CN101048183A - 细胞绷带 - Google Patents

Abstract

本发明提供了输送细胞跨越组织表面的方法，该方法包括将细胞分布在生物材料片上和/或内，以形成细胞绷带，并且将所述细胞绷带用在所述表面上，其中，在将细胞绷带用在所述组织表面上之后，细胞从所述细胞绷带中释放。还提供了用于结合两个或两个以上组织的方法，该方法包括提供与要结合的表面紧密接触的细胞绷带，其中，所述细胞绷带包括生物材料片，所述生物材料具有分布在其表面上和/或其内的细胞。还提供了用于本发明方法中的细胞绷带。

Description

细胞绷带

发明领域

本发明总体上涉及受伤组织的治疗或修复。

下面将结合它的优选实施方案对本发明进行说明，该实施方案是引导细胞通过并且进入软骨组织的方法。不过，本发明发现了在需要控制细胞通过组织表面分布的其他组织工程用途中的等同用途。

发明背景

关节软骨衬垫在身体的活动(diarthroidal)关节的铰接骨骼的末端。它由胶原原纤维，蛋白聚糖基质和软骨细胞(能产生软骨基质的细胞)组成。成熟关节软骨在退化或受损之后具有有限的再生能力。成熟关节软骨内的损伤是在很多关节病，特别是骨关节炎(OA)，创伤性损伤和分离性骨软骨炎(Hunziker，2002)发病过程中形成的。由于关节内骨折，高强度冲击或在韧带损伤之后可导致直接或间接的外伤(Buckwalter等，1998)。关节软骨损伤一般不会愈合或在某些生物学条件下只能部分愈合。所述损伤通常与残废和诸如关节疼痛，锁定现象和减弱的或受干扰的功能相关。另外，一般认为所述损伤会发展成OA的严重形式(Gilbert，1998；Hunziker，2002)。

业已进行了多种实验和临床尝试，以便诱导成熟关节软骨内的组织学和肉眼可见损伤的愈合，其目的在于重建持久性质的结构和功能充分的修复组织。

存在与关节软骨修复相关的两大生物学问题。第一个问题是构建具有与关节软骨相同的结构和机械特性的修复组织(Shapiro等，1993)。第二个问题是获得通过宿主和修复组织之间的界面的成功的整合。

关节软骨长期修复或再生的重要前提是移植的软骨或局部诱导的修复组织与受体部位的天然软骨的整合(Ahsan等，1999；Hunziker，1999)。整合软骨修复有可能因为在软骨-软骨界面部位缺少生产基质的细胞而受到妨碍(Ahsan等，1999；Reindel等，1995)。所述非细胞性是由于软骨细胞从损伤边缘损失、无血管性或缺少多能祖细胞的组合而造成的。

临床上使用的用于促进天然软骨修复的现有方法包括清创术，软骨下钻孔或微裂逢，以及镶嵌整形术(mosiacoplasty)。所述技术通常会导致纤维软骨修复组织，随着时间推移，这种修复会机械性地失效。更重要的是，无法监测所产生的修复组织的质量。

自体同源的软骨细胞植入(ACI)是关节软骨缺陷的第一代基于细胞的治疗。它基于扩增从非承重部位获取的自体同源关节软骨细胞，并且将它们植入骨膜或胶原片下面的缺损处(Gillogly，2003)。其目的是将植入的细胞保持在原位，直到它们形成软骨。

第二代软骨组织工程涉及使用用扩增的软骨细胞接种的生物可降解的支架，以便形成不成熟的，可植入的能填充缺损的结构。

不过，ACI和不成熟的结构只能用于治疗有限的缺损。这种方法不适合治疗无限制的损伤，这些损伤以骨关节炎为特征，它是与关节软骨流失相关的退化关节病。为了更好地治疗无限制的损伤，需要用″片状″预制的成熟软骨来重塑整个损伤的表面。因此，对在体外工程成熟的软骨组织感兴趣，以便生产成熟的，功能上和机械上可靠的植入物，可以方便地填充到软骨缺陷中，如由骨关节炎导致的缺陷。

一旦放置到损伤上面，就必须使工程成熟软骨与损伤周围的现有软骨整合，以便形成统一的组织，它能提供持久的关节表面。修复组织与周围天然软骨的整合是软骨组织工程方法开发的关键步骤。首先，工程软骨植入物的临时固定可以通过缝合或纤维蛋白胶实现。不过，在植入物和宿主软骨之间存在明确的不连续性，形成了骨折的折点(Hunziker，1999)。在文献中没有明确的证据表明在体内相邻的表面能够方便地或一致性地整合。这可以通过所述缺损的不良环境进行解释，所述缺损以胶原原纤维形成和裂缝形成为特征(Donohue等，1983；Thompson等，1991)。另外，已证实钝伤能导致缺陷壁的软骨细胞的细胞凋亡(Redman等，2004)。

本发明人猜测，为了获得连续的基质，具有合成软骨的能力的细胞必须在植入物和宿主组织之间迁移。位于天然或工程软骨凹陷中的软骨细胞不可能以这种方式迁移。以前的研究业已提出了用分离的软骨细胞涂敷工程软骨的表面(Peretti等，1999；Peretti等，2003；Schinagl等，1999)。最初假设这些细胞能够在移植物和周围的软骨之间形成连接。最近的观察表明，软骨细胞实际上起着破坏相邻的软骨和再生新的软骨组织的作用。不过，该方法取得了有限的成功，因为发现涂在移植物上的软骨细胞具有聚合成团块的倾向，其结果是在植入物和周围组织之间形成了细微的″小型连接″。这种小型连接不能在植入物和周围组织之间形成使修复的软骨能承受在关节中所经受的机械应力的足够强的结合。

本发明人认为，实现植入的软骨与受体部位的天然软骨整合改善的关键是寻找通过表面输送细胞，并且一旦就位的话就释放细胞的方法。

发明内容

因此，在第一方面，本发明提供了输送细胞通过组织表面的方法，该方法包括将所述细胞分配在生物材料片上和/或内以便形成细胞绷带，并且将所述细胞绷带用在所述表面上，其中，在将细胞绷带用在所述组织表面上之后，所述细胞从细胞绷带中释放，以便它们能够迁移通过所述生物材料并且进入相邻组织。

在本文中，术语″细胞绷带″用于表示将细胞应用在紧密附着组织表面的任何媒介物，它包括分布在生物材料上或内的细胞。方便地，所述细胞绷带是片状形式的。

在本文中，术语″生物材料″表示任何物质(药物除外)，合成的或天然的物质，这些物质可用作治疗，增强，或置换身体的任何组织，器官，或功能的系统或系统的一部分。优选的是，所述生物材料是生物可降解的，就是说，它不会在体内无限期地持续存在，而是会逐渐分解，尽管有可能存在残余物。任何生物材料都可以使用，只要所述细胞能够附着在它上面或能够保持在它内部。合适的生物材料的例子包括PGA，PGLA和壳聚糖。除了合成生物材料之外，还可以使用诸如胶原的天然生物材料，正如本文所披露的。所述生物材料可以是支架或非固体支持物(凝胶状)，如纤维的悬浮液，只要所述生物材料能够保持在原位，并且能够持续足够细胞生长/发育的时间。例如，支架可以通过缝合来固定于原位，并且具有较长的半衰期。所述生物材料可能具备固有的黏性，它有助于将细胞绷带保持在需要的部位。所述生物材料的主要功能是物理载体，尽管它还可以提供生物学刺激，例如，通过使用能够对细胞发送信号的材料。

以下说明涉及组织，特别是软骨的手术″植入″和″移植″。植入表示手术导入在体外生长的工程组织(″植入物″)，而移植表示手术导入从身体的其他部分转移的组织(″移植物″)。移植物可来自患者或来自供体。本发明具有普遍用途，而无论所述组织来自何处。因此，本文所提到的移植组织同样应用于植入的组织，反之亦然。

第二方面，本发明提供了用于将两种或两种以上组织结合在一起的方法，该方法包括提供欲与要结合的表面密切接触的细胞绷带，其中，所述细胞绷带包括生物材料片，所述生物材料具有分布在其上和/或内的细胞。优选的是，所述细胞绷带被设置在要结合的组织之间。

优选的是，所述细胞是软骨生产细胞，或能够产生软骨的细胞，如软骨细胞，软骨-祖细胞或干细胞和所述组织是软骨性质的。合适的软骨细胞的例子有从关节软骨、半月板或鼻软骨中获得的软骨细胞。合适的干细胞的例子是人类骨髓间充质干细胞。优选的是，所述细胞均匀分布在整个细胞绷带中，或分布在细胞绷带的每一面的整个表面上，以便软骨生产细胞以均匀的形式提供给相邻的组织，跨越细胞绷带和要结合的每一个组织的表面之间的整个界面上。这样，有利于软骨生产细胞从细胞绷带向每一个相邻组织迁移，在通过所述整个表面的界面上产生连续的整合。

在本发明的优选实施方案中，所述细胞绷带包括软骨细胞，软骨-祖细胞或干细胞，并且被用于使一种软骨组织与另一种软骨组织整合。优选的是，所述细胞是从要治疗的患者体内分离的。所述细胞可来自与用来生产工程软骨相同的来源，或来自一般来源，如任何基质细胞类型或其他细胞类型。在关节软骨的骨关节炎损伤的修复中，所述细胞绷带可用于使手术植入的工程软骨，或从供体组织移植的天然软骨与受体部位的相邻的天然软骨整合。由于所述细胞绷带是片状形式的，所述植入物或移植物可以是，例如，在植入之前用细胞绷带缠绕，或在植入之前将所述细胞绷带放入所述损伤中。例如通过缝合固定植入物和细胞绷带。如果用细胞绷带卷绕所述植入物，所述细胞绷带起着固定植入物的作用，并且使软骨细胞或其他细胞分布跨过植入物的表面和靠近损伤的天然组织。所述片材能顺应植入物/移植物和靠近损伤的组织的形状，以便保持所述细胞靠近相对的组织表面。所述片材能够完全填充植入物和宿主组织之间的间隙，因此能控制活跃分裂的细胞向软骨-软骨界面输送。所述方法能够使新的软骨均匀发育通过相对的表面，并且能够使所述植入物和周围组织的连续整合跨越两个组织之间的整个界面，因此提供了生物机械稳定的组织和持久的关节表面。

所述细胞绷带提供了控制输送活跃分裂的细胞到软骨-软骨界面的机制，所述细胞具备合成软骨的能力。正如在实施例中所表明的，所述细胞绷带实现了细胞间隙之间的闭合，这是通过提供软骨生产细胞实现的，所述细胞能够迁移到要结合(连接)的每一个组织中，因此产生有效整合。本发明人推测，所述细胞绷带提供了软骨生产细胞的来源，所述细胞能降解周围软骨的基质，并且迁移到它里面，合成新的软骨，以便填充它们迁移通过的间隙，因此产生了连续的基质。因此，本发明的特征是间隙闭合，其中，要结合的所述组织表面以如下方式彼此有效地整合：通过软骨生产细胞从细胞绷带迁移到每一种相邻组织中，然后是所述细胞绷带的生物材料支撑部分的生物降解，与间隙填充相反，其中，长出了新的组织，以便填充相邻组织的表面之间的间隙。本发明的间隙闭合作用提供了每一种要结合的组织与它的相邻组织的连续的基质整合，导致了修复的机械稳定性(持久性)比现有技术的间隙填充修复方法更高，现有技术的方法只能产生新组织来填充由变性或损伤形成的间隙。

应当理解的是，为了完全实现本发明的间隙闭合效果，从细胞绷带中释放的软骨生产细胞不仅要迁移到相邻组织中，在这里它们能再生软骨，而且随着它的降解，还要迁移到细胞绷带的生物材料支架中，再生软骨。这样，跨越相邻组织表面形成了连续的基质。

优选细胞绷带是较薄的。优选的是，它的厚度小于1.0mm。更优选的是，所述细胞绷带的厚度小于0.9mm，0.8mm，0.7mm，0.6mm，0.5mm或0.4mm，按优选程度提高的顺序排列。所述生物材料的物理特性将决定最小厚度，超出该厚度会因为缺乏强度而破坏绷带的完整性。业已发现，厚度为0.5mm的细胞绷带具有理想的特性。现有技术的间隙填充组织修复方法需要较厚的支架，以便占据由损伤造成的间隙，并且在基质生成期间保留细胞。相反，本发明的间隙闭合方法需要较薄的生物材料片，以便在软骨生产细胞迁移到相邻组织(例如植入物和天然软骨)之后，所述生物材料易于降解，并且能形成要结合的组织的大体上连续的整合。理想的是，所述细胞绷带本身能逐渐降解，以便被整合的组织所取代。

优选的是，细胞绷带的生物材料在紧贴要与它整合的组织的表面上具有开放结构，例如，对于胶原膜来说，所述表面上的胶原纤维的″交织″是相对疏松的，以便使得接种在所述薄膜上的胶原生产细胞能够方便地迁移到相邻组织中。在显微镜水平上，这样的开放的、疏松的支架具有″粗糙″外观，并且，在随后的例子中，被称为粗糙表面。可通过商业渠道获得的生物材料支架具有特殊的物理特性，与它们所涉及的用途吻合。例如，可以从″Geistlich″购买的胶原膜具有″粗糙″表面和″光滑″表面。在显微镜水平上，粗糙表面上的胶原纤维是疏松填充的，并且提供了它们之间有空间的沿各种方向的纤维的开放结构。相反，在光滑表面上，所述纤维是更紧密地填充的，并且与所述表面平行。具有一个粗糙表面和一个光滑表面的膜适合自体同源的软骨细胞植入治疗，其中，所述胶原膜的用途是将植入的细胞固定在位置上。所述膜的光滑表面起着阻止细胞从要修复的损伤处流出的屏蔽作用。

本发明人业已发现，粗糙表面的开放结构使得细胞绷带中的软骨生产细胞能够更方便地从细胞绷带向周围组织迁移。因此，所述生物材料结构的开放程度，表现为表面的粗糙度是整合的控制因素。因此，优选的是，所述细胞绷带在它与每一个要结合的表面的界面上具有粗糙表面，从而此在绷带的每一个表面上提供软骨生产细胞，并且能够使软骨生产细胞方便地迁移到相邻组织中，能够正好在要结合的组织界面上实现有效的整合。

本发明人使用透明的软骨模型系统得到的结果表明，为了实现本发明方法的间隙闭合目的，细胞绷带的生物材料的理想特性是，它应当较薄，以便使要结合的组织之间的间隙尽可能地最小化，并且，它的结构应当具有足够的黏性，以便保留在移植时业已接种在它上面的软骨细胞，不过，黏性又不会大到妨碍细胞从细胞绷带向相邻组织迁移。换句话说，可以对所述生物材料进行物理或化学调适，以在植入后快速释放细胞进入组织。可以改进细胞从细胞绷带的释放率，以便适应特殊用途。合适的特性是通过Geistlich胶原膜的粗糙表面证实的。

优选的是，所述细胞绷带的生物材料片的两个表面上和/或内具有细胞，并且在两个表面上是粗糙的，以便能够迁移到要结合的组织中的细胞位于每一要结合的组织的界面上。

尽管上面业已结合优选实施方案对本发明进行了说明，所述实施方案是使植入的或移植的软骨整合在骨关节损伤的修复中的方法，但本领域技术人员可以理解的是，本发明同样适用于由其他疾病或损伤造成的受损软骨的修复。

所述细胞绷带还可用于整合两片或两片以上工程软骨，以便形成统一的工程软骨片，其尺寸比用其他方法在体外生长的尺寸要大。在体外生长的软骨组织的大小受到质量传递极限的制约，即，一旦一片组织达到了某种尺寸，位于中央的细胞就不再可能与周围的介质交换养分(例如氧气)和废物。使用本发明的细胞绷带，可以克服这一局限，包括采集多个小片的工程软骨，用细胞绷带缠绕它们，并且诱导它们彼此整合，并且以拼图玩具的方式形成较大的片。由此形成的复合软骨随后可以与本发明的细胞绷带一起使用，以便修复关节软骨的损伤。另外，多片工程软骨可以与细胞绷带一起植入，以便所述多片工程软骨彼此整合，并且同时与天然软骨整合，这两种整合都是在体内进行的。

可以通过本发明的方法修复的另一种损伤是半月板裂伤。半月板软骨存在于膝部的半月板中。半月板裂伤是较为常见的损伤，它与骨关节炎的后期发展的较高风险相关。这种损伤可以通过将细胞绷带覆盖在所述裂伤上，并且通过例如缝合固定。在这种情况下，要通过该方法结合的两个表面来自相同的组织：它们是由所述裂伤形成的内表面。所述细胞绷带可以夹在所述两个表面之间(即插入裂伤)。或者，通过生物材料支持物(例如跨越所述裂伤固定)，可以将软骨生产细胞固定在靠近所述裂伤的地方。本发明人业已发现来自细胞绷带的细胞能够浸润到相邻的软骨组织。因此，认为来自所述生物材料的某些细胞能够浸润到裂伤部位。同样，在用于组装上述复合工程软骨的方法中，所述外被细胞绷带可以促进单片工程软骨的整合而又不必将它安置在要结合的表面之间，使细胞绷带贴在相对表面的结合处。

另一方面，本发明提供了细胞绷带，它包括生物材料片，所述生物材料具有分布在它上和/或内的细胞。优选的是，所述细胞是软骨生产细胞，或能够产生软骨的细胞，如软骨细胞，软骨-祖细胞或干细胞。合适的软骨细胞的例子有从关节软骨，半月板或鼻软骨中获得的软骨细胞。合适的干细胞的例子是人类骨髓间充质干细胞。细胞绷带的其他优选特征正如结合本发明的方法所披露的。在特别优选的实施方案中，所述生物材料片在两个表面内或上具有细胞，并且所述生物材料的结构适合细胞从绷带上向外迁移到相邻的组织中，一旦放置好细胞绷带的话(例如，对于胶原膜来说，所述膜应当在两面都是粗糙的)。优选的是，所述薄膜还适合易于随时间推移而降解。在这一方面，理想的是所述膜较薄，正如上文所披露的。

所述细胞绷带使得细胞可以定向通过组织表面，并且控制它们的分布。当所述细胞保留在所述表面和/或在生物材料的框架中时，保持了它们跨越组织表面的均匀分布。因此，促进了细胞跨越整个组织表面的均匀的发育。当所述绷带用在两个组织表面之间的界面上时，被夹在组织之间，以便促进两个组织的整合，可以实现移植组织和周围组织的界面上的连续整合。通过改变加载到生物材料上的细胞数量，可以控制跨越所述表面的细胞密度。

本发明并不局限于仅结合软骨和软骨。相同的原理可应用于将诸如软骨的其他组织表面与骨骼的结合，骨骼与骨骼的结合，和韧带与骨骼的结合。选择细胞类型和生物材料，以便适合要结合的组织。

本发明各个方面的优选特征各自可加以必要的变更。

下面将纯粹通过非限定实施例形式对本发明的实施方案进行说明，其中，要结合附图进行说明，其中：

图1表示用于检验所述细胞绷带的模型系统。图片a是表示细胞绷带用途的示意图。图片b中的照片是在缝合之后不久的模型的例子。图片c中的照片是在培养8周以后的模型的例子。

图2表示未处理对照。在组织切片上，在环形/核心界面上没有发现细胞或细胞外基质。图片a是低放大倍数的Van Gieson染色，而图片b是高放大倍数的苏木精和曙红染色。

图3表示胰蛋白酶对照。在组织切片上，可以在圆环和核心之间的界面上观察到某些中度基质形成，其中，核心和环是全面接触的。图片a是低放大倍数的Van Gieson染色；图片b是高放大倍数的Van Gieson染色。在图片c(低放大倍数)和d(高放大倍数)中，业已将荧光显微镜检术用于检测软骨的天然自发荧光，并且只在所述界面上发现了弱的和修补的间隙组织。

图4表示游离细胞涂层对照的组织学。在环和核心的界面上可以在组织切片上观察到基质形成的某些部位，不过，没有出现组织的明显整合。图片a和b是Van Gieson染色，而图片c是苏木精和曙红染色，均为高放大倍数的。

图5表示游离细胞涂层对照的细胞标记。为了评估涂层的效率，在包覆到核心上之前，用荧光染料(PKH26)对细胞进行标记。在包衣三天之后通过荧光显微镜检术检查核心-环结构的冷冻切片进行跟踪。荧光显微镜检术表明，所述核心没有得到均匀和有效的包覆。核心的某些部分包覆了细胞的大的团块(箭头)，而其他绝大部分没有任何细胞。图片a是低放大倍数的而图片b是高放大倍数的。

图6表示细胞从组织工程核心的迁移。用软骨细胞接种PGA支架，插入环内的核心中，并且让它生长6周时间。组织分析发现了种植在支架上的细胞能够降解相邻的软骨环并且迁移到周围基质中的证据(图片a是低放大倍数的，箭头表示迁移的细胞；图片b是高放大倍数的)。在某些实验中，用荧光染料事先标记细胞，然后再接种到PGA上。在图片c中可以看出，尽管大部分细胞保留在PGA内，但某些细胞业已明显迁移到环状软骨中(箭头)。

图7表示在培养8周之后的细胞绷带的肉眼外观。无细胞绷带的对照(仅有PGA)不能整合，并且在每一情况下在核心和环之间都存在明显的间隙(图片a)。用细胞绷带重新插入核心，产生了间质组织，这些组织完全填充了所述界面，产生了连续跨越所述核心和环的清晰的粗大的组织(图片b)。在一种实施方案中，两个独立的核心/环结构之间使用细胞绷带能够生长在一起，显示了所述组织的紧密整合(图片c和d)。

图8表示在培养8周之后的细胞绷带的显微镜下外观。用细胞绷带重新插入核心产生了间质组织，它完全填充了界面，在核心和界面之间产生了有效整合。在图片a和b中示出了高放大倍数的苏木精和曙红染色的组织切片的典型例子。在图片a中，出现了细胞从绷带迁移到核心和环状组织本身中的证据(箭头)。

图9是表示透明的或半月板软骨细胞绷带夹心模型的示意图。

图10表示培养40天之后的透明的软骨夹心模型的肉眼外观。在同一个陪替氏培养皿中可以看到两个独立的夹心结构。标记了其中的一个结构，以便标明细胞绷带相对两片透明的软骨的位置。

图11表示胶原膜表面粗糙度对软骨整合的影响。将接种在1mm胶原膜上的牛鼻软骨细胞放置在两片鼻中隔透明的软骨之间，并且培养40天。低放大倍数(×10，图片A)的组织学分析表明，在粗糙和光滑表面之间在它们与相邻软骨的相互作用方面存在明显差异。在高放大倍数(×20)下，尽管细胞迁移明显正在进行，但可以看到光滑表面具有与软骨的明确的分界线，表明了整合较差(图片B)。不过，粗糙表面与相邻软骨之间没有明确的边界，表明了有效的整合(图片C)。

图12表示胶原膜厚度对软骨整合的影响。将接种在厚度为1mm(厚)或0.5mm(薄)胶原膜上的牛鼻软骨细胞分别放置在两片鼻中隔透明的软骨之间，并且培养20天。组织分析表明，在该时间点上，厚膜没有出现整合的证据，而在薄膜的粗糙表面上出现了有效整合。

图13是表示整个半月板器官培养模型的示意图。

图14表示在培养45天之后半月板软骨整个器官模型的肉眼外观。

图15表示使用用干细胞制成的细胞绷带在培养40天之后在夹心模型上的有效的半月板软骨整合。注意缺少任何明确的分界线，表明了非常好的整合。

图16表示在培养45天之后整个半月板器官培养模型上的有效的半月板软骨整合。注意到了界面组织与周围半月板组织的相似性。

例1

方法

软骨移植物

使用皮肤活组织检查打孔器(Schuco International London Ltd)从成年牛鼻软骨上获得天然软骨柱(直径8mm)。所述圆片为8mm直径×4mm厚度，从鼻中隔中部获得。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)对它进行漂洗，并且用补充了10X青霉素/链霉素和两性霉素B的PBS培养20分钟。将所述圆片保持在含有10％FCS的DMEM培养基(完全培养基)中用于随后的实验。还使用皮肤打孔器在8mm的圆片内形成3mm(或4mm，只要使用细胞绷带)直径的核心。将其余的软骨用于制备单层软骨细胞。

实验设计

在本研究中使用的模型是环状软骨组件(图1)(Obradovic等，2001)中的核心。将所述核心以压入配合的方式插入所述环，并且使用#4-0丝线和FS-3三角针缝合在一起。使用一个或两个缝线，在尽可能离核心-环界面远的地方缝合。将一系列对照用于与细胞绷带进行比较。在第一个对照(n＝10)中，在界面上没有任何细胞涂层或填充的情况下组装核心和环。在第二种对照中，在组装之前用胰蛋白酶(0.25％w/v；Sigma)对核心和环进行处理。在第三个对照中，用无基质-软骨细胞对核心进行包衣。它们是在制备核心和环之后，通过酶促方法从残余的软骨中分离的(Kafienah等，2002)。所述细胞在含有FGF-2(10ng/ml)的完全培养基中扩增，以便增加它们的数量，并且抑制它们在培养物中的脱分化(Martin等，1999)。在包衣当天，对扩张的软骨细胞进行胰蛋白酶化，计数，并且以500,000细胞/ml的密度悬浮在完全培养基中。内部核心在用薄层1％琼脂糖凝胶包衣的6孔平板上在细胞悬浮液中培养。所述平板在轻柔转动的平台上培养24小时。在某些场合下，用胰蛋白酶(0.25％w/v，20分钟)预处理所述核心，以便除去可能妨碍细胞附着的蛋白聚糖(Hunziker等，1998)。在第四个对照中，将未成熟的组织工程软骨用作核心。按照我们建立的方法，用软骨细胞接种聚乙醇酸(PGA)支架(4mm宽×2mm厚圆盘)(Kafienah等，2003；Kafienah等，2002)。将所述细胞支架结构插入环形孔，并且按上述方法缝合。

使用位于核心和环之间的PGA支架对本发明的细胞绷带进行说明。如上所述(Kafienah等，2002)用细胞接种PGA支架(1cm宽×2mm厚)。在接种之后直接将细胞-支架结构夹在所述核心和环之间，并且按上述方法缝合整个组件。将未接种的支架用作对照。

在所有情况下，组装的外植体在含有FGF-2的扩增完全培养基中培养4天时间，然后在由完全培养基与胰岛素(10mg/mL；Sigma)和抗坏血酸(50mg/mL；Sigma)组成的分化培养基中培养。每隔2-3天补充培养基。

细胞标记

为了评估涂敷的效率并且追踪细胞迁移，用荧光染料PKH26(Sigma)标记软骨细胞。标记方法是按照生产商的方法加上某些改进进行的。简单地讲，在释放胰蛋白酶之后，用不含钙和镁的PBS洗涤10×10⁶细胞一次，并且重新悬浮到500μl的缓冲液C中，该缓冲液是由生产商在标记试剂盒中提供的。将所述细胞悬浮液与500μl的含有PKH26的标记溶液在稀释缓冲液中混合，以便优化最终浓度。标记是在25℃下进行8分钟。通过添加1mL FBS终止反应。将沉淀物转移到新的试管中，并且用完全培养基洗涤四次。通过锥虫蓝评估细胞生活力，并且发现生活力几乎为100％。

组织学和免疫组织化学分析

在4周或8周，用10％中性缓冲的甲醛固定外植体，并且包埋在石蜡中，切片(厚度8μm)。用番红-O对蛋白聚糖进行染色，H&E用于形态学分析或将Van Gieson用于胶原染色，按照标准方法进行。在干冰上立即冷冻用荧光标记细胞包衣的外植体(在4或8周)，并且在切片之前在-70℃下保存组织。对于用荧光标记的细胞包衣的外植体来说，使用O.C.T.化合物封固冷冻组织。使用低温切割机制备厚度8μm的切片。载玻片在室温下风干至少1小时，并且用1-2滴氰基丙烯酸酯进行封固。

图像获取和分析

使用点片照相机和Spot软件3.0.4版本(Diagnostic InstrumentsSterling Heights，M1)获取数字图像。

结果

下面归纳了用于与细胞绷带进行比较的对照：

1.无处理对照(用无细胞绷带重新插入核心)

2.胰蛋白酶对照(无细胞绷带；用0.25％w/v胰蛋白酶预处理的核心和环，取代细胞绷带作为在其他地方披露的整合的替代机制)

3.游离细胞包衣对照(无细胞绷带；用以500,000/ml的密度悬浮在培养基中的软骨细胞预培养核心24小时，以便用游离细胞涂敷软骨表面)

4.组织工程核心(将通过工程方法在PGA圆片上生成的软骨取代软骨核心插入环)

非处理对照

用无细胞绷带重新插入或用胰蛋白酶处理的核心，不能与周围的软骨整合。在图2的组织切片中没有出现软骨片之间相互作用的证据，在界面上具有清晰的空隙。

胰蛋白酶对照

用胰蛋白酶处理然后重新插入的核心表现出与环状组织整合的中等能力。在核心和环完全接触的部位有间质基质的某些形成，不过甚至在培养8周之后所述基质的积累仍不广泛(图3)。

游离细胞涂层对照

用软骨细胞预培养然后重新插入的核心表现出在组织周围的局部碎片中具有某些基质形成的证据，不过，不存在环和核心整合的证据(图4)。出现这种现象的原因是用荧光染料预先标记涂层细胞识别的。这样，显而易见的是，涂层细胞以离散团块形式迁移到核心组织上，形成了可能与环组织相互作用的焦点部位，不过不能进行有效的组织整合(图5)。这表明，为了实现整合，需要将细胞更均匀地涂在软骨表面周围的方法，该方法允许所述细胞与周围软骨之间的密切相互作用。

组织工程核心

本发明解决了如何使用生物材料支架将细胞输送到软骨表面的问题，所述生物材料支架使得接种的细胞能够迁移到所述组织中。作为主要证据，通过将软骨细胞接种在PGA上制备了组织工程核心，并且将该核心植入所述环中，以取代原有的软骨核心。这样，观察到了软骨细胞降解周围的软骨基质，并且迁移到它里面的明确证据(图6)。本发明人的推测是，这些迁移的细胞能够合成新的软骨，以填充它们迁移通过的空间。

细胞绷带

本发明最后的实验是使用夹在两片软骨之间的细胞绷带，参见图1。在使用PGA而没有细胞的对照实验中，没有软骨整合(图7a)，不过，在使用细胞绷带的培养物中，存在肉眼(图7)和镜下(图8)水平上的软骨整合良好的非常明确的证据。

例2.确定最适合封闭间隙而不是填充间隙的支架的参数

方法

我们将夹心模型用于软骨整合，其中，将2片牛鼻中隔透明的软骨与细胞绷带一起放在它们之间(图9)。对该实验来说，所述绷带由接种在厚的(1mm)或薄的(0.5mm)胶原膜上的牛鼻软骨细胞构成，所述胶原膜是从″Geistlich″获得的。这些膜各自具有″粗糙″表面和″光滑″表面。用U形夹将所述夹心固定在一起(图10)。在培养40天之后，出现了整合的宏观证据(图10)。

结果

表面粗糙度和整合

我们检验了粗糙表面能通过促进细胞更迅速地从支架进入周围组织而增强整合的假说。培养到第40天，在组织学水平上出现了在胶原膜的粗糙表面与透明的软骨的界面上出现整合的明确证据，而使用厚膜，在光滑表面上很少出现整合的证据(图11)。不过，还存在细胞从光滑表面上迁移的证据，预计，这种迁移在较长培养时间后会导致整合。以上发现表明，到第40天，软骨细胞业已从粗糙表面上迁移出来，并且促进了组织整合，而在光滑表面上，细胞迁移仍在进行，还没有实现有效整合。

膜厚度和整合

我们检验了以下假说，即薄的支架比厚的支架占据较小的空间，并因此有利于更快速地整合。在培养20天之后，厚支架没有出现软骨整合的证据，而薄支架业已在粗糙表面上诱导了有效整合(图12)。这些发现证实了在以整合(消除空间)为目标时，薄支架是最有效的。

例3.确定用于修复透明的和半月板软骨的最佳细胞类型

方法

我们使用牛透明的软骨或羊半月板软骨，将夹心模型用于图9和10所示的软骨整合。在每一种场合下，我们比较了使用牛/羊关节软骨软骨细胞，羊半月板纤维软骨细胞软骨细胞，牛鼻软骨细胞或人骨髓间充质干细胞。我们还使用了半月板软骨修复的完整的器官模型。在整个半月板上形成两个切口，并且将细胞绷带插入每一个切口中(图13)。利用U形夹固定绷带(图14)。

结果

软骨夹心模型中的细胞类型

在透明的和半月板软骨夹心系统中，用鼻软骨细胞或干细胞获得了最佳结果。关节和半月板软骨细胞总是较差的。不过，对于半月板软骨修复来说，干细胞似乎能产生特别有效的整合(图15)。因此，鼻或干细胞是透明的或半月板软骨整合的优选细胞。

完整半月板模型的细胞类型

与所有其他细胞类型相比，干细胞能产生良好的整合。能产生与周围半月板组织非常类似的界面组织(图16)。因此，干细胞是用于半月板软骨整合的优选细胞。

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Claims (20)

1.输送细胞跨越组织表面的方法，该方法包括将细胞分布在生物材料片上和/或内，以便形成细胞绷带，并且将所述细胞绷带用在所述表面上，其中，在将所述细胞绷带用在组织表面上之后，所述细胞从所述细胞绷带中释放。

2.如权利要求1的方法，其中，所述组织是软骨组织，而所述细胞是软骨生产细胞，或能够产生软骨的细胞。

3.用于结合两个或两个以上组织的方法，该方法包括提供与要结合的表面紧密接触的细胞绷带，其中，所述细胞绷带包括生物材料片，所述生物材料具有分布在其上和/或其内的细胞。

4.如权利要求3的方法，其中，所述生物材料片的厚度小于1.0mm。

5.如权利要求3或4的方法，其中，所述至少一个组织是软骨组织，而所述细胞是软骨生产细胞或能够产生软骨的细胞。

6.如权利要求3-5中任意一项的方法，其中，至少一个组织是移植的或植入的软骨，而另一个组织是受体部位的天然软骨。

7.如权利要求3-5中任意一项的方法，其中，至少一个组织是移植的或植入的软骨，而另一个组织是位于受体部位的骨骼。

8.如权利要求3-5中任意一项的方法，其中，要结合的表面是由骨折或组织撕裂形成的。

9.如权利要求8的方法，其中，所述组织是半月板软骨，而要结合的表面是由半月板裂伤形成的表面。

10.一种细胞绷带，它包括生物材料片，所述生物材料具有分布在其上和/或其内的细胞。

11.如权利要求10的细胞绷带，其中，所述生物材料片具有位于两个表面内或上的细胞。

12.如权利要求10或11的细胞绷带，其中，所述调适生物材料的结构以允许从所述绷带中释放细胞。

13.如权利要求10-12中任意一项的细胞绷带，它的厚度小于1.0mm。

14.如权利要求10-13中任意一项的细胞绷带，其中，所述细胞是软骨生产细胞或能够产生软骨的细胞。

15.如权利要求10-14中任意一项的细胞绷带，其中，所述生物材料是合成的。

16.如权利要求10-14中任意一项的细胞绷带，其中，所述生物材料是天然衍生的。

17.权利要求10-16中任意一项的细胞绷带促进移植的或植入的软骨和受体部位的天然软骨的整合的用途。

16.权利要求9-14中任意一项的细胞绷带促进移植的或植入的软骨和受体部位的骨骼整合的用途。

16.权利要求9-13中任意一项的细胞绷带修复半月板裂伤的用途。

17.权利要求9-13中任意一项的细胞绷带促进两片或两片以上工程软骨整合的用途。

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