CN116870241A - 一种原位形成的双网络水凝胶敷料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种原位形成的双网络水凝胶敷料及其制备方法与应用。双网络水凝胶敷料是通过将H2O2(过氧化氢)、HRP(辣根过氧化物酶)、Tsg‑Tyr(罗非鱼皮明胶‑酪胺)和FucC‑Tyr(羧基化岩藻多糖‑酪胺)混合在Aga(琼脂糖)中，利用HRP/H2O2的催化交联和Aga的溶胶‑凝胶转变所构建。TF双网络水凝胶具有快速和可调节的凝胶化，Aga的加入进一步增强了水凝胶的稳定性。TF双网络水凝胶良好的三维网孔结构，将有利于伤口处的营养物质的交换。此外，TF双网络水凝胶在体外展示了优异的抗氧化性能和生物相容性。同时，在体内全层伤口愈合实验中，TF双网络水凝胶能够有效加速伤口愈合。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种原位形成的双网络水凝胶敷料及其制备方法与应用。
背景技术
皮肤在现实的生活中，极易受到烧伤、擦伤等损伤，破坏皮肤的完整性，影响人体的正常生活。这些损伤未及时处理可能导致皮肤组织的深层次损伤，形成慢性伤口，进一步影响人体健康。迄今为止，包括膜、水胶体和水凝胶等各种伤口敷料被广泛的开发利用。传统的伤口敷料，可以作为伤口外部环境的屏障，保护伤口免受外界的影响。但是，合适的伤口敷料应该具有良好的生物相容性、维持伤口湿润环境和抗氧化等优异的生物功效，才能在伤口愈合中展现出更好的治疗效果。
明胶作为一种由胶原蛋白部分水解获得的天然聚合物，其在生理环境中具有良好的生物降解性和生物相容性。目前，明胶已经作为生物医用材料应用于骨修复和伤口修复等领域。然而，单一网络的水凝胶在复杂的生理环境中可能表现出较差的稳定性。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本文提供了一种原位形成的双网络水凝胶敷料及其制备方法与应用，利用罗非鱼皮明胶(Tsg)和褐藻类岩藻多糖(Fuc)组成的水凝胶伤口敷料，具有可控的凝胶化时间，良好的生物相容性，能够促进伤口愈合。
本发明为实现技术目的采用的技术方案为：
本发明提供了一种原位形成的双网络水凝胶敷料，是通过将H2O2(过氧化氢)、HRP(辣根过氧化物酶)、Tsg-Tyr(罗非鱼皮明胶-酪胺)和FucC-Tyr(羧基化岩藻多糖-酪胺)混合在Aga(琼脂糖)中，利用HRP/H2O2的催化交联和Aga的溶胶-凝胶转变所构建。
本发明还提供了一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，包括：将H2O2和HRP分别溶于Aga溶液中，然后分别加入到含有Tsg-Tyr和FucC-Tyr的Aga混合溶液中，震动混合物，形成凝胶，随后保持在低温下，得到TF双网络水凝胶。
优选地，所述Aga溶液通过以下方法制备：将Aga溶解在去离子水中，溶解得到1％(w/v，质量体积比，单位g/mL)的Aga溶液，然后冷却使用。
优选地，H2O2在Aga溶液中的浓度为0.02～0.1mmol/mL，更优选0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mmol/mL；HRP在Aga溶液中的浓度为0.1～0.5mg/mL，更优选0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL。
优选地，含有Tsg-Tyr和FucC-Tyr的Aga混合溶液的浓度均为0％、3％、5％、7％和9％(w/v，质量体积比，单位g/mL)，其中，Tsg-Tyr：FucC-Tyr＝1:1(w/w)。
优选地，分别溶解有H2O2和HRP的Aga溶液与含有Tsg-Tyr和FucC-Tyr的Aga混合溶液的体积比为1：4。
优选地，形成凝胶后，在2～8℃保持24h，得到TF双网络水凝胶。
优选地，Tsg-Tyr通过以下方法制备：
1-1)将Tsg悬浮在MES(吗啉乙磺酸)水溶液中加热，待Tsg溶解后，将溶液冷却。
1-2)将Tyr、EDC和NHS加入到步骤1-1)冷却后的溶液中，搅拌后，将合成的聚合物溶液透析。样品随后冻干，得到产物Tsg-Tyr。
更优选地，步骤1-1)中，Tsg与MES(吗啉乙磺酸)水溶液的质量体积比(g/mL)是1:50；和/或MES(吗啉乙磺酸)水溶液的摩尔浓度是50mM。
更优选地，步骤1-2)中，Tyr、EDC和NHS的重量比是1：0.73：0.22，在25℃搅拌12h。
优选地，FucC-Tyr通过以下方法制备：
2-1)将Fuc加入NaOH和异丙醇溶液，冰浴、搅拌后制成均匀悬浊液。
2-2)将溶有氯乙酸和NaOH的异丙醇混合液缓慢滴入步骤2-1)的反应体系中，逐渐升温，
搅拌，停止反应，冷却至室温，调节pH至中性。透析后旋转蒸发溶液，冷冻干燥，
得到羧甲基化岩藻多糖(FucC)。
2-3)将FucC溶解在蒸馏水中，然后加入EDC和NHS，并将溶液的酸碱度调节至5.5～6.5。混合物在室温下搅拌，然后加入Tyr。随后，反应在25℃下搅拌2天，去离子水透析。最后，冷冻干燥，得到产物FucC-Tyr。
更优选地，步骤2-1)中，每120mg Fuc加入10mL 20％NaOH(w/v)和25mL的异丙醇溶液。
更优选地，步骤2-2)中，溶有氯乙酸和NaOH的异丙醇混合液是在每25mL异丙醇溶有3g氯乙酸与10mL 20％(w/v)NaOH，该混合液与反应体系的体积比为1：1，升温至60℃，搅拌时间为3h。
更优选地，步骤2-3)中，FucC、EDC、NHS和Tyr的重量比是1：1.8：1：4。
本发明又提供了上述双网络水凝胶敷料在制备用于改善全层伤口愈合的产品中的应用。
本发明的上述技术方案具有如下优势：
本发明制备的TF双网络水凝胶具有快速和可调节的凝胶化，Aga的加入进一步增强了水凝胶的稳定性。TF双网络水凝胶良好的三维网孔结构，将有利于伤口处的营养物质的交换。此外，TF双网络水凝胶在体外展示了优异的抗氧化性能和生物相容性。同时，在体内全层伤口愈合实验中，TF双网络水凝胶能够有效加速伤口愈合。
附图说明
图1是本发明实施例的水凝胶敷料外观图；
图2是本发明测试例1的凝胶时间测试图；
图3是本发明测试例2的水凝胶敷料SEM图；
图4是本发明测试例3水凝胶敷料的力学性能测试图；
图5是本发明测试例4水凝胶敷料的抗氧化效果图；
图6是本发明测试例5水凝胶敷料的细胞相容性测试图；
图7是本发明测试例6水凝胶敷料的治疗伤口图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和功能特点更加清楚，下面将结合附图，在实施例中对本发明中的技术方案进行进一步完整的描述。
本发明中，“室温”可以是“25℃±5℃”。
实施例1
本发明一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
1、Tsg的接枝酪氨改性：将2g Tsg悬浮在100mL吗啉乙磺酸溶液(50mM)中，加热溶解后，将溶液冷却至室温。将1g Tyr、0.73g EDC和0.22g NHS加入到该溶液中，并在25℃搅拌12h后，将聚合物溶液透析(MW：3500)，样品随后冻干，得到产物Tsg-Tyr。
2、Fuc的接枝酪氨改性：首先对岩藻多糖进行羧甲基化，称量120g岩藻多糖，加入10mL 20％NaOH(即质量浓度20g/100mL)和25mL异丙醇溶液，冰浴、搅拌后制成均匀悬浊液。将混合液缓慢滴入反应体系中，逐渐升温至60℃，搅拌，冷却至室温，调节pH＝7，透析后旋转蒸发溶液，冷冻干燥，得到羧甲基化岩藻多糖(FucC)。将0.50g FucC溶解在100mL蒸馏水中，然后加入0.90g EDC和0.50g NHS，调节酸碱度至5.5～6.5。混合物在室温下搅拌30min，然后加入2g Tyr。随后，在25℃下搅拌2天。在去离子水中透析(MW：3500)48h后，将透析液冷冻干燥，得到产物FucC-Tyr。
3、1gAga溶解在100mL去离子水中，冷却至50℃使用。用上述Aga溶液制备一定浓度的H2O2溶液和HRP溶液，H2O2浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mmol/mL，HRP浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL。
将制备的含有H2O2和HRP的Aga溶液各0.05mL分别加入到0.2mL含有Tsg-Tyr和FucC-Tyr的浓度为0％、3％、5％、7％和9％w/v(单位g/mL，对应每100mLAga溶液中含有Tsg-Tyr/FucC-Tyr的重量为0g、3g、5g、7g和9g)，Tsg-Tyr:FucC-Tyr＝1:1(w/w，质量比)的Aga溶液中，并振动混合物，快速形成单一网络水凝胶。随后，在2～8℃下保持24h，得到双网络水凝胶(TF)。根据最初Tsg-Tyr与FucC-Tyr的混合物的浓度为0％、3％、5％、7％和9％w/v，所得水凝胶分别命名为Aga、TF-3、TF-5、TF-7和TF-9等水凝胶。
上述所制备的水凝胶敷料的外观如图1所示。TF-9水凝胶呈现透明状胶体状态，具有良好的凝胶体系。
测试例1凝胶时间测试
测试了HRP(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL)、H2O2(0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mmol/mL)和聚合物浓度(0％、3％、5％、7％和9％w/v)对凝胶时间的影响。根据上述TF水凝胶的制备方法，我们利用倒置法，倾斜离心管后60s内没有流下被认为是凝胶状态，记录胶凝时间，测定了水凝胶的凝胶时间变化。
结果如图2所示，当聚合物浓度为9％时，凝胶时间仅为4s，这将非常有利于对于伤口复杂环境下的紧急处理。这主要是由于聚合物中酚基团含量的增加，促进了水凝胶之间的共价交联反应。
测试例2扫描电镜测试
根据实施例1制备水凝胶，用扫描电子显微镜观察TF-9水凝胶的孔形态。利用冷冻干燥的样品，获得内部横截面，然后溅射一薄层金，用于内部形貌研究。
实验结果如图3所示，TF-9水凝胶相对于原始的Tsg，具备更加稳定的三维网孔结构和更加均匀的孔隙结构，这可能有利于对伤口渗出物的吸收和止血。
测试例3力学性能测试
使用材料测试仪(Instron 3343，Instron，USA)对各组水凝胶的力学性能进行了分析。对放置在金属板之间的圆柱型柱状水凝胶进行压缩测试。
实验结果如图4所示，结果表明，随着聚合物浓度的增加，TF水凝胶的压缩强度逐渐增加。这些增强的机械性能可能是由于聚合物中酚基团增加，聚合物之间共价交联程度增加所导致的。
测试例4抗氧化性能测试
通过清除DPPH自由基的方法，评估各组水凝胶的抗氧化性能。用组织研磨机将水凝胶切割成匀浆。然后将DPPH和水凝胶匀浆分散于乙醇中，以PBS为空白组。混匀后在暗处孵育。紫外-可见分光光谱测定混合物的吸光度。DPPH清除率的计算公式如下：
其中，As是样品吸光度，Ac是对照吸光度。
实验结果如图5所示，TF水凝胶的抗氧化能力，将促进其在伤口复杂环境中的应用，增加了它们在伤口治疗中的应用潜力。
测试例5水凝胶敷料的细胞相容性测试
采用MTT法，利用小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)进行细胞相容性实验。将NIH-3T3细胞在普通培养基培养，24h后，将原本的培养基则替换为含有不同浓度TF-9水凝胶浸提液的培养基继续培养。在第1天和第3天用MTT法测定每组细胞的增殖情况。
结果如图6所示，结果表明，TF-9未影响NIH-3T3细胞的代谢活性，具有良好的细胞活性。
测试例6动物伤口愈合测试
利用大鼠背部全层皮肤缺损模型评价水凝胶的促伤口修复性能。在皮肤缺损部位放置制备的水凝胶制成的伤口敷料，其中，对照组大鼠的皮肤缺损部位未治疗(C组)，阳性对照组为P组，TF-9治疗组(Y组)。在第0、4、8和12天拍摄伤口部位的照片并记录，实验结果如图7所示。
结果表明，Y组创面恢复速度快于C组和P组，在第12天创面基本完全愈合。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种原位形成的双网络水凝胶敷料，是通过将H2O2、HRP、Tsg-Tyr和FucC-Tyr混合在Aga中，利用HRP/H2O2的催化交联和Aga的溶胶-凝胶转变所构建。
2.一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，包括：将H2O2和HRP分别溶于Aga溶液中，然后分别加入到含有Tsg-Tyr和FucC-Tyr的Aga混合溶液中，震动混合物，形成凝胶，随后保持在低温下，得到TF双网络水凝胶。
3.根据权利要求2所述的一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述Aga溶液通过以下方法制备：将Aga溶解在去离子水中，溶解得到1％(w/v)的Aga溶液，然后冷却使用；和/或H2O2在Aga溶液中的浓度为0.02～0.1mmol/mL，HRP在Aga溶液中的浓度为0.1～0.5mg/mL。
4.根据权利要求2所述的一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，含有Tsg-Tyr和FucC-Tyr的Aga混合溶液的浓度均为0％、3％、5％、7％和9％(w/v)，其中，Tsg-Tyr：FucC-Tyr＝1:1(w/w)。
5.根据权利要求2所述的一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，分别溶解有H2O2和HRP的Aga溶液与含有Tsg-Tyr和FucC-Tyr的Aga混合溶液的体积比均为1：4；和/或形成凝胶后，在2～8℃保持24h，得到TF双网络水凝胶。
6.根据权利要求2所述的一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，Tsg-Tyr通过以下方法制备：
1-1)将Tsg悬浮在MES水溶液中加热，待Tsg溶解后，将溶液冷却。
1-2)将Tyr、EDC和NHS加入到步骤1-1)冷却后的溶液中，搅拌后，将合成的聚合物溶液透析，样品随后冻干，得到产物Tsg-Tyr。
7.根据权利要求6所述的一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤1-1)中，Tsg与MES水溶液的质量体积比是1:50，MES水溶液的摩尔浓度是50mM；和/或步骤1-2)中，Tyr、EDC和NHS的重量比是1：0.73：0.22，在25℃搅拌12h。
8.根据权利要求2所述的一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，FucC-Tyr通过以下方法制备：
2-1)将Fuc加入NaOH和异丙醇溶液，冰浴、搅拌后制成均匀悬浊液；
2-2)将溶有氯乙酸和NaOH的异丙醇混合液缓慢滴入步骤2-1)的反应体系中，逐渐升温，搅拌，停止反应，冷却至室温，调节pH至中性，透析后旋转蒸发溶液，冷冻干燥，
得到羧甲基化岩藻多糖；
2-3)将FucC溶解在蒸馏水中，然后加入EDC和NHS，并将溶液的酸碱度调节至5.5～6.5，
混合物在室温下搅拌，然后加入Tyr，随后，反应在25℃下搅拌2天，去离子水透析，最后，冷冻干燥，得到产物FucC-Tyr。
9.根据权利要求8所述的一种原位形成的双网络水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤2-1)中，每120mg Fuc加入10mL 20％(w/v)NaOH和25mL的异丙醇溶液；和/或步骤2-2)中，溶有氯乙酸和NaOH的异丙醇混合液是在每25mL异丙醇溶有3g氯乙酸与10mL 20％(w/v)NaOH，该混合液与反应体系的体积比为1：1，升温至60℃，搅拌时间为3h；和/或步骤2-3)中，FucC、EDC、NHS和Tyr的重量比是1：1.8：1：4。
10.权利要求1所述的一种原位形成的双网络水凝胶敷料在制备用于改善全层伤口愈合的产品中的应用。
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