CN110958892A - 软骨移植物支架 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物材料，该生物材料包括基本上不含活细胞的软骨移植物支架，其中软骨移植物支架呈现为以片层或网格形式的多个凹口。

Description

软骨移植物支架

描述

技术领域

本发明涉及对治疗应用有用的具有刻的凹口(engraved notches)的软骨移植物支架，以及制造这种支架的方法。

背景技术

基质相关软骨细胞移植(MACT或MACI)是目前治疗大关节软骨缺陷的黄金标准，并且改善了大多数患者的症状。但是，移植失败仍然会发生，并且成功与否在很大程度上取决于长期的术后物理治疗。虽然供者年龄、体重指数、缺陷类型和手术方式起着作用，但移植失败的一个重要原因是植入后的康复不足或创伤性发生，两者都与早期的负荷有关(Marlovits等，Eur J Radiol，2006年，1月；57(1):24-31)，这可以通过减少导致风险的负荷所加载的时间，或不易受感染的植入物，例如通过更坚硬的支架材料来防止。

最天然的力学行为可以在关节软骨本身中找到。先前的研究已经表明，在使得基质更易接近的过程中，即使当糖胺聚糖(GAG)在这个过程中被消耗时，对软骨脱细胞的可能性在生物力学上具有可容忍的影响(Schneider等，组织工程C部分方法(Tissue Eng PartC Methods)，2016年12月；22(12):1095-1107)。

一些移植失败发生得很晚，尽管在此之前，软骨组织的形成已经发生，并在超过一年的时间里表现良好。长期随访临床研究报道，软骨肥大和纤维软骨的形成存在于多达三分之一的患者中，其中有10％的患者需要再次手术。

除了生物力学性能得到改善外，在脱细胞支架中，保留在关节软骨中胶原的复杂结构具有最天然的环境的优点。软骨来源的胶原II型被证明能提供软骨诱导刺激。结合天然的3D结构，这可能会抵消不期望的软骨类型的形成，从而对移植物的长期功能产生积极影响。

重定植测试表明，细胞很好地附着在脱细胞支架的表面，但显示基质渗透性差。这是极为密集的透明软骨ECM所产生的一个众所周知的挑战。

WO2006/090372公开了一种提供包含软骨的组织的移植方法。在适当的低温保存条件下切除并处理含软骨的组织，以产生低温保存的含软骨的组织。解冻后，保存的含软骨的组织包括整个软骨部分至少10％的活的软骨细胞。切除的含软骨的组织包括顶部有软骨部分或层的骨组织。至少一个或多个凹口可制成软骨部分。

WO2014/011891描述了穿孔软骨产品。通过分离、汽化、消化和通过逐步降低温度来冷冻保存软骨样品，从而制备软骨产品。这种处理过的软骨产品包括提升的水平的活的软骨细胞。

US2014/0243993公开了镶嵌软骨。该镶嵌软骨包括多个相互连接的软骨块(cartilage tiles)和与生物相容的载体，以及附加的生物成分，例如纤维蛋白或胶原凝胶。所述软骨块可以在软骨组织中显示多个通道。穿孔也考虑到软骨结构或片的强化低温保存。软骨片内的活软骨细胞可以从片中迁移出来，进行修复和再生功能。

WO2009022191描述了用于修复软骨缺陷的关节软骨，是由纯软骨制成的，在面向骨的表面处有切口。切口由切割刀片提供。有切口的软骨可以在表面定植细胞。

根据最新技术制得的软骨产品，包括活的和/或死的软骨细胞。但是，细胞成分可以是用于同种异体反应性免疫反应的抗原刺激物。因此，仍然需要具有与正常软骨相似的力学特性的支架，该支架不会引起同种异体反应性免疫反应。

发明内容

因此，本发明的目的是提供具有刻的切口的软骨移植物支架，用于细胞生长，从而能使支架重新定植和优化移植物整合，并且不会引起同种异体反应性免疫反应。

所述目的通过本发明的主题解决。

本发明涉及生物材料，该生物材料包括基本上不含活细胞材料的软骨移植物支架，其中软骨移植物支架包括多个凹口。

本发明的另一个实施例涉及生物材料，该生物材料包括脱细胞和/或失活的软骨移植物支架，其中软骨移植物支架包括多个凹口。

本发明的另一个实施例涉及的如本文所述的生物材料，其中凹口位于软骨移植物支架的表面上。

根据本发明的另一个实施例，凹口不会穿透软骨移植物支架。在一些实施例中，额外的孔可以穿透软骨移植物支架，以允许流体从一侧流向另一侧。

根据本发明的另一个实施例，凹口具有限定的深度、宽度和/或距离。具体地，凹口的深度约为20至5.000μm，或约为20至3.000μm，或约为20至1.000μm，或约为20至500μm，或约为20至50μm。在本发明的一些实施例中，凹口之间的距离约为10至1.000μm，或约为10至100μm，或约为10至50μm。

根据本发明的另一个实施例，凹口是片层或网格形式的。

凹口的片层形式特别适合为细胞提供空间，使细胞渗透深入软骨移植物支架并沉积新基质于其中。由于去除了基质成分例如糖胺聚糖(GAG)，细胞的附着性得到改善，并促进了新组织的形成。

本发明的另一个实施例涉及如本文所述的生物材料，其中软骨移植物支架基本上不含活细胞材料，具体地，软骨移植物支架基本上不含活的软骨细胞。更具体地，软骨移植物支架在整个软骨移植物支架中具有少于10％，或少于5％，或少于2％，或少于1％的活的软骨细胞。

本发明的另一个实施例涉及如本文所述的生物材料，其中软骨移植物支架选自由弹性软骨、透明软骨纤维软骨和由天然或合成聚合物制成的人工软骨材料组成的组。

根据本发明的另一个实施例，软骨移植物支架被预定植。具体地，软骨移植物支架由软骨细胞，或自体或异体来源的具有软骨生成潜能的其他细胞(例如，间充质干细胞、骨髓细胞)预定植。

在另一个实施例中，可以在植入时将细胞添加到支架上。细胞可以选自由具有软骨生成潜能的细胞(软骨细胞、间充质干细胞、骨髓细胞)组成的组。

本发明的一个实施例涉及制备生物材料的方法，包括以下步骤：

a.从供体获得软骨层，

b.切割多个凹口，以及

c.使软骨生物材料脱细胞和/或失活。

本发明的另一个实施例涉及制备生物材料的方法，包括以下步骤：

a.从供体获得软骨层，

b.使软骨生物材料脱细胞和/或失活，以及

c.切割多个凹口。

本发明的另一个实施例涉及如本文所述的方法，其中凹口用激光束进行。具体地，凹口由CO₂或飞秒激光提供。

在本发明的一些实施例中，活细胞(例如软骨细胞)从软骨移植物支架中去除。具体地，细胞被化学灭活，例如，通过酸性的或碱性的处理，离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂处理。

在本发明的一些实施例中，软骨移植物支架的活细胞被灭活。具体地，细胞受到物理方法的损伤，例如冷冻/解冻循环。最常用的用于损伤或从组织基质中部分地去除细胞的物理方法，是基于使用温度、力和压力，以及电干扰。

本发明的一个实施例涉及如本文所述的用于组织再生或治疗骨软骨缺陷的生物材料。

本发明的另一个实施例涉及如本文所述用于治疗软骨性骨或肌肉缺陷的生物材料。

附图说明

图1描绘了以不同速度和重复进行的软骨中的CO₂-激光片层，(a)宏观视图显示了用一个激光设置进行的8mm软骨活检中的规则的网格模式。(b，c)组织学截面显示了运行两次或五次获得的凹口的深度。在激光边缘缺乏胶原II型免疫染色，示出了激光的热损伤(比例尺＝200μm)；

图2描绘了(a)在宏观视图中和(b，c)在软骨移植物支架的胶原Ⅱ型免疫染色组织学截面(b:1000次运行，0.25mm距离；c:600次运行，0.1mm距离，1m/秒；比例尺＝200μm)的8mm的软骨活检中的飞秒-激光-刻线；

图3描绘了CO₂激光刻的软骨移植物支架，用ASC进行脱细胞、GAG消耗和定植，并在软骨分化介质中培养5周；胶原II型和阿辛蓝(Alcian blue)染色的组织学石蜡截面显示，在片层之间形成的组织分化良好，以及与软骨移植物支架结合良好(比例尺＝200μm)；

图4左：充满修复组织的失活的片层移植物(冷冻-解冻循环)，然而所述修复组织从软骨表面分离。右：在预处理的片层移植物(HCl、胃蛋白酶和NaOH)上，新形成的组织密集地附着在支架的软骨边缘(比例尺＝200μm)；

图5描绘了用不同技术产生的软骨凹口a)与软骨边缘紧密相连的剃刀刀片凹口b)飞秒激光凹口在片层软骨边缘之间产生约50μm的空间，c)CO₂激光产生导致V形凹口的大多数材料烧蚀(比例尺＝200μm)；

图6显示了重定植的飞秒激光的支架，在片层空间有少量细胞(左)，随着时间的推移导致修复组织(右)(比例尺＝200μm)；

图7描绘了皮下植入骨软骨塞的裸鼠，其具有(a)未填充的缺陷；(b)用重定植的支架填充的缺陷；(c)用重定植的支架填充组织的移植的骨软骨塞5周后的缺陷；

图8描绘了用ASC定植的FS-激光刻的支架、共培养和软骨细胞的体内结果，显示了定植的细胞在片层之间的组织形成，以及支架和新形成的组织的良好结合。石蜡截面用抗体免疫染色，该抗体与新合成的胶原II型(左列)和总的胶原II型(右列)反应，显示软骨细胞和共培养物的胶原II型的沉积(比例尺＝100μm)。

具体实施方式

惊讶地发现，刻有切口(凹口)的软骨移植物支架用于细胞生长，是一种有前景的选择，可以使支架重定植并优化移植物整合。

因此，本发明提供了包括脱细胞的软骨移植物支架的生物材料，其中软骨移植物支架包括多个凹口。

如本文所用，术语“软骨移植物支架”是指任何组织，具体地，是指天然软骨组织。

软骨是无血管的结缔组织，由胶原和/或弹性蛋白纤维和软骨细胞组成，它们都形成基质，并可以含有进一步的成分，如糖胺聚糖。天然软骨移植物支架可从任何来源获得，例如透明软骨，例如气管、肋骨或存在于关节末端的关节软骨，例如膝、髋、肩、肘等，或纤维软骨，例如存在于耻骨联合、椎间盘纤维环中的软骨，半月板和颞下颌关节(TMJ)，或来自弹性软骨，如存在于外耳、咽鼓管和会厌的软骨。透明软骨可以在形成关节的骨头末端、肋骨末端、鼻子末端、气管周围的硬环和支撑喉部上找到。关节软骨是一种特别类型的透明软骨，它覆盖关节表面，并提供持久的低摩擦表面，分散机械力并保护关节的下层骨。纤维软骨位于脊柱、髋和骨盆之间。

软骨移植物支架也可以是合成材料或人工材料，例如细胞“支架”材料、由二氧化硅和聚合物(例如聚己内酯)组成的生物玻璃材料，或无细胞支撑基质，例如，胶原丝支架或海绵，热可逆的凝胶水凝胶、己内酯聚合物或芳香族有机酸聚合物等。

软骨移植物支架可以从人或动物供体、青少年供体、死亡个体(动物或人，即尸体)中获得。具体地，人体上有许多关节，可以作为生产透明/关节软骨移植物支架的获取点。可用于获取关节软骨移植物支架的足部关节包括但不限于，跟骨立方关节、楔间关节、跗跖关节、小跖趾关节、指间关节和髋关节，例如来自股骨头。

根据本发明的另一个实施例，软骨移植物支架是人类软骨移植物支架。根据本发明的另一个实施例，软骨移植物支架是非人类支架。在本发明的另一个实施例中，软骨移植物支架是关节软骨。

软骨移植物支架的厚度约为100μm至5.000μm。通常地，厚度可以在250μm至3000μm之间。软骨移植物支架的厚度可以是均匀的或不均匀的。优选地，厚度是均匀的。

如本文所用，术语“脱细胞”是指基本上不含活细胞材料的生物材料，例如基本上不含活的软骨细胞。

如本文所使用的短语“基本不含有”，是指由本发明生产的软骨移植物支架，其中至少90％的活细胞材料已被灭活和/或从支架上去除，优选地，约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％的活细胞材料已被灭活和/或去除。

“脱细胞软骨移植物支架”是指基本上不含细胞成分以在一定程度上消除或降低软骨移植物支架的抗原性，其中支架被视为是非免疫原的，如同异种移植物。

脱细胞导致与天然软骨具有相同的生化组成的脱细胞基质具有低免疫原性。另一方面，失活软骨(DVC)产生的基质可能仍然含有细胞残基和抗原细胞的表面标记。对于脱细胞，通常采用物理和化学工艺，而对于失活，则使用物理方法。软骨的成功脱细胞可以使用不同的方法来完成，在剩余的生化成分、细胞去除和机械性能方面有不同的结果，例如使用往复式渗透性振动、洗涤剂和酶清洗。软骨移植物支架的失活可通过冷冻/解冻循环，或在-20℃下冷冻进行。

本发明的一个实施例涉及包含脱细胞的软骨移植物支架的生物材料，其中所述支架包含多个切口或凹口。多个切口或凹口的深度可以为生物材料厚度的5％至95％之间。多个切口的深度和宽度可以不均匀。此外，多个切口或凹口可以布置成均匀或非均匀排列。

多个切口或凹口以切口模式设置在支架上。切口模式可以是基本上平行间隔关系的多个直的或弯曲的细长通道、从共同中心区域辐射的多个细长通道、从共同中心区域辐射的多个同心通道；形成网格的多个细长通道；形成“Z字形”模式的多个细长通道、形成波浪状模式的多个细长通道，例如片状，形成螺旋模式的多个细长通道、布置在适当尺寸的基质中的多个相互间隔的点凹口，或其任何组合以及本领域技术人员所设想到的许多其他模式。

本发明的另一个实施例涉及生物材料，该生物材料包括具有多个凹口的脱细胞软骨移植物支架，其中凹口刻在软骨移植物支架的表面上。凹口可以具有预定的深度。切口的预定深度可以是距软骨移植物支架表面20μm，或者距表面甚至是25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm、250μm、500μm、750μm、1.000μm、1.500μm、2.000μm、2.500μm、3.000μm、3.500μm、4.000μm、4.500μm或5.000μm，甚至更深。应当理解，预定深度不要超过软骨移植物支架的厚度，即不穿过软骨移植物支架。

在一些实施例中，可以提供局部穿孔，以允许流体从一侧流向另一侧。

举例来说，每个切口的宽度可为为约15μm至约25μm，或约25μm至约100μm。但是，宽度可以小于约15μm，或者甚至大于约100μm。相邻凹口之间的距离，例如相邻凹口之间的距离、同心凹口之间的距离、或相邻线性凹口之间的距离或线性排列凹口之间的距离，可以是大约10μm、50μm 100μm、250μm、500μm、750μm或1.000μm。凹口的深度可以在整个软骨层上基本上均匀，或者可替代地，可以在不同的凹口之间变化。

本发明的另一实施例涉及自动化方法，所述方法不仅提供高的精度和标准化，而且允许大规模生产成品生物材料。

用例如剃刀刀片或刀具切割设备实现凹口时，导致切割边缘靠近，中间几乎没有填充空间(图5a)。这些凹口只有在弯曲的情况下才会打开(或是由于人工制品，如在组织加工过程中的情况下)。

但是，一定的间隙是必要的，以为细胞提供空间，用于重新定植，避免机械损伤和组织形成。激光在切割过程中烧蚀材料，去除材料的数量取决于激光类型和技术。飞秒激光允许狭窄的凹口(例如50μm)(图5b)，但是仍然足够宽，以允许细胞再增殖，并为组织形成提供保护环境。由FS激光产生的凹口可以被认为是成功的组织生成所需的最小空间(图6)。CO₂激光产生V形凹口，使得软骨支架基质和新形成组织的比例几乎为1:1(图5c)。

凹口可以是切口、开口(cut)、孔口(apertures)、孔(hole)、间隙、通道、裂缝等，并且可以按照本文所述的任何合适的模式布置。凹口可以通过多种方式进行，例如铣刀或激光束。在本发明的一个实施例中，凹口由激光束产生。通过使用激光，不仅可以制作凹口，而且可以局部去除特定数量的软骨基质。因此，在优选的实施例中，凹口由激光束产生，从而局部去除基质成分。在优选实施例中，选择性地从软骨基质中去除糖胺聚糖。

根据本发明的一个实施例，使用产生精细定义结构的二氧化碳激光。根据本发明的另一个实施例，使用飞秒激光。激光刻可以重复进行。根据凹口的深度，实施一次、两次、三次、四次、五次或更多次重复。

通过使用激光产生凹口，细胞可以深入到支架中，在所述支架中填充凹口，形成新的软骨并且支持移植物重建，包括从整个缺陷深度恢复GAG含量。合适的细胞可以是软骨细胞，也可以是具有软骨生成潜能的、自体或异体来源的其他细胞(如干细胞)。它们在植入前就定植于支架上(在手术中或在细胞培养实验室中进行预培养)，或通过应用细胞悬液或骨髓刺激直接与缺陷内的支架结合。

此外，一旦凹口填满，细胞可能被刺激渗透到脱细胞基质中，它们唯一的选择是在胶原片之间横向(sideways)迁移。

根据本发明的一个实施例，激光可用于将精细结构刻到软骨移植物支架，例如关节软骨中，并且这些结构可填充细胞以实现高度整合的分化组织。激光刻的脱细胞支架的生产是精确的、可重复的，并且可以在几乎不增加任何工作或时间的情况下扩大规模。

在由二氧化碳、氮气和氦气组成的激光介质中，CO₂激光发射波长为10.6μm的红外光束。各种可调参数，如能量和速度(其乘积等于激光功率)、光束直径(及其能量密度和亮度)、脉冲持续时间和重复率，产生多种选择，以达到所期望的刻的深度和限制热损伤。功率增加、脉冲持续时间长以及速度降低会导致更深的刻印或切割。由于激光脉冲长度超过10微微秒(psec)的激光(如CO₂，但不是超短脉冲激光中的飞秒激光)中的烧蚀是热的，因此剩余组织的ECM分子可能在烧蚀过程中受到损伤。在长时间的热暴露过程中，天然胶原的三螺旋结构通过氢键和范德华力的失稳转变成随机的螺旋结构。免疫组织化学显示了与这些参数相关的激光边缘胶原II型结构的变化。通过避免热能沉积到非烧蚀的组织，或者通过组织暴露时间足够短，或者当组织烧蚀前沿的速度接近或快于热扩散到残余组织(冷烧蚀)时使用飞秒激光，可以最小化这种不期望的副作用。

在一些实施例中，上述缺点可用于在软骨中提供凹口的替代方法。软骨移植物支架局部暴露于长时间的热暴露中，以便将胶原转化为明胶。然后去除形成的明胶，从而获得局部凹口。可通过热产生或热传递仪器进行所述处理。

热产生或热传递的仪器的例子包括但不限于激光、加热的手术刀刀片、加热的剪刀或加热的镊子。应将仪器加热至约200℃的温度。在另一个实施例中，可通过CO₂或飞秒激光进行加热。

因此，本发明的另一个实施例涉及具有选择的合适的能量和速度值的激光设置，以优化结果。优选通过选择快速激光运动和短脉冲持续时间来缩短曝光时间。凹口深度由重复率或是由于延长的暴露时间决定。

与孔相比，片层结构具有使支架更灵活的优点，在任何缺陷中潜在地使细胞支架接触表面和支架-宿主的接触最大化。它们为新基质的生成提供了更大的空间，并且在培养初期，当新基质尚未填充它们时，可以使介质层流通过凹口。胶原的天然结构保存在片层或柱状物(激光或切割边缘除外)中，新合成的基质通过支架的地形(topography)被推向垂直基质排列-这比促进圆形基质沉积的海绵移植物更具优势。共聚焦显微镜显示胶原纤维沿切缘排列并垂直于凹口内的软骨表层，当接近凹口较宽的表层时，基质更不对齐，并且具有沿着支架表面对齐的趋势-这两个都是关节软骨的胶原网络的特征。

在失活的(但不是脱细胞的并且不是GAG消耗的)支架上，组织学揭示了新形成的基质和支架之间存在间隙。这可能是由于组织样品制备过程中发生的收缩，但这意味着新细胞/组织与支架表面的附着性不如在脱细胞-脱GAG样品中紧密，在上述样品中没有观察到这种影响(图4)。

为了进一步改善GAG消耗的软骨移植物支架中细胞的附着性，可以对支架进行化学处理。在本发明的一个实施例中，用酶、酸性和/或碱性的溶液处理软骨移植物支架。在优选的实施例中，软骨移植物支架用胃蛋白酶、HCI和NaOH进行处理。

为了使软骨样品失活，软骨样品分别在-20℃和室温下保存约1小时，干燥冷冻几次，浸入低张缓冲液中冷冻几次。然后将软骨样品在盐酸中孵化一夜，进行脱细胞，用酶溶液隔夜进行选择性基质消耗，然后在氢氧化钠中孵化以使边缘变粗糙。

软骨移植物支架可用于治疗有此需要的受试者。设想包括脱细胞的和/或失活软骨移植物支架的生物材料可以促进或增强精确的基质沉积和组织形成。软骨移植物支架表面上的多个凹口产生的结构，相对于缺少所述凹口的软骨具有增加的表面积。增加的表面积可以使细胞附着，以及使得营养物质在损伤部位软骨移植物支架内、贯穿和横跨整个支架上容易输送，从而有助于增强再生或愈合。

本发明的生物材料用于软骨和软骨组织的修复、替换和再生。软骨移植物支架可以定义为包括蛋白多糖和胶原的致密结缔组织层。

与目前用于软骨再生的商业上可以获得的支架相比，本发明方法生产的支架具有优异的力学性能，并且对细胞附着和基质沉积有积极影响。激光产生的结构通过保留力学特性，从而大大增加细胞与支架的接触以及与软骨基质相关的细胞数量，促进增强的移植物的整合和更快的重建。设想脱细胞的GAG消耗的具有刻有片层和网格模式的软骨，具有减少术后物理治疗的持续时间和移植失败的风险的潜力，从而通过降低治疗成本以及通过使患者更快地恢复日常生活，从而有利于健康花费。

本发明的另一个实施例涉及如本文所述的生物材料，其施用于患者体内用于治疗软骨和/或骨缺陷处。例如，来自周围组织的细胞可以在体外繁殖并产生新的软骨。新形成的软骨组织可填充缺陷，并在治疗处与现有的天然软骨和/或软骨下骨结合。

根据本发明的另一个实施例，可在软骨、骨、韧带、肌腱、半月板、关节或肌肉的缺陷处施用生物材料。本发明的另一个实施例涉及用于治疗退行性缺陷或损伤的生物材料。本发明的另一个实施例涉及用于治疗骨关节炎或肌肉缺陷的生物材料。

根据本发明的另一个实施例，可将生物材料施用于受试者以修复软骨，或促进软骨生长或再生。所述生物材料可施用于关节(例如膝盖)、骨(例如股骨或肱骨)或软骨。

根据本发明的另一个实施例，可将生物材料施用于具有软组织缺陷的受试者，以修复和/或再生其软组织缺损。所述生物材料可施用于韧带、肌腱或肌肉。软组织缺陷可以是韧带、肌腱或肌肉的扭伤、拉伤、挫伤或应力损伤。

根据本发明的另一个实施例，可将生物材料局部施用于有此需要的受试者。所述生物材料可经手术植入，优选地，所述生物材料以微创手术(例如通过关节镜检查)施用。

实施例

下面的实施例是为了帮助理解本发明而提出的，但不旨在也不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。这些实施例不包括对常规方法的详细描述。这种方法对于普通的本领域技术人员来说是已知的。

材料和方法

样品采集

经患者同意并经当地道德委员会批准，从经历髋关节置换的捐赠者的股骨头中采集了宏观上完整的人类关节软骨。从软骨下骨分离全厚度的非钙化软骨，用直径为8mm的活检打孔器准备活检，用PBS+抗生素(青霉素/链霉素(Pen/Strep))洗涤。软骨活检用于标准化至300μm的全厚度或样品厚度，使用Teixido软骨切割器(综合生命科学(IntegraLifeSciences)的

美国)。软骨取自活检的中间区域，弃去来自表层和深钙化区的组织。

激光设置

激光刻可以用CO₂-激光或者用飞秒-激光。前者是Trotec Speedy 300(Trotec有限公司，奥地利)，标准波长为10.6μm，脉冲持续时间为0.2毫秒。飞秒-激光是

高Q激光(

High Q Laser)，波长为520μm，焦距为100mm。为了在软骨活检中穿孔，将CO₂-激光设置为30W和5000Hz，速度设置为42.6cm/s，进行一到五个线型。飞秒-激光持续设置为12.4J/cm²，等于7μJ，脉冲重复频率为200kHz。全厚度软骨活检以400-600次和1000mm/s为间隔来刻。300μm厚度的软骨活检刻140次。

为了生成网格模式，激光束在飞秒-激光和CO₂激光的样品上以平行水平和垂直线平移，样品旋转90°并重复平行线模式。

失活/脱细胞

采用激光刻网格模式的软骨活检是失活或者脱细胞的，并进行靶向基质消耗(“脱细胞-脱GAG”)。

对于灭活样品，分别在-20℃和室温下交替保存1小时，两次干燥冷冻和两次冷冻浸入低渗缓冲液(10mM Tris碱，使用HCI调节至pH 8.0)中冷冻。脱细胞-脱GAG样品也经历了这些冷冻/解冻循环，然后在0.1M的盐酸中孵化一夜以进行脱细胞，在1mg/mL的胃蛋白酶(0.1％在0.5M乙酸中)中孵化一夜用于选择性的基质消耗，然后在0.1M的氢氧化钠中孵化6小时来使得边缘粗糙。所有孵化步骤均在37℃下连续摇动中进行。

细胞培养

来源于人体脂肪的基质/干细胞(ASC)通过胰蛋白酶法获取并用于再定植实验。

体内研究

选择小动物模型来证明支架材料在软骨环境和系统条件下的行为。将牛骨软骨塞植入裸鼠皮下。骨软骨塞(直径1cm)有实验性软骨缺陷(4mm)。这些缺陷用作膝关节缺陷模型，并用开发的生物材料(一叠两片300μm的芯片)和1×10⁶细胞(人体ASC、牛软骨细胞或共培养物)填充(“治疗”)。空白缺陷作为对照。细胞在植入前两天进行预培养。植入后6周取标本。

组织学检测

将体外和体内样品固定在4％中性福尔马林缓冲液中，用石蜡包埋，用阿辛蓝(pH2.5)和Ⅱ型胶原抗体进行染色。

结果

激光设置

CO₂-激光刻显示出一个V形切口。深度在特定设置内是规则的，并且随着重复次数的增加而增加，所述重复次数的范围为一次重复150μm到五次重复680μm。激光边缘显示胶原II型变性，约为50μm宽(图1)。

飞秒-激光刻产生的直的和平行的凹口，与片层之间存在狭窄距离。片层的表面不显示基质的任何变化(图2)。

支架的体外性能

用ASC重新定植到CO₂-激光刻的软骨组织切片，形成了完整的支架结构和由ASC重新(de-novo)产生的软骨分化组织，ASC在细胞内沉积了胶原Ⅱ型和蛋白多糖，并用这种基质填充了片层。细胞和基质通过完全且强烈的表面附着与支架结合良好(图3)。

支架的体内性能

将细胞植入的支架植入实验性缺陷中，表明该材料在裸鼠系统条件下的软骨环境中表现良好。它在六周内几乎保持不变，并且完全填补了缺陷。即使在肉眼可见的裸鼠的皮肤下，或者在说明后把圆柱体切成两半(图7)的情况下，与对照的差异都是可见的。体内植入6周后，支架仍然存在，并很好地嵌入新形成的组织中。ASC形成的组织无软骨分化迹象，ASC与软骨细胞共培养，以及软骨细胞单独形成软骨组织。胶原Ⅱ型呈阳性，外观致密，与支架基质完全附着和整合(图8)。

Claims (22)

1.一种生物材料，包括基本上不含活细胞的软骨移植物支架，其中软骨支架包括片层或网格形式的多个凹口。

2.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述凹口位于软骨移植物支架的表面上。

3.根据权利要求1或2所述的生物材料，其中所述凹口不会穿透软骨移植物支架。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物材料，其中所述凹口具有限定的深度、宽度和/或距离。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的生物材料，其中所述凹口的深度为20至5.000μm，或20至3.000μm，或20至1.000μm，或20至500μm，或20至50μm。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的生物材料，其中所述凹口之间的距离为10至1.000μm，或10至100μm，或10至50μm。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的生物材料，其中所述软骨移植物支架基本上不含活细胞，特别是基本上不含软骨细胞。

8.根据权利要求7所述的生物材料，其中所述软骨移植物支架具有的活细胞材料小于10％，或小于5％，或小于2％，或小于1％。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的生物材料，其中所述软骨移植物支架选自由弹性软骨、透明软骨纤维软骨和由天然或合成聚合物制成的人工软骨材料组成的组。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的生物材料，其中所述软骨移植物支架是预定植的。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的生物材料，其中细胞在植入时被添加到软骨移植物支架中。

12.根据权利要求10或11所述的生物材料，其中用于预定植或在植入时添加到支架的细胞选自由软骨细胞、间充质干细胞、骨髓细胞组成的组。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的生物材料，其中所述软骨移植物支架是经过预处理的。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的生物材料，其中在软骨移植物支架中选择性地去除基质成分。

15.根据权利要求14所述的生物材料，其中选择性地去除糖胺聚糖(GAG)。

16.一种制备生物材料的方法，包括以下步骤：

a.从供体获得软骨层，

b.切割多个凹口，以及

c.使软骨生物材料脱细胞和/或失活。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述凹口由激光束进行。

18.根据权利要求17所述的方法，其中激光是飞秒激光或CO₂激光。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述生物材料是经预处理的。

20.根据权利要求19所述方法，其中预处理溶液包括0.1至10U/mL的酶。

21.一种生物材料，该生物材料包括根据权利要求1至15中任一项的脱细胞的软骨支架，用于组织再生或治疗骨软骨缺陷。

22.根据权利要求21所述的生物材料，用于治疗软骨、骨或肌肉缺陷。

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