JP2010509965A - 半月板インプランテーションのための組織の調製 - Google Patents

Abstract

本発明は、組織マトリックスを調製する方法、ならびに損傷もしくは欠損のある半月板の置換および／または修復におけるそのマトリックスのその後の使用に関する。本発明はまた、実質的に脱細胞化された半月板組織を提供する。

Description

本発明は、損傷もしくは欠損のある半月板の置換および／または修復のための、組織マトリックス、特に軟部組織マトリックスを調製する方法に関する。本発明はまた、引き続く移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）／インプランテーションのための実質的に脱細胞化された半月板組織を提供する。

ヒトの膝は、３つの空間的に相互に関係のある骨（大腿骨、脛骨および膝蓋骨）、靱帯および軟骨構造を含む重要かつ複雑な関節であり、これらの全てが相互に作用して種々の動きを生じる。関節内の膝の骨の表面は、関節軟骨で覆われる。この重要な表面によって骨は骨に対する損傷を生じることなくお互いに対して円滑に滑ることが可能になる。半月板は、骨の関節軟骨表面の間のＣ型の軟骨クッションであって、重量を分散することによってショックアブソーバとして働き、そのようにして膝の関節の全体的安定性を改善する。各々の膝関節は、内側半月および外側半月を有し、この半月板は線維軟骨細胞、プロテオグリカンならびにコラーゲン線維およびエラスチン繊維からなる細胞外マトリクスから構成される。傷害、疾患または炎症を通じて半月板が損傷されるとき、関節の変化は、罹患した個体において膝関節の引き続く膨張、疼痛、および／または膝の関節機能の喪失を発症し得る。断裂した半月板を修復することは可能であるが、重度に損傷した半月板、または大きな裂け目のある半月板は除去しなければならないかもしれない。

成体における関節軟骨は通常は大幅な程度では再生されないので、一旦破壊されれば、傷害を受けた成体の半月板は歴史的には、除去および人工補綴物との置換を含む種々の外科的介入によって治療されている。より高齢の患者では、膝関節置換術がしばしば好ましい選択肢である。しかし、より若い個体（５０歳または５５歳齢未満の個体）については、関節全体を置換する代わりになる別の方法として、損傷を受けた半月板を置換するために人工の半月板またはドナー組織のいずれかを用いる半月板移植がある。

半月板の置換のためのドナー組織の使用に関連する問題は、半月板とは細胞外マトリックスを合成、維持および修復を担う細胞である線維軟骨細胞が全体にわたって浸透した高密度の繊維軟骨性組織であるということである。ヒトの内側半月は約４．５ｍｍの長さであって、外側半月は約３．５ｍｍの長さであって、各々の厚みは２５〜３５ｍｍにおよぶ（ブタの値は、ヒト半月の値と同様である）。該半月は分厚くかつ高密度な組織であって、細胞が全体に特に微小血管の周囲に位置するので、特に中央の領域では脱細胞化することが極めて困難で、このことは言い換えると移植のために免疫学的に不活性または脱細胞化された組織を調製することが困難であり、したがって拒絶のリスクがあるということを意味する。言い換えれば、生体適合性が低く、ホストは異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｇｒａｆｔ）または異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）のいずれかに由来する免疫学的反応があるリスクが高い。

無細胞の生体適合性半月板インプラントを得るために、人工の半月板補綴物が開発されている。しかし、人工の半月板補綴物に関連する問題は、これが天然の半月板組織ほど頑丈ではなく、また天然の半月板の弾性特性を欠き、結果としてこのような補綴物は天然の物質ほどショック吸収に有効ではないということである。

ドナーの半月組織を有効に脱細胞化し得る方法によって、半月板のインプラント／移植を必要とする個体の処置に直接の利益がもたらされる。

本発明の第一の態様によれば、ホストへの引き続くインプランテーションのためのドナー半月組織を調製する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）緩衝溶液中で組織を超音波処理する工程と、
（ｉｉ）該組織を凍結および融解する工程と、
（ｉｉｉ）該組織を低張液中でインキュベートする工程と、
（ｉｖ）陰イオン性界面活性剤を含む低張液中で該組織をインキュベートする工程と、
（ｖ）工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を繰り返す工程と、
（ｖｉ）少なくとも１つのヌクレアーゼ酵素を含む溶液中で該組織をインキュベートする工程と、
（ｖｉｉ）酸化剤を用いて該組織を洗浄する工程と
を含む。

好ましくは、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の前に行われてもよく、すなわち、該ドナーの半月組織は、超音波処理手順の前に凍結／融解手順に供されてもよく、これらの２つの工程の順序は、本発明の範囲を限定することを意図していない。

本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む、包含する、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、ならびにこれらの単語の変化形、例えば、「含んでいる、包含している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む、包含する、含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含むがそれに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、整数または工程を除外することは意図しない（そして除外しない）。

本明細書の説明および特許請求の範囲の全体にわたって、単数形は、その文脈が他を要求しない限り複数形を包含する。詳細には、不定冠詞を用いる場合、本明細書は、その文脈が他を要求しない限り、複数および単数を意図するものと理解されるべきである。

本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的な部分または基は、矛盾しない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態または実施例に対して適用可能であることが理解されるべきである。

本発明の一実施形態では、この方法は、ホストへの引き続くインプランテーションのためのドナー半月板組織を調製する工程を包含し、
（ｉ）該組織を凍結および融解する工程と、
（ｉｉ）該組織を低張液中でインキュベートする工程と、
（ｉｉｉ）陰イオン性界面活性剤を含む低張液中で該組織をインキュベートする工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返す工程と、
（ｖ）少なくとも１つのヌクレアーゼ酵素を含む溶液中で該組織をインキュベートする工程と、
（ｖ）酸化剤を用いて該組織を洗浄する工程と
を包含する。

本発明のこの実施形態では、緩衝溶液中で該組織を超音波処理する工程は省略される。本発明の方法は超音波の工程なしに首尾よく達成され得ることが発見されたが、半月板組織が一旦脱細胞化されれば、超音波の工程によって、インプランテーションの際に再細胞化の改善が可能になると考えられる。したがって、これは、本発明の任意の好ましい工程であるが、引き続く再細胞化を改善するために必要であり得る工程であり、したがってある場合には、本発明の方法の一部として行われる。

該半月板は、同種異系または異種のドナーの膝関節からの内側半月または外側半月の全体または一部を除去することによって入手できることが理解される。

好ましくは、好ましい半月板のレシピエントはヒトであり、別の場合には、該レシピエントは、該組織の損傷または変性の結果として半月板インプラントを要する任意の他の種であってもよい。

異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔまたはｘｅｎｏ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）は、ある種のドナーから別の種のレシピエントへの組織の移植である。異種移植（ｈｅｔｅｒｏｇｒａｆｔおよびｈｅｔｅｒｏ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）という用語も時々用いられるが、同種移植（ｈｏｍｏｇｒａｆｔまたはａｌｌｏｇｒａｆｔ）という用語は、同じ種の移植をいう。

本発明では、該レシピエントがヒトである場合、該ドナーは、好ましくはヒト、または厚みおよび強度などのほぼ釣り合いのとれた生理学的特性の半月板を有する任意の他の哺乳動物である。

好ましくは、該半月板ドナー組織はヒトまたはブタのいずれか由来である。

本明細書で先に言及された脱細胞化は、超音波の非存在下で達成され得るが、本発明の方法に含まれる場合、該超音波処理工程は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または任意の他の生理学的に受容可能な緩衝液中で行われる。

好ましくは超音波エネルギーはパルスされ、典型的な形態は１、２、３、４、５、６、７または８秒オンであって、０．５、１または２秒オフであるが、正確なパルスのタイミングは、本発明の範囲を限定するとは意図されないことが理解される。

好ましくは、該超音波のパワーは１００〜７００ワットであり、より好ましくは約４００ワットである。

該超音波処理工程は好ましくは１０〜４０分間、理想的には約２０分間行われ、好ましくは室温未満で行われる。理想的には超音波処理は約４℃で行われる。

該凍結／融解のプロセスは好ましくは、例えば、−１０〜−８０℃、典型的には−２０℃で、２〜２４時間該組織を凍結させる工程と、引き続いて該組織を室温に達するまで約２、３または４時間解凍する工程とを包含する。このプロセスは、少なくとも１回、好ましくは２回、低張性緩衝液の非存在下で行われ、該組織が低張性緩衝液に浸される場合は、再度少なくとも１回、好ましくは２回繰り返される。低張性緩衝液の有無における該凍結／融解は、逆にされてもよく、任意選択的に変更されてもよいことが理解される。低張液とは、電解質の濃度が細胞中の濃度よりも低い溶液である。この状況では、浸透圧によって、細胞壁の内側および外側の電解質濃度を同等にしようとして、細胞への水の移動がもたらされる。

好ましくは、低張性緩衝液はｐＨ約８．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液であり、約０．１％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡおよびアプロチニンを（約１０ＫＩＵ・ｍｌ^−１の濃度で）含む。

好ましくは、低張液での該インキュベートの工程は、温度が徐々に上昇する２段階の低張液での洗浄を含む。第一の段階は、約１２〜４８時間、典型的には約２４時間、室温未満だが凍結を上回る温度、例えば約４℃でのインキュベーションであり、第二段階のインキュベーションは、ほぼ同じ期間にわたり、室温を上回る温度、例えば約３７℃であって、第三段階（超音波処理が行われる実施形態では工程（ｉｖ）、省略される場合は工程（ｉｉｉ））を、陰イオン性界面活性剤をさらに含む低張液中で該組織をインキュベートすることによって行う。該陰イオン性界面活性剤でのこの第三の洗浄工程は、１〜３日、好ましくは約４８時間にわたる、該第二の洗浄を上回るが煮沸は下回る温度、例えば約５５℃でのインキュベーションを含む。

本明細書で先に記載されたインキュベーション工程において上記で特定されるインキュベーションの温度および期間は、本発明の方法について適切なプロトコールを例示するものであり、本発明の範囲を限定する意図ではない。

好ましくは、該陰イオン性界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。好ましくは、これは０．０３〜０．３％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度での該低張性洗浄用液中に存在し、さらに好ましくは約０．１５％（ｖ／ｖ）で存在する。

好ましくは、超音波処理が行われる場合には工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の３段階のインキュベーション工程を、超音波処理が省略される場合には工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を最低３サイクル繰り返す。

好ましくは、本発明の１実施形態では、超音波処理が行われる場合は工程（ｖ）の後に、陰イオン性界面活性剤を含む低張液又は含まない低張液での洗浄の工程の超音波処理が省略される場合、工程（ｉｖ）の後、この方法はさらに緩衝液中で組織の洗浄する工程を包含する。

好ましくは、該緩衝液はＰＢＳである。該洗浄プロセスは、４０〜６０℃の温度で、理想的には約５５℃で１、２または３時間の間の反復されるインキュベーションを含んでもよい。この工程は好ましくはさらに１、２または３回反復される。

好ましくは、この方法は、１つ以上のヌクレアーゼ酵素を含む溶液でのインキュベーション（超音波工程が使用される場合、工程（ｖ）または工程（ｖｉ））を包含する。

該ヌクレアーゼ酵素を用いて、石灰化の部位として機能することが示されている任意の残りの核物質を消化する。

典型的であるが非限定的なヌクレアーゼインキュベート溶液は５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、ウシ血清アルブミン（５０μｇ／ｍｌ）であって、ＲＮａｓｅ（１Ｕ・１ｍｌ^−１）およびＤＮａｓｅ（５０Ｕ・ｍｌ^−１）を含む。

組織は好ましくは、穏やかに攪拌しながら、ヌクレアーゼ溶液とともに典型的には約３７℃で、約２、３または４時間にわたってインキュベートされる。

ヌクレアーゼ溶液とのインキュベーション後、次いで該組織を好ましくはさらに約１２〜４８時間、典型的には２４時間、３０〜５０℃で、典型的には約３７℃で、高張液中でインキュベートする。

好ましくは該高張液は、Ｔｒｉｓ溶液（０．０５Ｍ）ｐＨ７．６に１．５ＭのＮａＣｌおよびＥＤＴＡ（０．１％ｗ／ｖ）を加えたものである。

好ましくは、該組織は次に、ＰＢＳおよびキレート剤を含む緩衝液中で１２〜２４時間洗浄される。

好ましくは、該キレート剤は、０．１％の濃度（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡである。

好ましくは、本発明の方法の最終工程の酸化剤は、過酢酸としても公知であって、通常はＰＡＡと略されるペルオキシ酢酸（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ_３）である。

好ましくは、ＰＡＡの濃度は０．０１〜０．５％（ｖ／ｖ）の範囲であって、さらに好ましくは約０．１％ＰＡＡ（ｖ／ｖ）である。

好ましくは、この方法はさらに、漸減する温度でＰＢＳ中での多段階のインキュベーション洗浄を包含する。この最終段階の洗浄のための典型的なプロトコールは、３５〜５０℃、理想的には４５℃での１２〜４８時間、典型的には２４時間のＰＢＳでの第一の洗浄、３０〜４０℃で、理想的には３７℃で同様の期間の間の第二のインキュベーション洗浄、および０〜１０℃および理想的には４℃での同様の期間の最終インキュベーション洗浄である。

好ましくは、該多段階のインキュベーション洗浄は、さらに１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回または８回反復される。

本発明の方法の説明全体にわたって、言及される期間、温度および濃度は、例としてのみ与えられ、本発明の範囲を限定すると意図されないことが理解される。

好ましくは、この方法はさらに、引き続く使用のための該調製された組織を保存する工程を包含する。

このような工程は例えば、凍結保存または低温保存によって示される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明の方法によって生成される移植生成物が提供される。

本発明のなおさらなる態様によれば、移植組織としての使用のための、本発明の方法によって入手可能な半月板組織が提供される。

本発明のなおさらなる態様によれば、移植組織としての、本発明の方法によって入手可能な半月板組織の使用が提供される。

好ましくは、本発明によって生成される生成物は、該半月板組織の該中央領域における細胞の非存在（１００％）または実質的な非存在（９０％）によって特徴付けられ得る。

本発明の方法は、線維軟骨細胞などの細胞を実質的に欠いている半月板組織を調製することができる手段を提供する。

好ましくは、本発明によって生成される生成物は、０〜２０ｎｇ／ｍｇの間のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）含量によって、さらに好ましくは０〜１０ｎｇ／ｍｇのｇＤＮＡ含量、さらに好ましくは０〜５ｎｇ／ｍｇのｇＤＮＡ含量によって特徴づけることができる。

したがって、本発明の生成物は、線維軟骨細胞などの細胞を実質的に欠き、ｇＤＮＡ含量があっても無視できるものであり、それ自体が引き続く移植のために最も適切な物質である。

本発明の方法および生成物は有利にも、脱細胞化の改良された方法のおかげでホストによる拒絶のリスクが最少である、該ホストと真に生体適合性である天然の半月板組織を提供すると考えられる。

本発明の方法は、半月板の外側および中央の領域ならびに特に微小血管の周囲の領域および中央に位置する該組織内の深部における、脱細胞化に対して問題となる領域から半月板組織を脱細胞化するために首尾よく使用されている。

本発明のなおさらなる態様によれば、本明細書において先に記載された該溶液を備え、任意選択的にその使用のための１セットの書面の説明書を備えるキットが提供される。

本発明のなおさらなる態様によれば、本発明の第一の態様の方法に従って脱細胞化されたドナー半月板組織を調製する工程と、該損傷または欠損のある半月板を該脱細胞化された半月板と置き換える工程とを含む、半月板移植を要する個体の処置の方法が提供される。

本発明はここで、以下の図面を参照して単なる例として記載される。

本発明の方法に従う工程手順による典型的な工程のフローダイヤグラムを示す。 種々のプロトコールを用いる脱細胞化後のブタ内側半月板のＤＮＡ含量および組織像を示す。図２Ａは新鮮な半月板を示し、図２Ｂは基礎的な脱細胞化手順後の半月板を示す。図２Ｃは、脱細胞化および超音波処理後の該半月板を示し、図２Ｄは、５５℃での脱細胞化および超音波処理後の半月板を示し、図２Ｅは、５５℃での脱細胞化、超音波処理および凍結融解の後の該半月板を示す。図２Ｆは、５５℃での脱細胞化（２回）、超音波処理および凍結融解の後の該半月板を示す。図２Ｇは５５℃での脱細胞化（３〜４回）、超音波処理、凍結融解およびＰＡＡ処理の後の該半月板を示す。 新鮮なブタの半月板由来のある範囲の組織像を示す。 本発明の方法に従う脱細胞化後の同等の領域由来の組織像を示す。 新鮮な半月板組織および脱細胞化した半月板組織の生化学的データを示す。 新鮮な半月板組織および脱細胞化した半月板組織におけるα−ゲルの免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。

［材料および方法］
［半月板組織の調製］
ブタの半月板は、動物の屠殺の２４時間内に地方の食肉処理場から入手した。その半月板は、膝の被膜を穏やかに切除することによって膝関節から切開し、その後に前十字靱帯および後十字靱帯の両方を切断して該半月板を露出した。次いで、半月板角付着に対して垂直に切開して、該半月板を解放した。次いで、該被膜および該半月板付着から余計な組織をハサミで取り除いた。次いで半月板を取り出して、ＰＢＳ（Ｏｘｏｉｄ）中で洗浄して、過剰な血液を除去した。次いでサンプルを、将来使用するためにＰＢＳで湿らせた濾紙上に−４０℃で保管した。

［組織／組織像調製物］
組織標本（ｎ＝３）を１０％（ｖ／ｖ）の中性の緩衝ホルマリン中に４８時間固定し、次いで脱水してパラフィンワックスに包埋した。６μｍの厚みの連続切片をとって１０切片中１つ用いた。標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）（Ｂｉｏｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．，Ｓｋｅｌｍｅｒｓｄａｌｅ，ＵＫ）染色を用いて、組織構造を評価した。核酸はＨｏｅｃｈｓｔ色素を用いて染色した（ビス−ベンズイミドＨ３３２５８五水和物、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、ユージーン、オレゴン州）。α−Ｇｅｌのモノクローナル抗体はＡｌｅｘｉｓ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、サンディエゴ、米国から入手した。

［超音波処理］
組織サンプル（２ｃｍ幅）を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｓｙｒｉｎｇｅｓ Ｌｔｄ．から購入した４−０プロレーン縫合（ｐｒｏｌｅｎｅ ｓｕｔｕｒｅｓ）を用いてアルミニウムガーゼに対して縫合した。これを、氷上で保持した氷冷ＰＢＳを充てんした２５０ｍｌのガラスビーカーの中に入れた。種々の超音波の形態（高強度超音波プロセッサー、６００ワット、モデル６０１、Ｐｒｏｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、メクスバラ、サウスヨークシャー州）を、あらゆる処理の後に変化されている該ＰＢＳを用いて直接プローブ下に該組織サンプルを置くことによって、該組織サンプルに適用した。完了の際、該組織を取り出して、残りの脱細胞化手順に供した。該パルス形態は、ＰＢＳを変更し、繰り返す前に１０分間、１秒オン、１秒オフであった。

［半月板の圧入（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）］
圧入装置を用いて、新鮮なブタ半月板および脱細胞化されたブタ半月板の負荷時の変形を分析した。リグは、シャフトから構成され、該シャフトは、該シャフトの移動をモニタリングするための線形可変差動変圧器（ＬＶＤＴ）に対して一端でおよび他方の端で接続された、取り外し可能な３ｍｍの円柱状の剛直な平坦な圧子を有する。重量を該ＬＶＤＴの下において、該シャフトの動きを手動の解放機構によって開始した。該ＬＶＤＴは、ステップの高さおよび得られた較正係数を用いて較正した。該ＬＶＤＴは、０．００１インチの解像度を有した。該シャフトの速度は、油入りダッシュポットによって制御した。６ｍｍの直径のカッターを用いてサンプル（ｎ＝３）を最初に切断して、円柱形状のプラグを取り出した。３ｍｍを測定した切片をもとのプラグの中心から取り出した。サンプルを、両面粘着テープ（３Ｍ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、英国）およびシアノアクリレート接着剤の液滴を用いてサンプルホルダーの基部に固定した。約２Ｎのロードを粘性のダッシュポットを通じて適用した。サンプルをＰＢＳに浸した。試験を１時間行った。該ＬＶＤＴによって、結果を電圧に対する時間のフォーマットで作成することが可能になった。データは、Ｌａｂ Ｖｉｅｗ８（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オースティン、米国）を用いて、較正係数を適用して得られ、結果を時間対変形（ｍｍ）に変換した。

［ヒドロキシプロリンアッセイ］
ヒドロキシプロリンアッセイを行う前に、サンプル（ｎ＝３）を一定重量まで凍結乾燥して、その後に６Ｍの塩酸（ＨＣＬ）を用いて４時間、１２０℃でのインキュベーションによって加水分解し、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて中和した。採用した手順は、ＥｄｗａｒｄｓおよびＯ’Ｂｒｉｅｎが記載した方法に基づいた［２９］。標準的な較正溶液を、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Ｓｉｇｍａ）を用いて作成した。試験溶液（５０μｌ）を平底９６のウェルプレートのウェルに添加して、ここに１００μｌの酸化溶液（クロラミンＴ水和物、Ｓｉｇｍａ）を添加し、穏やかに攪拌しながら５分間おいた。次いでＥｈｒｌｉｃｈ（エールリッヒ）試薬（１００μｌ）を各々のウェルに添加した。次いでそのプレートをカバーして、水浴中において６０℃で４５分間インキュベートし、その後に吸光度を５７０ｎｍで読んだ。次いで、ヒドロキシプロリンの濃度を、ヒドロキシプロリン標準曲線から補間によって決定した。

［硫酸化糖アッセイ］
硫酸化糖アッセイを行う前に、サンプル（ｎ＝３）を一定の重量まで凍結乾燥し、その後にパパイン緩衝液（ｐＨ６．０のＰＢＳ中の、１ｍｇ・ｍｌ^−１パパイン、Ｓｉｇｍａであり、５ｍＭのシステイン−ＨＣｌ、Ｓｉｇｍａ、および５ｍＭのＮａ_２ＥＤＴＡ、ＶＷＲを含む）中において６０℃で４８時間、組織を酵素消化した。その方法はＦａｒｎｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．から採用した［３０］。要するに、標準の較正溶液は、硫酸コンドロイチン（Ｓｉｇｍａ）から作成した。標準または試験溶液（４０μｌ）を２５０μｌの１，９−ジメチレンブルー溶液に、平底の９６ウェルプレートのウェル中に添加した。次いでその吸光度を１分後に５２５ｎｍで読んだ。次いで、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に相当する硫酸化糖の得られた濃度を、該標準曲線からの補間によって決定した。

［ｇＤＮＡ存在の抽出および分析］
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、組織のためのＤＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、インディアナポリス、米国）を用いて抽出した。要するに、２００ｍｇの新鮮なブタ半月板組織および脱細胞化ブタ半月板組織を、プロテイナーゼＫ溶液を用いて消化した（ｎ＝３）。この後、ＲＮａｓｅ溶液を加えて、サンプル中に存在するＲＮＡを消化した。次いでタンパク質沈殿溶液を添加して、該サンプルを遠心分離した（１５，０００ｇ、２０分、２０℃）。次いで、イソプロパノール（０．７容積、ＶＷＲ）をペレットに添加して、存在するＤＮＡを回収した。次いで、該単離されたＤＮＡペレットを氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄して、風乾させ、その後にｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中で再懸濁した。

定量的には、ｇＤＮＡの存在をＥ−ｇａｌ ＰｏｗｅｒＢａｓｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリー、英国）を用いて分析した。乾燥２％（ｗ／ｖ）アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をサンプルの添加の前に基部に挿入した。再懸濁したサンプル（４μｌ）を、ローディング緩衝液（２μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって調製して、サンプルのローディングを容易にさせた。次いで、総容積をＥ−ゲルの個々のレーンにロードし、次いで電気泳動した。１ｋｂのＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．、Ｓｈｅｒｉｆｆ Ｈｕｔｔｏｎ、英国）を並行して泳動し、単離されたＤＮＡのサイズを評価した。臭化エチジウムでの染色によって、Ｋｏｄａｋ Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ １５００システム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、ハロー、英国）での視覚による検査を可能にさせた。ＤＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計で２６０〜２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した（Ｌａｂｔｅｃｈ Ｉｎｔ．、Ｒｉｎｇｍｅｒ、英国）。

図１を参照すると、本発明の方法の１実施形態の典型的なフローチャートが示されている。図１のプロトコールに関しては、超音波および凍結／融解の順序を逆にしてもよいが、本明細書において以下に示されるとおり、超音波処理、凍結／融解およびＰＡＡでの処理の工程は、半月板組織の完全な脱細胞化を果たすのに必須である。

図２Ａ〜Ｇを参照すると、半月板の模式図が、半月板の全体的な断面形状を近似するため直角三角形として示され、細胞密度の指標である細胞のＤＮＡ含量を示すＨｏｅｃｈｓｔ染色が示されている。さらに、組織像のスライドが右側に提供される。図２Ａ−Ｇは、種々のプロトコールを用いる脱細胞化後のブタの内側半月のＤＮＡ含量および組織像を示す。

図２Ａは、新鮮なブタの内側半月、および該組織全体にわたる細胞の存在を示し、ここで半月板の外側から内側の領域への細胞のＤＮＡ含量または細胞密度の均一な分布がある。

図２Ｂのブタの内側半月の脱細胞化について、従ったプロトコールは、Ｂｏｏｔｈ，Ｃ ｅｔ ａｌ．「Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｖａｌｖｅ ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ Ｉ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｈｉｓｔｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ」、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ １１、ｐｐ．４５７〜４６２（２００２）に記載される。このプロセスは、超音波処理も凍結／融解も含まないが、室温でのＳＤＳインキュベーション工程を使用する。この手順に従ったＤＮＡ含量についての結果によって、細胞が半月板末梢領域のみから除去されていること、および細胞が内側の領域には依然として存在することが示される。図２Ｃで使用されるプロトコールは、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．に記載のプロトコールに超音波工程がさらに加わる。その結果、末梢の細胞は、該内側領域からある程度は一緒に除去されているが、細胞はほとんどの半月板全体に依然として残っていることが示される。図２Ｃのプロトコールと同じプロトコールに従うが、脱細胞化陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を上昇した温度（５５℃）で用いた結果（図２Ｄ）によって、細胞は半月板のかなりの割合から完全に除去されているが、密度が減っても半月板の中央には依然として存在していることが示される。図２Ｅで従ったプロトコールに関して、これは、５５℃での脱細胞化、超音波処理および凍結／融解の後の半月板を示している。この結果によって、細胞は、中央領域全体において低密度で見いだされ、微小血管の周囲に位置する細胞数が多いことが示される。図２Ｆについて、５５℃での脱細胞化（２回）、超音波処理および凍結／融解に従ったプロトコールでは、極めて少数の細胞しか残っておらずその細胞が溶解され、該半月板の該中央内にランダムに位置する限りにおいて、結果はさらによい。図１の５５℃での脱細胞化（３回）、超音波処理、凍結／融解およびＰＡＡ処理で示された本発明の方法を使用する図２Ｇの結果を参照すれば、細胞の完全な除去が見られる。Ｈｏｅｓｃｈｔ染色によって、完全な細胞除去に起因するＤＮＡの完全な欠失が示される。

種々の脱細胞化プロトコールから得られた結果は、試験された不完全なプロトコールのいずれを用いても、他の先行技術の方法を用いても不可能である、完全な脱細胞化が、本発明の方法を用いて達成され得るということを示す。

図３Ａを参照すると、新鮮なブタ内側半月板内の細胞分布が示されている。半月板の断面積は直角三角形を近似し（図２Ａ〜２Ｇを参照のこと）、脱細胞化に対する問題の領域が該半月板の外側および中央の領域、特に中央に位置する組織内の微小血管深部の周囲を含むことが示される。実施例２Ａ〜２Ｅに示されるとおり、本発明に従う不完全な方法を用いて脱細胞化され得る領域は、上方および下方の末梢の半月板および内部半月板であった。図３Ｂを参照すると、本発明の方法によって脱細胞化されたブタ内側半月と同等の部分が示され、ここでは問題のある外側および中央の領域を含む半月板は完全に細胞を欠き、言い換えれば、半月板は完全に脱細胞化されて、ホストへの移植に適切な組織が得られる。

図４は、本発明の方法に従って脱細胞化されている新鮮な半月板および脱細胞化半月板の両方について時間に対する変形のグラフを示す。このデータは、圧入を用いる生体力学試験の図を提供する。この結果、脱細胞化された半月板が新鮮な組織に比較して同様の圧縮の生体力学特性を有し、したがって釣り合いのとれた物理的特性を有し、かつホストへの移植に適切であることが示される。

異種のＧａｌα１−３ Ｇａｌβ１−４ ＧｌｃＮａｃ−Ｒすなわちα−Ｇａｌエピトープは、異種移植において超急性の拒絶反応を担うことが公知である。組織工学（再生医療）では、残存α−Ｇａｌエピトープはヒトで重度の炎症を誘発し得、移植片の不全をもたらし得る。図５Ａは、新鮮なブタ内側半月板におけるモノクローナルの抗αＧａｌ抗体を用いるα−Ｇａｌエピトープの存在についての陽性の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。本発明の方法に従って脱細胞化された半月板と比較した場合、図５Ｂは、陰性染色によるエピトープの非存在を示す。これらの結果は、本発明の方法によって調製された該半月板がα−Ｇａｌエピトープ欠損であり、したがって、ヒトのホストへの移植に適切であることを示す。

新鮮ブタ半月板組織の乾燥重量１ｍｇあたりのヒドロキシプロリンの濃度は１４３．３（±２３．２９）μｇ・ｍｇ^−１であった。脱細胞化の後、ヒドロキシプロリンの濃度は１２３．９６（±３６．３）μｇ・ｍｇ^−１であることが見出された。脱細胞化組織に比較して新鮮な組織のヒドロキシプロリン含量には有意差はなかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．０５）。

新鮮なブタ半月板組織の乾燥重量１ｍｇあたりの硫酸化糖の濃度は３０．３（±３．９）μｇ・ｍｇ^−１であった。脱細胞化後、硫酸化糖の濃度は１２．３（±１．６）μｇ・ｍｇ^−１であることが見出され、このことは５９．４％の損失を示している。脱細胞化組織に比較した場合、新鮮組織の硫酸化糖含量には有意差があり（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）、このことはＧＡＧの損失を示している。

脱細胞化半月板組織サンプルを処理して、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し、ロードして、アガロースゲル上で電気泳動し、新鮮な半月板組織（ほぼ１０，０００塩基対の明確なバンドを示した）と比較してｇＤＮＡがないことを確認した（図示しない）。結果を、分光光度計を用いて定量的に確認し、ここで２６０〜２８０ｎｍの間の吸光度のピークが、新鮮な組織サンプルについてみられ、このことはｇＤＮＡの存在を示している。このピークは４０（±９．７）ｎｇ・ｍｇ^−１に相当した。２（±０．５）ｎｇ・ｍｇ^−１に対応する脱細胞化組織について小さいピークも記録された。

結論として、本発明の方法は、完全に脱細胞化されかつ免疫学的に不活性なブタまたはヒトのドナー半月板組織であって、その物理的特性を保持している半月板組織を提供することが可能であることを示す。このような半月板は、ホストへの引き続く移植に用いられ得、これによって健常な半月板のものと同じ強度および機能的能力を提供しながら、移植拒絶の確率を回避または最小化する。

Claims (57)

1. ホストへの引き続くインプランテーションのためのドナー半月板組織を調製する方法であって、
   （ｉ）前記組織を凍結および融解する工程と、
   （ｉｉ）前記組織を低張液中でインキュベートする工程と、
   （ｉｉｉ）陰イオン性界面活性剤を含む低張液中で前記組織をインキュベートする工程と、
   （ｉｖ）工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返す工程と、
   （ｖ）少なくとも１つのヌクレアーゼ酵素を含む溶液中で前記組織をインキュベートする工程と、
   （ｖｉ）酸化剤を用いて前記組織を洗浄する工程と
   を含む方法。
2. 緩衝溶液中で前記組織を超音波処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記半月板が同種異系ドナーまたは異種ドナーの膝関節由来の内側半月または外側半月の全体または一部を除去することによって得られる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
4. 前記調製された半月板のホストまたはレシピエントがヒトである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記ドナー組織がヒト由来またはブタ由来である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記凍結および融解する工程が−１０〜−８０℃の間で組織を凍結する工程を包含する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記組織が−２０℃で凍結される、請求項６に記載の方法。
8. 前記凍結する工程が２〜２４時間にわたり、前記引き続く融解する工程が前記組織が解凍されるまで２、３または４時間にわたる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記凍結および融解する工程が、低張緩衝液の非存在下で少なくとも１回以上行われ、前記組織が低張緩衝液中に浸されるとき１回以上繰り返される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記低張緩衝液がｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓ溶液であり、ＥＤＴＡおよびアプロチニンを含む、請求項９に記載の方法。
11. 工程（ｉｉ）の低張液でインキュベートする工程が、徐々に上昇する温度での２段階の低張液での洗浄を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 第１段階のインキュベーションが、室温より低いが凍結の温度を上回る温度で１２〜４８時間にわたる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第１段階のインキュベーション期間が４℃の温度で２４時間である、請求項１２に記載の方法。
14. 第２段階のインキュベーションが室温を上回る温度で１２〜４８時間にわたる、請求項１１に記載の方法。
15. 前記第２段階のインキュベーションが３７℃で２４時間にわたる、請求項１４に記載の方法。
16. 陰イオン性界面活性剤をさらに含む低張溶液中で前記組織をインキュベートする工程を包含する第３段階のインキュベーション工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
17. 前記陰イオン性界面活性剤での第３段階のインキュベーション工程が、１〜３日にわたり、前記インキュベーション温度が前記第２段階のインキュベーション工程の温度を上回る、請求項１６に記載の方法。
18. 前記インキュベーション期間が５５℃の温度で４８時間である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記ＳＤＳの濃度が０．０３〜０．３％（ｖ／ｖ）の範囲である、請求項１９に記載の方法。
21. ＳＤＳの前記濃度が０．１５％（ｖ／ｖ）である請求項２０に記載の方法。
22. 前記インキュベーション工程が少なくとも３サイクル繰り返される、請求項１１〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記インキュベーション工程の後にキレート剤を含む緩衝液中で前記組織を洗浄する工程をさらに含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記緩衝液がＰＢＳであり、前記キレート剤がＥＤＴＡである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記組織の前記洗浄する工程が、４０〜６０℃の温度で１、２または３時間の間の反復インキュベーションを含む、請求項２３または２４のいずれかに記載の方法。
26. １つ以上のヌクレアーゼ酵素を含む溶液で前記組織をインキュベートする工程が前記反復インキュベーション工程の後に続いている、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
27. ヌクレアーゼを含む前記溶液が、５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（Ｐｈ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、ウシ血清アルブミン（５０μｇ／ｍｌ）であって、ＲＮａｓｅ（１Ｕ・１ｍｌ^−１）およびＤＮａｓｅ（５０Ｕ・１ｍｌ^−１）を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記組織が７℃の間の温度で２、３、または４時間、ヌクレアーゼを含む溶液でインキュベートされる、請求項２６または２７のいずれかに記載の方法。
29. ヌクレアーゼを含む溶液でのインキュベーションの後に、３０〜５０℃の温度で１２〜４８時間、ＥＤＴＡを含む高張液中で前記組織をインキュベートする工程をさらに含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
30. 前記組織が、ヌクレアーゼを含む溶液中でのインキュベーションと、高張液中での引き続くインキュベーションの後に、１２〜２４時間、ＰＢＳおよびＥＤＴＡを含む緩衝液中で洗浄される、請求項１〜２９のいずれに記載の方法。
31. 酸化剤を用いて前記組織を洗浄する工程における前記酸化剤がペルオキシ酢酸（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ_３）または過酢酸（ＰＡＡ）である、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
32. 前記ＰＡＡの濃度が０．０１〜０．５％（ｖ／ｖ）の範囲である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ＰＡＡの濃度が０．１％（ｖ／ｖ）である、請求項３２に記載の方法。
34. 酸化剤の存在下における前記組織の洗浄する工程の後に、漸減する温度でのＰＢＳ中の多段階インキュベーション洗浄の工程をさらに包含する、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
35. 第１の洗浄が、３５〜５０℃で、１２〜４８時間、ＰＢＳを用いるものであり、第２のインキュベーション洗浄がそれより低温で１２〜４８時間であり、最終のインキュベーション洗浄が０〜１０℃で１２〜４８時間である、請求項３５に記載の方法。
36. 前記多段階インキュベーション洗浄が、さらに１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回または８回反復される、請求項３４または３５に記載の方法。
37. 引き続く使用のために前記調製された組織を保存する工程をさらに包む、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
38. 前記保存する工程が凍結保存または低温凍結のいずれかである、請求項３７に記載の方法。
39. 超音波処理工程が工程（ｉ）の前、または工程（ｉ）の後に行われる、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
40. 前記超音波処理工程が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または任意の他の生理学的に許容可能な緩衝液中に浸した場合、前記組織について行われる、請求項３９に記載の方法。
41. 超音波エネルギーがパルスされる、請求項３９または４０に記載の方法。
42. 前記パルス形態が１、２、３、４、５、６、７または８秒オンであり、０．５、１または２秒オフである、請求項４１に記載の方法。
43. 前記超音波のパワーが１００〜７００ワットである、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
44. 前記超音波のパワーが４００ワットである、請求項４３に記載の方法。
45. 前記超音波処理工程が、室温未満で１０〜４０分間行われる、請求項３９〜４４のいずれかに記載の方法。
46. 前記超音波処理工程が約４℃で２０分間行われる、請求項４５に記載の方法。
47. ホストへの引き続くインプランテーションのためのドナー半月板組織を調製する方法であって、
    （ｉ）緩衝溶液中で前記組織を超音波処理する工程と、
    （ｉｉ）前記組織を凍結および融解する工程と、
    （ｉｉｉ）低張液中で前記組織をインキュベートする工程と、
    （ｉｖ）陰イオン性界面活性剤を含む低張液中で前記組織をインキュベートする工程と、
    （ｖ）工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を繰り返す工程と、
    （ｖｉ）少なくとも１つのヌクレアーゼ酵素を含む溶液中で前記組織をインキュベートする工程と、
    （ｖｉｉ）前記組織を酸化剤で洗浄する工程と
    を含む、方法。
48. 請求項２〜４６のいずれかに記載の任意の１つ以上の特徴をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
49. 請求項１〜４８のいずれかに記載の方法によって生成される半月板移植生成物。
50. 移植組織としての使用のための請求項１〜４８のいずれかに記載の方法によって得られる半月板組織を含む生成物。
51. 請求項１〜４８のいずれかに記載の方法によって得られる半月板組織の移植組織の使用。
52. 半月板組織の中央領域における細胞の非存在（１００％）または実質的な非存在（９０％）によって特徴付けられる請求項４９〜５１のいずれかに記載の半月板生成物。
53. ０〜２０ｎｇ／ｍｇの間のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）含量によって特徴付けられる請求項４９〜５１のいずれかに記載の半月板生成物。
54. ｇＤＮＡ含量が０〜１０ｎｇ／ｍｇである請求項５３に記載の半月板生成物。
55. 前記ｇＤＮＡ含量が０〜５ｍｇ／ｍｇの間である、請求項５３に記載の半月板生成物。
56. 本明細書に記載された溶液を備え、その使用のための１セットの書面の説明書を任意選択的に備えるキット。
57. 請求項１〜４９のいずれかに記載の脱細胞化されたドナー半月板組織を調製する工程と、損傷または欠損のある半月板を前記脱細胞化された半月板と置き換える工程とを包含する、半月板移植を要する個体の処置の方法。

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