以5000×g离心30min,得到含外泌体的浓缩液。将人表皮干细胞外泌体进行数量和大小分布测量:将外泌体制成1mL0.5g/L的溶液,将样品注入样品槽,注满为止,利用NanosightNS300颗粒粒度分析仪检测粒径大小和浓度,利用颗粒粒度分析仪检测到人脂肪干细胞外泌体的大小如图3所示,横坐标代表直径范围,纵坐标代表人脂肪干细胞外泌体的浓度/强度,可以看出大多数外泌体均处于30-110nm直径范围内,浓度达到5mg/ml。
实施例6 小鼠模型的建立
糖尿病足溃疡大鼠模型的制备:取4月龄Wistar大鼠,大鼠按照50mg/kg空腹腹腔注射STZ溶液,配方为用pH4.4、浓度为0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液溶解STZ,其终浓度为10mg/mL,正常对照组空腹腹腔注射等量的柠檬酸一柠檬酸三钠缓冲液,1周后测外周空腹血糖≥16.7mmoI/L,即为大鼠糖尿病造模成功。在糖尿病大鼠的双后足背部做一3mm×6mm的全层矩形皮肤缺损,视为足部溃疡造模成功,并记为第0天。每天用0.5%的碘伏对足部溃疡消毒1次。
实施例7 小鼠模型治疗实验
脂肪干细胞移植组:将脂肪干细胞用PBS制成单细胞悬液,其细胞浓度为5.0×106个/mL。于造模后当天(第0天),脂肪干细胞移植组在双侧后足背皮下,距创缘5mm处、等距6点每个注射点注射50uL的细胞悬液。
表皮干细胞外泌体+脂肪干细胞移植组:将脂肪干细胞用PBS制成单细胞悬液,其中添加表皮干细胞外泌体,二者混匀后,脂肪干细胞浓度为5.0×106个/mL,外泌体的浓度达到1mg/mL。于造模后当天(第0天),表皮干细胞外泌体+脂肪干细胞移植组在双侧后足背皮下,距创缘5mm处、等距6点每个注射点注射50uL的细胞悬液。
表皮干细胞外泌体+脂肪干细胞+GTC-15多肽移植组:将脂肪干细胞用PBS制成单细胞悬液,其中添加表皮干细胞外泌体和GTC-15多肽,三者混匀后,脂肪干细胞浓度为5.0×106个/mL,外泌体的浓度达到3mg/mL,GTC-15多肽的浓度达到1mg/mL。于造模后当天(第0天),表皮干细胞外泌体+脂肪干细胞+多肽移植组在双侧后足背皮下,距创缘5mm处、等距6点每个注射点注射50uL的细胞悬液。
正常足溃疡对照组、糖尿病足溃疡对照组注射等量的PBS。
采集样本:于细胞移植后第6天对足部创面进行数码拍照,并收集足背部创伤组织标本。将组织标本在创面中部用于RT-PCR的检测。创面的愈合率:各时间点对足背创面拍照,Image-Pro Plus 6.0软件计算其面积,并按照公式计算创面愈合率。愈合率=(原始创面面积-当前测量面积)/原始创面面积*100%。RT-PCR检测血管内皮细胞生长因子在创伤组织中mRNA的表达:将第6天的组织提取总RNA,总RNA经RNAisoPlus抽提后,取1ug的总RNA反转录成cDNA,之后采用2OuL反应体系进行PCR反应。大鼠血管内皮细胞生长因子的引物序列:上游5'-GTCCTCACTTGGATCCCGACA-3’,下游5’-CCTGGCAGGCAAACAGACTTC-3’;大鼠GAPDH的引物序列:上游5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’,下游5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。PCR具体参数:95℃预变性30s,95℃变性10s,60℃扩增35s,72℃延伸1min,共35个循环,最后72℃延伸5min。采用2-△△CT计算mRNA的表达量。
愈合率的结果如图4所示。从图4的结果可以看出,本发明采用的脂肪干细胞+外泌体+多肽的组合能够协同显著的促进小数糖尿病溃疡的创面愈合率达到了95%,效果较为显著。
mRNA的表达量变化如图5所示。由于糖尿病小数创面愈合缓慢与其血管生成受损有关,而血管内皮细胞生长因子是最强的促血管生长因子,能够促进血管内皮细胞分裂与增殖,诱导血管生成。从图5的结果可以看出,本发明采用的脂肪干细胞+外泌体+多肽的组合能够协同显著的促进内皮细胞生长因子mRNA的表达,最高达到了4.2,比对照的糖尿病足溃疡对照组的1.4显著提高。
应当理解的是,本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且,应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
序列表
<110> 天津汉青生物科技有限公司
<120> 外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Trp Asn Ile Trp Ser Cys Met Lys Lys Gly Thr Tyr His Asn Arg
1 5 10 15
His Thr Ile Thr Cys Pro Gln Tyr
20

Claims (6)

1.脂肪干细胞与表皮干细胞外泌体协同GTC-15多肽在制备治疗糖尿病患者组织损失修复的药物中的用途,其特征在于:所述GTC-15多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.脂肪干细胞与表皮干细胞外泌体协同GTC-15多肽在制备用于治疗糖尿病患者组织损失修复的药物组合物中的用途,其特征在于:所述GTC-15多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于:所述药物或者药物组合物中进一步的含有药学上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于:其中药学可接受的载体包括任何一种药用适合的辅料。
5.如权利要求4所述的用途,其特征在于:其中药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液。
6.一种干细胞制剂,其特征在于各组分浓度为:
脂肪干细胞浓度为1-9×106个/mL;
表皮干细胞外泌体的浓度1-5mg/mL;
GTC-15多肽的浓度达到1-5mg/mL;
采用生理盐水进行溶解。
CN202110000661.4A 2021-01-04 2021-01-04 外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途 Active CN112316114B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110000661.4A CN112316114B (zh) 2021-01-04 2021-01-04 外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110000661.4A CN112316114B (zh) 2021-01-04 2021-01-04 外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112316114A true CN112316114A (zh) 2021-02-05
CN112316114B CN112316114B (zh) 2021-04-27

Family

ID=74302413

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110000661.4A Active CN112316114B (zh) 2021-01-04 2021-01-04 外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112316114B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113307851A (zh) * 2021-06-11 2021-08-27 北京戴域生物技术有限公司 一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015052527A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Reneuron Limited Microparticles, mirna and wound therapy
CN106620653A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 温州医科大学 一种用于治疗皮肤创面的组合物及其制备方法
CN109793758A (zh) * 2019-02-18 2019-05-24 江苏拓弘生物科技有限公司 间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015052527A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Reneuron Limited Microparticles, mirna and wound therapy
CN106620653A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 温州医科大学 一种用于治疗皮肤创面的组合物及其制备方法
CN109793758A (zh) * 2019-02-18 2019-05-24 江苏拓弘生物科技有限公司 间充质干细胞外泌体微针贴剂及其制备和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENGGUI WANG等: "Engineering Bioactive Self-Healing Antibacterial Exosomes Hydrogel for Promoting Chronic Diabetic Wound Healing and Complete Skin Regeneration", 《THERANOSTICS》 *
张筱薇等: "脂肪间充质干细胞在糖尿病足治疗中的研究进展", 《中国美容医学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113307851A (zh) * 2021-06-11 2021-08-27 北京戴域生物技术有限公司 一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112316114B (zh) 2021-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112691186B (zh) 包含间充质干细胞和外泌体的组合物及其组织修复中的应用
Chunmeng et al. Effects of dermal multipotent cell transplantation on skin wound healing
KR101851925B1 (ko) 제대 조직―유래 세포를 사용한 말초 혈관 질환의 치료
JP2011525370A5 (zh)
CN110713984B (zh) 诱导人间充质干细胞生成功能内皮细胞的方法
CN113563452B (zh) 一种生物活性肽及其与脂肪干细胞外泌体在皮肤增殖修复中的应用
KR20190128622A (ko) 주산기 조직 유래된 중간엽 줄기 세포: 그의 제조 방법 및 용도
CN110577931A (zh) 间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用
IL298107B1 (en) Compounds containing stem cells derived from adipose tissue for use in the treatment of recurrent symptoms of complex rectal abscesses in Crohn&#39;s disease
CN111956668B (zh) 一种皮肤再生修复细胞组合物及制备方法
CN114874982B (zh) 一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法
CN109517789B (zh) Ghrelin活性剂用于诱导干细胞向软骨细胞分化
CN112316114B (zh) 外泌体用于提高间充质干细胞组织修复功能的用途
CN114807015B (zh) 一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用
CN110903348B (zh) 一种促进伤口愈合的小肽及其应用
US20090068154A1 (en) Cell Composition for Transplant
JP4247333B2 (ja) 皮膚組織改善材およびその製造方法
Wang et al. Impaired cutaneous T-cell attracting chemokine elevation and adipose-derived stromal cell migration in a high-glucose environment cause poor diabetic wound healing
CN113730439A (zh) 能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉及其制备方法和应用
CN116426469B (zh) LAP2α在间充质干细胞成脂向分化中的应用
CN115011554B (zh) 骨髓间充质干细胞的外泌体、体外培养方法以及应用
Hao et al. Amniotic membrane extract-enriched hydrogel augments the therapeutic effect of menstrual blood-derived stromal cells in a rat model of intrauterine adhesion
CN107056895B (zh) 诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的人工多肽及其生物制品
Ren et al. Three-dimensional cultivation of human adipose-derived stem cells with human decellularized adipose tissue matrix scaffold promotes diabetic wound healing
KR100725133B1 (ko) 자가혈청과 태반추출물을 이용한 섬유아세포의 배양방법 및이를 이용한 피부재생용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210407

Address after: Room 1906, block a, electronic technology building, 2070 Shennan Middle Road, Fuqiang community, Huaqiangbei street, Futian District, Shenzhen, Guangdong 518000

Applicant after: Zhongke Tiancheng (Shenzhen) Group Co.,Ltd.

Address before: 31847, door 3, 4, building 1, Haigang Pioneer Park, Port Economic Zone, Binhai New Area, Tianjin

Applicant before: Tianjin Hanqing Biotechnology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant