CN105854082A - 一种半月板支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种半月板支架及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：取异种异体或同种异体的股骨或胫骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织后，使用电动摆锯切取预定厚度的松质骨片，清洗后采用蒸馏水浸泡；经脱钙脱脂脱蛋白后将松质骨片处理成环形支架；最后将所述环形支架在-20℃进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。本发明采用脱矿松质骨制成的半月板支架具有生物活性，可促进细胞的粘附和增殖；并且环形的形状也增加了表面积，有利于细胞与培养液的物质充分交换，减少支架内部细胞凋亡，从而增加了细胞数量。

Description

一种半月板支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料与组织工程技术领域，更具体地说，涉及一种半月板支架及其制备方法。

背景技术

半月板由纤维软骨组成，内外侧各一个，位于膝关节的关节间隙，是膝关节的重要组成部分。半月板具有吸收震荡、传递负荷、营养关节软骨润滑和增加关节接触面积以及维持关节稳定等重要功能。半月板严重损伤或切除后，将会加快膝关节向骨性关节炎发展的进程。尽管半月板切除术具有短期疗效好、功能恢复快等优点，但是半月板切除后再生半月板的质量不能行使正常半月板的生物力学功能，远期将不可避免地加重关节软骨退变。同种异体半月板移植可以替代缺失的半月板，但供体来源非常有限，远不能满足临床需求。随着组织工程技术和材料学的进展，不少学者试图用组织工程技术修复再造半月板，为半月板修复提供一种新的治疗模式。组织工程半月板(Tissue engineeringmeniscus，TEM)构建需要种子细胞复合植入支架材料，在特定生长因子或应力刺激下完成。

TEM的支架材料包括天然材料和人工合成的材料。天然材料包括胶原、小肠粘膜下组织、脱钙骨、骨膜、软骨膜等。人工合成材料包括水凝胶、涤纶、特富龙、纤维素、藻酸盐、聚乳酸(PLA)、碳纤维、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、胶原及糖氨聚糖复合物、纳米纤维、聚氨酯等。

理想的支架材料一般应具有以下性能：(1)良好的生物相容性和生物可降解性；(2)具有足够的力学强度；(3)高孔隙率；(4)高表面积；(5)表面利于细胞的黏附增殖和分化；(6)易于消毒及植入；(7)可加工成各种形状和结构，易于重复操作。天然材料具有良好的生物相容性，且含有生物活性成分，能够促进细胞增殖和基质分泌，但大多数组织在生物学强度及孔隙率和形态上难以满足完整TEM构建的要求。人工合成材料来源广泛，可塑性强，但生物相容性和可降解性较差，体内植入后可能引起较多的异物反应。部分材料(如胶原、藻酸盐材料、纤维素凝胶等)的力学强度较弱，也不适合构建组织工程半月板。

脱钙骨基质(DBM)主要是利用同种或异种器官/组织，经过脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。该材料具有细胞外基质成分，有良好的组织亲和性和相容性，有利于细胞的粘附、增殖和分化，并且具有一定的力学强度。DBM具有三维天然孔隙结构系统，同时含有I型胶原，胶原是细胞粘附和生长的良好支架，以其作为支架材料，具有可降解性，易于被机体吸收，因而脱钙骨基质(DBM)不仅具有良好的生物相容性和生物降解性，而且具有天然孔隙结构，有利于细胞长入，含有可以促进种子细胞粘附、增殖及分化的生物活性分子，具有人工合成支架材料无可比拟的优势。但是，目前并没有使用脱钙骨基质作为半月板支架对缺损进行修复的报道或者应用。并且，当应用在半月板修复时，如果采用常规方法获得的脱钙骨基质，其愈合时间较长甚至不愈合，且存在排异反应。如果患者出现伤口局部红肿、伤口渗液、伤口不愈合，往往需要手术清创，甚至一部分严重排斥患者需要将植入的支架材料取出，给患者带来极大的痛苦。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对目前半月板修复的效果不佳的缺陷，提供一种由同种或异种松质骨制成的半月板支架及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种半月板支架的制备方法，包括以下步骤：

S1、取异种异体或同种异体的股骨或胫骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织后，使用电动摆锯切取预定厚度的松质骨片，清洗后采用蒸馏水浸泡；

S2、将松质骨片在质量浓度为4.5-5.5％的盐酸溶液中浸泡2-3天进行脱钙，取出后用蒸馏水进行清洗；

S3、将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：(0.9-1.1)的甲醇/氯仿溶液中浸泡20-28小时进行脱脂，取出后用蒸馏水进行清洗；

S4、将脱脂后的松质骨片在质量浓度为2.5-3.5％的双氧水溶液中浸泡3-5小时进行脱蛋白，取出后用蒸馏水进行清洗；

S5、将所述松质骨片处理成环形支架；

S6、将所述环形支架在-20℃进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。

在根据本发明所述的半月板支架的制备方法中，所述步骤S1中切取的松质骨片的厚度为6-8mm；所述步骤S5中采用环钻在处理后的松质骨片上卡压后得到所述环形支架；所述半月板支架为用于修复内侧半月板的支架时，采用的环钻外径为40-44mm，内径为32-36mm；或者所述半月板支架为用于修复外侧半月板的支架时，采用的环钻外径为28-32mm，内径为18-22mm。

在根据本发明所述的半月板支架的制备方法中，所述步骤S2中将松质骨片在质量浓度为5％的盐酸溶液中浸泡2-3天进行脱钙；所述步骤S3中将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：1的甲醇/氯仿溶液中浸泡24小时进行脱脂；所述步骤S4中将脱脂后的松质骨片在质量浓度为3％的双氧水溶液中浸泡4小时进行脱蛋白。

在根据本发明所述的半月板支架的制备方法中，所述制备方法还包括在步骤S5与步骤S6之间执行的步骤：在环形支架上等间隔钻孔，得到6-12个放射状的沿所述环形支架直径延伸的通孔，所述通孔的直径为2-4mm。

在根据本发明所述的半月板支架的制备方法中，所述步骤S5中在环形支架上等间隔钻取8个直径为3mm的通孔。

在根据本发明所述的半月板支架的制备方法中，所述制备方法还包括在步骤S6之后执行的步骤：使用前将半月板支架浸泡在含50％胎牛血清的DMEM培养基中进行预处理。

本发明还相应提供了一种半月板支架，其采用如上所述的半月板支架的制备方法制得。

本发明还提供了一种半月板支架，所述半月板支架由异种异体或同种异体的股骨或者胫骨干骺端的松质骨制成，且所述半月板支架呈环形。

在根据本发明所述的半月板支架中，半月板支架的厚度为6-8mm；所述半月板支架为用于修复内侧半月板的支架，其环形外径为40-44mm，环形内径为32-36mm；或者所述半月板支架为用于修复外侧半月板的支架，其环形外径为28-32mm，环形内径为18-22mm。

在根据本发明所述的半月板支架中，所述半月板支架上等间隔设置有6-12个放射状的沿环形直径延伸的通孔，且所述通孔的直径为2-4mm。

实施本发明的半月板支架及其制备方法，具有以下有益效果：本发明采用脱矿松质骨制成的半月板支架具有生物活性，可促进细胞的粘附和增殖；并且环形的形状也增加了表面积，有利于细胞与培养液的物质充分交换，减少支架内部细胞凋亡，从而增加了细胞数量。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为根据本发明优选实施例的半月板支架的制备方法流程图；

图2a和2b为根据本发明半月板支架第一实施例的立体图和修剪示意图；

图3a和图3b分别为根据本发明半月板支架第二实施例的立体图和俯视图；

图4a和4b分别为根据本发明的方法制备的半月板支架的照片和组织学切片；图4c和4d分别为该半月板支架的电镜照片；

图5a和5b，分别为根据本发明的方法制备的半月板支架复合细胞的HE染色和甲苯胺蓝染色示意图；

图6为半月板支架复合细胞的激光共聚焦示意图；

图7为等量半月板细胞接种到环形支架和圆形支架上的结果图；

图8a和图8b分别为内侧半月板移植手术和术后6周整体观察图；

图9为内侧半月板移植术后6周取出的半月板支架的HE染色效果图；

图10a为内侧半月板移植术后9个月半月板支架的效果图；图10b为内侧半月板移植术后9个月取出的半月板支架的图片；图10c则为内侧半月板切除术后9个月(切除对照组)的膝关节图片；

图11a和图11b分别为术后9个月移植组的HE染色和甲苯胺蓝染色的结果图；图11c和图11d分别为术后9个月切除对照组的HE染色和甲苯胺蓝染色的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

请参阅图1，为根据本发明优选实施例的半月板支架的制备方法的流程图。如图1所示，本发明的半月板支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)在步骤S1中，取异种异体或同种异体的股骨或胫骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织，包括周围肌肉、韧带、肌腱以及骺端组织，使用电动摆锯切取预定厚度的松质骨片，用自来水清洗干净后采用蒸馏水浸泡。当用于制备人体的半月板支架时，其厚度为6-8mm。优选地，在该步骤中切取的松质骨片的厚度为7mm。为制备适于人体使用的半月板支架，本发明中采用的异种异体的股骨或胫骨包括但不限于成年猪的股骨或胫骨；同种异体的股骨或胫骨为人的新鲜尸体骨的股骨或者胫骨。由于取材位置不同得到的脱钙骨基质的形态不一致，现有技术中通常采用的肩胛骨或肋骨等位置的松质骨制得的脱钙骨基质并不适应于半月板修复。而发明人在大量的实验和经验总结后发现，与肩胛骨和肋骨相比，股骨干骺端松质骨或胫骨干骺端松质骨的厚度较大，分布更加均匀，能够满足构造TEM支架的需要，更利于半月板细胞生长以及组织的修复。

(2)在步骤S2中，将松质骨片在质量浓度为4.5-5.5％的盐酸溶液中浸泡2-3天进行脱钙，取出后用蒸馏水进行清洗。优选地，在该步骤中采用质量浓度为5％的盐酸溶液进行脱钙。

(3)在步骤S3中，将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：(0.9-1.1)的甲醇/氯仿溶液中浸泡20-28小时进行脱脂，取出后用蒸馏水进行清洗。优选地，在该步骤中将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：1的甲醇/氯仿溶液中浸泡24小时进行脱脂。

(4)在步骤S4中，将脱脂后的松质骨片在质量浓度为2.5-3.5％的双氧水溶液中浸泡3-5小时进行脱蛋白，取出后用蒸馏水进行清洗。优选地，在该步骤中将脱脂后的松质骨片在质量浓度为3％的双氧水溶液中浸泡4小时进行脱蛋白。

(5)在步骤S5中，将所述松质骨片处理成环形支架。在本发明的优选实施例中，可以采用环钻在处理后的松质骨片上卡压后得到环形支架。当需要制备用于修复人体内侧半月板的支架时，该步骤中采用的环钻外径为40-44mm，内径为32-36mm；优选为环钻外径42mm，环钻内径34mm。当需要制备用于修复人体外侧半月板的支架时，该步骤中采用的环钻外径为28-32mm，内径为18-22mm；优选为环钻外径30mm，环钻内径20mm。当选取的松质骨片尺寸不够时，也可以切取多块松质骨片，通过拼接达到所需的尺寸。

(6)在步骤S6中，将所述环形支架在-20℃的条件下进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，并在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。经过处理后的松质骨主要成分为I型胶原，虽然免疫原性低，但是仍然存在一定排异反应。但是本发明经过钴60辐照和深低温冷冻处理后极大地降低其免疫原性，实验证明长期的免疫排斥反应不明显。

在本发明的一些优选实施例中，本发明提供的半月板支架的制备方法还包括在步骤S5与步骤S6之间执行的以下步骤：在环形支架上等间隔钻孔，得到6-12个放射状的沿环形的直径延伸的通孔，该通孔的直径为2-4mm。优选地，在环形支架上等间隔钻取8个直径为3mm的通孔。

在本发明的另一些优选实施例中，该半月板支架的制备方法还可以进一步在步骤S6之后执行的步骤：在使用前将半月板支架浸泡在含50％胎牛血清的DMEM培养基中进行预处理。与现有技术中培养细胞经常采用的含10％的胎牛血清DMEM培养基相比，本发明通过实验证明了在复合细胞之前加入含50％胎牛血清的DMEM培养基，可以增加细胞的粘附性及复合率。

本发明还相应提供了一种半月板支架。该半月板支架可以通过本发明的半月板支架的制备方法制得，也可以采用其它工艺步骤进行制备。请参阅图2a，为根据本发明半月板支架第一实施例的立体图。该半月板支架1由异种异体或同种异体的股骨或者胫骨干骺端的松质骨制成，并且该半月板支架1呈环形，又称为环形支架。该环形支架的厚度h为6-8mm。当该半月板支架用于修复人体内侧半月板时，其环形外径d1为40-44mm，环形内径d2为32-36mm；优选地，环形外径d1为42mm，环形内径d2为34mm。当该半月板支架用于修复人体外侧半月板时，其环形外径d1为28-32mm，环形内径d2为18-22mm；优选地，环形外径d1为30mm，环形内径d2为20mm。当选取的松质骨片尺寸不够时，也可以采用多块松质骨片拼接而成。

本发明提供的半月板支架可以用于半月板修复。在进行手术前，可以取出消毒并封装好的半月板支架，将患者半月板细胞接种到该半月板支架上进行复合培养7天，随后根据半月板修复或移植所需大小取用相应节段，进行缝合即可。正常半月板尤其是人体外侧半月板接近于一个完整的环形，而手术当中半月板并非必须完全切除，需要根据半月板损伤的范围和程度决定，但是损伤的情况在术前很难预计。采用本发明的环形支架，就可以在手术过程中根据需要移植和替代部分的大小和形状对环形支架进行修剪后进行移植。请参阅图2b，为根据本发明半月板支架第一实施例的修剪示意图。图2b中第一节段11可移植入体内用于半月板修复，第二节段12可用于植入前检测。一般情况下，对于人体内侧半月板修复而言，可以切取环宽为8-10mm的环形支架。对于人体外侧半月板修复而言，可以切取环宽为10-12mm的环形支架。因此，本发明提供的环形支架可以同时满足植入以及植入前检测的需要，并且操作方便且手术精确度高。

请参阅图3a和图3b，为根据本发明半月板支架第二实施例的立体图和俯视图。该第二实施例与第一实施例的区别在于，在环形支架上等间隔设置有6-12个放射状的通孔2，这些放射状的通孔2沿环形支架的直径方向延伸，贯穿环形支架的内部圆柱面和外部圆柱面。通孔2的直径为2-4mm。如图3b中，设置了8个放射状的通孔2，每个通孔2的直径为3mm。这些根据半月板纤维的结构，在支架内部增加的放射状通孔，可以便于细胞增殖。在本发明的另一些优选实施例中，还可以在植入体内之前，在这些通孔2中放入患者的正常半月板组织，诱导半月板细胞的生长，加快半月板支架与周围组织的愈合速度。

实施例1：

1、取成年猪股骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织，包括周围肌肉、韧带、肌腱以及骺端组织，使用电动摆锯切取厚度为6mm的松质骨片，用自来水清洗干净后采用蒸馏水浸泡。

2、将松质骨片在质量浓度为4.5％的盐酸溶液中浸泡2天进行脱钙，取出后用蒸馏水进行清洗。

3、将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：0.9的甲醇/氯仿溶液中浸泡20小时进行脱脂，取出后用蒸馏水进行清洗。

4、将脱脂后的松质骨片在质量浓度为2.5％的双氧水溶液中浸泡3-5小时进行脱蛋白，取出后用蒸馏水进行清洗。

5、采用环钻在处理后的松质骨片上卡压后得到环形支架。环钻外径为40mm，内径为32mm，制备用于修复内侧半月板的支架。

6、将所述环形支架在-20℃的条件下进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，并在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。

实施例2：

1、取成年猪股骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织，包括周围肌肉、韧带、肌腱以及骺端组织，使用电动摆锯切取厚度为8mm的松质骨片，用自来水清洗干净后采用蒸馏水浸泡。

2、将松质骨片在质量浓度为5.5％的盐酸溶液中浸泡3天进行脱钙，取出后用蒸馏水进行清洗。

3、将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：1.1的甲醇/氯仿溶液中浸泡28小时进行脱脂，取出后用蒸馏水进行清洗。

4、将脱脂后的松质骨片在质量浓度为3.5％的双氧水溶液中浸泡5小时进行脱蛋白，取出后用蒸馏水进行清洗。

5、采用环钻在处理后的松质骨片上卡压后得到环形支架。环钻外径为44mm，内径为36mm，制备用于修复内侧半月板的支架。

6、将所述环形支架在-20℃的条件下进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，并在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。

实施例3：

1、取成年猪胫骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织，包括周围肌肉、韧带、肌腱以及骺端组织，使用电动摆锯切取厚度为6mm的松质骨片，用自来水清洗干净后采用蒸馏水浸泡。

2、将松质骨片在质量浓度为4.9％的盐酸溶液中浸泡3天进行脱钙，取出后用蒸馏水进行清洗。

3、将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：0.9的甲醇/氯仿溶液中浸泡28小时进行脱脂，取出后用蒸馏水进行清洗。

4、将脱脂后的松质骨片在质量浓度为2.8％的双氧水溶液中浸泡4.5小时进行脱蛋白，取出后用蒸馏水进行清洗。

5、采用环钻在处理后的松质骨片上卡压后得到环形支架。环钻外径为42mm，内径为34mm，制备用于修复内侧半月板的支架。

6、将所述环形支架在-20℃的条件下进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，并在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。

实施例4：

1、取成年猪股骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织，包括周围肌肉、韧带、肌腱以及骺端组织，使用电动摆锯切取厚度为7mm的松质骨片，用自来水清洗干净后采用蒸馏水浸泡。

2、将松质骨片在质量浓度为5％的盐酸溶液中浸泡3天进行脱钙，取出后用蒸馏水进行清洗。

3、将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：1的甲醇/氯仿溶液中浸泡24小时进行脱脂，取出后用蒸馏水进行清洗。

4、将脱脂后的松质骨片在质量浓度为3％的双氧水溶液中浸泡4小时进行脱蛋白，取出后用蒸馏水进行清洗。

5、采用环钻在处理后的松质骨片上卡压后得到环形支架。环钻外径为42mm，内径为34mm，制备用于修复内侧半月板的支架。

6、将所述环形支架在-20℃的条件下进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，并在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。

实施例5：

1、取人新鲜尸体骨的股骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织，包括周围肌肉、韧带、肌腱以及骺端组织，使用电动摆锯切取厚度为7mm的松质骨片，用自来水清洗干净后采用蒸馏水浸泡。

2、将松质骨片在质量浓度为5％的盐酸溶液中浸泡3天进行脱钙，取出后用蒸馏水进行清洗。

3、将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：1的甲醇/氯仿溶液中浸泡24小时进行脱脂，取出后用蒸馏水进行清洗。

4、将脱脂后的松质骨片在质量浓度为3％的双氧水溶液中浸泡4小时进行脱蛋白，取出后用蒸馏水进行清洗。

5、采用环钻在处理后的松质骨片上卡压后得到环形支架。环钻外径为30mm，内径为20mm，制备用于修复外侧半月板的支架。

6、将所述环形支架在-20℃的条件下进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，并在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。

实验1：

同种或异种骨脱钙、脱脂、脱蛋白的程度不同将直接影响支架材料的微环境，也会影响半月板修复的效果。本发明分别将上述实施例1-5制备的半月板支架与兔子的半月板细胞复合培养，同时还选取了脱钙、脱脂、脱蛋白步骤中溶液浓度与处理时间的大量对比例，将其与半月板细胞进行复合培养。实验证明，在同样的细胞培养条件下，本发明的脱钙、脱脂和脱蛋白处理得到的半月板支架的细胞数量多，细胞生长情况较好，且其中实施例4和实施例5优于实施例1-3。因此本发明中通过控制脱钙、脱脂和脱蛋白的处理液浓度和时间，使得制备的半月板支架更适于半月板细胞的粘附和增殖。

请参阅图4a和4b，分别为根据本发明的方法制备的半月板支架的照片和组织学切片。该半月板支架采用实施例4的参数制成，区别仅在于为了后续适应于动物实验，对半月板支架的尺寸进行了修改。具体地，环形支架的环形外径为10mm，内径为4mm，厚度为3mm。图4c和4d分别为该半月板支架的电镜照片。

请参阅图5a和5b，分别为根据本发明的方法制备的半月板支架复合细胞的HE染色和甲苯胺蓝染色示意图。将实施例4制得的半月板支架接种兔子半月板细胞7天后，对其进行HE染色和甲苯胺蓝染色，分别得到图5a和图5b的组织学切片图。请参阅图6，为上述半月板支架的激光共聚焦示意图。上述组织学切片和激光共聚焦结果表明细胞长入半月板支架内部的空隙。

实验2：

本发明还在实施例4和5的制备参数条件下，制备了适应于人体内侧半月板和外侧半月板的半月板支架，环形外径为40-44mm，环形内径为32-36mm；或者环形外径为28-32mm，环形内径为18-22mm。并且在环形支架上等间隔钻孔，分别制备了40个不同的样本，其分别具有6-12个放射状的沿环形支架直径延伸的通孔，通孔的直径为2-4mm不等。同时制备了40个对比样本，即不设置通孔或者通孔数量位于6-12的范围外，或者通孔的直径位于2-4mm的范围外。将这80个样本使用人体半月板细胞进行体外复合培养后一部分进行细胞计数，另一部分移植进人体进行了体内实验。实验证明，本发明的通孔数量和直径大小制得的半月板支架的细胞数量和修复效果明显优于其它对比样本。尤其是设置8个通孔，且直径为3mm的实施例效果最佳。

实验3：

现有的半月板支架通常采用半月形或者条形的支架，再复合细胞植入体内，其细胞粘附和增殖的效果不理想。本发明的另一个独特之处在于，采用环形支架替代现有的半月形或者条形的支架。本发明以圆形支架模拟现有技术中半月形或者条形的整体培养方式，与本发明提供的环形支架进行对比。本发明以实施例4的制备参数制得了多个环形的实验样本以及圆形的对比样本。并将与体积相对应的等量半月板细胞接种到环形支架和圆形支架上，复合培养7天后，通过CCK8进行检测。请参阅图7，为CCK8检测显示的结果图，相应的统计数据见表格1。该结果表明环形支架的细胞密度明显高于圆形支架，差异有显著性。

表格1

细胞密度	环形支架	圆形支架	P值
				M±SD(/mm3)	175±40	84±18	0.024*

本发明还对圆形支架和环形支架在细胞植入前力学强度特性进行了检测，其中圆形支架的压缩模量为0.5±0.03MPa，弹性模量为0.89±0.03MPa；环形支架的压缩模量为0.51±0.02MPa(P>0.05)，弹性模量为0.91±0.03MPa(P>0.05)。实验证明圆形与环形支架在植入细胞前力学强度无明显统计学差别。

在植入细胞后圆形支架的压缩模量为0.65±0.05MPa，弹性模量为0.98±0.03MPa；环形支架的压缩模量为0.76±0.04MPa(P<0.05)，弹性模量为1.3±0.05MPa(P<0.05)。该结果证明植入细胞后，环形支架较圆形支架的力学强度明显提高。

实验4：

本发明还对制备的半月板支架进行了动物实验。采用实施例4的参数制备半月板支架，区别仅在于为了适应兔膝关节的半月板修复，将环形支架的环形外径设置为10mm，内径为4mm，厚度为3mm。并根据兔子内侧半月板的尺寸进行了切割。将切割后的半月板支架移植到兔膝关节的内侧半月板位置，并在移植后6周取材。图8a为内侧半月板移植手术的整体观察图。图8b为术后6周移植部位的整体观察图。图9为内侧半月板移植术后6周取出的半月板支架的HE染色效果图。检测结果表明支架部分吸收，有细胞长入，开始替代过程。周围少量淋巴细胞浸润。在术后9个月再次观察。其中图10a为内侧半月板移植术后9个月半月板支架的效果图，图中箭头处为移植的半月板支架，其表明植入的半月板支架外形接近于正常半月板，移植物愈合良好。图10b为内侧半月板移植术后9个月取出的半月板支架的图片。图10c则为内侧半月板切除术后9个月(切除对照组)的膝关节图片。该切除对照组与实验组的区别在于，仅切除了箭头位置的半月板，而未植入任何支架。图10c表明切除对照组仅有少量边缘组织新生，同时关节软骨退变明显。

图11a和图11b分别为术后9个月移植组的HE染色和甲苯胺蓝染色的结果图。图11c和图11d分别为术后9个月切除对照组的HE染色和甲苯胺蓝染色的结果图。该组织学切片显示，移植后的半月板内部细胞分布均匀，甲苯胺蓝染色有异染，组织学结构接近纤维软骨结构，周围无淋巴细胞增生；而切除对照组新生的边缘组织仅内部小面积细胞增生明显，有少量异染。

本发明制备的半月板支架具有以下特点：

(1)本发明的半月板支架采用异种脱矿松质骨时，其来源广泛，制备简单，可解决半月板修复材料来源有限的问题；

(2)本发明采用的脱矿松质骨本身具有生物活性，可促进细胞的粘附和增殖；并且采用的股骨或胫骨干骺端的松质骨，与肩胛骨或者股骨其它位置的松质骨相比，其厚度较大，分布更加均匀，能够满足构造TEM支架的需要，更利于半月板细胞生长以及组织的修复。

(3)本发明经过钴60辐照和深低温冷冻处理后进一步降低了I型胶原的免疫原性，实验证明长期的免疫排斥反应不明显。

(4)本发明采用的环形的半月板支架增加了表面积，有利于细胞与培养液的物质充分交换，减少支架内部细胞凋亡，从而增加了细胞数量；并且环形支架的力学性能较模拟半月形或者条形的圆形支架有了明显提高；

(5)本发明采用的环形半月板支架可以根据修复和移植的形态需要简单修整后直接使用，另一部分则可用于进行植入前的检测，同时满足植入及植入前检测的需要，并且其操作方便且手术精确度高；

(6)本发明的半月板支架根据半月板纤维的结构，在支架内部增加放射状的通孔，便于细胞增殖。

本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱离本发明范围时，可进行各种变化和等同替换。此外，为适应本发明技术的特定场合或材料，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围的实施例。

Claims (10)

1.一种半月板支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取异种异体或同种异体的股骨或胫骨干骺端的松质骨，剔除周围附着的组织后，使用电动摆锯切取预定厚度的松质骨片，清洗后采用蒸馏水浸泡；

S2、将松质骨片在质量浓度为4.5-5.5％的盐酸溶液中浸泡2-3天进行脱钙，取出后用蒸馏水进行清洗；

S3、将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：(0.9-1.1)的甲醇/氯仿溶液中浸泡20-28小时进行脱脂，取出后用蒸馏水进行清洗；

S4、将脱脂后的松质骨片在质量浓度为2.5-3.5％的双氧水溶液中浸泡3-5小时进行脱蛋白，取出后用蒸馏水进行清洗；

S5、将所述松质骨片处理成环形支架；

S6、将所述环形支架在-20℃进行冷冻干燥，用钴60辐照灭菌处理，在-80℃低温保存2周以上，得到半月板支架。

2.根据权利要求1所述的半月板支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中切取的松质骨片的厚度为6-8mm；所述步骤S5中采用环钻在处理后的松质骨片上卡压后得到所述环形支架；所述半月板支架为用于修复内侧半月板的支架时，采用的环钻外径为40-44mm，内径为32-36mm；或者所述半月板支架为用于修复外侧半月板的支架时，采用的环钻外径为28-32mm，内径为18-22mm。

3.根据权利要求1所述的半月板支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中将松质骨片在质量浓度为5％的盐酸溶液中浸泡2-3天进行脱钙；所述步骤S3中将脱钙后的松质骨片在体积浓度为1：1的甲醇/氯仿溶液中浸泡24小时进行脱脂；所述步骤S4中将脱脂后的松质骨片在质量浓度为3％的双氧水溶液中浸泡4小时进行脱蛋白。

4.根据权利要求1所述的半月板支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在步骤S5与步骤S6之间执行的以下步骤：在环形支架上等间隔钻孔，得到6-12个放射状的沿所述环形支架直径延伸的通孔，所述通孔的直径为2-4mm。

5.根据权利要求4所述的半月板支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中在环形支架上等间隔钻取8个直径为3mm的通孔。

6.根据权利要求1所述的半月板支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在步骤S6之后执行的步骤：使用前将半月板支架浸泡在含50％胎牛血清的DMEM培养基中进行预处理。

7.一种半月板支架，其特征在于，采用权利要求1-6中任意一项所述的半月板支架的制备方法制得。

8.一种半月板支架，其特征在于，所述半月板支架由异种异体或同种异体的股骨或者胫骨干骺端的松质骨制成，且所述半月板支架呈环形。

9.根据权利要求8所述的半月板支架，其特征在于，所述半月板支架的厚度为6-8mm；所述半月板支架为用于修复内侧半月板的支架，其环形外径为40-44mm，环形内径为32-36mm；或者所述半月板支架为用于修复外侧半月板的支架，其环形外径为28-32mm，环形内径为18-22mm。

10.根据权利要求8所述的半月板支架，其特征在于，所述半月板支架上等间隔设置有6-12个放射状的沿环形直径延伸的通孔，且所述通孔的直径为2-4mm。