PL240714B1 - Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej - Google Patents

Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej Download PDF

Info

Publication number
PL240714B1
PL240714B1 PL430801A PL43080119A PL240714B1 PL 240714 B1 PL240714 B1 PL 240714B1 PL 430801 A PL430801 A PL 430801A PL 43080119 A PL43080119 A PL 43080119A PL 240714 B1 PL240714 B1 PL 240714B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
tissue
culture
fragments
medium
chondrocytes
Prior art date
Application number
PL430801A
Other languages
English (en)
Other versions
PL430801A1 (pl
Inventor
Sławomir JAROS
Sławomir Jaros
Grzegorz SOBIERAJ
Grzegorz Sobieraj
Julia Balcerek
Original Assignee
Arthec Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arthec Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia filed Critical Arthec Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL430801A priority Critical patent/PL240714B1/pl
Priority to PCT/EP2020/071826 priority patent/WO2021023718A1/en
Priority to FIEP20750270.9T priority patent/FI4007615T3/fi
Priority to US17/632,141 priority patent/US20220265899A1/en
Priority to JP2022533249A priority patent/JP2022543174A/ja
Priority to EP20750270.9A priority patent/EP4007615B8/en
Priority to PT207502709T priority patent/PT4007615T/pt
Priority to ES20750270T priority patent/ES2967034T3/es
Priority to KR1020227006953A priority patent/KR20220042423A/ko
Priority to CN202080069155.4A priority patent/CN114466923B/zh
Priority to DK20750270.9T priority patent/DK4007615T3/da
Priority to CA3149427A priority patent/CA3149427A1/en
Priority to HUE20750270A priority patent/HUE064647T2/hu
Publication of PL430801A1 publication Critical patent/PL430801A1/pl
Priority to IL290282A priority patent/IL290282A/en
Publication of PL240714B1 publication Critical patent/PL240714B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3612—Cartilage, synovial fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

PL 240 714 B1
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy ogólnie uzyskiwania tkanki jako materiału w leczeniu każdego uszkodzenia tkanki chrzęstnej, zwłaszcza w wyniku urazowego uszkodzenia chrząstki, zwyrodnieniowego lub degeneracyjnego uszkodzenia chrząstki. Dokładniej, wynalazek dotyczy sposobu prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej.
Zapalenie kości i stawów (ang. osteoarthritis, OA), czyli choroba zwyrodnieniowa stawów, charakteryzuje się bólem stawu oraz jego dysfunkcją powodowanymi postępującym i nieodwracalnym procesem utraty chrząstki stawowej. Stanowi ona piątą co do wielkości przyczynę niepełnosprawności w populacji Stanów Zjednoczonych, zaraz za chorobami układu sercowo - naczyniowego, mózgowo naczyniowego, czy układu oddechowego. Głównym czynnikiem ryzyka zachorowania na OA jest wiek. Istnieją też dodatkowe czynniki takie jak otyłość, urazy okolic stawowych, intensywna aktywność fizyczna, np. wyczynowe uprawianie sportu.
Liczba zdiagnozowanych przypadków OA w wielu krajach wciąż rośnie, np. w USA w latach 1995-2005 odnotowano wzrost o około 6 milionów (Lawrence RC, Felson DT, Helmick CG, et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. Part II. Arthritis Rheum. 2008; 58(1):26-35; Lawrence RC, Helmick CG, Arnett FC, et al. Estimates of the prevalence of arthritis and selected musculoskeletal disorders in the United States. Arthritis Rheum. 1998; 41:778799). Jednocześnie obserwuje się wzrost szerszej populacji osób cierpiących na choroby zwyrodnieniowe i reumatyczne. Liczba zdiagnozowanych przypadków zwyrodnień w Ameryce ma osiągnąć 67 mln, czyli 25% dorosłej populacji do roku 2030, z których 25 mln, czyli 9,3% dorosłej populacji, ma doświadczyć ograniczeń sprawności ruchowej (Hootman JM, Helmick CG. Projections of U.S. prevalence of arthritis and associated activity limitations. Arthritis Rheum. 2006; 54:226-229). Wynikiem tych trendów jest wzrost poziomu negatywnych konsekwencji w zakresie jakości życia, jak też ogromnego wzrostu kosztów systemów ochrony zdrowia.
Niemalże każdy pacjent leczony operacyjnie z powodu rozległych zmian zwyrodnieniowych stawów, szczególnie stawu kolanowego, biodrowego, barkowego i skokowego, w okresie poprzedzającym rozwój uogólnionych zmian stawowych przechodzi okres, w którym destrukcja chrzęstnych powierzchni stawowych jest limitowana do pojedynczego ogniska. Jest ono źródłem powoli „rozlewającego się” po stawie procesu degeneracyjno - zwyrodnieniowego. Wraz z poprawą dostępu pacjenta do wysokospecjalistycznych narzędzi diagnostycznych - jak np. rezonans magnetyczny MRI i artroskopia - skrócił się czas wykrywania punktów zapalnych choroby. Obecnie nie rozpoznaje się choroby zwyrodnieniowej stawu na poziomie zmian radiologicznych w obrazach RTG - gdzie zwykle obejmowały one znaczną część stawu i wymagały leczenia protezoplastyką całkowitą stawu. Wciąż jednakże pacjenci nadal nie mogą liczyć na uniknięcie zabiegu protezoplastyki stawu, ze względu na brak dobrych narzędzi do terapii małych lub średnich uszkodzeń chrząstki stawowej. Kolejnym etapem leczenia w związku z powyższym jest częściowa bądź powierzchniowa protezoplastyka stawu, która niestety również nie daje gwarancji pełnego wyleczenia bez konieczności powtórzenia operacji.
Endoprotezy całkowite nadal nie rozwiązują problemu mobilności, sprawności pacjenta i uniknięcia powikłań pooperacyjnych. Sprawność pacjenta po zbiegu operacyjnym wszczepienia endoprotezy całkowitej stawu jest znacznie ograniczona w okresie 3 miesięcy, do pełnej sprawności pacjenci wracają rzadko. Poziom zadowolenia pacjenta mierzony stopniem redukcji dolegliwości bólowych i poprawą funkcji operowanej kończyny jest różny. Główne problemy pooperacyjne protezoplastyki stawów to poziom bólu, funkcji kończyny, akceptacji skutków samej operacji. Wycięcie stawu oznacza jego definitywne zniszczenie - kolejnym etapem może być tylko jeszcze rozleglejsze wycięcie tkanek i wszczepienie jeszcze większego implantu - co przy drugiej, trzeciej operacji kończy się zwykle trwałym kalectwem.
Z tego względu poszukuje się innych rozwiązań terapeutycznych, zwłaszcza wśród metod hodowli komórkowych, z zakresu przeszczepów materiału uzyskanego w hodowli komórkowej, jak przeszczep autologicznych chondrocytów.
Metody klasyfikowane jako „premium” takie jak technologie oparte na łożyskach, czy odnawianie powierzchni stawowych zostały wprowadzone jako odpowiedź na potrzebę zapewnienia pacjentom możliwości zachowania aktywności fizycznej, jak też wydłużenia czasu, w którym implant musi pozostać sprawny, ale koszt tych technologii jest znacznie wyższy. Rosnąca populacja osób młodszych, którym należałoby zaproponować droższe typy implantów będzie prowadzić do coraz większych obciążeń systemów ochrony zdrowia.
PL 240 714 B1
Na całym świecie obserwuje się wzrost ilości zabiegów w zakresie endoprotez. Rośnie sama liczba zabiegów, populacja pacjentów dotknięta zwyrodnieniami tkanki prowadzącymi do konieczności wykonania tych zabiegów, jak również spada wiek, w którym wykonuje się pierwszy zabieg. Dane zaprezentowane poniżej wskazują na istnienie potrzeby medycznej, do której odnosi się niniejszy wynalazek. W badaniach przeprowadzonych przez Kurtza i współpracowników (Kurtz SM et al. Future Young Patient Demand for Primary and Revision Joint Replacement: National Projections from 2010 to 2030, Clin Orthop Relat Res. 2009 Oct; 467(10): 2606-2612) potwierdzono tezę wzrostu populacji pacjentów młodszych. W roku 1993 liczba zabiegów związanych z pierwotnym lub wtórnym wszczepieniem implantu biodra (ang. total hip arthroplasty, THA) wykonanych u pacjentów poniżej 65 roku życia stanowiła 32%. W przypadku implantów kolana ta wartość wynosiła około 26%. W roku 2006 odnotowano wzrost proporcji pacjentów młodszych poddawanych THA do 40-46% w zakresie pierwotnych lub wtórnych rewizji. W przypadku TKA (ang. total knee arthroplasty, TKA) wartości dla pierwotnych zabiegów to 41%, dla wtórnych 44%. W przypadku pacjentów poniżej 65 lat wyraźne wzrosty częstotliwości są oczekiwane w przypadku pierwotnych THA, jak również pierwotnych i wtórnych TKA. Aktualnie najprawdopodobniej zmierzamy do przekroczenia bariery 50% zabiegów wykonywanych u pacjentów młodszych. Wyliczenia wskazują, iż w roku 2030 pierwotne THA wykonywane u pacjentów młodszych będzie stanowić 52%, pierwotne TKA 55%, wtórne TKA 62%. Najbardziej intensywny wzrost konieczności leczenia jest spodziewany w kategorii osób w wieku 45-54 lata, czyli istotnej z punktu widzenia społecznego i ekonomicznego. Oczekuje się, iż w tej grupie liczba zabiegów TKA (ang. total knee arthroplasty) w USA wzrośnie z około 59 000 w 2006 r. do około 994 000 w roku 2013, zatem spodziewany jest 17 - krotny przyrost. Prognozy dla THA (ang. total hip arthroplasty) mówią o 5,9 - krotnym wzroście liczby operacji. Projekcje w zakresie ilości wykonanych operacji założenia protezy stawu kolanowego wskazują prawdopodobny wzrost o 174% od roku 2005 do roku 2030, co będzie stanowić 572 000 zabiegów w ostatnim roku prognozy. W przypadku artroplastyki kolana, prognozowany wzrost ma być jeszcze większy, i wynieść 673% do roku 2030, co ma stanowić około 3,5 mln operacji.
Wzrosty te powodują konieczność poszukiwania alternatywnych metod leczenia. Zabiegi te są często długie, obciążające czas pracy chirurgów. W przypadku tak intensywnego przyrostu zapotrzebowania na terapie stawów istnieje ryzyko istotnego wydłużenia czasu oczekiwania na zabieg, w którym to z racji upośledzenia ruchowego i silnego bólu pacjenci będą nieproduktywni, jak również będą obciążać dodatkowo systemy opieki społecznej i zdrowotnej.
Jedną z nowych metod jest autologiczny przeszczep chondrocytów (ang. autologous chondrocyte implantation, ACI) polega na pobraniu fragmentu chrząstki pacjenta z niezniszczonej części stawu, izolacji chondrocytów, namnożeniu ich in vitro, a następnie wszczepieniu w miejsce uszkodzenia chrząstki zawiesiny komórek.
Znane metody hodowli komórek - chondrocytów do celów terapeutycznych, polegają na pobraniu fragmentu tkanki chrzęstnej, poddaniu jej enzymatycznemu trawieniu a następnie przeprowadzeniu hodowli otrzymanych komórek - chondrocytów, z wykorzystaniem wybranego podłoża. Znanych jest wiele metod enzymatycznych uzyskiwania zawiesiny chondrocytów do dalszej hodowli komórkowej. W tym celu wykorzystywane są różne rodzaje i kombinacje enzymów jak kolagenaza II, trypsyna or az połączenia enzymów takie jak: kolagenaza II i hialuronidaza, trypsyna i kolagenaza II, pronaza i kolagenaza P. W ten sposób uzyskane chondrocyty przenoszone są następnie do odpowiedniego podstawowego podłoża hodowlanego. Znanych jest wiele mediów hodowlanych stosowanych do hodowli chondrocytów takie jak: mieszanina mediów Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/Ham's F12-, medium Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM), medium Ham’s F-12 czy medium CMRL 1415 lub RPMI 1640. Podczas hodowli chondrocytów stosowane są również suplementy takie jak: glutamina oraz dodatkowo kwas askorbinowy, ITS-A (ang. Insulin-Transferin-Selenium-A) czy TGF-e1 i IGF-1.
Znane media hodowlane zawierają szereg składników niezbędnych do prawidłowego wzrostu komórek, takich jak: aminokwasy, sole, składniki buforujące, glukozę oraz składniki dodatkowe jak barwniki. W zależności od medium stężenia i kombinacje wymienionych składników są różne i specyficzne.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium) zawiera: wapnia chlorek bezwodny, żelaza azotan dziewięciowodny, potasu chlorek, magnezu siarczan bezwodny, sodu chlorek, sodu wodorowęglan, potasu fosforan jednozasadowy jednowodny, D-glukoza, L-argininy chlorowodorek, L-cystyny dichlorowodorek, L-glutamina, glicyna, L-histydyny chlorowodorek jednowodny, L-izoleucyna, L-leucyna, L-lizyny
PL 240 714 B1 chlorowodorek, L-metionina, L-fenyloalanina, L-seryna, L-treonina, L-tryptofan, disodu L-tyrozyna dwuwodna, L-walina, wapnia D-pantotenian, choliny chlorek, kwas foliowy, i-inozytol, niacynamid, ryboflawina, tiaminy chlorowodorek, pirydoksyny chlorowodorek) z solą sodową kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego.
Medium Ham’s F-12 zawiera: wapnia chlorek bezwodny, siarczan miedziowy pięciowodny, siarczan żelazawy siedmiowodny, chlorek magnezu, chlorek potasowy, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny, siarczan cynku siedmiowodny, L-alaninę, L-argininy chlorowodorek, L-asparaginę jednowodną, kwas L-asparaginowy L-cysteiny chlorowodorek, kwas L-glutaminowy, L-glutaminę, glicynę, L-histydyny trichlorowodorek jednowodny, L-izoleucynę, L-leucynę, L-lizyny chlorowodorek, L-metioninę, L-fenyloalaninę, L-prolinę, L-serynę, L-treoninę, L-tryptofan, L-tyrozynę dwuzasadową dwuwodną, L-walinę, D-biotynę, chlorek choliny, kwas foliowy, mio-inozytol, niacynamid, kwas D-pantotenowy (hemicalcium), pirydoksyny chlorowodorek, ryboflawinę, tiaminy chlorowodorek, witaminę B12, D-glukozę, hipoksantynę, kwas linolowy, fenolową czerwień, putrescyny chlorowodorek, kwas pirogronowy jednozasadowy, tymidynę.
Do pasażowania chondrocytów wykorzystuje się roztwór Trypsyna - EDTA. Zdarza się również, że oprócz medium podstawowego do hodowli nie dodaje się żadnych suplementów i antybiotyków.
Wybór podstawowego podłoża hodowlanego oraz suplementów i zastosowanie ich w odpowiednich stężeniach czy kombinacjach jest ściśle związane z pożądanym celem. Inaczej wygląda schemat układania podłoża hodowlanego w przypadku nastawienia na szybkie namnożenie komórek, inaczej gdy celem jest zahamowanie różnicowania chondrocytów czy zwiększona produkcja kolagenu typu II.
Hodowla chondrocytów może być adherentna lub zawiesinowa. Zawiesinowa jest wtedy, kiedy przez cały czas trwania komórki nie przyklejają się do powierzchni płytki - dzielą się w zawiesinie, komórki pływają w medium.
Znana jest hodowla chondrocytów in vitro adherentna w monowarstwie, kiedy komórki przeklejone są do powierzchni płytki. Zarówno hodowla adherentna jak i zawiesinowa mają głównie na celu namnożenie komórek do odpowiedniej ilości i o odpowiedniej charakterystyce. Otrzymane w ten sposób komórki mają szerokie zastosowanie. Od bezpośredniego wszczepienia ich w formie zawiesiny pacjentowi, od którego zostały w postaci chrząstki pobrane, po tworzenie różnego rodzaju struktur, które, dopiero w uzyskanej nowej formie, są przeszczepiane pacjentowi.
Znane są metody uzyskiwania komórek do przeszczepu w warunkach in vitro, które polegają na zastosowaniu tzw. kleju tkankowego. Jako klej tkankowy wykorzystuje się takie składniki jak: fibrynogen, trombina, roztwór chlorku wapnia i aprotynina. Składniki aplikuje się za pomocą dwóch strzykawek połączonych specjalnym łącznikiem. W ciągu kilkunastu sekund od połączenia składników powstaje klej, który wraz z zawiesiną chondrocytów tworzy roztwór stosowany do przeszczepu o adhezyjności w miejscu ubytku.
Coraz bardziej popularne wydają się być hodowle z wykorzystaniem różnego rodzaju związków, pokrywających powierzchnię płytek, butelek i innych naczyń hodowlanych celem wymuszenia na nich wzrostu komórek chrząstki. Do najpowszechniejszych należą: agaroza, Poly-HEMA (ang. poly-2-hydroxyethyl-methacrylate), alginian, nanowłókna Xano - Matrix (zbudowane z tereftalanu polietylenu i octanu celulozy), mikrosfery z biodegradowalnego PLGA (ang. DL-lactic-co-glycolic acid) czy naturalne i syntetyczne hydrożele. Adherentne właściwości chondrocytów są również wykorzystywane w prowadzeniu hodowli 3D z zastosowaniem dedykowanej do tego celu konstrukcji czy szkieletu jak np. Gelfoam® (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI) czy BD™ Three-Dimensional Collagen Composite Scaffold. Wykorzystanie specjalnych mikronośników różnego rodzaju umożliwia znaczne zwiększenie powierzchni hodowli oraz perfuzję podłoża hodowlanego.
Znane jest również wykorzystanie sztucznych struktur naśladujących naturalnie występujące kość i chrząstkę.
Znane metody jednakże nie pozwalają na uzyskanie tkanki o właściwej budowie i cechach biologicznych jak najbardziej przypominających naturalną tkankę.
Próby leczenia ubytków chrząstki za pomocą terapii biologicznej są wynikiem metodyki prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów uzyskanych z izolowanej tkanki, a następnie podaniem ich w zawiesinie do stawu.
Przykładem tego rodzaju produktu stanowiącego zawiesinę komórek jest Carticell. Leczenie polegało na biopsji chrząstki podczas artroskopii, po czym namnożeniu komórek in vitro. Po odpowiednim czasie komórki podawano z powrotem do stawu pod klapę okostnową podczas drugiego zabiegu. Była to pierwsza tego typu terapia zatwierdzona przez amerykańskie FDA (Food and Drug Administration).
PL 240 714 B1
Aktualna generacja produktu nazywa się MACI (Genzyme Biotech). Badania kliniczne były prowadzone na relatywnie małej populacji. Punktem końcowym była minimum 10 punktowa poprawa w skalach KOOS Pain i Function (SRA). W grupie MACI odpowiedź wyniosła 87,5% (63/72; 95% CI [77,6%, 94,1%]), natomiast w grupie leczonej metodą mikrozłamań 68,1% (49/72; 95% CI [56,0%, 78,6%]). W grupie MACI odnotowano mniej ciężkich działań niepożądanych (13/72) niż w grupie leczonej metodą mikrozłamań (25/72).
Bardzo podobnym produktem jest ChondroCelect (TiGenix N.V., Belgia). Zawiesina do implantacji to komórki autologiczne chrząstki ludzkiej w DMEM zawierającym aminokwasy, witaminy, sole, węglowodany. Terapia również polega na hodowaniu komórek chrząstki ex vivo a następnie podaniu zawiesiny o gęstości 10 000 komórek/μl.
Za leczeniem biologicznym ChondroCelect przemawia poziom odbudowy struktury tkanki w porównaniu do tego, co uzyskuje się metodą mikrozłamań mierzony 12 miesięcy po leczeniu. Ponadto, w badaniu klinicznym obserwowano systematyczną poprawę w okresie 36 miesięcy w odniesieniu do skali KOOS (the Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score) w obydwu ramionach, chociaż tutaj przewaga ChondroCelect nie była już wyraźna. Nie odnotowano różnicy statystycznej w odpowiedzi pacjentów z ramienia leczonego ChondroCelect i kontrolnego. Grupa ChondroCelect (CC) obejmowała 41 pacjentów, grupa leczona metodą mikrozłamań (MZ) 49 pacjentów. Pacjenci poniżej 3 lat od powstania urazu otrzymali większą korzyść w grupie CC (27 z 41) niż MZ (32 z 49). Po okresie 3 lat różnice pomiędzy grupami zanikły. Późniejsza interwencja w zakresie leczonych w badaniu klinicznym stawów była konieczna u 2 z 51 pacjentów CC i 7 z 61 pacjentów MZ. Było to skutkiem niewystarczającego stopnia naprawy chrząstki po leczeniu. Po badaniu pacjentów poddano długoterminowej obserwacji (5 lat) - 37 z ramienia CC i 40 z ramienia MZ. W obydwu ramionach pacjenci utrzymali efekt terapeutyczny odnotowany po 36 miesiącach. Nie odnotowano statystycznie istotnych różnic pomiędzy grupami. Koszt terapii wynosi około 20 000 EUR (https://bioinformant.com/price-of-cell-therapy-products).
Dostępne metody obejmujące przeszczepy chondrocytów na matrycach kolagenowych wiążą się z długim okresem leczenia i rekonwalescencji. Często obarczone są dużym odsetkiem niepowodzeń powyżej 50% - ze względu na fakt, że nie zastępuje się uszkodzonego ubytku tkanką homogenną a jedynie częściowo jej składnikami. Cena procedur jest z kolei bardzo wysoka. Stosunek korzyści terapeutycznej do ceny nie wydaje się dobry dla pacjenta.
Znane metody hodowli chondrocytów in vitro do wykorzystania w przeszczepach autologicznych, tj., namnożonych w hodowli komórek, a potem podanie hodowli zawiesinowej do stawu, nie dają gwarancji odtworzonego stawu, co wiąże się z wysokim kosztem, ograniczoną skutecznością w porównaniu z chirurgicznymi metodami tradycyjnymi, trudnością w odtworzeniu tkanki w warunkach in vivo. W związku z tym mają zastosowanie zwłaszcza w leczeniu niewielkich urazów. Wynalazek adresuje wymienione w stanie techniki problemy.
Znane hodowle chondrocytów nie umożliwiają przekształcenia się namnażających się komórek w tkankę chrzęstną. Wynika to z trudności w wytworzeniu się połączeń międzykomórkowych - wymaga to czasu, idealnych warunków jeżeli chodzi o odżywianie komórek, jak też ograniczeń mechanicznych.
W wyniku prac eksperymentalnych opracowano metodykę hodowli komórkowej chrząstki szklistej celem uzyskania materiału do leczenia schorzeń chrząstki. Opracowano metodę, polegającą na jednoczesnym wykorzystaniu do hodowli fragmentów natywnej tkanki, które łączy się in vitro w większe płaty oraz zawiesiny komórek - chondrocytów, pełniącej rolę kleju do łączenia fragmentów tkanek.
Przeprowadzono zatem odpowiednio zaplanowane badania eksperymentalne w celu opracowania metodyki przeprowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów i między innymi poddano przebadaniu różne gęstości komórek, długości powierzchni stycznych łączonych fragmentów, różne rodzaje suplementów i mediów hodowlanych, aby wytworzyć połączenia międzykomórkowe, które nie są łatwo naruszane.
Według wynalazku komórki rosną i dzielą się przyklejone do powierzchni podłoża hodowlanego, np. płytki. W zawiesinie są jedynie wtedy, kiedy odklejamy je od powierzchni płytki do pasażu oraz kiedy zawieszone w medium służą do zalania tkanki.
Wynalazek dotyczy metodyki, umożliwiającej hodowlę komórek i fragmentów tkanek prowadzoną in vitro tak, że możliwe jest uzyskanie tkanki chrzęstnej w formie zbliżonej do naturalnej a nie zawiesiny komórek lub komórek umieszczonych w matrycy, co jest znane ze stanu techniki. Hodowlę komórek i fragmentów tkanki chrzęstnej szklistej prowadzi się, w warunkach in vitro, a następnie uzyskany materiał w postaci tkanki służy do wszczepienia pacjentowi w miejsce ubytku. Wynalazek polega na po
PL 240 714 B1 braniu mniejszych fragmentów zdrowej tkanki chrzęstnej od pacjenta z miejsc mało obciążonych, a następnie umieszczeniu ich w medium odpowiednim do hodowli komórkowych/tkankowych, gdzie podczas hodowli mniejsze fragmenty łączy się w płaty o większej powierzchni poprzez bezpośrednie umieszczenie co najmniej dwóch fragmentów tkanki - skrawków w bliskim sąsiedztwie tzn. tak aby fragmenty stykały się co najmniej na jednej krawędzi każdego ze skrawków, przy czym odcinek styczny pomiędzy co najmniej dwoma łączonymi fragmentami tkanki wynosi co najmniej 0,1 cm. Równolegle leżące krawędzie co najmniej dwóch skrawków tkanki dopasowane są kształtem, aby można było połączyć skrawki poprzez złączenie ze sobą dopasowanych kształtem krawędzi na odcinku stycznym, gdzie fragmenty lub całe brzegi krawędzi są ułożone w sposób równoległy.
Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej, charakteryzuje się według wynalazku tym, że pobraną tkankę chrzęstną szklistą tnie się na co najmniej dwa fragmenty tkanki, a następnie fragmenty te układa się na płytce hodowlanej obok siebie w medium hodowlanym zawierającym minimum 2 mM glutaminy, minimum 2% FBS, minimum 4,5 g/l glukozy, przy czym kształt fragmentów tkanek dopasowuje się co najmniej na jednym odcinku krawędzi każdego fragmentu tak aby po ułożeniu fragmentów blisko siebie przestrzeń pomiędzy zbliżonymi co najmniej dwoma fragmentami tkanki była jak najmniejsza i tak aby wypełniana fragmentami tkanek przestrzeń płytki hodowlanej była jak najmniejsza. Tak dopasowuje się krawędzie aby w trakcie hodowli złączyć ze sobą fragmenty na co najmniej jednym odcinku stycznym. Odcinek styczny pomiędzy co najmniej dwoma łączonymi fragmentami tkanki wynosi co najmniej 0,1 cm. Do hodowli dodaje się zawiesiny chondrocytów i prowadzi się hodowlę komórkową fragmentów tkanki z chondrocytami. Medium hodowlane zmieniania się w ustalonym czasie, dodając do medium hodowlanego chondrocyty, przy czym hodowlę prowadzi się aż do uzyskania złączenia fragmentu tkanki na co najmniej części odcinka stycznego. Korzystnie, odcinek styczny pomiędzy co najmniej dwoma łączonymi fragmentami tkanki wynosi co najmniej 0,5 cm. Korzystnie, fragmenty tkanki mają kształt zbliżony do owalnego. Korzystnie, kształt fragmentów tkanek tak się dobiera, aby fragmenty tkanki w hodowli przylegały do siebie bardzo blisko na odcinku stycznym.
Korzystnie, medium hodowlane zawiera suplementy w stężeniu minimum 0,01% IGF i/lub 0,01% TGF i/lub 0,01% chondroityny i lub/minimum 0,1% insuliny. Korzystnie, medium hodowlane zawiera 5575 mg/l pirogronianu sodu i wodorowęglan sodu, 2 mM - 4 mM glutaminy, 2% - 10% FBS, oraz co najmniej 4,5 g/l glukozy, jak również etanoloaminę i/lub glutation i/lub kwas askorbinowy i/lub insulinę i/lub transferynę i/lub siarczan miedzi i/lub chlorek manganu.
Korzystnie, przed dodaniem chondrocytów prowadzi się hodowlę komórkową samych fragmentów tkanki w medium, korzystnie przez co najmniej 14 dni, po czym do hodowli dodaje się chondrocyty. Korzystnie, do hodowli fragmentów tkanki dodaje się zawiesiny chondrocytów w takiej ilości, że na 2,5 ml medium hodowlanego jest co najmniej 40 000 chondrocytów. Korzystnie, minimalne stężenia chondrocytów przy hodowli dwóch fragmentów o odcinku stycznym wynoszącym 0,1 cm - 1 cm wynosi 40 000 chondrocytów na 2,5 ml medium.
Korzystnie, chondrocyty do hodowli uzyskuje się w wyniku trawienia enzymatycznego, po czym wymaganą liczbę komórek uzyskuje się w wyniku hodowli chondrocytów w monowarstwie w hodowli adherentnej.
Korzystnie, hodowlę prowadzi się w warunkach 37°C i 5% CO2.
W trakcie prac doświadczalnych ustalono eksperymentalnie, że minimalny odcinek styczny na łączonych krawędziach musi wynosić minimum 0,1 cm - odcinek styczny tzn. krawędzie można zbliżyć do siebie na odcinku równoległym. Odcinek styczny może być fragmentem krawędzi skrawka tkanki lub całą krawędzią skrawka tkanki. Łączone ze sobą krawędzie są zwłaszcza prostoliniowe lub zaokrąglone. W trakcie hodowli następuje połączenie skrawków z wykorzystaniem hodowli zawiesinowej chondrocytów, uzyskanej z tkanki tego samego dawcy. Tkanka chrzęstna zawiera zarówno chondrocyty oraz macierz pozakomórkową. Istotnym jest taki dobór kształtu fragmentów tkanki - skrawków, aby przestrzeń pomiędzy krawędziami łączonymi fragmentów chrząstki była jak najmniejsza - stykanie się krawędzi lub odcinka krawędzi minimalnie na odcinku 0,1 cm. Dopasowanie kształtów krawędzi stycznych, pomiędzy skrawkami - fragmentami tkanki, powinno mieć miejsce najpóźniej na etapie umieszczenia ich w bezpośrednim sąsiedztwie na płytce hodowlanej, przed dodaniem do nich chondrocytów.
Dzięki temu hodowla umożliwia uzyskanie tkanki szklistej a nie jedynie komórek. W miejscu łączenia hodowlanych skrawków tkanki, uzyskiwana tkanka może być mniej wytrzymała mechanicznie, lub mniej dojrzała, ale będzie to tkanka o strukturze stałej z połączeniem międzykomórkowym.
PL 240 714 B1
Według wynalazku procedura obejmuje:
1. Pobranie tkanki szklistej od pacjenta
2. Cięcie tkanki na odpowiednie skrawki - fragmenty
3. Poddanie części skrawków trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania chondrocytów i dalszemu wyprowadzeniu hodowli komórek - hodowla chondrocytów
4. Umieszczenie pozostałych skrawków (nietrawionych) w medium hodowlanym - hodowla fragmentów tkanki, do których dodaje się chondrocyty
5. Po uzyskaniu odpowiedniej ilości chondrocytów w hodowli uzyskuje się komórki dale j stosowane w hodowli łączonej - fragmenty tkanki i komórki, zaś komórki umożliwiają łączenie nietrawionych skrawków tkanki
6. Do płytki hodowlanej z umieszczonymi fragmentami tkanki dodaje się chondrocyty w zawiesinie.
Komórki zawiesinowe będą lokowały się w szczelinie i wspomogą zrośnięcie się co najmniej dwóch krawędzi co najmniej dwóch fragmentów tkanki.
W hodowli łączonej nietrawione skrawki - fragmenty tkanki w hodowli umieszcza się blisko siebie dopasowując kształt krawędzie na odcinku stycznym, aby przestrzeń pomiędzy łączonymi krawędziam i była jak najmniejsza tzn. można było złączyć krawędzie styczne fragmentów tkanki.
Istotnym jest taki dobór kształtu fragmentów - linii krawędzi stycznych, aby przestrzeń pomiędzy krawędziami stykających się ze sobą fragmentów chrząstki była jak najmniejsza. Dopasowanie kształtów krawędzi stycznych powinno mieć miejsce najpóźniej na etapie umieszczenia ich w bezpośrednim sąsiedztwie na płytce hodowlanej, przed dodaniem do hodowli chondrocytów w zawiesinie.
Wynalazek opracowano w wyniku długotrwałych prac eksperymentalnych. W przykładach 1-3 przedstawiono próby prowadzenia hodowli komórkowej celem uzyskania materiału w postaci chrząstki szklistej do odbudowy zniszczonej chrząstki stawowej.
Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania i na rysunku, na którym na fig. 1 przedstawiono zasadę łączenia fragmentów tkanek - A-B - odcinki styczne, C - kształty fragmentów tkanek, na fig. 2 przedstawiono zasadę łączenia fragmentów tkanek - nieprawidłowe kształty fragmentów tkanek, na fig. 3-5 - zdjęcia z mikroskopu.
Przykłady połączeń, które nie są preferowane to wszelkiego typu połączenia łukowo - liniowe, jak też geometryczne, ale o różnych kątach, gdzie powstająca przestrzeń pomiędzy fragmentami ma relatywnie dużą objętość, zaś brak jest odcinków stycznych o przebiegu co najmniej fragmentu krawędzi skrawka w sposób równoległy na odcinku co najmniej 0,1 cm przedstawiono na fig. 2. Na fig. 2 za znaczono przykłady nie preferowanego ułożenia skrawków - krawędzie nie są komplementarne na całości przebiegu odcinków stycznych, powstają duże objętości przestrzeni pomiędzy krawędziami. Wady: trudniejsze wypełnienie przestrzeni, zmniejszona odporność mechaniczna.
P r z y k ł a d 1 - próba hodowli samych fragmentów tkanki chrzęstnej szklistej tak jak przeprowadza się sposobem według wynalazku
W celu utworzenia w sposobie in vitro jednolitego płata tkanki chrząstki jako materiału służącego do leczenia ubytków chrząstki stawowej, w pierwszej kolejności uzyskano materiał kliniczny pobrany od dorosłego człowieka, w postaci fragmentu tkanki chrząstnej szklistej pobranej ze stawu kolano wego, z miejsc nieobciążonych. Tkankę pobiera się od pacjenta z miejsc mało obciążonych ruchowo. Tkanka ta powinna być zdrowa. Kształt pobranego płatu lub płatów chrząstki może być w związku z tym różny. Można pobierać jeden lub więcej fragmentów chrząstki. Można jeden lub kilka fragmentów podzielić na mniejsze na zasadzie skrawków w poprzek lub wzdłuż linii chrząstka - kość.
W następnej kolejności fragment chrząstki pocięto w warunkach sterylnych na mniejsze fragmenty w przypadku pobrania dużego fragmentu chrząstki stawowej.
Natychmiast po pobraniu materiału od pacjenta, przeniesiono go do sterylnej 50 ml probówki wypełnionej roztworem soli fizjologicznej (0,90% NaCl) tak, aby tkanka była całkowicie zanurzona w roztworze. Następnie chrząstkę pocięto na cienkie na grubość max. 3 mm plastry o różnych kształtach i o rozmiarach poniżej 1 cm na długość/lub szerokość lub grubość.
Uzyskane fragmenty tkanki, całkowicie zanurzone w roztworze soli fizjologicznej (0,90% NaCl), przetransportowano w sterylnej 50 ml probówce do laboratorium hodowli komórkowej. Transport tkanki przeprowadzono w warunkach sterylnych w temperaturze 2-8°C. Wszystkie operacje przeprowadzane z wykorzystaniem tkanki były prowadzone w warunkach przepływu laminarnego. Po uprzednim przygotowaniu plastrów odpowiedniej wielkości uzyskany materiał stanowił wyjściową bazę dla otrzymania finalnego płata tkanki.
PL 240 714 B1
Finalny płat tkanki do leczenia ubytków chrząstki stawowej miał powstać na matrycy odpowiednio ułożonych względem siebie na powierzchni dołka płytki hodowlanej plastrów tkanki, hodowanych w odpowiednich warunkach i składzie medium hodowlanego.
Ważnym etapem było właściwe dopasowanie kształtu krawędzi stycznych plastrów tkanki. Poprzez złączenie fragmentów tkanki krawędziami stycznymi nastąpiło najbliższe ułożenie fragmentów tkanki względem siebie na płytce hodowlanej.
Przeprowadzono próbę hodowli z wykorzystaniem fragmentów tkanki od 2-4 stykających się ze sobą na co najmniej jednym odcinku prostoliniowym - krawędzi stycznej od długości 0,1-1 cm.
Jak opisano wcześniej, kształt dopasowywano według krawędzi stycznych co najmniej dwóch fragmentów tkanek - skrawek - łączonych krawędzi. Maksymalna długość/szerokość jak i maksymalna liczba fragmentów - skrawek uzależniona jest od wielkości płytki hodowlanej.
Spośród wszystkich plastrów pobranego materiału tkanki, konieczny był wybór minimum dwóch plastrów do maksymalnie tylu ile zmieści się na powierzchni dołka wykorzystywanej płytki hodowlanej. W przypadku gdy wspomniany układ plastrów już przygotowanych nie jest możliwy ze względu na niedopasowanie krawędzi plastrów aby ze sobą sąsiadowały przycinano i nadawano tym samym pożądanych kształtów już po pobraniu materiału od pacjenta.
Założono, że na tych etapach hodowli tkanek, gdzie planowane jest rozpoczęci e tworzenia nowego fragmentu tkanki, na bazie wcześniej pobranych i przygotowanych fragmentów tkanki, kluczowe jest ułożenie obok siebie minimum dwóch fragmentów tkanki. Fragmenty te należy ułożyć tak, aby łączone fragmenty miały krawędzie styczne na jak najdłuższym odcinku i kompatybilne w zakresie kształtu z fragmentem/fragmentami sąsiadującymi, tak aby wypełniana przestrzeń płytki hodowlanej była jak najmniejsza. Efekt ten można uzyskać zarówno na etapie pobierania tkanki od pacjenta poprzez pobranie fragmentów o odpowiednim kształcie, jak też później w laboratorium w warunkach in vitro. Kompatybilność kształtu krawędzi - ich usytuowanie w sąsiedztwie tak, że co najmniej jedna krawędź jednego fragmentu tkanki styka się z krawędzią drugiej tkanki co zapewnia łatwiejsze wypełnienie powierzchni pomiędzy nimi przez chondrocyty znajdujące się w zawiesinie dzięki zminimalizowaniu objętości wolnej przestrzeni pomiędzy fragmentami chrząstki, jak również zwiększa odporność mechaniczną nowo uzyskanego fragmentu tkanki w miejscu łączenia.
Podczas hodowli obserwowano czy zastosowane płaty tkanki - skrawki - zwiększą powierzchnię i czy wypełnią się przestrzenie między krawędziami. Kompatybilne plastry tkanki o wielkości ok. 1 mm x 1,2 cm x 0,7 cm przeniesiono do dołków 6-dołkowej, sterylnej płytki do hodowli komórkowej, wypełnionej 2,5 ml medium 2 do hodowli komórek, zawierającym: wapnia chlorek bezwodny, siarczan miedziowy pięciowodny, siarczan żelazawy siedmiowodny, chlorek magnezu, chlorek potasowy, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny, siarczan cynku siedmiowodny, L-alaninę, L-argininy chlorowodorek, L-asparaginę jednowodną, kwas L-asparaginowy L-cysteiny chlorowodorek, kwas L-glutaminowy, L-glutaminę, glicynę, L-Histydyny trichlorowodorek jednowodny, L-izoleucynę, L-leucynę, L-lizyny chlorowodorek, L-metioninę, L-fenyloalaninę, L-prolinę, L-serynę, L-treoninę, L-tryptofan, L-tyrozynę dwuzasadową dwuwodną, L-walinę, D-biotynę, chlorek choliny, kwas foliowy, mio-inozytol, niacynamid, kwas D-pantotenowy (hemicalcium), pirydoksyny chlorowodorek, ryboflawinę, tiaminy chlorowodorek, witaminę B12, D-glukozę, hipoksantynę, kwas linolowy, fenolową czerwień, putrescyny chlorowodorek, kwas pirogronowy jednozasadowy, tymidynę z dodatkiem roztworu 1 -krotnie stężonego roztworu Suplement Glutamax. Hodowlę prowadzono w warunkach 37°C i 5% CO2 przez 7 dni. Powiązania pomiędzy dwoma fragmentami tkanki, żywotność i proliferację monitorowano za pomocą 10-krotnego i 40-krotnego powiększenia optycznego. Modyfikacje tkanek: połączenie, żywotność i proliferację obserwowano regularnie, przed każdym kolejnym pasażem i wymianie medium na świeże, za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego przy 10-krotnym i 40-krotnym powiększeniu. Medium hodowlane wraz z suplementami była zmieniana raz w tygodniu.
Przy każdej kolejnej zmianie medium następowało:
1) usunięcie starego medium
2) delikatne przeniesienie plastrów tkanki do nowej płytki hodowlanej
3) dodatek świeżego medium.
Podczas hodowli obserwowano czy zastosowane płaty tkanki - skrawki - zwiększą powierzchnię i czy wypełnią się przestrzenie między krawędziami. Po pięciu miesiącach hodowli samych fragmentów tkanek - bez zawiesiny chondrocytów, postępując tak jak w wynalazku, nie zaobserwowano żadnych połączeń między parami fragmentów tkanki chrzęstnej umieszczonymi w jednym dołku. Nie było też nowej tkanki rosnącej na powierzchni starej tkanki.
PL 240 714 B1
P r z y k ł a d 2 - próba hodowli samych fragmentów tkanki chrzęstnej przeprowadzonej sposobem według wynalazku
Procedurę hodowli prowadzono podobnie jak opisano w przykładzie 1.
Kompatybilne plastry tkanki przeniesiono do dołków 6-dołkowej, sterylnej płytki do hodowli komórkowej, wypełnionej 2,5 ml medium 2 do hodowli komórek z dodatkiem roztworu 1 -krotnie stężonego roztworu Suplement Glutamax oraz glukozy [4,5 g/l].
Po pięciu miesiącach hodowli nie zaobserwowano żadnych połączeń między parami fragmentów tkanki chrzęstnej umieszczonymi w jednym dołku. Nie było też nowej tkanki rosnącej na powierzchni starej tkanki.
P r z y k ł a d 3 - próba hodowli samych fragmentów tkanki chrzęstnej przeprowadzonej sposobem według wynalazku
Procedurę hodowli prowadzono jak opisano w przykładzie 1, z tym że kompatybilne plastry tkanki przeniesiono do dołków 6-dołkowej, sterylnej płytki do hodowli komórkowej, wypełnionej 2,5 ml medium 1 do hodowli komórek, zawierającym: wapnia chlorek bezwodny, żelaza azotan dziewięciowodny, potasu chlorek, magnezu siarczan bezwodny, sodu chlorek, sodu wodorowęglan, potasu fosforan jednozasadowy jednowodny, D-glukoza, L-argininy chlorowodorek, L-cystyny dichlorowodorek, L-glutamina, glicyna, L-histydyny chlorowodorek jednowodny, L-izoleucyna, L-leucyna, L-lizyny chlorowodorek, L-metionina, L-fenyloalanina, L-seryna, L-treonina, L-tryptofan, disodu L-tyrozyna dwuwodna, L-walina, wapnia D-pantotenian, choliny chlorek, kwas foliowy, i-inozytol, niacynamid, ryboflawina, tiaminy chlorowodorek, pirydoksyny chlorowodorek z solą sodową kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego z wysokim stężeniem glukozy [4,5 g/l].
Po pięciu miesiącach hodowli nie zaobserwowano żadnych połączeń między parami fragmentów tkanki chrzęstnej umieszczonymi w jednym dołku. Nie było też nowej tkanki rosnącej na powierzchni starej tkanki.
P r z y k ł a d 4 - ogólny opis sposobu według wynalazku
W celu utworzenia w sposobie in vitro jednolitego płata tkanki chrząstki jako materiału służącego do leczenia ubytków chrząstki stawowej, w pierwszej kolejności uzyskano materiał kliniczny pobrany od dorosłego człowieka, w postaci fragmentu tkanki chrząstnej szklistej ze stawu kolanowego. Pobiera się zawsze chrząstkę szklistą preferencyjnie ze stawu leczonego (może być kolano, biodro, staw skokowy, barkowy, każdy inny staw). Można pobierać z innego stawu w sytuacji kiedy staw leczony jest mały lub trudno z niego pobrać chrząstkę szklistą. Zawsze powinno to być też miejsce nieobciążone. Tkankę pobiera się od pacjenta z miejsc mało obciążonych ruchowo. Tkanka ta powinna być zdrowa. Kształt pobranego płatu lub płatów chrząstki może być w związku z tym różny. Można pobierać jeden lub więcej fragmentów chrząstki. Można jeden lub kilka fragmentów podzielić na mniejsze na zasadzie skrawków w poprzek lub wzdłuż linii chrząstka - kość.
W następnej kolejności fragment chrząstki pocięto w warunkach sterylnych na mniejsze fragmenty w przypadku pobrania dużego fragmentu chrząstki stawowej.
Natychmiast po pobraniu materiału od pacjenta, przeniesiono go do sterylnej 50 ml probówki wypełnionej roztworem soli fizjologicznej (0,90% NaCl) tak, aby tkanka była całkowicie zanurzona w roztworze. Następnie chrząstkę pocięto na cienkie na grubość max. 3 mm plastry o różnych kształtach i o rozmiarach poniżej 1 cm na długość/lub szerokość (dotyczy to zarówno fragmentów, które będą stanowiły podstawę do uzyskania finalnego płata tkanki jak i fragmentów, które dadzą początek hodowli wolnych chondrocytów.
Możliwe wielkości to od około grubość/długość/szerokość: 1 mm x 0,5 cm x 0,5 cm, 1 mm x 0,6 cm x 0,6 cm, 1 mm x 0,7 cm 0,7 cm, 1 mm x 0,8 cm x 0,8 cm, 1 mm x 0,9 cm x 0,9 cm, 1 mm x 1 cm x 1 cm, 2 mm x 1 cm x 1 cm, 3 mm x 1 cm x 1 cm. Uzyskane fragmenty tkanki o wielkości ok. 1 mm x 1 cm x 1 cm, całkowicie zanurzone w roztworze soli fizjologicznej (0,90% NaCl), przetransportowano w sterylnej 50 ml probówce do laboratorium hodowli komórkowej. Transport tkanki przeprowadzono w warunkach sterylnych w temperaturze 2-8°C.
Wymiary i kształt łączonych płatów nie mają znaczenia. Ważne jest, żeby przygotować je tak aby przestrzeń pomiędzy łączonymi krawędziami na odcinku stycznym co najmniej dwóch fragmentów tkanki była jak najmniejsza, tak aby złączyć ze sobą krawędzie na co najmniej 0,1 cm długości odcinka stycznego. Wielkość samego fragmentu zależy również od wielkości i kształtu urazu jak też od wielkości i kształtu chrząstki zdrowej pobranej w celu uzyskania „protezy biologicznej” w postaci odtworzonego fragmentu tkanki chrzęstnej według wynalazku. Odcinek styczny wynosił minimum 0,1 cm. Wszystkie
PL 240 714 B1 operacje przeprowadzane są z wykorzystaniem tkanki lub komórek były prowadzone w warunkach przepływu laminarnego. Po uprzednim przygotowaniu z nich plastrów odpowiedniej wielkości, podzielono wszystkie fragmenty na dwie części. Jedna z nich posłużyła do uzyskania zawiesiny chondrocytów, czyli mieszaniny pełniącej funkcję budulca tkankowego w hodowli komórek z fragmentami tkanki. Druga stanowiła fragmenty do hodowli płatów tkanki i stanowiła bazę dla otrzymania finalnego płata odtwarzanej tkanki. Finalny płat tkanki do leczenia ubytków chrząstki stawowej uzyskano według opisanej niżej procedury, czyli plastry tkanki o ustalonym kształcie, odpowiednio ułożone względem siebie na powierzchni dołka płytki hodowlanej, łączono za pomocą zawiesiny chondrocytów - w hodowli „tkankowokomórkowej”.
1) Przygotowanie fragmentów tkanki chrzęstnej do dalszej hodowli fragmentów tkanki.
Ważnym etapem jest właściwa selekcja tych plastrów tkanki, których krawędzie będą umożliwiały jak najbliższe ułożenie ich względem siebie na płytce hodowlanej. Fragmenty tkanki muszą stykać się ze sobą na co najmniej jednym odcinku prostoliniowym. Minimalna liczba fragmentów tkanki skrawków to dwa. Długość minimalna dla fragmentu tkanki o dowolnym kształcie: minimum: 0,1 cm, korzystnie minimum 0,5 cm. Szerokość minimalna dla fragmentu tkanki o dowolnym kształcie: minimum: 0,1 cm, korzystnie minimum 0,5 cm. Grubość tkanki: minimum 1 mm i maksymalnie 4 mm.
Jak opisano wcześniej, kształt dopasowuje się według krawędzi stycznych co najmniej dwóch fragmentów tkanek - skrawków - łączonych krawędzi na odcinku stycznym. Ta długość odcinka stycznego krawędzi łączonych powinna wynosić minimum 0,1 cm, korzystnie minimum 0,5 cm bez względu na to czy odcinek jest prostoliniowy czy zakrzywiony bowiem długość ta odnosi się do linii styczn ej odcinka stycznego a nie linii prostej. Maksymalna długość/szerokość jak i maksymalna liczba fragmentów - skrawków uzależniona jest od wielkości płytki hodowlanej i celu leczniczego.
Spośród wszystkich plastrów pobranego materiału tkanki, konieczny był wybór minimum dwóch plastrów do maksymalnie tylu ile zmieści się na powierzchni dołka wykorzystywanej płytki hodowlanej. W przypadku gdy wspomniany układ plastrów już przygotowanych nie jest możliwy ze względu na niedopasowanie krawędzi plastrów, aby ze sobą sąsiadowały dopuszcza się ich przycięcie i nadanie tym samym pożądanych kształtów już po pobraniu materiału od pacjenta.
Na tych etapach hodowli tkanek i komórek, gdzie planowane jest rozpoczęcie tworzenia nowego fragmentu tkanki, na bazie wcześniej pobranych i przygotowanych fragmentów tkanki, kluczowe jest ułożenie obok siebie minimum dwóch fragmentów tkanki. Fragmenty te należy ułożyć tak, aby łączone fragmenty miały krawędzie styczne na jak najdłuższym odcinku, ale minimalnie wynoszącym 0,1 cm, kompatybilne w zakresie kształtu z fragmentem/fragmentami sąsiadującymi, tak aby zminimalizować objętości wolnej przestrzeni pomiędzy fragmentami chrząstki i tak aby wypełniana przestrzeń płytki hodowlanej była jak najmniejsza. Efekt ten można uzyskać zarówno na etapie pobierania tkanki od pacjenta poprzez pobranie fragmentów o odpowiednim kształcie, jak też później w laboratorium w warunkach in vitro. Kompatybilność kształtu krawędzi - ich usytuowanie w sąsiedztwie tak, że co najmniej jedna krawędź lub jej fragment jednego fragmentu tkanki styka się z krawędzią drugiego fragmentu tkanki co zapewnia łatwiejsze wypełnienie powierzchni pomiędzy nimi przez chondrocyty znajdujące się w zawiesinie dzięki zminimalizowaniu objętości wolnej przestrzeni pomiędzy fragmentami chrząstki, jak również zwiększa odporność mechaniczną nowo uzyskanego fragmentu tkanki w miejscu łączenia. Możliwe przykłady kształtów krawędzi i sposobów łączenia ich przedstawiono na fig. 1, przykłady nie wyczerpują listy wszystkich możliwości. Istotnym jest aby uzyskać i łączyć w trakcie hodowli minimum dwa fragmenty tkanki bezpośrednio do siebie przylegające krawędzią na odcinku przylegających krawędzi, gdzie minimum odcinka stycznego wynosi 0,1 cm zarówno docinków prostoliniowych i zakrzywionych. Wartość ta dotyczy długości odcinka stycznego fragmentu lub całej krawędzi fragmentu tkanki bez względu na jej kształt.
Na fig. 1 przedstawiono całe fragmenty tkanek lub krawędzie fragmentów tkanek - skrawków z pokazaniem połączenia ich przez zbliżenie do siebie dopasowanych kształtem krawędzi na odcinku stycznym.
Według wynalazku istotnym jest dopasowanie kształtu skrawka tkanki - fragmentu tkanki poprzez zaplanowanie przebiegu krawędzi sąsiadujących równolegle - miejsce łączenia przylegających co najmniej dwóch fragmentów tkanek. Taki kształt istnieje w przypadku wszystkich figur gdzie mamy boki proste. Ten kształt może być również na pewnym odcinku prostym a jednocześnie następnie łukowatym. Kształt zaś samych fragmentów tkanek - skrawków zatem może być dowolny. Przebieg linii krawędzi powinien być na obydwu łączonych fragmentach tkanki na odcinku stycznym kompatybilny - równoległy aby można było na tych krawędziach złączyć oba fragmenty tkanki. Odcinek krawędzi lub cała
PL 240 714 B1 krawędź łączonych fragmentów tkanki na odcinku stycznym - na odcinku złączenia co najmniej dwóch fragmentów tkanki, nazywa się dalej odcinkiem stycznym.
Zasadą jest to, że długość na odcinku stycznym łączonych ze sobą krawędzi tkanki - długość części lub całej krawędzi fragmentu na odcinku stycznym - złączenia się fragmentów tkanek powinna wynosić minimum 0,1 cm krawędzi - długość odcinka stycznego. Na fig. 1 przedstawiono przykładowe kształty odcinków stycznych: A - odcinki o charakterze prostoliniowym, B - odcinki o charakterze łukowym, jak również przykłady kształtów łączonych fragmentów tkanek: C - fragmenty tkanek o charakterze kątowym, geometrycznym, ich kombinacje.
Przykłady połączeń, które nie są preferowane to wszelkiego typu połączenia łukowo - liniowe, jak też geometryczne, ale o różnych kątach, gdzie powstająca przestrzeń pomiędzy fragmentami ma relatywnie dużą objętość zaś brak jest odcinków stycznych o przebiegu co najmniej fragmentu krawędzi skrawka w sposób równoległy na odcinku co najmniej 0,1 cm przedstawiono na fig. 2. Na fig. 2 pokazano przykłady nie preferowanego ułożenia skrawków - krawędzie nie są komplementarne na całości przebiegu odcinków stycznych, powstają duże objętości przestrzeni pomiędzy krawędziami. Wady: trudniejsze wypełnienie przestrzeni, zmniejszona odporność mechaniczna.
2) Wstępna hodowla samych fragmentów tkanek.
Wyselekcjonowane lub odpowiednio przycięte plastry - fragmenty tkanek - skrawki, jak opisano wcześniej, przeniesiono za pomocą pęsety do dołków 1-dołkowej, 6-dołkowej lub 12-dołkowej sterylnej płytki do hodowli komórkowej. Wyselekcjonowane lub odpowiednio przycięte plastry tkanki umieszczono w dołkach uprzednio wypełnionych 10 ml, 2,5 ml lub 1,25 ml medium 1 do hodowli komórek z 4,5 g/l glukozy również nazywane nazwą handlową DMEM lub medium 2 z dodatkiem roztworu 1-krotnie stężonego roztworu Suplement Glutamax nazywane nazwą handlową F12 lub mieszaniną medium 1 oraz medium 2 w stosunku 1:1 i 2%, 4%, 5% lub 10% surowicy FBS oraz 2 mM - 4 mM glutaminą.
Dla tego przykładu użyto medium hodowlane 1, znane pod nazwą handlową DMEM, zawierającego: wapnia chlorek bezwodny, żelaza azotan dziewięciowodny, potasu chlorek, magnezu siarczan bezwodny, sodu chlorek, sodu wodorowęglan, potasu fosforan jednozasadowy jednowodny, D-glukoza, L-argininy chlorowodorek, L-cystyny dichlorowodorek, L-glutamina, glicyna, L-histydyny chlorowodorek jednowodny, L-izoleucyna, L-leucyna, L-lizyny chlorowodorek, L-metionina, L-fenyloalanina, L-seryna, L-treonina, L-tryptofan, disodu L-tyrozyna dwuwodna, L-walina, wapnia D-pantotenian, choliny chlorek, kwas foliowy, i-inozytol, niacynamid, ryboflawina, tiaminy chlorowodorek, pirydoksyny chlorowodorek z solą sodową kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego z dodatkiem glukozy.
Dla tego przykładu użyto medium hodowlane 2 zawierające: wapnia chlorek bezwodny, siarczan miedziowy pięciowodny, siarczan żelazawy siedmiowodny, chlorek magnezu, chlorek potasowy, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny, siarczan cynku siedmiowodny, L-alaninę, L-argininy chlorowodorek, L-asparaginę jednowodną, kwas L-asparaginowy L-cysteiny chlorowodorek, kwas L-glutaminowy, L-glutaminę, glicynę L-Histydyny trichlorowodorek jednowodny, L-izoleucynę, L-leucynę, L-lizyny chlorowodorek, L-metioninę, L-fenyloalaninę, L-prolinę, L-serynę, L-treoninę, L-tryptofan, L-tyrozynę dwuzasadową dwuwodną, L-walinę, D-biotynę, chlorek choliny, kwas foliowy, mio-inozytol, niacynamid, kwas D-pantotenowy (hemicalcium), pirydoksyny chlorowodorek, ryboflawinę, tiaminy chlorowodorek, witaminę B12, D-glukozę, hipoksantynę, kwas linolowy, fenolową czerwień, putrescyny chlorowodorek, kwas pirogronowy jednozasadowy, tymidynę z dodatkiem 1-krotnie stężonego roztworu supelmetu Glutamax.
Dla tego przykładu sprawdzono również działanie mieszaniny obu mediów 1:1.
Istotne jest aby medium zawierało minimum 4,0 g/l glukozy, korzystnie 4,5 g/l glukozy, minimum 10% FBS, minimum 2 mM glutaminy.
Korzystne jest aby medium hodowlane zawierało 55-75 mg/l pirogronianu sodu i wodorowęglan sodu, 2 mM - 4 mM glutaminy, 2% - 10% FBS, oraz co najmniej 4,5 g/l glukozy, jak również etanoloaminę, glutation, kwas askorbinowy, insulinę, transferynę, siarczan miedzi, chlorek manganu.
W każdym dołku, zastosowanej płytki hodowlanej, umieszczono minimum dwa plastry tkanki o wielkości ok. 1 mm x 1 cm x 1 cm, ułożone tak, by jedną z krawędzi maksymalnie do siebie przylegały na odcinku krawędzi stycznej lub fragmenty krawędzi na odcinku stycznym wynoszącym w przykładzie wykonania co najmniej od 0,1 cm. Przeprowadzono kilka doświadczeń eksperymentalnych z zastosowaniem 2-4 fragmentów o odcinku stycznym 0,1 - 0,5 - 1 cm. Chrząstkę inkubowano przez 7 dni w 37°C i 5% CO2. Po tym czasie dokonywano obserwacji mikroskopowej i wymiany medium na świeże.
PL 240 714 B1
W przypadku płytki 6-dołkowej, która zastosowana w tym eksperymencie, każdorazowo objętość świeżego medium, wymienianego co 7 dni wynosiła 2,5 ml. Odwrócony mikroskop wykorzystano do oceny żywotności plastrów tkankowych; czystości mikrobiologicznej hodowli; kontroli pojawienia się ewentualnych nowych struktur komórkowych, wynikających z podziału obecnych w tkance komórek. Powiązania pomiędzy dwoma fragmentami tkanki, żywotność i proliferację monitorowano za pomocą 10-krotnego i 40-krotnego powiększenia optycznego.
Hodowlę samych fragmentów tkanki prowadzono do momentu uzyskania wystarczającej ilości chondrocytów (oddzielna hodowla - hodowla adherentna), żeby zalać fragmenty tkanki zawiesiną namnożonych chondrocytów. W przypadku niniejszego eksperymentu było to 17 dni. Hodowla samych fragmentów tkanki stanowiła swego rodzaju inkubację i miała na celu utrzymanie fragmentów tkanki w stanie aktywnym i gotowym do kolejnego kroku już w hodowli właściwej z wolnymi chondrocytami.
3) Uzyskanie zawiesiny chondrocytów oraz wstępna adherentna hodowla samych chondrocytów.
Uzyskiwanie chondrocytów i hodowla chondrocytów celu ich namnożenia można przeprowadzić znaną metodą.
Po selekcji plastrów tkanki, pełniących funkcję bazy przyszłego nowego płata tkankowego, pozostałe plastry przeznaczone do izolacji chondrocytów, stanowiące od 15% do 50% wagi wszystkich plastrów, posłużyły do uzyskania zawiesiny chondrocytów. Kształt fragmentu tkanki dla uzyskania chondrocytów nie ma znaczenia. W tym celu przeznaczona do trawienia enzymatycznego tkanka została dodatkowo poszatkowana na mniejsze kawałki (nie większe niż 3 mm x 3 mm x 3 mm) przy użyciu skalpela. Tak przygotowany materiał poddano działaniu kolagenazy II.
Uzyskane kawałki tkanki przeniesiono do sterylnej probówki o objętości od 15 ml do 50 ml. W tym przypadku była to probówka o objętości 50 ml. Kawałki tkanki przepłukano 3-krotnie 1-krotnie stężonym roztworem soli buforowanym fosforanem (1 x PBS). Czas trawienia enzymatycznego, a także ilość enzymu, dostosowano do masy fragmentów tkanek, jak również do uzyskania właściwej żywotności komórek po reakcji. W poniższym badaniu zastosowano stosunki wagowe tkanki do enzymu mieszczące się w zakresie: 1 g : 1 mg, 1 g : 2 mg, 1 g : 3 mg oraz 1 g : 4 mg. Reakcję trawienia prowadzono w warunkach medium hodowlanego 1, znanego pod nazwą handlową DMEM, zawierającego: wapnia chlorek bezwodny, żelaza azotan dziewięciowodny, potasu chlorek, magnezu siarczan bezwodny, sodu chlorek, sodu wodorowęglan, potasu fosforan jednozasadowy jednowodny, D-glukoza, L-argininy chlorowodorek, L-cystyny dichlorowodorek, L-glutamina, glicyna, L-histydyny chlorowodorek jednowodny, L-izoleucyna, L-leucyna, L-lizyny chlorowodorek, L-metionina, L-fenyloalanina, L-seryna, L-treonina, L-tryptofan, disodu L-tyrozyna dwuwodna, L-walina, wapnia D-pantotenian, choliny chlorek, kwas foliowy, i-inozytol, niacynamid, ryboflawina, tiaminy chlorowodorek, pirydoksyny chlorowodorek z solą sodową kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego z dodatkiem glukozy;
lub w warunkach medium hodowlanego 2 zawierającym: wapnia chlorek bezwodny, siarczan miedziowy pięciowodny, siarczan żelazawy siedmiowodny, chlorek magnezu, chlorek potasowy, wodorowęglan sodu, chlorek sodu, fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny, siarczan cynku siedmiowodny, L-alaninę, L-argininy chlorowodorek, L-asparaginę jednowodną, kwas L-asparaginowy L-cysteiny chlorowodorek, kwas L-glutaminowy, L-Glutaminę, glicynę, L-Histydyny trichlorowodorek jednowodny, L-izoleucynę, L-leucynę, L-lizyny chlorowodorek, L-metioninę, L-fenyloalaninę, L-prolinę, L-serynę, L-treoninę, L-tryptofan, L-tyrozynę dwuzasadową dwuwodną, L-walinę, D-biotynę, chlorek choliny, kwas foliowy, mio-inozytol, niacynamid, kwas D-pantotenowy (hemicalcium), pirydoksyny chlorowodorek, ryboflawinę, tiaminy chlorowodorek, witaminę B12, D-glukozę, hipoksantynę, kwas linolowy, fenolową czerwień, putrescyny chlorowodorek, kwas pirogronowy jednozasadowy, tymidynę z dodatkiem 1 -krotnie stężonego roztworu supelmetu Glutamax;
lub mieszaniny dwóch powyżej wymienionym mediów hodowlanych zastosowanych w stosunku 1:1 z dodatkiem glukozy.
Tkankę umieszczano w medium w stosunku: 3 ml medium: 0,1 g tkanki lub 3 ml medium: 0,2 g tkanki lub 3 ml medium: 0,3 g tkanki lub 3 ml medium: 0,5 g tkanki, zawierającym odpowiednie stężenie kolagenazy II. Masa tkanki w gramach stanowi sumaryczną wartość, na którą składa się masa wykorzystanych plastrów tkanki. Maksymalnie trawieniu poddano plastry, których masa w sumie wynosiła 0,5 g. Trawienie przeprowadzono w warunkach 37°C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek. Reakcję prowadzono przez minimum 16 godzin do całkowitego strawienia tkanki. Po trawieniu pobrano supernatant, zawierający wolne chondrocyty i wirowano przy 300 x g przez minimum 10 minut w temperaturze pokojowej. Uzyskany osad komórkowy, zawierający chondrocyty w ilości od 0,3 mln z 1 g
PL 240 714 B1 tkanki do 1,5 mln z 1 g tkanki, przepłukano trzy razy w 1-krotnie stężonym PBS. Przy czym ilość tkanki poddawanej trawieniu to z reguły średnio masa ok. 0,1 - 0,2 g. Ostatecznie osad komórek ponownie zawieszono w minimum 1 ml medium 1 z 4,5 g/l glukozy lub medium 2 z dodatkiem roztworu 1-krotnie stężonego roztworu Suplement Glutamax lub mieszaninie medium 1 i medium 2 w stosunku 1:1, zawierającym 2% lub 4% lub 5% lub 10% FBS i minimum 2 mM roztwór glutaminy celem obserwacji oraz oceny jakościowej i ilościowej reakcji trawienia. Oceniano czy po trawieniu komórki są dobrej żywotności (jakościowa ocena) i czy cały fragment tkanki się podtrawił (ilościowa). Ocenie jakościowej podlegała żywotność komórek (żywotność minimum 80% była traktowana jako pozytywna), kształt i ogólna kondycja komórek po trawieniu (okrągłe z widocznym jądrem były traktowane jako komórki w dobrej kondycji). Komórki o żywotności nie mniejszej niż 80% wysiano w gęstościach 150 000 komórek na 2 ml medium lub 200 000 komórek na 2 ml medium lub 250 000 komórek na 2 ml medium do butelek hodowlanych o objętości 25 cm2 lub 75 cm2. W trakcie hodowli, co drugi dzień, komórki obserwowano za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego w celu oceny szybkości wzrostu i określenia momentu pasażu komórkowego, ściśle związanego z poziomem konfluencji. Pożywkę hodowlaną zmieniano dwa razy w tygodniu. Gdy komórki osiągnęły odpowiednią konfluencję (maksimum 85%), trypsynizowano je przez 5 minut za pomocą 2 ml 0,05% (w/v) roztworu trypsyny / EDTA w PBS w temperaturze 37°C. Hamowanie trypsynizacji przeprowadzono poprzez dodatek medium 1 z dodatkiem glukozy 4,5 g/l lub medium 2 z dodatkiem roztworu 1-krotnie stężonego roztworu Suplement Glutamax lub mieszaniny medium 1 i medium 2 w stosunku 1:1, zawierającego 2%, 4%, 5% lub 10% FBS w objętości 1-krotnie, 1,5-krotnie lub 2-krotnie razy większej w stosunku do objętości zastosowanego roztworu trypsyny / EDTA. Liczbę komórek i żywotność określono za pomocą mikroskopu i roztworu błękitu trypanu według standardowej procedury.
W trakcie hodowli chondrocytów przede wszystkim monitorowano wzrost i żywotność komórek. Hodowlę prowadzono do momentu uzyskania konfluencji 85% przy min. 80% żywotności komórek. Hodowlę tę prowadzono w celu namnożenia wystarczającej ilości komórki do kolejnej hodowli łączonej fragmentów tkanki łącznie z samymi chondrocytami czyli do tzw. „zalewania tkanki”, gdzie zawiesina chondrocytów służy jako klej do łączenia użytych fragmentów tkanki. Część komórek była wykorzystywana do „zalewania” tkanki a część do zakładania kolejnej hodowli tak, żeby materiał komórkowy była ciągle dostępny.
Komórki pozostawały w ciągłej hodowli do wykorzystania w stymulacji połączeń pomiędzy kawałkami tkanki chrzęstnej opisanych w punkcie a).
Hodowla chondrocytów celem ich namnożenia prowadzona jest zawsze w monowarstwie - hodowla adherentna. O zawiesinie komórek mówimy wtedy kiedy po odklejeniu komórek od powierzchni płytki dokonuje się opisanych kroków płukania i wirowania oraz zawieszenia chondrocytów w docelowym buforze i zalewania nimi płatów tkanki w hodowli łączonej.
4) Hodowla łączona - fragmenty tkanki z zawiesiną chondrocytów uzyskanych komórek według pkt. 3
Istotnym jest aby na dołek, zawierający 2,5 ml medium hodowlanego i przy założeniu wykorzystania dwóch plastrów tanki o wielkości ok. 1 mm x 1 cm x 1 cm dodać minimum 40 000 chondrocytów. Maksymalne stężenia chondrocytów przy hodowli dwóch fragmentów o odcinku stycznym 0,1 cm to 8000 komórek na 2,5 ml medium.
Plastry tkanki chrzęstnej, hodowane w medium 1 z 4,5 g/l glukozy lub medium 2 z dodatkiem roztworu 1-krotnie stężonego roztworu Suplement Glutamax lub mieszaninie medium 1 i medium 2, opisane powyżej, w stosunku 1:1 z 2% lub 4% lub 5% lub 10% FBS, z minimum 2 mM glutaminą oraz minimum 0,01% IGF-1 i/lub minimum 0,01% TGF-e1 i/lub minimum 0,01% chondroityną i/lub minimum 0,1% insuliną były „zalewane” chondrocytami, otrzymywanymi w wyniku ich rozhodowania po trawieniu (żywotność > minimum 85%).
Istotne jest aby medium zawierało minimum 4,5 g/l glukozy, minimum 10% FBS, minimum 2 mM glutaminy.
Korzystne jest aby medium hodowlane zawierało 55 - 75 mg/l pirogronianu sodu i wodorowęglan sodu, 2 mM - 4 mM glutaminy, 2% - 10% FBS, oraz co najmniej 4,5 g/l glukozy, jak również etanoloaminę, glutation, kwas askorbinowy, insulinę, transferynę, siarczan miedzi, chlorek manganu oraz minimum 0,01% IGF-1 i/lub minimum 0,01% TGF-e1 i/lub minimum 0,01% chondroityny i/lub minimum 0,1% insuliny.
Komórki po zwirowaniu i uprzedniej ocenie ilościowej i jakościowej przeprowadzanej jak opisano wyżej, zawieszano w pożywce medium 1 z 4,5 g/l glukozy lub medium 2 z dodatkiem roztworu 1 -krotnie
PL 240 714 B1 stężonego roztworu Suplement Glutamax lub mieszaninie medium 1 i medium 2 w stosunku 1:1 w objętości minimum 500 μl na minimum 40 000 komórek, po czym dodawano je do dołka z minimum dwoma fragmentami tkanki. Istotnym jest aby medium hodowlane zawierało 55 mg/l - 75 mg/I pirogronianu sodu, wodorowęglan sodu, 2 mM - 4 mM glutaminy, 2% - 10% FBS, oraz 4,5 g/l - 5,0 g/l glukozy.
Tak powstała kombinacja hodowli fragmentów tkanki i chondrocytów była prowadzona w warunkach 37°C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek przez minimum 12 tygodni aż do uzyskania nowych połączeń tkankowych między użytymi fragmentami tkanki. Proces „zalewania” tkanki zawiesiną, zawierającą każdorazowo stałą ilość chondrocytów, był powtarzany raz w tygodniu. Wymiana medium ze wskazaną częstotliwością była podyktowana doświadczeniem zdobytym w ramach prowadzenia hodowli tkankowych. Dodatek chondrocytów miał miejsce po ówczesnym delikatnym przeniesieniu fragmentów tkanki do nowego dołka 6-dołkowej płytki. Dokonywano wtedy również wymiany medium na świeże, w przypadku płytki 6-dołkowej była to objętość końcowa wraz z suplementami równa 2,5 ml.
Modyfikacje tkanek: połączenie, żywotność i proliferację obserwowano regularnie, przed każdym kolejnym „zalewaniem” tkanki komórkami, za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego przy 10-krotnym i 40-krotnym powiększeniu. Medium hodowlane wraz z suplementami było zmieniane raz w tygodniu.
Przy każdym kolejnym „zalewaniu” nowymi chondrocytami następowało:
1) Usunięcie starego medium
2) Delikatne przeniesienie plastrów tkanki do nowej płytki hodowlanej
3) Dodatek świeżego medium
4) Zalewanie plastrów komórkami (jak wyżej podana ilość komórek i medium, w którym są zawieszone - teraz dodano na jaką objętość świeżego medium) - opis wyżej
Po kilku dniach hodowli testowej zauważono widoczne zmiany w tkance chrząstki. Zidentyfikowano nowe połączenia tkankowe między starymi fragmentami tkanki. Po kilku tygodniach luka między starymi fragmentami tkanki została wypełniona nową tkanką i zarośnięta. Otrzymano płat nowej tkanki, powstałej z plastrów chrząstki oraz wolnych chondrocytów regularnie dostarczanych do hodowli. Uzyskany jeden płat tkanki z wyjściowo dwóch plastrów tkanki posiadał „bruzdę” pośrodku, będącą przypuszczalnie nową tkanką, powstałą z udziałem chondrocytów regularnie dostarczanych do hodowli w postaci zawiesiny. Płat tkankowy był wielkości ok. 1 mm x 2,1 cm x 1 cm. Możliwe było jego przenoszenie z dołka płytki do innego miejsca przeznaczenia bez konieczności stosowania dwóch pęset i bez ryzyka uszkodzenia. Nowe połączenie pomiędzy wyjściowymi plastrami tkanki odznaczało się nieco jaśniejszą barwą w stosunku do starej tkanki, co przedstawiono na fig. 3 - zdjęcie z mikroskopu odwróconego w dniu rozpoczęcia hodowli (fig. 3A), po siedemnastu (fig. 3B) oraz pięćdziesięciu dwóch dniach (fig. 3C, D) hodowli komórkowo-tkankowej przy zastosowaniu dwóch fragmentów tkanki o odcinku stycznym.
Przez cały okres prowadzenia właściwej hodowli, stanowiącej kombinację hodowli plastrów tkanki oraz zawiesiny komórek równolegle, w sposób opisany powyżej, prowadzono oddzielną hodowlę chondrocytów w zawiesinie. Hodowla komórek w zawiesinie była niezbędna dla stałego utrzymania źródła materiału komórkowego wykorzystywanego do „zalewania” plastrów tkanki. Obserwacje przeprowadzono przy 40-krotnym powiększeniu.
Na fig. 3. przedstawiono mikroskopowy obraz hodowli plastrów tkanki w medium 1 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 10% FBS, 2 mM glutaminy, jak opisano powyżej - wizualizacja tworzenia nowej tkanki w czasie. A: Obraz fragmentów dwóch plastrów tkanki przylegających do siebie maksymalnie blisko na odcinku stycznym o długości ok. 1 cm w pierwszym dniu hodowli (zdjęcie dokumentujące moment rozpoczęcia hodowli, dzień 1). Wyraźnie widoczna wolna przestrzeń pomiędzy powierzchniami styku dwóch plastrów tkanki. B: Obraz fragmentów dwóch plastrów tkanki, przylegających do siebie na odcinku stycznym ok. 1 cm i widocznego wypełnienia tkankowego, tworzącego się pomiędzy powierzchniami styku dwóch plastrów tkanki w siedemnastym dniu hodowli w medium 1 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 10% FBS, 2 mM glutaminy. C, D: Obraz fragmentów dwóch plastrów tkanki, przylegających do siebie na odcinku stycznym ok. 1 cm i widocznego wypełnienia tkankowego, utworzonego pomiędzy powierzchniami styku dwóch plastrów tkanki w pięćdziesiątym drugim dniu hodowli w medium 1 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 10% FBS, 2 mM glutaminy. Nowa tkanka powstała po pięćdziesięciu dwóch dniach hodowli wyraźnie zabliźnia wolną przestrzeń, występującą na styku dwóch plastrów tkanki w pierwszym dniu hodowli. Widoczne znaczne wyrównanie kolorytu starej i nowej tkanki na jednym z końców dwóch powierzchni stykowych widocznych fragmentów plastrów tkanki. Zdjęcia wykonane z wykorzystaniem 10-krotnego przybliżenia (A, B, C) oraz 40-krotnego powiększenia (D).
PL 240 714 B1
P r z y k ł a d 5 - wariant wykonania wynalazku
Hodowlę przeprowadza się jak opisano w przykładzie 4 z tym, że w zmienionych w pewnym zakresie warunkach.
1) Uzyskanie fragmentów tkanki chrzęstnej do dalszej hodowli
Otrzymano osiem plastrów tkanki o kształcie zbliżonym do owalnego, z tym że z jednej strony każdy płat przycięto, by umożliwić jak największą powierzchnię styku dla dwóch umieszczonych obok siebie fragmentów. Otrzymane plastry były cienkie na grubość ok. 1 mm. Ich długość to o k. 0,9 cm, a szerokość ok. 0,5 - 0,6 cm.
2) Wstępna hodowla samych fragmentów tkanek
Wyselekcjonowane i odpowiednio przycięte plastry, jak opisano wcześniej, przeniesiono za pomocą pęsety do dołków 6-dołkowej sterylnej płytki do hodowli komórkowej. Dwa wyselekcjonowane plastry tkanki o grubości ok. 1 mm i długości ok. 0,9 cm i szerokości ok. 0,6 cm umieszczono w dołku uprzednio wypełnionym 2,5 ml mieszaniny medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy i 10% surowicy FBS, 55 mg/l pirogronianu sodu oraz 2 mM glutaminy. Odcinek styczny był prostoliniowy. Medium 1 i 2 opisano w przykładzie poprzednim.
W trzech dołkach, zastosowanej płytki hodowlanej, umieszczono po dwa plastry tkanki w każdym, ułożone tak, by jedną z krawędzi (krawędź styczna) o długości ok. 0,6 cm maksymalnie do siebie przylegały. Były to powtórzenia biologiczne tego samego testu. Chrząstkę inkubowano przez 7 dni w 37°C i 5% CO2. Pożywkę hodowlaną zmieniano co 7 dni, każdorazowo wykorzystując odwrócony mikroskop do oceny żywotności plastrów tkankowych; czystości mikrobiologicznej hodowli oraz analizy pojawienia się ewentualnych nowych struktur komórkowych, wynikających z podziału obecnych w tkance komórek. Wykorzystywano 10-krotne i 40-krotne powiększenie optyczne. Obserwacji dokonywano przed wymianą medium.
3) Uzyskanie zawiesiny chondrocytów i hodowla
Pozostałe dwa plastry (wielkość: ok. 1 mm x 0,9 cm x 0,5 cm) przeznaczono do izolacji chondrocytów, stanowiły one w sumie ok. 25% wagi wszystkich plastrów. W tym celu przeznaczona do trawienia enzymatycznego tkanka została dodatkowo poszatkowana na mniejsze kawałki (wielkość uzyskanych kawałków ok. 2 mm x 2 mm x 2 mm) przy użyciu skalpela. Tak przygotowany materiał poddano działaniu kolagenazy II. Uzyskane kawałki tkanki przeniesiono do sterylnej probówki o objętości 30 ml. Kawałki tkanki przepłukano 3-krotnie 1-krotnie stężonym roztworem soli buforowanym fosforanem (1 x PBS). W poniższym badaniu zastosowano stosunki wagowe tkanki do enzymu: 1 g : 1 mg. Reakcję trawienia prowadzono w warunkach mieszaniny medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy (w stosunku 3 ml medium 0,3 g tkanki - czyli 2 ml), zawierającym odpowiednią ilość kolagenazy II, czyli 0,2 mg. Masa tkanki w gramach stanowiła sumaryczną wartość na jaką składa się masa wykorzystanych plastrów tkanki. Trawienie przeprowadzono w warunkach 37°C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek. Reakcję prowadzono 20 godzin przez noc. Po trawieniu pobrano supernatant, zawierający wolne chondrocyty i wirowano przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (21 °C). Uzyskany osad komórkowy, zawierający chondrocyty, przepłukano trzy razy w 1-krotnie stężonym PBS. Ostatecznie osad komórek ponownie zawieszono w 1 ml mieszaniny medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, zawierającym 10% FBS i 2 mM glutaminę celem obserwacji oraz oceny jakościowej (głównie ocena żywotności i kondycji komórek po trawieniu - oceniano np. regularność kształtu) i ilościowej reakcji trawienia. Otrzymano zawiesinę chondrocytów o żywotności 98%, zawierającą 0,49 mln żywych komórek. Następnie otrzymane komórki wysiano w gęstości 10 000 komórek na cm2. Komórki wysiano na płytki 6 - dołkowe oraz butelkę hodowlaną o objętości 25 cm2.
Komórki pozostawały w ciągłej hodowli do wykorzystania w stymulacji połączeń pomiędzy kawałkami tkanki chrzęstnej.
4) Hodowla łączona - fragmenty tkanki z zawiesiną chondrocytów
Plastry tkanki chrzęstnej opisane w punkcie 2 niniejszego przykładu, hodowane w mieszaninie medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 10% FBS, 2 mM glutaminy, 55 mg/l pirogronianu były „zalewane” chondrocytami, otrzymanymi w wyniku ich rozhodowania po trawieniu (żywotność w zakresie 85% - 92%). Komórki po żwirowaniu i uprzedniej ocenie ilościowej i jakościowej przeprowadzanej jak opisano wyżej (punkt 3 niniejszego przykładu), zawieszano w mieszaninie medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy w objętości końcowej 1000 μl, po czym objętość zawiesiny, zawierającą 80 000 komórek dodawano do każdego dołka z dwoma plastrami tkanki. Następnie dodawano suplementy, którymi w tym badaniu były IGF-1 i TGF w finalnym stężeniu w medium w dołku dla obu dodatków wynoszącym 0,01%.
PL 240 714 B1
Tak powstała kombinacja hodowli fragmentów tkanki i chondrocytów była inkubowana w warunkach 37°C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek przez w sumie 5 tygodni aż do uzyskania nowych połączeń tkankowych między użytymi fragmentami tkanki. Proces „zalewania” tkanki zawiesiną, zawierającą każdorazowo stałą ilość chondrocytów (80 000/2,5 ml medium komórek na dołek, zawierający dwa plastry tkanki), był powtarzany raz w tygodniu (każdorazowo co 7 dni). Przed przeniesieniem tkanki i dodatkiem świeżego medium oraz chondrocytów plastry tkanki były poddawane obserwacji (jak opisano w przykładzie 4). Dodatek chondrocytów miał miejsce po ówczesnym delikatnym przeniesieniu fragmentów tkanki do nowego dołka 6-dołkowej płytki.
Po siedmiu dniach testowej hodowli zauważono pierwsze widoczne zmiany w tkance chrząstki. Po dziewiętnastu dniach zidentyfikowano nowe połączenia tkankowe między starymi fragmentami tkanki, co przedstawiono na fig. 4 - zdjęcie z mikroskopu odwróconego w dniu rozpoczęcia hodowli (fig. 4A) oraz po dziewiętnastu dniach hodowli komórkowo-tkankowej (fig. 4B) przy zastosowaniu dwóch fragmentów tkanki o odcinku stycznym 0,6 cm. Nowe połączenia przypominały tworzące się pomiędzy plastrami tkanki włókna wiążące plastry. Po pięciu tygodniach luka między starymi fragmentami tkanki została wypełniona nową tkanką i zarosła. Miejsce styku dwóch plastrów tkanki zostały wypełnione nowymi połączeniami komórkowymi. Nowa tkanka pomiędzy plastrami chrząstki przyjęła formę swego rodzaju „blizny”. Na zdjęciach mikroskopowych nowa tkanka jest jaśniejsza niż tkanka wyjściowych plastrów chrząstki. Otrzymano płat nowej tkanki, powstałej z plastrów chrząstki oraz wolnych chondrocytów regularnie dostarczanych do hodowli. Otrzymano nowy płat tkankowy o wielkości ok. 1 mm x 1,8 cm x 0,6 cm.
Na fig. 4. przedstawiono mikroskopowy obraz hodowli plastrów tkanki w mieszaninie medium 1 i 2 - wizualizacja tworzenia nowych połączeń tkankowych w czasie. A: Obraz fragmentów dwóch plastrów tkanki przylegających do siebie maksymalnie blisko, na odcinku 0,6 cm w pierwszym dniu hodowli (zdjęcie dokumentujące moment rozpoczęcia hodowli). Wyraźnie widoczna wolna przestrzeń pomiędzy powierzchniami styku dwóch plastrów tkanki. B: Obraz fragmentów dwóch plastrów tkanki, przylegających do siebie na odcinku 0,6 cm i widocznych połączeń tkankowych tworzących się pomiędzy powierzchniami styku dwóch plastrów tkanki w dziewiętnastym dniu hodowli w mieszaninie medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 10% FBS, 2 mM glutaminy i suplementów: IGF-I i TGF w stężeniu 0,01%. Widoczna nowa tkanka, zarówno na powierzchni jednego z przylegających fragmentów jak i pomiędzy fragmentami plastrów tkanki. Powstałe połączenia mają charakter włókien łączących ze sobą dwie powierzchnie styku. Zdjęcie wykonane z wykorzystaniem 10-krotnego przybliżenia.
P r z y k ł a d 6 - wariant wykonania wynalazku
Hodowlę przeprowadza się jak opisano w przykładzie 4 i 5 z tym, że:
1) Uzyskanie fragmentów tkanki chrzęstnej do dalszej hodowli:
Otrzymano dziesięć plastrów tkanki o kształcie zbliżonym do owalnego, z tym że każdy płat przycięto z dwóch stron (dwóch najdłuższych). Otrzymane plastry były cienkie na grubość ok. 3 mm. Ich długość to ok. 1 cm, a szerokość ok. 0,2 cm.
2) Wstępna hodowla samych fragmentów tkanek:
Wyselekcjonowane i odpowiednio przycięte plastry, jak opisano wcześniej, przeniesiono za pomocą pęsety do dołków 6-dołkowej sterylnej płytki do hodowli komórkowej. Cztery wyselekcjonowane plastry tkanki o grubości ok. 3 mm i długości ok. 1 cm (długość powierzchni stycznej - w każdym z fragmentów kształt powierzchni zapewniał maksymalną powierzchnię i kompatybilną powierzchnię styku, zbliżoną do prostoliniowej) i szerokości ok. 0,2 cm umieszczono w dołku uprzednio wypełnionym 1,25 ml mieszaniny medium do hodowli komórek 1 i 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 2% surowicy FBS oraz 2 mM glutaminy.
Odcinek styczny pomiędzy każdą parą wynosił ok. 1 cm. W dołku, zastosowanej płytki hodowlanej 12-dołkowej, umieszczono po cztery plastry tkanki, ułożone tak, by jedną z krawędzi (krawędź styczna) o długości ok. 1 cm maksymalnie do siebie przylegały.
3) Uzyskanie zawiesiny chondrocytów i hodowla:
W poniższym badaniu zastosowano stosunki wagowe tkanki do enzymu: 1 g: 2 mg. Reakcję trawienia prowadzono w warunkach mieszaniny medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy (w stosunku 3 ml medium 0,3 g tkanki - czyli 2 ml), zawierającym odpowiednią ilość kolagenazy II, czyli 0,4 mg. Reakcję prowadzono przez 14 godzin. Ostatecznie osad komórek ponownie zawieszono w 1 ml mieszaniny medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, zawierającym 2% FBS i 2 mM glutaminę celem obserwacji oraz oceny jakościowej (głównie ocena żywotności i kondycji komórek po
PL 240 714 B1 trawieniu - oceniano np. regularność kształtu) i ilościowej reakcji trawienia. Otrzymano zawiesinę chondrocytów o żywotności 92%, zawierającą 0,42 mln żywych komórek.
4) Hodowla łączona - fragmenty tkanki z zawiesiną chondrocytów
Plastry tkanki chrzęstnej opisane w punkcie 2 niniejszego przykładu, hodowane w mieszaninie medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 2% FBS, 2 mM glutaminy - były „zalewane” chondrocytami, otrzymanymi w wyniku ich rozhodowania po trawieniu (żywotność w zakresie 85 % - 92%). Do dołka z plastrami tkanki dodawano odpowiednią objętość zawiesiny, zawierającą 80 000 komórek/1,25 ml medium. Następnie dodawano suplement, którym w tym badaniu była chondroityna w finalnym stężeniu w medium w dołku wynoszącym 0,01%.
Tak powstała kombinacja hodowli fragmentów tkanki i chondrocytów była inkubowana w warunkach 37°C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek przez w sumie 8 tygodni aż do uzyskania nowych połączeń tkankowych między użytymi fragmentami tkanki. Proces „zalewania” tkanki zawiesiną, zawierającą każdorazowo stałą ilość chondrocytów (80 000 komórek na dołek, zawierający cztery plastry tkanki), był powtarzany raz w tygodniu (każdorazowo co 7 dni). Przed przeniesieniem tkanki i dodatkiem świeżego medium oraz chondrocytów plastry tkanki były poddawane obserwacji (jak opisano w przykładzie 4). Dodatek chondrocytów miał miejsce po ówczesnym delikatnym przeniesieniu fragmentów tkanki do nowego dołka 12-dołkowej płytki.
Po czternastu dniach testowej kultury zauważono pierwsze widoczne zmiany w tkance chrząstki. Po dziewiętnastu dniach zidentyfikowano nowe połączenia tkankowe między starymi fragmentami tkanki, co przedstawiono na fig. 5 - zdjęcie z mikroskopu odwróconego w dniu rozpoczęcia hodowli (fig. 5A) i po siedmiu dniach hodowli komórkowo-tkankowej (fig. 5B, C) przy zastosowaniu czterech fragmentów tkanki o odcinku stycznym 1 cm.
Nowe połączenia przypominały tworzące się pomiędzy plastrami tkanki włókna wiążące plastry. Po siedmiu tygodniach luki między starymi fragmentami tkanki zostały wypełnione nową tkanką i zarosły. Miejsca styku dwóch plastrów tkanki zostały wypełnione nowymi połączeniami komórkowymi. Otrzymano płat nowej tkanki, powstałej z plastrów chrząstki oraz wolnych chondrocytów regularnie dostarczanych do hodowli. Otrzymano nowy płat tkankowy o wielkości ok. 3 mm x 1 cm x 0,8 cm.
Na fig. 5. przedstawiono mikroskopowy obraz hodowli plastrów tkanki (pierwszego i drugiego) w medium 1 - wizualizacja tworzenia nowych połączeń tkankowych w czasie. A: Obraz fragmentów dwóch plastrów tkanki (pierwszym i drugim) przylegających do siebie maksymalnie blisko, na odcinku stycznej równym ok. 1 cm, w pierwszym dniu hodowli (zdjęcie dokumentujące moment rozpoczęcia hodowli). Pomiędzy pierwszym plastrem tkanki, umieszczonym najbliżej brzegu płytki, a kolejnym drugim plastrem tkanki widoczna jest wolna przestrzeń. Fragment pierwszy został delikatnie przycięty na brzegu powierzchni stycznej celem jego identyfikacji w dalszej części eksperymentu (fragment plastra pierwszego znajduje się u dołu zdjęcia). B, C: Obraz fragmentów dwóch plastrów tkanki (pierwszego i drugiego) i widocznych połączeń tkankowych tworzących się pomiędzy powierzchniami styku, o długości ok. 1 cm, dwóch plastrów tkanki w dwudziestym siódmym dniu hodowli w medium 1 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 2% FBS, 2 mM glutaminy i chondroityny w stężeniu 0,01%. Pomiędzy powierzchniami styku plastrów tkanek tworzą się połączenia kształtem przypominające włókna. W kolejnych dniach hodowli pomiędzy nimi utworzy się nowa tkanka trwale wiążąca dwa plastry tkanki. Połączenia tego samego rodzaju zaobserwowano również pomiędzy plastrami kolejno: drugim i trzecim oraz trzecim i czwartym. Zdjęcia [A, B] wykonane z wykorzystaniem 10-krotnego przybliżenia, zdjęcie [C] z wykorzystaniem 40-krotnego przybliżenia.
P r z y k ł a d 7 - wariant wykonania wynalazku
Hodowlę przeprowadza się jak opisano w przykładzie 5 z tym, że:
1) Uzyskanie fragmentów tkanki chrzęstnej do dalszej hodowli:
Otrzymano pięć plastrów tkanki o kształcie zbliżonym do prostokątnego. Otrzymane plastry były cienkie na grubość ok. 2 mm. Ich długość to ok. 0,5 cm, a szerokość ok. 0,4 cm.
2) Wstępna hodowla samych fragmentów tkanek:
Wyselekcjonowane i odpowiednio przycięte plastry, jak opisano wcześniej, przeniesiono za pomocą pęsety do dołków 6-dołkowej sterylnej płytki do hodowli komórkowej. Trzy wyselekcjonowane plastry tkanki o grubości ok. 2 mm i długości ok. 0,5 cm i szerokości ok. 0,4 cm (długość powierzchni styku) umieszczono w dołku uprzednio wypełnionym 2,5 ml medium do hodowli komórek 2 z dodatkiem 4% surowicy FBS oraz 2 mM glutaminy. Powyższe plastry tkanki były kształtu owalnego, przy czym dwa

Claims (11)

  1. PL 240 714 B1 z trzech plastrów miały powierzchnię styku wypukłą, a jeden plaster dwie powierzchnie wklęsłe. Wszystkie powierzchnie styczne były kompatybilne ze sobą, tzn. przylegały do siebie bardzo blisko i maksymalnie jak to było możliwe.
    W dołku, zastosowanej płytki hodowlanej 6-dołkowej, umieszczono po trzy plastry tkanki, ułożone tak, by jedną z krawędzi (krawędź styczna) o długości ok. 0,4 cm maksymalnie do siebie przylegały.
    3) Uzyskanie zawiesiny chondrocytów i hodowla:
    W poniższym badaniu zastosowano stosunki wagowe tkanki do enzymu: 1 g : 4 mg. Reakcję trawienia prowadzono w warunkach mieszaniny medium 1 i medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy (w stosunku 6 ml medium 0,3 g tkanki - czyli 4 ml), zawierającym odpowiednią ilość kolagenazy II, czyli 0,8 mg. Reakcję prowadzono przez 8 godzin. Ostatecznie osad komórek ponownie zawieszono w 1 ml medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, zawierającym 4% FBS i 2 mM glutaminę celem obserwacji oraz oceny jakościowej (głównie ocena żywotności i kondycji komórek po trawieniu - oceniano np. regularność kształtu) i ilościowej reakcji trawienia. Otrzymano zawiesinę chondrocytów o żywotności 86%, zawierającą 0,32 mln żywych komórek.
    4) Hodowla łączona - fragmenty tkanki z zawiesiną chondrocytów
    Plastry tkanki chrzęstnej opisane w punkcie 2 niniejszego przykładu, hodowane w medium 2 z dodatkiem 4,5 g/l glukozy, 4% FBS, 2 mM glutaminy - były „zalewane” chondrocytami, otrzymanymi w wyniku ich rozhodowania po trawieniu (żywotność w zakresie 85% - 92%). Do dołka z plastrami tkanki dodawano odpowiednią objętość zawiesiny, zawierającą 60 000 komórek. Następnie dodawano suplement, którym w tym badaniu były insulina w finalnym stężeniu w medium w dołku wynoszącym 0,2%.
    Tak powstała kombinacja hodowli fragmentów tkanki i chondrocytów była inkubowana w warunkach 37°C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek przez w sumie 11 tygodni aż do uzyskania nowych połączeń tkankowych między użytymi fragmentami tkanki. Proces „zalewania” tkanki zawiesiną, zawierającą każdorazowo stałą ilość chondrocytów (60 000 komórek na dołek, zawierający trzy plastry tkanki), był powtarzany raz w tygodniu (każdorazowo co 7 dni). Przed przeniesieniem tkanki i dodatkiem świeżego medium oraz chondrocytów plastry tkanki były poddawane obserwacji (jak opisano w przykładzie 4). Dodatek chondrocytów miał miejsce po ówczesnym delikatnym przeniesieniu fragmentów tkanki do nowego dołka 6-dołkowej płytki.
    Po dwudziestu jeden dniach testowej hodowli zauważono pierwsze widoczne zmiany w tkance chrząstki. Po czterdziestu trzech dniach zidentyfikowano nowe połączenia tkankowe między starymi fragmentami tkanki pomiędzy wszystkimi plastrami tkanki, czyli pomiędzy pierwszym a drugim oraz drugim i trzecim. Po jedenastu tygodniach luki między starymi, fragmentami tkanki zostały wypełnione nową tkanką i zarosły. Miejsce styku trzech plastrów tkanki zostały wypełnione nowymi połączeniami komórkowymi. Otrzymano płat nowej tkanki, powstałej z plastrów chrząstki oraz wolnych chondrocytów regularnie dostarczanych do hodowli. Otrzymano nowy płat tkankowy o wielkości ok. 2 mm x 1,5 cm x 0,4.cm.
    Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej, znamienny tym, że pobraną zdrową tkankę chrzęstną szklistą od pacjenta z miejsc mało obciążonych ruchowo tnie się na co najmniej dwa fragmenty tkanki, a następnie fragmenty te układa się na płytce hodowlanej obok siebie w medium hodowlanym zawierającym minimum 2 mM glutaminy, minimum 2% FBS, minimum 4,5 g/l glukozy, przy czym kształt fragmentów tkanek dopasowuje się co najmniej na jednym odcinku krawędzi każdego fragmentu tak aby po ułożeniu fragmentów blisko siebie przestrzeń pomiędzy zbliżonymi dwoma fragmentami tkanki była jak najmniejsza i tak aby wypełniana fragmentami tkanek przestrzeń płytki hodowlanej była jak najmniejsza w ten sposób aby w trakcie hodowli złączyć ze sobą fragmenty na co najmniej jednym odcinku stycznym, pr zy czym odcinek styczny pomiędzy co najmniej dwoma łączonymi fragmentami tkanki wynosi co najmniej 0,1 cm, przy czym do hodowli dodaje się zawiesiny chondrocytów i prowadzi się hodowlę komórkową fragmentów tkanki z chondrocytami, zaś medium hodowlane zmienia się w ustalonym czasie dodając do medium hodowlanego chondrocyty, przy czym hodowle prowadzi się aż do uzyskania złączenia fragmentu tkanki na co najmniej fragmencie odcinka stycznego.
    PL 240 714 B1
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że medium hodowlane zawiera suplementy w stężeniu minimum 0,01% IGF i/lub 0,01% TGF i/lub 0,01% chondroityny i lub/minimum 0,1% insuliny.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że medium hodowlane zawiera 55 - 75 mg/l pirogronianu sodu i wodorowęglan sodu, 2 mM - 4 mM glutaminy, 2% - 10% FBS, oraz co najmniej 4,5 g/l glukozy, jak również etanoloaminę i/lub glutation i/lub kwas askorbinowy i/lub insulinę i/lub transferynę i/lub siarczan miedzi i/lub chlorek manganu.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1 lub 2 lub 3, znamienny tym, że przed dodaniem chondrocytów prowadzi się hodowle komorową samych fragmentów tkanki w medium, korzystnie przez co najmniej 14 dni, po czym do hodowli dodaje się chondrocyty.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1 lub 4, znamienny tym, że do hodowli fragmentów tkanki dodaje się zawiesiny chondrocytów w takiej ilości, że na 2,5 ml medium hodowlanego jest co najmniej 40 000 chondrocytów.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1 lub 4 lub 5, znamienny tym, że minimalne stężenia chondrocytów przy hodowli dwóch fragmentów o odcinku stycznym wynoszącym 0,1 cm - 1 cm wynosi 40 000 chondrocytów na 2,5 ml medium.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że chondrocyty do hodowli uzyskuje się w wyniku trawienia enzymatycznego, po czym wymaganą liczbę komórek uzyskuje się w wyniku hodowli chondrocytów w monowarstwie w hodowli adherentnej.
  8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w podwyższonej temperaturze 37°C i 5% CO2.
  9. 9. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-8, znamienny tym, że odcinek styczny pomiędzy co najmniej dwoma łączonymi fragmentami tkanki wynosi co najmniej 0,5 cm.
  10. 10. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienny tym, że fragmenty tkanki mają kształt zbliżony do owalnego.
  11. 11. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-10, znamienny tym, że kształt fragmentów tkanek tak się dobiera aby fragmenty tkanki w hodowli przylegały do siebie bardzo blisko na odcinku stycznym.
PL430801A 2019-08-02 2019-08-02 Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej PL240714B1 (pl)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL430801A PL240714B1 (pl) 2019-08-02 2019-08-02 Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej
ES20750270T ES2967034T3 (es) 2019-08-02 2020-08-03 Un método de cultivo in vitro de condrocitos y cartílagos para obtener material para el tratamiento de defectos del cartílago articular
KR1020227006953A KR20220042423A (ko) 2019-08-02 2020-08-03 관절 연골 결손을 치료하기 위한 물질을 얻기 위한 시험관내 연골세포 및 연골 배양 방법
US17/632,141 US20220265899A1 (en) 2019-08-02 2020-08-03 A method of in vitro chondrocyte and cartilage culture to obtain material for the treatment of articular cartilage defects
JP2022533249A JP2022543174A (ja) 2019-08-02 2020-08-03 関節軟骨欠損症の処置用の材料を得るための、軟骨細胞および軟骨のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の方法
EP20750270.9A EP4007615B8 (en) 2019-08-02 2020-08-03 A method of in vitro chondrocyte and cartilage culture to obtain material for the treatment of articular cartilage defects
PT207502709T PT4007615T (pt) 2019-08-02 2020-08-03 Método de cultura in vitro de condrócitos e cartilagem para obtenção de material para tratamento de defeitos da cartilagem articular
PCT/EP2020/071826 WO2021023718A1 (en) 2019-08-02 2020-08-03 A method of in vitro chondrocyte and cartilage culture to obtain material for the treatment of articular cartilage defects
FIEP20750270.9T FI4007615T3 (fi) 2019-08-02 2020-08-03 Menetelmä kondrosyytti- ja rustoviljelyyn in vitro, materiaalin saamiseksi nivelruston vaurioiden hoitoon
CN202080069155.4A CN114466923B (zh) 2019-08-02 2020-08-03 一种体外培养软骨细胞和软骨以获得治疗关节软骨缺损材料的方法
DK20750270.9T DK4007615T3 (da) 2019-08-02 2020-08-03 Fremgangsmåde til in vitro dyrkning af kondrocytter og bruskvæv til opnåelse af materiale til behandling af ledbruskdefekter
CA3149427A CA3149427A1 (en) 2019-08-02 2020-08-03 A method of in vitro chondrocyte and cartilage culture to obtain material for the treatment of articular cartilage defects
HUE20750270A HUE064647T2 (hu) 2019-08-02 2020-08-03 In vitro kondrocita és porc tenyésztési eljárás ízületi porc károsodások kezelésére szolgáló anyag elõállítására
IL290282A IL290282A (en) 2019-08-02 2022-02-01 A method for the culture of chondrocytes and cartilage in order to obtain material for the treatment of articular cartilage disorders

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL430801A PL240714B1 (pl) 2019-08-02 2019-08-02 Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL430801A1 PL430801A1 (pl) 2021-02-08
PL240714B1 true PL240714B1 (pl) 2022-05-23

Family

ID=74492953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL430801A PL240714B1 (pl) 2019-08-02 2019-08-02 Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20220265899A1 (pl)
EP (1) EP4007615B8 (pl)
JP (1) JP2022543174A (pl)
KR (1) KR20220042423A (pl)
CN (1) CN114466923B (pl)
CA (1) CA3149427A1 (pl)
DK (1) DK4007615T3 (pl)
ES (1) ES2967034T3 (pl)
FI (1) FI4007615T3 (pl)
HU (1) HUE064647T2 (pl)
IL (1) IL290282A (pl)
PL (1) PL240714B1 (pl)
PT (1) PT4007615T (pl)
WO (1) WO2021023718A1 (pl)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030099620A1 (en) * 1997-10-30 2003-05-29 The General Hospital Corporation Bonding of cartilaginous matrices using isolated chondrocytes
EP1356024A2 (en) * 2001-01-31 2003-10-29 Interface Biotech A/S An improved in vitro method of culturing mammalian cells for autologous cell implantation/transplantation methods
US7067123B2 (en) * 2003-04-29 2006-06-27 Musculoskeletal Transplant Foundation Glue for cartilage repair
WO2005079881A1 (en) * 2004-02-19 2005-09-01 Interface Biotech A/S Arthroscopic method for cell implantation in mammals
CN102526806B (zh) * 2012-01-20 2013-12-18 陕西博鸿生物科技有限公司 一种组织工程软骨及其制备方法
CN106434538A (zh) * 2016-09-29 2017-02-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 软骨细胞的三维培养方法、制得的软骨组织与应用
CN110016461A (zh) * 2019-01-15 2019-07-16 深圳市第二人民医院 一种软骨细胞体外扩增方法

Also Published As

Publication number Publication date
PL430801A1 (pl) 2021-02-08
IL290282A (en) 2022-04-01
HUE064647T2 (hu) 2024-03-28
EP4007615B8 (en) 2024-01-03
FI4007615T3 (fi) 2023-12-15
DK4007615T3 (da) 2023-12-04
PT4007615T (pt) 2023-12-11
EP4007615A1 (en) 2022-06-08
KR20220042423A (ko) 2022-04-05
CA3149427A1 (en) 2021-02-11
US20220265899A1 (en) 2022-08-25
JP2022543174A (ja) 2022-10-07
EP4007615B1 (en) 2023-09-27
WO2021023718A1 (en) 2021-02-11
CN114466923B (zh) 2024-06-14
ES2967034T3 (es) 2024-04-25
CN114466923A (zh) 2022-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2285382C (en) Neocartilage and methods of use
US5197985A (en) Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells
US6365405B1 (en) Compositions of chondrocytes, preparation and utilization
CA2111845C (en) Monoclonal antibodies specific for marrow-derived mesenchymal cells
CZ20032082A3 (cs) Zlepšený způsob kultivace savčích buněk in vitro pro autologní způsoby implantace a transplantace
Malaviya et al. Fluid-induced shear stress stimulates chondrocyte proliferation partially mediated via TGF-β 1
WO1999027077A1 (en) Method for producing human intervertebral disc cells
EP1819290B1 (en) Scaffoldless constructs for tissue engineering of articular cartilage
EP1226232A2 (en) Synthetic substrate for tissue formation
US20040030404A1 (en) Method for cultivating a cartilage replacement and a biomatrix produced according to this method
JP2009530334A (ja) 軟骨細胞の軟骨表現型の維持、改善および修復方法
JP6495934B2 (ja) グラフト移植および組織工学的手順におけるｆｇｆ−１８
Wongin et al. Effect of cell sheet manipulation techniques on the expression of collagen type II and stress fiber formation in human chondrocyte sheets
PL240714B1 (pl) Sposób prowadzenia hodowli komórkowej chondrocytów in vitro do uzyskiwania materiału do leczenia ubytków chrząstki stawowej
US20230241117A1 (en) Method of producing cell preparation for joint medical treatment, cell preparation for joint medical treatment, and method of culturing mesenchymal stem cell
KR20130007184A (ko) 반월상 연골 이식을 위한 연골세포의 증식방법
AU2002227888A1 (en) An improved in vitro method of culturing mammalian cells for autologous cell implantation/transplantation methods