CN108478871B - 一体化骨-软骨修复支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种一体化骨‑软骨修复支架，由软骨下骨修复层、中间层和软骨修复层组成的一体化结构，软骨下骨修复层为成型多孔磷酸钙生物陶瓷，中间层为巯基‑透明质酸水凝胶，软骨修复层由I型胶原水凝胶和软骨细胞或骨髓间充质干细胞组成，中间层位于软骨下骨修复层与软骨修复层之间以及成型多孔磷酸钙生物陶瓷的多孔结构中，将软骨下骨修复层与软骨修复层隔离开。本发明还提供了该一体化骨‑软骨修复支架的制备方法。本发明提供的修复支架能阻止血管侵入软骨层，提高骨层与软骨层之间连接的紧密性与稳定性，实现二者的生物结合，达到良好的修复效果。

Description

一体化骨-软骨修复支架及其制备方法
技术领域
本发明属于骨软骨修复支架领域，涉及一种具有一体化修复关节软骨、软骨下骨及两者连接处界面层的支架及其制备方法。
背景技术
运动损伤、意外或者疾病都可能导致骨/软骨的损伤。骨-软骨缺损包含了多种结构和功能不同的组织，其中主要的三种类型为：负责润滑和减小摩擦的关节软骨，承载力学的软骨下骨，以及将软骨和下骨分隔在两个不同环境并能够阻止血管入侵软骨层的钙化层。由于软骨不包含血管或神经，而软骨下骨包含无髓鞘的神经末梢，因此当关节疾病产生疼痛时，软骨下骨可能已经暴露或损伤。有调查发现，超过60％的关节病患者患有的软骨损伤中软骨下骨已经暴露在外。有研究指出，软骨下骨层不仅可以为软骨修复提供一个较好的力学环境，也可以使新生软骨在修复过程中与周围正常软骨组织连接更紧密，较单层软骨修复效果要更佳。所以，越来越多人关注到骨-软骨损伤一体化的修复的重要性，而不只局限于关节软骨的修复。
到目前为止，临床治疗骨-软骨全层缺损的方法有：微裂纹、软骨刮削、关节置换、马赛克成形术、软骨下骨钻孔和假关节置换等。然而，这些治疗方式具有供体来源有限、治疗部位的病变、移植体的松脱和假体有限以及耐久性差等局限性，迫切需要新的技术手段来修复骨-软骨一体化损伤。组织工程技术给我们带来了新的方向。
目前已有关于骨-软骨一体化复合支架再生修复骨-软骨缺损的报道。其中，有一些是分别利用适合或能促进骨、软骨生长的两种材料或一种材料的不同结构形成双层支架进行修复。且通常都是在体外构建的一个双层的支架然后整体植入。然而双层支架结构中缺少阻止血管侵入软骨层的结构，一旦血管侵入软骨层，将再次引起骨关节病变的发生，这给长期稳定有效的修复带来了一定的风险。另一些研究中为了能更好地将骨、软骨两层区分在两种不同的生存环境中，在骨与软骨两层中添加过渡层，形成有隔离层的三层复合结构。隔离层的形成大多是通过模拟天然钙化层的成分、结构或功能来构建的。然而，CelesteScotti等人提出仅通过化学或物理结合很难保证软骨与骨层之间的长时间整合，特别是当界面上没有形成新的细胞外基质来填补材料的降解缺失的话，长时间之后，可能出现软骨与软骨下骨两层的剥离，界面层阻止血管入侵的功能也可能丧失。因此，如何才能形成更为紧密的骨与软骨两层结构之间连接的界面层，且该界面层能起到天然骨-软骨结构中钙化层将骨与软骨分隔在两个不同环境并阻止血管侵入软骨层的作用，依旧是一项很难攻克的挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种一体化骨-软骨修复支架及其制备方法，以阻止血管侵入软骨层，提高骨层与软骨层之间连接的紧密性与稳定性，实现二者的生物结合，达到更好的修复效果。
本发明提供的一体化骨-软骨修复支架，由软骨下骨修复层、中间层和软骨修复层组成的一体化结构，软骨下骨修复层为成型多孔磷酸钙生物陶瓷，中间层为巯基-透明质酸水凝胶，软骨修复层由I型胶原水凝胶和软骨细胞或骨髓间充质干细胞组成，中间层位于软骨下骨修复层与软骨修复层之间以及成型多孔磷酸钙生物陶瓷的多孔结构中，将软骨下骨修复层与软骨修复层隔离开，巯基-透明质酸水凝胶是由结构式如式(Ⅰ)所示的巯基-透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基-透明质酸中半胱氨的接枝率为1％～80％，
Figure BDA0001631474810000021
上述一体化骨-软骨修复支架的技术方案中，中间层处于软骨下骨修复层与软骨修复层之间的部分的厚度根据实际修复对象进行确定，通常为0.1～5mm，优选为0.5～5mm，更优选为1～3mm。
上述一体化骨-软骨修复支架的技术方案中，中间层中交联巯基-透明质酸的含量为0.1wt％～10wt％，优选为1wt％～3wt％，软骨修复层中I型胶原的含量为5～20mg/mL，优选为10～20mg/mL。
上述一体化骨-软骨修复支架的技术方案中，成型多孔磷酸钙生物陶瓷的孔隙率为60％～80％。优选地，多孔磷酸钙生物陶瓷为多孔双相磷酸钙陶瓷(BCP陶瓷)，更优选地，BCP陶瓷由羟基磷灰石与β-磷酸三钙组成，进一步地，BCP陶瓷中羟基磷灰石的含量为10wt％～50wt％。
上述一体化骨-软骨修复支架的技术方案中，巯基-透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱胺改性得到的，作为改性基础的透明质酸的分子量优选为0.001MDa～6.0MDa，优选地，作为改性基础的透明质酸的分子量优选为0.1MDa～1.0MDa，巯基-透明质酸的制备方法可参见CN 104892962A。
上述一体化骨-软骨修复支架的技术方案中，巯基-透明质酸中半胱氨的接枝率优选为10％～80％，进一步优选为20％～60％，更优选地，巯基-透明质酸中半胱氨的接枝率为30％～40％。
上述一体化骨-软骨修复支架的技术方案中，成型多孔磷酸钙生物陶瓷的形状及厚度、软骨修复层的厚度根据实际的待修复对象进行确定。
上述一体化骨-软骨修复支架，可根据实际应用需要在体外制备好后整体植入待进行骨-软骨修复的缺损部位，也可以在将成型多孔磷酸钙生物陶瓷植入待进行骨-软骨修复的缺损部位后将巯基-透明质酸水凝胶前驱液，以及I型胶原水凝胶与软骨细胞或骨髓间充质干细胞组成的混合液依次原位注射至缺损部位形成一体化骨-软骨修复支架，具体可以分为以下两种方法。
方法一：
(1)将成型多孔磷酸钙生物陶瓷植入待进行骨-软骨修复的部位；
(2)用α-MEM培养基溶解巯基-透明质酸，在冰浴下调节pH值至7.2～7.4，得到0.1wt％～10.0wt％的巯基-透明质酸溶液，将巯基-透明质酸溶液注射到成型多孔磷酸钙生物陶瓷上方，巯基-透明质酸通过自交联反应形成巯基-透明质酸水凝胶层；
(3)在冰浴下，将I型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.2～7.4，然后用PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为5～20mg/mL，将软骨细胞或骨髓间充质干细胞悬液加入I型胶原溶液中，混匀，将所得I型胶原-细胞混合液注射至巯基-透明质酸水凝胶层上方，待I型胶原成胶形成I型胶原水凝胶层后即得一体化骨-软骨修复支架。
方法二：
(1)将成型多孔磷酸钙生物陶瓷置于模具中；
(2)用α-MEM培养基溶解巯基-透明质酸，在冰浴下调节pH值至7.2～7.4，得到0.1wt％～10.0wt％的巯基-透明质酸溶液，将巯基-透明质酸溶液注射到模具中的成型多孔磷酸钙生物陶瓷上方，巯基-透明质酸通过自交联反应形成巯基-透明质酸水凝胶层；
(3)在冰浴下，将I型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.2～7.4，然后用PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为5～20mg/mL，将软骨细胞或骨髓间充质干细胞悬液加入I型胶原溶液中，混匀，将所得I型胶原-细胞混合液注射至模具中的巯基-透明质酸水凝胶层上方，待I型胶原成胶形成I型胶原水凝胶层后即得一体化骨-软骨修复支架，将一体化骨-软骨修复支架从模具中取出。
上述两种方法的步骤(3)中，按照1×104～5×108cells/mL的比例向I型胶原溶液中加入细胞悬液。所述巯基-透明质酸溶液的浓度优选为1wt％～3wt％，优选用用PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为10～20mg/mL。
上述两种方法中，所述醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4、浓度为0.01～0.02mol/L。
与现有技术相比，本发明产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供的一体化骨-软骨修复支架由软骨下骨修复层、软骨修复层和将软骨下骨修复层与软骨修复层隔离开的中间层组成，软骨下骨修复层为成型多孔磷酸钙生物陶瓷，中间层为巯基-透明质酸水凝胶，软骨修复层由I型胶原水凝胶和软骨细胞或骨髓间充质干细胞组成。成型多孔磷酸钙生物陶瓷能促进骨层的修复，也能在前期为软骨的修复提供力学支撑；软骨修复层中，软骨细胞或骨髓间充质干细胞分布在I型胶原水凝胶的3D环境中，能更好的维持细胞功能、快速增殖分化并分泌软骨相关基质；巯基-透明质酸水凝胶层将软骨与骨分隔开，由于透明质酸的亲水性和多阴离子表面，以透明质酸为基础的巯基-透明质酸水凝胶能阻碍细胞的粘附，从而能阻止血管入侵及细胞的迁移，巯基-透明质酸水凝胶层的存在，阻止了血管侵入带来的影响，也阻止了下骨及骨髓中细胞迁入可能带来的影响，且巯基-透明质酸水凝胶也具有钙化层的半渗透性，允许部分营养物质的通过，为软骨层提供了一个适宜的微环境，随着修复时间的延长，巯基-透明质酸降解，为软骨层中骨髓间充质干细胞分化成的软骨细胞提供空间，逐渐被软骨细胞取代，与骨接触部分的软骨成为肥大软骨细胞，表达胶原蛋白II型，胶原蛋白X型，碱性磷酸酶，骨蛋白，高磷化的羟基附着蛋白，形成能够长期保持的钙化层，使骨层与软骨层之间实现“生物结合”。与现有三层复合结构的修复材料相比，本发明提供的一体化骨-软骨修复支架能使骨与软骨之间形成更为紧密和稳定的结合，具有更好的修复效果。
2.实验表明，相比于空白对照组和不含中间层的Col I+BCP组，Col I+HA-SH+BCP组采用的一体化骨-软骨修复支架对兔关节骨软骨缺损处具有更好的修复效果，在经过了1个月的修复期后，在Col I+HA-SH+BCP组的兔关节骨软骨缺损处的软骨层和骨层都有新生组织生成，新生软骨为透明软骨，含有大量的软骨细胞特异性分泌基质GAG及Col II。
附图说明
图1a是实施例2制备的空白一体化骨-软骨修复支架的照片，图1b为实施例3制备的一体化骨-软骨修复支架的照片，图1c～f依次为实施例3制备的一体化骨-软骨修复支架在体外培养1,3,7,14天后的激光共聚焦图。
图2a是实施例4在小鼠皮下注射HA-SH水凝胶后的照片，图2b～d是在注射1,2,4周后取出HA-SH水凝胶采用激光共聚焦观察材料内部细胞长入情况的结果，图2b1～d1是HE染色结果，图2b2～d2是注射1,2,4周后取出的HA-SH水凝胶照片。
图3是实施例5的空白对照组、Col I+BCP组以及Col I+HA-SH+BCP组的兔关节骨软骨缺损处的修复大体观图。
图4是实施例5的空白对照组、Col I+BCP组以及Col I+HA-SH+BCP组的兔关节骨软骨缺损处的切片染色结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的一体化骨-软骨修复支架及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
实施例1
本实施例中制备巯基-透明质酸(HA-SH)，步骤如下：
(1)将分子量为0.3MDa的透明质酸钠溶解于去离子水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，充分溶解，用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液调节混合液的pH值至4.75，在室温反应2h，然后加入半胱氨盐酸盐(CSH·HCl)溶液，在室温反应24h，之后用1mol/L的NaOH溶液调节反应液的pH值至8.5，加入二硫苏糖醇(DTT)溶液，在室温反应12h。
该步骤中，透明质酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、半胱氨盐酸盐(CSH·HCl)与二硫苏糖醇(DTT)的摩尔比为1:2:3:2:6。
(2)用1mol/L的HCl溶液调节步骤(1)所得反应液的pH值至3.0～3.5，在pH值为3.0～3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到HA-SH，采用改进的Ellman法测定HA-SH中的巯基取代度，该HA-SH中半胱氨的接枝率为33.54％。
采用改进的Ellman法测定HA-SH中的巯基取代度发现，通过改变EDCI与CSA·HCl的摩尔比，透明质酸钠的分子量，可以改变HA-SH中巯基的取代度，即改变HA-SH中半胱氨的接枝率，随着EDCI与CSA·HCl的摩尔比增加，巯基取代度逐渐升高，而透明质酸钠的分子量越高，巯基取代度越低，可能的原因是高粘度高分子量的透明质酸钠会导致流动性下降，这可能降低了透明质酸钠与CSA·HCl相互接触的几率，导致较低的反应活性，通过调整EDCI与CSA·HCl的摩尔比以及透明质酸钠的分子量，可以调整HA-SH中半胱氨的接枝率为1％～80％范围内。
实施例2
本实施例中，制备不含软骨细胞及骨髓间充质干细胞的空白一体化骨-软骨修复支架，步骤如下：
(1)将成型多孔双相磷酸钙陶瓷(多孔BCP陶瓷)置于径为4mm、高5mm的一端封闭的圆筒状模具内，多孔BCP陶瓷由羟基磷灰石(HA)与β-磷酸三钙(β-TCP)组成，HA与β-TCP的质量比为2:8，孔隙率约为70％，成型多孔BCP陶瓷是直径为4mm、高度为2mm的圆柱状块体，成型多孔BCP陶瓷采用与模具同轴线的方式置于圆筒状模具的封闭端。
(2)用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，在冰浴下用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，得到3.0wt％的HA-SH溶液，立即将HA-SH溶液注射到模具中的成型多孔BCP陶瓷上方，HA-SH溶液注射至模具中后，部分HA-SH溶液会进入成型多孔BCP陶瓷的孔隙结构中，HA-SH通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成HA-SH水凝胶层，HA-SH水凝胶层高出成型BCP陶瓷上表面约1mm。
(3)在冰浴下，将I型胶原(Col I)用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，然后用PBS缓冲液调节Col I的浓度为10mg/mL，将所得Col I溶液注射至模具中的HA-SH水凝胶层上方至，静置成胶，形成的Col I水凝胶层的厚度约为2mm，得到空白一体化骨-软骨修复支架，将该空白一体化骨-软骨修复支架从模具中取出。
实施例3
本实施例中，制备一体化骨-软骨修复支架，步骤如下：
(1)将成型多孔BCP陶瓷置于径为4mm、高5mm的一端封闭的圆筒状模具内，多孔BCP陶瓷由HA与β-TCP组成，HA与β-TCP的质量比为2:8，孔隙率约为70％，成型多孔BCP陶瓷是直径为4mm、高度为2mm的圆柱状块体，成型多孔BCP陶瓷采用与模具同轴线的方式置于圆筒状模具的封闭端。
(2)用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，在冰浴下用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，加入尼罗红染料混匀，得到HA-SH浓度为3.0wt％的HA-SH-染料混合溶液，立即将HA-SH-染料混合溶液注射到模具中的成型多孔BCP陶瓷上方，HA-SH-染料混合溶液注射至模具中后，部分HA-SH-染料混合溶液会进入成型多孔BCP陶瓷的孔隙结构中，HA-SH通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成含染料HA-SH水凝胶层，含染料HA-SH水凝胶层高出成型BCP陶瓷上表面约2mm。
(3)提取1～3天幼兔的软骨细胞，用培养皿在在37℃、0.5％CO2细胞培养箱中培养并传至p2代后，消化收集细胞，加入α-MEM培养基制成软骨细胞悬液。
在冰浴下，将Col I用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，然后用PBS缓冲液调节Col I的浓度为10mg/mL，按照5×106cells/mL的密度将软骨细胞接种至所得Col I溶液中，混匀，得到Col I-细胞混合液，将Col I-细胞混合液注射至含染料HA-SH水凝胶层上方，静置成胶，形成的Col I水凝胶层的厚度约为1mm得到一体化骨-软骨修复支架，将该一体化骨-软骨修复支架从模具中取出，放入α-MEM培养基中培养。
本实施例同时制备了多个一体化骨-软骨修复支架，将各一体化骨-软骨修复支架同时放入培养基中培养，分别在培养1，3，7以及14天后各取出一个一体化骨-软骨修复支架，FDA染色，通过激光共聚焦观察软骨细胞的分布情况。
图1a是实施例2制备的空白一体化骨-软骨修复支架的照片，图1b为实施例3制备的一体化骨-软骨修复支架的照片，图1c～f依次为实施例3制备的一体化骨-软骨修复支架在体外培养1,3,7,14天后的激光共聚焦图。通过大体观察可知，骨-软骨修复支架分成清晰可见的三层结构，BCP陶瓷为软骨下骨修复层，Col I水凝胶为软骨修复层，HA-SH水凝胶为中间层。通过激光共聚焦图片可知，骨-软骨修复支架中的软骨细胞存活良好，即使到14天后也基本没有软骨细胞迁移到HA-SH水凝胶层中。
实施例4
本实施例中，将HA-SH溶液注射至小鼠皮下形成水凝胶，考察HA-SH水凝胶中是否有细胞、血管长入。
用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，在冰浴下用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，得到3.0wt％的HA-SH溶液，立即将HA-SH溶液注射到小鼠皮下，注射量为0.1mL，HA-SH通过巯基之间形成二硫键的自交联反应在小鼠皮下形成HA-SH水凝胶。分别在注射1、2及4周后将HA-SH水凝胶取出，通过大体观及激光共聚焦观察是否有细胞、血管长入。
图2a是在小鼠皮下注射HA-SH水凝胶后的照片，图2b～d是在注射1,2,4周后取出HA-SH水凝胶采用激光共聚焦观察材料内部细胞长入情况的结果，图2b1～d1是HE染色结果，图2b2～d2是注射1,2,4周后取出的HA-SH水凝胶照片。由图2可知，将HA-SH溶液注射至小鼠皮下4周以后，依旧基本没有血管和细胞长入HA-SH水凝胶内部。结合图1和图2可以看出，不论在体内还是体外，HA-SH水凝胶都具有较好阻止细胞迁移及血管长入的能力。
实施例5
本实施例中，考察本发明提供的一体化骨-软骨修复支架对成年雄兔股骨膝关节缺损处的修复情况，实验分为空白对照组、Col I+BCP组以及Col I+HA-SH+BCP组。
(1)空白对照组：取3月龄的成年雄兔，股骨膝关节滑车处造直径为4mm、深度为5mm的缺损。不做处理，作为空白对照组。一个月时取出关节，从大体观及HE、番红O染色结果，观察缺损处的修复情况。
(2)Col I+BCP组：
①取3月龄的成年雄兔，股骨膝关节滑车处造直径为4mm、深度为5mm的缺损，将成型多孔BCP陶瓷用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液浸润后植入缺损部位的底部，多孔BCP陶瓷由HA与β-TCP组成，HA与β-TCP的质量比为2:8，孔隙率约为70％，成型多孔BCP陶瓷是直径为4mm、高度为2mm的圆柱状块体。
②收集梯度密度离心分离得到的3月龄成年兔骨髓间充质干细胞，加入α-MEM培养基制成骨髓间充质干细胞悬液。在冰浴下，将Col I用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节Col I的浓度为10mg/mL，按照5×106cells/mL的密度将骨髓间充质干细胞接种至Col I溶液中，混匀，得到Col I-细胞混合液，将Col I-细胞混合液注射至成型多孔BCP陶瓷上方的缺损处，部分Col I-细胞混合液会进入成型多孔BCP陶瓷的孔隙结构中，静置成胶，形成的Col I水凝胶层高出成型BCP陶瓷上表面约3mm，复位髌骨缝合伤口。一个月时取出关节，从大体观及HE、番红O染色结果，观察缺损处的修复情况。
(3)Col I+HA-SH+BCP组：
①取3月龄的成年雄兔，股骨膝关节滑车处造直径为4mm、深度为5mm的缺损，将成型多孔BCP陶瓷用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液浸润后植入缺损部位的底部，多孔BCP陶瓷由HA与β-TCP组成，HA与β-TCP的质量比为2:8，孔隙率约为70％，成型多孔BCP陶瓷是直径为4mm、高度为2mm的圆柱状块体。
②用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，在冰浴下用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，得到3.0wt％的HA-SH溶液，立即将HA-SH溶液注射到成型多孔BCP陶瓷上方的缺损处，部分HA-SH溶液会进入成型多孔BCP陶瓷的孔隙结构中，HA-SH通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成HA-SH水凝胶层，HA-SH水凝胶层高出成型BCP陶瓷上表面约1mm。
③收集梯度密度离心分离得到的3月龄成年兔骨髓间充质干细胞，加入α-MEM制成骨髓间充质干细胞悬液。在冰浴下，将Col I用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节Col I的浓度为10mg/mL，按照5×106cells/mL的密度将骨髓间充质干细胞接种至Col I溶液中，混匀，得到Col I-细胞混合液，将Col I-细胞混合液注射至HA-SH水凝胶层上方的缺损处，静置成胶，形成的Col I水凝胶层的厚度约为2mm，复位髌骨缝合伤口。一个月时取出关节，从大体观及HE、番红O染色结果，观察缺损处的修复情况。
图3是一个月后空白对照组、Col I+BCP组以及Col I+HA-SH+BCP组的兔关节骨软骨缺损处的修复大体观图，图4是一个月后空白对照组、Col I+BCP组以及Col I+HA-SH+BCP组的兔关节骨软骨缺损处的切片HE、番红O染色结果。通过大体观及切片染色结果观察发现，在经过了1个月的修复期以后，Col I+HA-SH+BCP组相较于另外两组的有更好的修复效果，无论软骨还是骨层都有新生组织生成，且新生软骨为透明软骨，含有大量的软骨细胞特异性分泌基质GAG及Col II。
实施例6
本实施例中，制备一体化骨-软骨修复支架，步骤如下：
(1)参照实施例1中的方法，以分子量为1.0MDa的透明质酸钠作为改性基础的透明质酸，得到半胱氨的接枝率约为40％的HA-SH。
(2)将成型多孔BCP陶瓷置于径为4mm、高7mm的一端封闭的圆筒状模具内，多孔BCP陶瓷由HA与β-TCP组成，HA的含量为10wt％，孔隙率约为60％，成型多孔BCP陶瓷是直径为4mm、高度为2mm的圆柱状块体，成型多孔BCP陶瓷采用与模具同轴线的方式置于圆筒状模具的封闭端。
(3)用α-MEM培养基溶解HA-SH，在冰浴下用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，得到HA-SH浓度为1.0wt％的HA-SH溶液，立即将HA-SH溶液注射到模具中的成型多孔BCP陶瓷上方，HA-SH溶液注射至模具中后，部分HA-SH溶液会进入成型多孔BCP陶瓷的孔隙结构中，HA-SH通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成HA-SH水凝胶层，HA-SH水凝胶层高出成型BCP陶瓷上表面约3mm。
(4)提取1～3天幼兔的软骨细胞，用培养皿在在37℃、0.5％CO2细胞培养箱中培养并传至p2代后，消化收集细胞，加入α-MEM培养基制成软骨细胞悬液。
在冰浴下，将Col I用1mol/L的醋酸溶液溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节Col I的浓度为20mg/mL，按照5×108cells/mL的密度将软骨细胞接种至所得Col I溶液中，混匀，得到Col I-细胞混合液，将Col I-细胞混合液注射至含染料的HA-SH水凝胶层上方，静置成胶，形成的Col I水凝胶层的厚度约为2mm，得到一体化骨-软骨修复支架。
实施例7
本实施例中，制备一体化骨-软骨修复支架，步骤如下：
(1)参照实施例1中的方法，以分子量为0.1MDa的透明质酸钠作为改性基础的透明质酸，得到半胱氨的接枝率约为30％的HA-SH。
(2)取3月龄的成年雄兔，股骨膝关节滑车处造直径为4mm、深度为5mm的缺损，将成型多孔BCP陶瓷用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液浸润后植入缺损部位的底部，多孔BCP陶瓷由HA与β-TCP组成，HA的含量为50wt％，孔隙率约为80％，成型多孔BCP陶瓷是直径为4mm、高度为2.5mm的圆柱状块体。
(3)用α-MEM培养基溶解HA-SH，在冰浴下用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，得到2.0wt％的HA-SH溶液，立即将HA-SH溶液注射到成型多孔BCP陶瓷上方的缺损处，部分HA-SH溶液会进入成型多孔BCP陶瓷的孔隙结构中，HA-SH通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成HA-SH水凝胶层，HA-SH水凝胶层高出成型BCP陶瓷上表面约0.5mm。
(4)收集梯度密度离心分离得到的3月龄成年兔骨髓间充质干细胞，加入α-MEM制成骨髓间充质干细胞悬液。在冰浴下，将Col I用0.25mol/L的醋酸溶液溶解，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，然后用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液调节ColI的浓度为15mg/mL，按照1×104cells/mL的密度将骨髓间充质干细胞接种至Col I溶液中，混匀，得到Col I-细胞混合液，将Col I-细胞混合液注射至HA-SH水凝胶层上方的缺损处，静置成胶，形成的Col I水凝胶层的厚度约为2mm，复位髌骨缝合伤口。

Claims (10)

1.一体化骨-软骨修复支架，其特征在于由软骨下骨修复层、中间层和软骨修复层组成的一体化结构，软骨下骨修复层为成型多孔磷酸钙生物陶瓷，中间层为巯基-透明质酸水凝胶，软骨修复层由I型胶原水凝胶和软骨细胞或骨髓间充质干细胞组成，中间层位于软骨下骨修复层与软骨修复层之间以及成型多孔磷酸钙生物陶瓷的多孔结构中，将软骨下骨修复层与软骨修复层隔离开，巯基-透明质酸水凝胶是由结构式如式（Ⅰ）所示的巯基-透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基-透明质酸中半胱氨的接枝率为1%~80%，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（I）。
2.根据权利要求1所述一体化骨-软骨修复支架，其特征在于中间层处于软骨下骨修复层与软骨修复层之间的部分的厚度为0.1~5mm。
3.根据权利要求2所述一体化骨-软骨修复支架，其特征在于中间层中交联巯基-透明质酸的含量为0.1wt%~10wt%，软骨修复层中I型胶原的含量为5~20mg/mL。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述一体化骨-软骨修复支架，其特征在于成型多孔磷酸钙生物陶瓷的孔隙率为60%~80%。
5.根据权利要求4所述一体化骨-软骨修复支架，其特征在于所述多孔磷酸钙生物陶瓷为多孔双相磷酸钙陶瓷。
6.根据权利要求5所述一体化骨-软骨修复支架，其特征在于所述多孔双相磷酸钙陶瓷由羟基磷灰石与β-磷酸三钙组成，其中羟基磷灰石的含量为10wt%~50wt%。
7.根据权利要求1至3中任一权利要求所述一体化骨-软骨修复支架，其特征在于，巯基-透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱氨改性得到的，作为改性基础的透明质酸的分子量为0.001 MDa~6.0 MDa。
8.权利要求1至7中任一权利要求所述一体化骨-软骨修复支架的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）将成型多孔磷酸钙生物陶瓷置于模具中；
（2）用α-MEM培养基溶解巯基-透明质酸，在冰浴下调节pH值至7.2~7.4，得到0.1wt%~10wt%的巯基-透明质酸溶液，将巯基-透明质酸溶液注射到成型多孔磷酸钙生物陶瓷上方，巯基-透明质酸通过自交联反应形成巯基-透明质酸水凝胶层；
（3）在冰浴下，将I型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.2~7.4，然后用PBS缓冲液调节I型胶原的浓度为5~20mg/mL，将软骨细胞或骨髓间充质干细胞悬液加入I型胶原溶液中，混匀，将所得I型胶原-细胞混合液注射至巯基-透明质酸水凝胶层上方，待I型胶原成胶形成I型胶原水凝胶层后即得一体化骨-软骨修复支架。
9.根据权利要求8所述一体化骨-软骨修复支架的制备方法，其特征在于步骤（3）中按照1×104~5×108cells/mL的比例向I型胶原溶液中加入细胞悬液。
10.根据权利要求8或9所述一体化骨-软骨修复支架的制备方法，其特征在于所述醋酸溶液的浓度为0.25~1.0 mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.2~7.4、浓度为0.01~0.02mol/L。
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