CN103751842A - 衍生自前胃胞外基质的组织支架 - Google Patents

Abstract

本发明涉及开发源自反刍动物前胃的胞外基质(ECM)支架。此类基质可用于许多临床和治疗应用，包括伤口修复、组织再生和乳房重建。此外本发明的特征还在于从哺乳动物器官，包括但不限于反刍动物前胃分离ECM支架的方法。该方法包括在组织两侧产生透壁渗透流。本发明的特征还在于在各个ECM薄片之间设置含有聚合物的层叠ECM支架。该聚合物可任选含有生物活性分子以增强该支架的功能。

Description

衍生自前胃胞外基质的组织支架

本发明专利申请是国际申请号为PCT/NZ2009/000152，国际申请日为2009年7月30日，进入中国国家阶段的申请号为200980130752.7，名称为“衍生自前胃胞外基质的组织支架”的发明专利申请的分案申请。 

相关申请

本申请要求2008年7月30日提交的美国临时申请号61/137,367和2009年4月24日提交的美国临时申请号61/172,671的优先权。以上申请的全部内容通过引用纳入本文。 

发明背景

胞外基质(ECM)在为组织生长和再生提供最佳化学和结构环境中起重要作用。传统上从去细胞化(decellularised)的人和动物真皮制备用于组织再生的ECM支架，而所述真皮从各种器官、各种动物粘膜下层和基底膜来源分离。这些支架促进组织再生，并且在免疫学上良好耐受。普通粘膜下层的组织移植组合物源自小肠、膀胱和简单的腺胃(参见，例如U.S.4,902,508、U.S.5,554,389和U.S.6,099,567，其全部内容通过引用纳入本文)。 

虽然ECM支架的制备和应用中已取得进展，但尚未鉴定到理想的支架组合物。理想的支架是非过敏性、非致癌性、连续应激下在机械上稳定、多孔性足以毛细管化(capillarisation)、能促进和引导合适的细胞和血管内生长、与宿主组织有相似顺应性、耐感染、不形成血栓、廉价并能变成原组织的完全功能类似物。具有这些特性的ECM支架可用于各种临床应用，包括伤口修复和软组织再生。 

发明概述

本发明提供源自反刍动物前胃的胞外基质(ECM)支架，在本文也称为“前 胃基质”(FM)支架。本发明的FM支架提供优于现有组织支架的许多优点，可用于各种临床和治疗领域，包括伤口修复和组织再生。此外，本发明提供从哺乳动物器官，包括但不限于反刍动物前胃产生ECM支架的改进方法。在具体的实施方式中，本发明FM支架可源自属于山羊属(Capra)、牛属(Bos)、鹿属(Cervus)或绵羊属(Ovis)的反刍动物，例如山羊(Capra aegagrus hircus)、牛(Bos taurus)或绵羊(Ovis aries)。 

因此，在第一方面，本发明的特征在于包含反刍动物前胃的固有-粘膜下层(propria-submucosa)的ECM的组织支架(FM支架)。在具体的实施方式中，所述固有-粘膜下层来自前胃的瘤胃、网胃或重瓣胃。这些组织支架通常具有浮雕状内腔表面(contoured luminal surface)。本发明的ECM组织支架还可含有去细胞化的组织，包括上皮组织、基底膜或肌层和它们的组合。组织支架还可包含一种或多种纤丝蛋白，包括但不限于胶原I、胶原III或弹性蛋白和它们的组合。在其它实施方式中，组织支架可包含一种或多种生长因子，包括但不限于：FGF-2、TGFb1、TGFb2或VEGF和它们的组合。在还有其它实施方式中，所述组织支架可包含一种或多种糖胺聚糖，包括但不限于：透明质酸和硫酸乙酰肝素及它们的组合。在另一实施方式中，所述组织支架可包含一种或多种粘连蛋白，包括但不限于胶原IV或层粘连蛋白和它们的组合。 

可将本发明FM支架制成各种形式，例如单一薄片或包含多层FM的层叠薄片。在某些实施方式中，所述FM支架包含2-15个层叠薄片。可通过缝线或缝合线将此类层叠薄片结合在一起。或者，可通过一个或多个薄片之间的聚合物将层叠薄片结合在一起。在一个实施方式中，通过缝线或缝合线连接各层叠薄片，并且在一个或多个薄片之间还含有聚合物。在另一实施方式中，层叠组织支架包含设置在各层叠薄片之间的聚合物。聚合物可以散布在薄片之间，或者可以聚合物层的形式均匀分散。本发明FM支架中可利用任何合适的聚合物，包括但不限于：胶原、壳聚糖、藻酸盐、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和它们的组合。 

在具体实施方式中，聚合物还包含生物活性分子，例如小分子或肽。生物活性分子可以非共价掺入聚合物，例如，作为混悬液、包封成颗粒、微粒或胶体，或作为它们的组合物。也可采用连接生物活性分子与聚合物 的任何合适的化学方法将生物活性分子共价掺入聚合物。生物活性分子可以是任何治疗所需的分子，例如生长因子、抗微生物剂、镇痛剂、止血剂、促血管生成剂或抗血管生成剂。在示范性实施方式中，聚合物包含FGF2、NGF、多西环素、阿莫西林和聚-L-赖氨酸中的一种或多种。 

在另一具体实施方式中，FM支架的宽度为至少10cm。例如，所述支架的宽度为至少10cm，长度为至少10cm。因此，某些FM支架可具有100cm²以上，例如400cm²的表面积。在一个实施方式中，FM支架的单一或层叠薄片是穿孔的。在另一实施方式中，FM经流化或微粉化。 

本发明FM支架的双轴强度通常高于其它胃肠或泌尿生殖来源的支架。因此，在具体的实施方式中，FM支架的平均双轴强度为至少80N或更高。 

本发明的组织支架可用于多种领域，包括但不限于：覆盖组织缺陷(tissue deficit)或加强软组织。在具体的实施方式中，所述组织缺陷或软组织的宽度为至少10cm。在另一实施方式中，所述组织缺陷或软组织的宽度为至少10cm，长度为至少10cm。在还有另一实施方式中，所述组织缺陷或软组织的表面积为至少100cm²。 

因此，一方面，本发明的特征在于诱导受损组织修复的方法，包括使该受损组织接触本发明FM支架，例如，包含反刍动物固有-粘膜下层的ECM的支架。本发明的特征还在于刺激软组织再生的方法，包括使该软组织接触本发明FM支架。 

当FM支架与组织接触时，该FM支架能增加位于该支架附近的细胞增殖。此外，FM支架可促进其所粘附的组织内的血管化。因此，在另一方面，本发明提供刺激组织中细胞增殖的方法，包括使该组织接触FM支架，从而刺激细胞增殖。本发明还提供诱导组织的血管化的方法，包括使该组织接触FM支架，从而在该组织内发生血管化。 

一方面，本发明的特征在于支持患者的乳房组织的可植入组织支架器件，其中所述器件包含反刍动物前胃的固有-粘膜下层的胞外基质。所述乳房组织可包含乳房假体，即乳房植入物。可将所述组织支架器件制成包含两层或多层胞外基质的层叠薄片。在具体的实施方式中，层叠薄片包含2-15层胞外基质。 

所述组织支架器件可以是平的，或者其可具有一定凹度。在一个实施方式中，可通过缝线或缝合线将所述器件的各层胞外基质固定在一起。所述胞外基质可以穿孔或不穿孔。在一些实施方式中，所述器件具有月牙形形状。在其它实施方式中，所述器件具有椭圆形状。 

在另一方面，本发明提供支持患者的乳房组织的方法，包括将前述组织支架器件安置在该患者中相对于乳房组织的支持位置。在一个实施方式中，所述乳房组织包含乳房假体。在另一实施方式中，所述乳房组织包含天然组织。在具体的实施方式中，安置组织支架包括覆盖乳房组织的下部和侧部。 

在另一方面，本发明提供通过安置在各薄片间的聚合物层叠的包含两个或更多个胞外基质薄片的组织支架。所述支架可包含选自下组的组织的粘膜下层的胞外基质：小肠、胃、膀胱、心包和真皮。在具体的实施方式中，所述胞外基质包含胶原。所述聚合物可包含胶原、壳聚糖、藻酸盐、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和它们的组合。 

在以上方面的具体实施方式中，所述聚合物还包含生物活性分子。所述生物活性分子可以非共价或共价连接于聚合物。在一个实施方式中，所述生物活性分子可以是小分子或肽，例如生长因子、抗微生物剂、镇痛剂、止血剂、促血管生成剂、抗血管生成剂或它们的组合。示范性生物活性分子包括FGF2、NGF、多西环素、聚-L-赖氨酸和它们的组合。 

在还有另一方面，本发明提供了通过将组织整体或其一部分内的诸层分离和/或去细胞化而产生ECM组织支架的方法。所述方法包括在所述组织的两侧产生透壁渗透流，从而将组织整体或其一部分内的诸层分离和/或去细胞化。可将透壁渗透流从组织整体或其一部分的内腔引向外腔侧(abluminal side)。这可通过，例如将组织在高渗和低渗溶液之间分开而实现，从而将透壁渗透流从低渗溶液引向高渗溶液。该方法还包括除去组织层的整体或其一部分，所述组织层包括上皮组织、基底膜或肌层和它们的组合。 

在具体的实施方式中，本发明方法包括将第一溶液包封在器官或组织(或其一部分)内，并将该器官或组织(或其一部分)浸入相对于第一溶液高渗的第二溶液内。该方法还包括从第二溶液中取出该器官或组织，并将该器 官或组织或其一部分浸入相对于第一溶液也是高渗的第三溶液中，以便例如使该组织进一步去细胞化。 

在备选实施方式中，所述方法包括将第一溶液包封在器官或组织(或其一部分)内，并将该器官或组织(或其一部分)浸入相对于第一溶液低渗的第二溶液内，任选随后将该器官或组织或其一部分浸入相对于第一溶液也是低渗的第三溶液中。 

高渗和低渗溶液可包含，例如水和任选的至少一种缓冲液、洗涤剂或盐。高渗溶液含有的溶质浓度可高于低渗溶液。在具体的实施方式中，高渗溶液包含4M NaCl，低渗溶液包含0.028%Triton X-200和0.1%EDTA。在另一具体实施方式中，低渗溶液包含0.1%SDS。在还有另一实施方式中，低渗溶液包含0.028%Triton X-200、0.1%EDTA和0.1%SDS。 

可在低温，例如4℃或更低(例如，约2℃-约4℃)实施本发明方法。还可在室温下或接近室温(例如，约18℃-约24℃)实施本发明方法。所述方法使组织层分离和去细胞化的时间还可能短于采用其它方法的时间。在具体实施方式中，在36个小时或更短、更优选在24个小时或更短时间内使组织层分离和去细胞化。在其它实施方式中，在6小时或更短时间内(例如，5小时或更短、4小时或更短或3小时或更短)使组织层分离和去细胞化。 

本发明方法可用于任何合适的组织来源或器官。在具体的实施方式中，组织包含角化复层鳞状上皮。在其它具体的实施方式中，组织源自反刍动物，例如山羊属(Capra)、牛属(Bos)、鹿属(Cervus)或绵羊属(Ovis)动物的前胃。在还有其它实施方式中，组织源自前胃的瘤胃、网胃或重瓣胃。此类组织可任选膨胀以增加穿过组织层的透壁渗透流，从而进一步促进分离和去细胞化。 

附图简述

图1是(A)前胃壁和(B)腺胃壁的示意性剖面图，均处于未处理状态和STOF处理后。 

图2显示用于乳房增大、重塑或乳房固定术的FM支架的两个示范性形状。(A)描述了月牙形支架。(B)描述椭圆形支架。 

图3显示通过产生穿过器官的透壁渗透流来处理该器官的一个实施方 式。 

图4描述了采用STOF处理组织以产生含断裂基底膜的去细胞化FM支架的示范性实施方式。 

图5显示STOF处理前后组织的总核酸含量。 

图6显示前胃组织的表面积与STOF处理后前胃总容积之间的线性关系。 

图7显示透壁渗透流造成的组织重量改变。随着组织水合增加，流体穿过并进入组织造成重量增加。 

图8显示STOF处理完成时STOF溶液中层粘连蛋白的蛋白质印迹分析检测。在图8中，泳道1表示Magic标记（InvitrogenTM）；泳道2表示STOF方法完成后从前胃外侧取得的0.028％Triton X-200溶液的样品；泳道3表示STOF方法完成后从前胃内侧取得的4M NaCl溶液的样品；泳道4表示STOF方法完成后从前胃外侧取得的0.028％Triton X-200+0.1％EDTA溶液的样品；泳道5表示STOF方法完成后从前胃外侧取得的0.1％SDS溶液的样品；泳道6表示层粘连蛋白标准品。 

图9显示球爆检验(Ball Burst test)的结果，显示了FM的相对强度。 

图10图示了多叠层绵羊FM产品的球爆强度。采用球爆检验测定单一或多叠层绵羊FM产品的双轴强度，该检验按照ASTM D3797-89“编织物破裂强度的标准检验方法：恒速穿越(CRT)球爆检验(Standard Test Method for Bursting Strength of Knitted Goods,Constant-Rate-of-Traverse(CRT)Ball-burst Test)”，利用装有球爆压缩箱(ball-burst compression cage)的Instron5800系列机电检测器，从而将25.4mm不锈钢球以305+/-13毫米/分钟的进料速度推向测试材料，直至衰坏。利用1kN测压仪记录衰坏时的最大压缩负载(N)。误差棒代表至少5份样品的标准误差。 

图11比较了4-叠层绵羊FM与市售可得移植物产品的标准化最大压缩负载。误差棒代表至少5份样品，或公布数据的标准误差。 

图12代表单轴检验的结果，显示了FM的相对强度。 

图13比较了绵羊FM单一和多叠层产物的强度。(A)衰坏时的最大负载(N)；(B)最大切线刚度(N/mm)；(C)最大伸长(mm)；(D)弹性模量(杨氏)(GPa)；(E)屈服应力(MPa)；和(F)厚度。利用Instron5800系列机电检测器测定衰坏时单一和多叠层产物的最大负载。将各种材料切割成0.6cm宽的狗-骨形样品。夹住样品，量器长度为7.5cm，以25.4毫米/分钟的速度伸长直至衰坏。利用500N测压仪记录负载(N)。从负载(N)与伸长(mm)曲线的斜率计算刚度。利用从产物厚度计算的截面积将负载与伸长曲线转 化为应力(N/m²)与应变曲线。后一曲线的斜率用于计算弹性模量或杨氏模量(GPa)。误差棒代表至少5份样品的标准误差。 

图14比较了1-和2-叠层绵羊FM产物与市售可得硬脑膜修复产品的屈服应力。误差代表至少5份样品，或公布数据的标准误差。 

图15比较了多叠层绵羊FM产物的缝合保留强度(suture retention strength)。按照ANSI/AAMI VP20–1994牛顿检测心血管植入物血管假体的指南(Guidelines for Cardiovascular Implants Vascular Prostheses Measured in Newton’s)来检验多叠层绵羊FM产物的缝合保留强度。利用2mm咬合深度(bite-depth)的缝线在4cm x2.5cm样品中进行缝合。利用装有100N测压仪的Instron5800系列机电检测器记录衰坏时的负载，采用的前进速度是100毫米/分钟。将衰坏时的负载定义为观察到的负载有90%降低。样品的自由端维持在25mm虎钳夹口中，而缝线通过不锈钩连接于相对的夹钳。误差棒代表至少6份样品的标准误差。 

图16比较了绵羊FM产物和硬脑膜修复产品的标准化缝合保留强度。误差代表至少5份独立样品，或公布数据的标准误差。 

图17比较了4-叠层绵羊FM产物和市售可得植入物基质的标准化缝合保留强度。误差代表至少5份样品，或公布数据的标准误差。Surgisis^TM未有误差报道。采用10mm的咬合深度检验Alloderm^TM和Strattice^TM，采用2mm的咬合深度检验4-叠层绵羊FM和Surgisis^TM。 

图18显示在猪伤口愈合研究中，在猪背上作出的全厚度切口的示例性布局。 

图19显示伤口愈合研究期间，组织活检中ECM支架的持久性。 

图20图示了伤口愈合期间对细胞增殖的定量测定。用绵羊FM(1-叠层、2-叠层)、SIS处理受伤的组织，或不作处理，采用IHC和数字方法计算从再生真皮层获得的3个40x框中的Ki67-阳性细胞总数。^**P<0.01采用单向ANOVA，相对于未处理对照的显著性。 

图21图示了定量测定用绵羊FM(1-叠层和2-叠层)、SIS处理的受伤组织，或不作处理的受伤组织中的血管。(A)描述了对各组织活检分析的每框中计算的平均血管总数。误差棒代表了在所示时间点对各处理组作分析 的20次活检的标准误差。**P<0.01和*P<0.05采用单向ANOVA，相对于未处理对照的显著性。(B)描述了在所示时间点，血管(小的、中等的和大的)数与各次处理观察到的血管总数的比例。(C)描述了每框中计算的小血管(300–500μm²)的平均数。取所研究的5只动物分析的所有框的平均数。误差棒代表了在所示时间点各处理组的20个分析框的标准误差。(D)描述了每框中计算的中等血管(500–1500μm²)的平均数。取所研究的5只动物分析的所有框的平均数。误差棒代表了在所示时间点各处理组的20个分析框的标准误差。(E)描述了每框中计算的大血管(>1500μm²)的平均数。取所研究的5只动物分析的所有框的平均数。误差棒代表了在所示时间点各处理组的20个分析框的标准误差。 

发明详述

本发明涉及开发源自反刍动物前胃的固有-粘膜下层的胞外基质(ECM)支架(FM支架)，本文称为“前胃基质”(FM)。FM支架的特征不同于源自包括腺胃在内的其它器官的ECM支架。这些特征使得FM支架尤其适用于涉及组织再生和修复的临床应用。本发明还涉及从哺乳动物器官(包括但不限于前胃)产生ECM支架的改进方法。 

I.定义 

为更易于理解本发明，首先定义某些术语。 

本文所用的术语“前胃基质”(缩写为FM)指含有反刍动物前胃的固有-粘膜下层的ECM支架。 

本文所用的术语“固有-粘膜下层”指反刍动物前胃中的固有膜和粘膜下层组合形成的组织结构。 

本文所用的术语“固有膜”指固有-粘膜下层的内腔部分，包括胞外基质的致密层。 

本文所用的术语“反刍动物”指具有四室胃的哺乳动物。这些室包括前胃，由瘤胃、网胃或重瓣胃组成，以及称为皱胃的第四室。反刍动物的非限制性例子包括属于山羊属(Capra)、牛属(Bos)、鹿属(Cervus)或绵羊属(Ovis)的哺乳动物。 

本文所用的术语“源自”指ECM的组织来源或起源。ECM可源自组织的整体或其一部分，从而它们保留该组织的至少一种组分，例如固有-粘膜下层。 

本文所用的术语“固有-粘膜下层”指反刍动物前胃壁的一部分，由固有膜和粘膜下层构成。 

本文所用的术语“封闭透壁渗透流”(STOF)指使组织或器官的各层去细胞化和/或分离的方法，其中穿过该组织或器官壁的整体或一部分产生透壁渗透流。 

本文所用的术语“高渗”指溶质浓度高于另一溶液的溶液。 

本文所用的术语“低渗”指溶质浓度低于另一溶液的溶液。 

本文所用的术语“分层”指分开组织或器官内的各层。 

本文所用的术语“去细胞化”指从组织或器官的一部分，例如ECM中去除细胞和它们相关的碎片。 

本文所用的术语“乳房重建”指打算改变患者乳房的大小、形状、位置或外观的任何方法。此类方法包括但不限于：乳房增大、乳房固定术(即，乳房提升)和乳房切除术后重建。 

以下各个小章节进一步详细描述了本发明的各方面。除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的意义。如有冲突，以本发明(包括定义)为准。虽然可采用与本文所述那些相似或等价的方法和材料来实施本发明，但以下描述了合适方法和材料的例子。本文所述材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。本文引述的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用全文纳入本文。 

II.解剖反刍动物的前胃 

反刍动物(例如，牛、绵羊和山羊)具有复合式的胃，与其它哺乳动物的简单胃相比，区别在于该复合式胃实质上更大且分成4个部分：瘤胃、网胃、重瓣胃和皱胃。这些部分各自具有不同的物理和组织学结构。瘤胃、网胃和重瓣胃统称前胃。瘤胃和网胃的结构和功能密切相关，常称为瘤网胃(rumenoreticulum)。仅有该复合式胃的最后一室，即皱胃的结构类似于简单的 腺胃。前胃和简单腺胃之间的解剖学差异反映出它们的功能差异。前胃的基本功能是储存、发酵和吸收，而简单腺胃执行分泌和消化功能。 

因此，前胃的总体解剖学和组织学特征显著不同于腺胃。前胃的解剖学特征示于图1A，腺胃的示于图1B。重要的是，前胃不含有腺体粘膜，而是由非腺体角化复层鳞状上皮构成，其由角质层、颗粒层、棘层和基底层构成，在许多方面类似于皮肤的结构。上皮位于前胃的内腔侧，通过基底膜与其下的固有-粘膜下层分开。前胃的外腔侧含有称为肌层的肌肉层。 

上述胃粘膜下层组成源自腺胃壁，其含有以下各层：粘膜(包括上皮层，网状或细小蜂窝状组织构成的固有层和腺体层)、粘膜下层(有蜂窝状组织构成并缺乏腺体)、肌层(由三层肌肉组成)和浆膜(围绕肌肉层的松散结缔组织外的间皮层)。胃壁内存在腺体层是单胃哺乳动物的腺胃或简单胃的特征。反刍动物的复合式胃中仅有最后一室，即，皱胃含有该腺体层。前胃和腺胃的其它特征描述于表1。 

表1.前胃和腺胃的特征 

前胃相对于腺胃的两个独特特征在于前胃的固有层远为致密且不包括腺体或腺体层。此外，瘤胃和大部分网胃缺乏肌层粘膜，即，腺胃粘膜层的基底区中的细小肌肉层。不存在肌层，固有层与粘膜下层组合形成统称为固有-粘膜下层的层。前胃的独特之处还在于固有层内异乎寻常厚且致密 的ECM带，其与上皮表面平行。该组织带含有胶原IV和层粘连蛋白，在组织发育和重建期间的细胞生长、分化和迁移中起着至关重要的作用。在该组织带下，ECM具有更典型的开放网状模式。包含在前胃中的ECM是糖胺聚糖硫酸乙酰肝素，调节生长因子FGF2的生物活性的一种重要辅因子。如专利US6,099,567所引述的，腺胃粘膜下层中不存在硫酸乙酰肝素。这是两种ECM间的重要区别。 

前胃组织还包含表面突起，在瘤胃中称为乳突，在网胃中称为嵴，在重瓣胃中称为薄层。固有-粘膜下层延伸入这些突起。 

III.源自前胃的组织支架 

按照本发明，ECM支架可源自前胃的瘤胃、网胃或重瓣胃。此类ECM支架(本文称为“前胃基质”或FM)的特征在于它们含有前胃壁的固有层和粘膜下层(固有-粘膜下层)。在本发明的具体实施方式中，FM支架源自瘤胃或重瓣胃的各薄片。除了固有-粘膜下层外，FM支架可任选包含去细胞化上皮、基底膜或肌层的完整或部分层(参见图1A)。 

与以前描述的从腺胃、肠和膀胱分离的支架相比，由于前胃的结构和功能独特，源自前胃的本发明ECM组织支架具有不同的生物化学、结构和物理特性。具体地说，FM在固有层内包含致密的ECM带。此外，FM任选包含完整或断裂的基底膜。相反，源自腺胃粘膜下层或小肠粘膜下层的支架几乎不含固有层，因为固有层主要位于粘膜的腺体之间，因此随着粘膜分层而除去。重要的是，组织学显示固有层出乎意料地致密，而FM支架的外腔侧为开放网状基质的结构。这些不同之处在上皮再生中起至关重要的作用，因为致密侧用作细胞迁移的屏障，而致密度较低的一侧不能提供屏障，因此细胞能侵入。用作组织再生的医疗仪器时，该结构使得FM壁适合在基质的致密内腔侧促进上皮再生，而在致密度较低的基质外腔侧发生成纤维细胞侵入。相反，源自腺胃和膀胱的粘膜下层的组织移植物具有均一的密度。 

与源自其它器官的那些相比，源自固有层的ECM的致密层有助于增加FM支架的厚度和强度。实施例11和12比较了源自前胃和源自其它器官的的组合物的厚度及破裂强度。前胃的大表面积以及源自前胃的支架的厚度 和强度增加，使得比从其它器官分离更可能从前胃分离较大的ECM支架。例如，本发明的ECM支架的宽度可大至5cm(例如，0.5cm、1cm、2cm、3cm、4cm或5cm)，更优选至少6cm、7cm、8cm或9cm，最优选至少10cm或更大。此外，本发明的ECM支架的长度可长至5cm(例如，0.5cm、1cm、2cm、3cm、4cm或5cm)，更优选至少6cm、7cm、8cm或9cm，最优选至少10cm或更长。因此，在具体的实施方式中，本发明的FM支架的宽度和长度可以是10cm或更多，该尺寸远大于源自其它器官的ECM支架。示范性FM支架的表面积为至少100cm²、200cm²、300cm²、400cm²、500cm²、600cm²、700cm²、800cm²、900cm²、或1000cm²或更大。在具体的实施方式中，FM支架的表面积约为400cm²。 

与从腺胃获得的支架不同，源自前胃的ECM支架(即，FM支架)可在内腔表面上包含基底膜的胶原IV和层粘连蛋白。出乎意料的是，这些蛋白质也存在于固有层的致密带中，从而为上皮细胞粘附和生长提供重要基板。腺胃支架通常不包含上皮或基底膜，或其一部分，因为这些层脆弱且不耐受物理分层(参见，图1B)。腺体粘膜下层的支架可在内腔侧包含肌层粘膜的残留物，在外腔侧包含肌层。 

FM支架具有类似于真皮的表皮突的浮雕样内腔表面。相反，小肠、膀胱和腺胃粘膜下层分层获得的支架具有较光滑的内腔表面。FM的浮雕样内腔表面提供复杂的拓扑学结构，从而有利于上皮再生。源自小肠粘膜下层、腺胃粘膜下层或膀胱粘膜下层的ECM支架不存在该拓扑学结构。 

本发明的FM支架含有伤口愈合的重要调节剂，包括但不限于：生长因子FGF-2、TGFb1、TGFb2和VEGF及糖胺聚糖透明质酸和硫酸乙酰肝素。FGF2通过传递形成新组织和血管所需的细胞迁移和分化信号而在伤口愈合中起重要作用。硫酸乙酰肝素是通过作用于FGF2受体而调节FGF2生物活性的重要辅因子。硫酸乙酰肝素是FGF2活性所需并增加FGF2的稳定性。重要的是，胃粘膜下层上不存在FGF2和硫酸乙酰肝素。FM还含有纤丝蛋白，包括胶原I、胶原III和弹性蛋白以及粘附蛋白，包括纤连蛋白、胶原IV和层粘连蛋白。这些蛋白质，特别是胶原和弹性蛋白有助于FM支架的高抗拉强度和弹性。实施例7详细量化了FM支架的分子组成。 

在具体的实施方式中，FM支架可层叠在一起以形成多层薄片。例如，层叠的FM可包含2个或更多个FM支架薄片(例如，2-30个FM支架薄片，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个薄片)。在具体的实施方式中，层叠的FM包含2-15个FM支架薄片，例如2-10个、2-6个或2-4个FM支架薄片。可采用本领域已知的任何合适技术将这些FM支架薄片层叠在一起。此外，可利用下述聚合物实现层叠。可利用可再吸收或不可再吸收的缝合材料或等价物通过缝合或不缝合来实现层叠。 

与源自较薄和较弱的ECM来源相比，FM支架的强度和物理特征转化成改善的操作特征。由于FM支架比从其它来源，例如腺胃分离的ECM支架在物理上更稳定，它们操作更容易，更耐受操作变形。这对于在外科手术过程之前和期间必需操作支架的临床实践有重要意义。 

FM支架可以是不穿孔的，或者它们可以穿孔。可采用任何合适的方法在FM支架中引入穿孔，包括手动钻孔或激光钻孔。孔径可在约10-约500微米之间变动(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、或约500微米)。可在FM支架制造期间的任何时间引入穿孔，但优选在灭菌之前进行。穿孔可完全穿过FM支架，或者可仅部分穿透FM支架。在包含多层FM薄片的层叠FM支架中，穿孔可完全穿过支架的所有层，或者可仅穿过一些层，因此仅部分穿透FM支架。穿孔使得细胞更易于渗入该支架，从而能发生更快速的组织内生长和支架重塑。 

本发明的FM支架的独特之处在于它们组合了改进的操作特征，有大量的形式可用并包含生物化学成分的新型组合。 

虽然本文描述了从反刍动物前胃分离ECM支架的合适方法，但本发明应包括通过任何手段，包括但不限于下述STOF方法从反刍动物前胃分离的ECM支架。 

IV.层叠组织支架 

可将ECM支架连接在一起以形成多叠层层叠薄片。层叠ECM支架可增加该支架的强度，使得层叠的ECM组合物尤其适合于要求支架承担负载 和/或保留缝合线或U形钉的领域。可将薄片以几个取向连接在一起。例如，可以彼此相同取向堆叠两个或更多个薄片，即，使得一个薄片的基质的内腔表面接触毗邻薄片的基质的外腔表面。在备选实施方式中，可以彼此相对的取向堆叠两个或更多个薄片，即，使得一个薄片的基质的内腔表面接触毗邻薄片的基质的内腔表面，或，使得一个薄片的基质的外腔表面接触毗邻薄片的基质的外腔表面。可采用多种技术，包括但不限于聚合物粘合层、缝合或使接触FM层简单脱水而将两层或更多层FM支架结合在一起以形成堆叠的FM支架。 

A.含有粘合剂聚合物的堆叠组织支架 

层叠ECM支架以形成多-叠层薄片的常规方法包括利用化学试剂直接彼此交联ECM支架。此类试剂通过直接作用于ECM支架而修饰支架，因此改变了支架的生物学特性。本发明通过提供形成层叠ECM支架(例如，FM支架)而不化学修饰支架本身的方法以克服该局限性。一种此类方法包括将聚合物分散在一层或多层ECM支架之间。聚合物用作粘合剂，将ECM支架的交替层连接在一起形成多叠层组合物。聚合物还可应用于ECM支架的外表面。重要的是，利用聚合物粘结ECM支架堆叠无需对ECM进行化学交联或其它共价修饰来产生层叠组合物。因此，层叠支架保留了原ECM支架的生物学特性。 

利用聚合物产生本文所述层叠ECM组合物的方法适用于将多层FM支架或本领域已知的多层其它ECM支架，例如源自简单腺胃、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层或真皮ECM的ECM组合物层叠在一起。在某些实施方式中，可利用聚合物形成

或

或它们的组合的层叠薄片。还可利用聚合物形成其中多层FM与其它ECM支架，例如源自腺胃、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、心包或真皮ECM的支架，如

或

层叠的层叠组合物。 

在一个实施方式中，通过将聚合物分布在两个或多个交替层的ECM支架(例如，FM支架)之间来形成层叠ECM薄片(例如，FM薄片)。聚合物可跨ECM支架间歇分布，或可以连续层存在。可将聚合物层作为完整薄膜或薄片，或溶液或凝胶涂布。聚合物的作用是将两个连续ECM薄片结合在一 起。在优选的实施方式中，聚合物在层叠夹层内形成连续且完整的层。还可将聚合物涂布于层叠ECM支架的外表面。可利用合适的聚合物层叠ECM支架的连续薄片，所述聚合物的范围包括胶原、壳聚糖、藻酸盐、聚乙烯醇、羧甲基纤维素或羟丙基纤维素或它们的组合。可将聚合物作为薄膜、薄片、溶液、悬液或凝胶涂布于冷冻干燥的ECM薄片，然后脱水产生层叠ECM薄片。或者，可将聚合物作为溶液、悬浮液、凝胶或干燥薄膜涂布于湿ECM薄片，然后脱水产生层叠ECM。其它合适的聚合物包括但不限于以下任一专利文件描述的聚-乙醇酸(PGA)、聚-乳酸(PLA)、共聚乳酸乳酸(Poly-lactic co-lactic acid)(PLLA)和聚(乳酸)-聚(乙醇酸)(PLGA)聚合物：美国专利申请号2002/0119180或2003/0031696、或美国专利号6,281,256、6,472,210、5,885,829、5,366,734；5,366,733；5,366,508；5,360,610；5,350,580；5,324,520；5,324,519；5,324,307；5,320,624；5,308,623；5,288,496；5,281,419；5,278,202；5,278,201；5,271,961；5,268,178；5,250,584；5,227,157；5,192,741；5,185,152；5,171,217；5,143,730；5,133,755；5,108,755；5,084,051；5,080,665；5,077,049；5,051,272；5,011,692；5,007,939；5,004,602；4,961,707；4,938,763；4,916,193；4,898,734；4,898,186；4,889,119；4,844,854；4,839,130；4,818,542；4,744,365；4,741,337；4,623,588；4,578,384；4,568,559；4,563,489；4,539,981；4,530,449；4,384,975；4,300,565；4,279,249；4,243,775；4,181,983；4,166,800；4,137,921，这些文件的内容通过引用全文纳入本文。 

技术人员可知道，聚合层对层叠支架总的性能特征有贡献。因此，通过改变聚合物层的性质可产生层叠物的不同强度和操作特征。此外，可采用改变聚合物层的组成来改变该层叠物的水合速度及其蛋白水解稳定性。例如，与利用亲水性聚合物产生的层叠物相比，利用疏水性较强的聚合物导致层叠物的水合率(rate of hydration)降低。预计非天然和合成聚合物(例如，聚乙烯醇)的酶稳定性优于天然产生的聚合物(例如，多糖)。 

通过将聚合物分布在ECM支架的连续层之间，可产生包含2个或更多个ECM支架薄片(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个ECM支架薄片)的层叠组合物。在示范性实施方式中，ECM支架是 FM支架。 

在一个实施方式中，从FM制备的胶原凝胶可用作聚合物以将两层或更多层FM支架层叠在一起。该凝胶保持亲代FM支架的生物化学性质，并在，例如用作组织再生的层叠FM支架的一部分时经历重塑。 

B.利用缝线或缝合线形成的层叠组织支架 

还可将多层ECM缝合在一起以形成层叠ECM支架(例如，层叠FM支架)。FM的物理特性(大小、厚度、强度等)使得薄片能够缝制或缝合在一起以形成层叠物以供随后应用。可利用或不用位于各FM薄片之间的聚合物层将层叠物缝制在一起。 

缝制提供改变层叠支架性能特征的另一种手段。缝制还有助于从一片或多片单一或层叠FM薄片产生具有可用于特定解剖学部位的三维结构的装置。缝制有助于在再水合之后以及操作期间保持层叠物的三维形式。 

可利用任何合适的细丝缝合FM支架薄片，包括但不限于：可吸收缝线(例如，聚卡普隆25(Monocryl)、聚二

烷酮(PDS)、羟乙酸乳酸聚酯(polyglactin)-910(Vicryl)、聚乙醇酸(Dexon))，不可吸收的缝线(例如，尼龙(Ethilon)、聚丙烯(Prolene)、棉丝或丝线。依据所需强度特征，细丝可以是任何厚度或规格(例如，6-0、5-0或4-0缝线)，可采用各种针脚长度(例如，2mm、4mm或6mm)和方式(例如，直针、平伏针、之字形针、超连锁针(overlock stitch)或连锁针(lock stitch))缝制。 

C.含有生物活性分子的层叠组织支架 

如上所述，本发明部分涉及在各ECM薄片之间包含聚合物的层叠ECM支架(例如，FM支架)。该聚合物有助于将ECM支架的毗邻薄片结合在一起。可改进聚合物的组成以改变层叠ECM支架的特性，包括支架赋予组织或器官的作用。在具体的实施方式中，聚合物可用作将生物活性分子递送给组织或器官的载体，从而在接触部位释放生物活性分子。可利用含有生物活性分子的组织支架，例如以促进组织再生的速度和质量，预防或治疗急性或慢性感染。 

可将任何所需的生物活性分子掺入聚合物。合适的分子包括，例如小分子、肽或蛋白质或它们的混合物。在一些实施方式中，将两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)不同生物活性分子掺入聚合物。可将生 物活性分子作为悬浮液、包封成颗粒、微粒和/或胶体或作为它们的混合物非共价地掺入聚合物。还可采用合适的化学方法连接生物活性分子与聚合物从而将生物活性分子共价掺入聚合物。含有一种或多种生物活性分子的聚合物可分布在层叠ECM支架(例如，FM支架)的一个或多个ECM薄片之间，和/或可以涂布于该支架的外表面。在具体的实施方式中，含有第一生物活性分子的聚合物分布在层叠ECM支架的一些层之间，含有第二生物活性分子的聚合物分布在层叠ECM支架的其它层之间。合适的生物活性分子包括但不限于：抗微生物剂、镇痛剂、生长因子、止血剂、促血管生成剂和抗血管生成剂及它们的组合。在具体的实施方式中，掺入层叠ECM支架的聚合物层中的生物活性分子包括FGF2、NGF、多西环素、聚-L-赖氨酸和它们的组合。在另一具体实施方式中，聚合物层含有抗微生物剂和生长因子。重要的是，与通过直接连接于ECM而将其它分子掺入ECM支架的常规方法相比，如本文所示，用生物活性分子功能化ECM支架层叠物的聚合物层不改变该ECM支架的固有生物学特性。 

与生物活性剂直接偶联于ECM的其它组合物相比，生物活性剂掺入ECM的连续层之间的粘合聚合物(例如，聚合物层中)的生物活性层叠ECM支架(例如，FM支架)具有数个关键优点。首先，将生物活性剂掺入聚合物或聚合物层不改变ECM支架的固有组成，因为其无需共价或化学修饰该支架来实现层叠或生物活性剂的加载。再次，利用预配制的生物活性聚合物层作为递送生物活性剂的载体使得生物活性分子给予的均匀性得到更好的控制和一致性。 

IV.利用前胃基质组合物 

前胃基质支架极其适合于各种组织再生应用。它们可用于覆盖组织缺陷，例如伤口，和加强和/或修复软组织。它们可作为单一或层叠薄片使用，可形成定制相容器件以适应具体器官、解剖学部位或特定外科手术应用。采用本领域已知的任何合适方法，包括缝合线、U形钉或敷料适当固定FM支架。 

在一个实施方式中，FM支架用于覆盖大片外伤或烧伤，从而克服将数个较小的支架器件连接在一起以实现完全覆盖的不便和复杂性。因此，本发明的具体FM支架可覆盖宽为10cm或更大，长为10cm或更大的伤口或损伤之处。 

固有层内存在结缔组织的致密层和浮雕状表面结构特征使得FM极其适 于真皮和上皮再生应用。在需要支架承担载荷或置于张力下的情况下FM支架的高抗张强度还尤其有用。因此，在具体的实施方式中，本发明的FM支架施加于需要刺激组织修复或再生或提供组织加强的伤口和外科手术部位。ECM随时间自然重塑，从而FM支架再吸收并为宿主组织替代。 

在其它实施方式中，本发明的FM支架用于替代受损、患病或丢失的心脏瓣膜、动脉、静脉、膀胱、肝脏、胃肠道的诸部分，或作为修复或替换头颈结构的模板。多种固体或流化形式的FM可用作真皮或表皮修复的支架，注射入各种身体括约肌，例如泌尿括约肌或食道括约肌或胃括约肌，折叠成管状或部分管状作为神经组织修复的导管，或挤压或模塑成任何形状以便用作组织再生组合物。因此，可将本发明的FM支架以固体薄片形式缝入，以凝胶形式置于伤口或身体位置中，或以其液体或颗粒形式注射。当在体内与靶组织接触时，本发明的FM支架诱导包括上皮和结缔组织在内的内源性组织生长。此外，FM可任选与细胞组合以产生组织构建物，从而产生新的皮肤、心血管、泌尿生殖、神经、筋膜、腱、鞘、韧带和胃肠组织。FM还可与角化细胞接种在基质的较致密内腔侧，与成纤维细胞接种在致密度较低的外腔侧以便用于某些皮肤学领域。可将FM支架与包括干细胞在内的各种细胞类型接种以便用于再生医学。 

在还有其它实施方式中，本发明的FM支架在体外细胞培养中用作贴附的基材，在组织工程改造领域用作细胞生长的支架，其中FM可促进真核细胞的增殖和/或诱导分化。在体外细胞培养领域中利用非-FM粘膜下层组织的方案描述于，例如通过引用全文纳入本文的U.S.5,695,998。这些方法通常适用于将FM用作基材以便促进体外细胞培养。这通常包括在有利于真核细胞生长的条件下使FM与真核细胞在体外接触。如本文所述，本发明的FM支架还可用于构建药物递送的装置。 

如本文所述，FM支架可增加定位于该支架附着部位附近的细胞增殖。因此，FM支架可用于促进、刺激或增加组织或器官中的细胞增殖。在优选的实施方式中，FM支架用于促进、刺激或增加受伤组织或组织缺陷中，例如再生伤口内的细胞增殖。 

FM支架还促进该FM支架所附着的组织或器官内的血管化(例如，血管生成)。因此，FM支架可用于促进、刺激或增加组织或器官的血管化。在优选的 实施方式中，FM支架用于促进、刺激或增加受伤组织或组织缺陷，例如再生伤口内的血管化。改善血管化是FM支架促进伤口闭合和改善伤口愈合质量的一种方式。 

本文所述的生物活性层叠FM支架具有许多其它临床应用，包括但不限于：将抗生素(例如，阿莫西林、青霉素、多胺或喹诺酮)递送至外科手术部位以治疗、抑制或预防微生物感染；将抗生素递送至伤口和组织缺陷以治疗、抑制或预防该部位的微生物感染；将生长因子(例如，FGF2、VEGF或PDGF)递送至伤口或外科手术部位以促进组织再生和/或该组织的血管化；递送酶抑制剂以降低长期创伤中的蛋白水解活性；将氧化氮类似物递送给伤口或外科手术部位以促进组织再生；将抗微生物剂或抗生物膜剂递送至伤口或外科手术部位以抑制或防止感染和/或生物膜形成。 

可以各种形式配制和使用本发明的FM支架，包括但不限于：粉末、乳液(流化FM)、凝胶或提取物。此外，可先通过常规方法，包括环氧乙烷处理、γ射线处理、气体等离子体灭菌或电子束(e-beam)处理来灭菌FM支架，然后使用。 

V.可用于乳房重建的层叠FM支架 

本文所述本发明FM支架的特征，例如强度、弹性、缝合保留等使得它们适于需要支持或加强软组织的各种应用。在具体的实施方式中，FM组织支架用于在乳房重建期间覆盖、安置和/或固定乳房假体，或在乳房固定术(即，“乳房提升”)期间覆盖、安置和/或固定天然乳房组织或乳房假体。 

乳房增大是常见的美容学方法，其中通常将假体，即乳房植入物置于胸部3个位置之一：胸大肌上和乳房组织下(腺体下)、部分在肌肉之下(部分肌肉下)或完全在肌肉之下(肌肉下)。无论植入物的位置，该方法的审美结果在很大程度上取决于周围组织支持假体的能力，从而该假体维持其在患者中的位置。随着时间流逝，假体可能中间移位，从而导致不对称；侧向移位，从而导致植入体偏移入胸腔的腋窝；或向下移位，从而导致“底部突出”。错位的常见原因是软组织不足以支持植入体的重量。软组织支持不足在接受非常大的植入物的患者中常见，例如已丧失大量重量的患者。 

该问题尤其在乳腺癌治疗后经历乳房重建的患者中加剧。癌症治疗，例如 放疗或化疗减弱支持假体所需的软组织。此外，在技术上很难在乳房切除术后获得肌肉或软组织充分覆盖假体。获得充分覆盖的可行性依赖于组织丧失的程度和剩余组织的质量。充分覆盖不可能时，一般通过转移患者另一部位的肌肉组织来实现覆盖，这可能伴随着贡献部位发病、愈合不佳、结疤和挛缩以及感染风险和可能的皮瓣坏死(flap necrosis)。 

本发明的FM组织支架解决了这些问题，即，其能增强乳房组织并能在乳房增大/重建期间实现对各种乳房假体的充分支持。还可在乳房固定术期间利用组织支架支持天然乳房组织或乳房假体。如本文所述，组织支架增加的支持部分地由源自反刍动物前胃的胞外基质提供。 

用于乳房重建的FM支架可以是，例如平的，或者具有凹陷形状。在优选的实施方式中，所述FM支架具有一定凹度。与平的薄片相比，此类凹度改善与圆形乳房组织和/或乳房假体的一致性和相似性，从而减少死空间并改善定位、组织添附(tissue apposition)和固定。FM极其适于该领域，因为可利用前胃的天然曲率和形状形成具有天然凹度的ECM支架。此外，可围绕模具形成FM支架以改变具体应用所需的形状(例如，通过增加或降低该支架的曲率)。 

用于乳房重建的FM支架也可包括单一或层叠FM薄片。例如，如本文所述，可将多个FM薄片层叠在一起以增加支架的强度和厚度。为支持乳房假体和/或天然乳房组织，需要较强的支架。因此，用于乳房重建的FM支架宜包括含有2个或更多个连接在一起的FM薄片(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个薄片)的层叠薄片。可如本文所述利用聚合物、利用缝线或缝合线，或同时利用聚合物和缝线或缝合线来层叠FM薄片。在具体的实施方式中，通过缝合将用于乳房重建的多层层叠FM支架固定在一起。采用缝合和/或粘合聚合物层叠多个FM薄片确保FM支架在植入患者之前和期间保留其三维形状。 

如本文所述，FM支架还可穿孔或不穿孔。穿孔降低植入物下的液体累积和血清肿形成的风险并使得细胞更易于渗入该支架，从而能发生更快速的组织内生长和支架重塑。 

用于乳房重建的FM支架可具有多个不同形状以在乳房增大期间充分覆盖乳房假体，或在乳房固定术期间充分覆盖天然乳房组织。在优选的实施方式 中，FM支架具有图2(A)所示的月牙形，或图2(B)所示的椭圆形。还可采用半圆形或新月形。在一个实施方式中，支架足够大从而能完全或部分覆盖乳房假体或乳房组织的下部和/或侧部。从而该支架能支持乳房假体和/或天然乳房组织的低极点(lower pole)，模拟下部和侧面的乳腺褶。在该实施方式中，可将该支架置于水平或垂直取向。支架的尺寸也可设置成在乳房假体侧向或中间侧沿垂直取向安置，以抑制假体的侧向或中间移位。 

在本发明的具体实施方式中，用于乳房重建的FM支架长约3cm-约35cm(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35cm)，宽约3cm-约35cm(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35cm)。用于乳房重建的示范性FM支架宽约3cm-约12cm，长约25cm-约35cm。本领域已知支架的其它合适形状和大小，例如WO2008/016919和US2007/0088434A1所述，其内容通过引用全文纳入本文。这些形状和大小均适用于本发明的FM支架。 

当植入患者时，用于乳房重建的FM支架因活细胞置换而经历受控的生物降解，从而原支架发生重塑。患者的细胞渗入该支架最终导致支架的ECM与渗入细胞产生的基质发生置换。随着时间流逝，支架经历正常的组成型重塑，从而形成新组织以支持乳房假体和/或乳房组织。该方法无需转移患者另一部位的组织，特别是在乳房切除术后重建的情况中，从而降低外科手术过程的复杂性和持续时间。 

因此，本文所述用于乳房重建的FM支架可用于涉及乳房增大或乳房固定术的各种过程，包括，例如预防性或在乳房假体初始放置之时，在后续矫正重置过程中、在乳房切除术后的重建中以及在乳房提升过程中。本领域已知在前述过程中利用组织支架的方法。此类方法通常包括将支架固定在所需位置，例如跨乳房的下部和侧部以支持乳房假体/乳房组织的低极点，或在乳房的侧向或中间侧以抑制侧向或中间移位。可采用本领域已知的任何合适方法实现固定，例如通过安置缝合线或U形钉，或利用胶粘装置。随着时间流逝，FM支架与周围组织整合。在乳房重建中利用人工组织的其它示范性技术描述于，例如 WO2008/016919和US2007/0088434A1所述，其内容通过引用全文纳入本文。此类技术也适用于乳房重建过程中的本发明FM组织支架。 

VI.采用封闭透壁渗透流(STOF)从哺乳动物器官分离组织支架 

传统上，在将组织在处理溶液中浸泡之前或之后，通过物理或化学分离方法除去上皮细胞和肌粘膜(muscularis mucosa)，从而自胃肠组织(例如，腺胃和小肠)或泌尿生殖组织(例如，膀胱)产生胞外基质支架。物理分离粘膜层通常除去上皮、基底膜、腺体层和大多数(即便不是全部)固有层及肌层。 

去细胞化方法除去支架的抗原性组分，同时保留ECM的生物学活性以及机械和结构完整性。除去细胞的物理方法通常包括快速冷冻、机械力、搅拌和超声处理。常规用于去细胞化的化学试剂包括碱和酸处理、非离子型洗涤剂(例如，Triton X-100)、离子型洗涤剂(例如，SDS、Triton X-200)、两性离子洗涤剂(例如，CHAPS、SB-10、SB-16)、三(正丁基)磷酸酯、低渗和高渗处理、和螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。酶处理方法通常利用胰蛋白酶、分散酶(dipase)、核酸内切酶和核酸外切酶。 

迄今为止采用的处理方法将开放的完整器官或该器官的一部分浸入一系列处理溶液，从而使所有表面暴露于各溶液。肌肉和上皮组织的不同特征可能意味着对一种组织层具有正面作用的溶液对另一组织层可能有负面影响。这常导致利用多个处理步骤，从而延长了处理时间。所有处理溶液会对生物化学组合物、组织超结构和其余ECM的机械行为产生影响。处理时间较短是理想的，因为长期暴露于处理试剂，例如Triton X-100、SB-10、SB-16、Triton X-200、SDS和胰蛋白酶中可能对ECM有害。处理时间较短还能提供较高通量，改善处理经济性并减少暴露于可能破坏天然ECM超结构的细胞蛋白酶。迄今为止采用的处理方法依赖于处理溶液经组织扩散，可采用搅拌和升温来促进该过程。因此，对于在4℃处理，在生理温度下处理组织缩短了处理时间。然而，取决于所用溶液，生理温度增加内源性蛋白酶活性并可促进微生物污染物的生长。 

本发明克服了这些困难，提供了从哺乳动物组织或器官制备ECM支架的改进方法。按照本发明的方法，不同溶液隔离在组织的各侧，从而可优化每种溶液以靶向相应的组织层。将一种溶液制备成对于另一溶液是高渗或低渗的， 从而当这些溶液接触组织或器官的相对侧时(例如，内腔侧和外腔侧)，产生穿过组织或器官壁的透壁渗透流。该处理方法有助于去细胞化、分离组织层及除去细胞碎片和处理试剂。此外，该方法有效减少处理时间。 

本文所述的本发明方法中产生穿过器官壁的透壁渗透流，该方法称为“封闭透壁渗透流”(STOF)。可采用STOF方法处理任何完整或封闭的动物或人组织以分离和/或去细胞化组织层，从而提取ECM支架。因此，该方法可用于处理反刍动物的前胃组织以产生FM支架，或用于处理任何其它哺乳动物组织。例如，STOF方法的非限制性实施方式示于图3。该图示出，用一种溶液充满器官，封闭，然后浸入另一溶液。两种溶液之间盐度的差异产生透壁渗透流。应该知道可通过改变溶液(即，高渗和低渗溶液)的位置产生任一方向的渗透梯度。优选产生模拟该器官的天然液流方向的梯度。例如，当处理反刍动物前胃的组织时，优选产生从组织的内腔到外腔表面的梯度。采用仿生学测定产生透壁流的方向，使得组织保留天然生理学和流动特性以促进处理。 

本发明的STOF方法尤其可用于处理难以去细胞化的组织，例如具有角化复层鳞状上皮的那些，因为该方法能用特异性试剂靶向组织层。可采用STOF处理可封闭的任何完整或部分完整的组织或器官，从而可产生透壁渗透流。这包括，例如胃肠、泌尿生殖、心血管和真皮来源的组织或器官。可应用该方法，利用各种处理溶液处理各种组织或器官，所述处理溶液包括但不限于：含盐(例如，NaCl、KCl、EDTA、EGTA)、洗涤剂(例如，Triton X-100、Triton X-200、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、CHAP、磺基甜菜碱、三(正丁基)磷酸酯)和酶(例如，胰蛋白酶、核酸内切酶和核酸外切酶)的那些。因此，该方法可适用于可塑造的任何动物或人组织或器官，该组织或器官或其一部分封闭从而产生透壁渗透梯度。也可跨组织截面产生透壁渗透梯度，该组织隔离容器内的一种溶液与其所浸入的第二溶液。 

STOF方法在低温下运行非常好，因为是渗透梯度驱动流动而非依赖于扩散和布朗运动。该方法在低温下的快速效率对于最大程度减少ECM支架的生物学组分的内在蛋白酶降解和防止微生物生长尤其有利。在一个实施方式中，在低于6℃(例如，2℃-4℃)的温度下，在不到36小时内(例如，优选在24小时或不到24小时内)实施该方法。该方法已有效用于，例如在4℃，不到24小 时内使绵羊前胃的角化复层鳞状上皮去细胞化。相比之下，以前报道的产生食道非细胞基质支架的方法需要一周以上(参见，例如Bhrany等.,“开发食道非细胞基质组织支架(The Development of an Esophagus Acellular Matrix Tissue Scaffold)”Tissue engineering(2006)12(2),通过引用纳入本文)。该改善是可能的，因为透壁渗透流吸引处理溶液穿过组织。在另一实施方式中，在室温或接近室温下(例如，18-24℃)实施该方法。在室温或接近室温下可进一步减少处理时间。例如，已在室温下，不6小时内采用STOF方法使绵羊前胃去细胞化和分层。STOF方法还赋予能利用不同溶液处理不同组织表面的益处，所述溶液经优化以除去靶向层(例如，肌肉或上皮)。 

透壁渗透流特性在于穿过组织的流体量取决于表面积。可通过包封在组织内的液体量(膨胀水平)来控制组织的表面积。因此，组织或器官可完全或部分膨胀以进一步增加该组织接触渗透梯度的表面积，从而增加通过组织或器官的渗透流。 

可采用本发明的STOF方法除去所处理组织的所有单层或多层或其中的一部分。例如，可在处理期间或其后除去全部上皮、基底膜或肌层和它们的组合或它们的一部分。根据待处理的组织和待分层的组织层的组成，可利用多种不同溶液。在一个实施方式中，高渗溶液包封在组织或器官内，该组织或器官浸泡在低渗溶液中。在另一实施方式中，低渗溶液包封在组织或器官内，该组织或器官浸泡在高渗溶液中。在两种情况中，渗透流的方向将是从接触低渗溶液的器官表面向接触高渗溶液的表面。 

高渗溶液可含有一种或多种缓冲剂、洗涤剂、盐或它们的组合。类似地，低渗溶液可含有一种或多种缓冲剂、洗涤剂、盐或它们的组合。在所有情况中，高渗溶液含有的溶质浓度高于低渗溶液。例如，高渗溶液含有的盐浓度高于低渗溶液。在优选的实施方式中，高渗溶液含有的盐浓度高于所处理的器官，低渗溶液含有的盐浓度低于所处理的器官。 

在具体的实施方式中，高渗溶液含有NaCl。合适的NaCl浓度范围是，例如约0.5M–10M(例如，约0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M、5M、5.5M、6M、6.5M、7M、7.5M、8M、8.5M、9M、9.5M或10M)。在示范性实施方式中，高渗溶液含有约4M NaCl。 

在另一具体实施方式中，低渗溶液含有Triton X-200和EDTA。低渗溶液中Triton X-200的合适浓度是，例如约0.001%-1%(例如，约0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%或1%)。低渗溶液中EDTA的合适浓度是，例如约0.01%-1%(例如，约0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%或1%)。在示范性实施方式中，低渗溶液含有约0.028%Triton X-200和约0.1%EDTA。 

在另一具体实施方式中，低渗溶液含有SDS。低渗溶液中SDS的合适浓度是约0.001%-1%(例如，约0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、0.75%或1%)。在示范性实施方式中，低渗溶液含有约0.1%SDS。在另一示范性实施方式中，低渗溶液含有约0.028%SDS。在具体的实施方式中，低渗溶液含有约0.028%Triton X-200、0.1%EDTA和0.1%SDS。在另一具体实施方式中，低渗溶液含有约0.028%Triton X-200、0.1%EDTA和0.028%SDS。 

通过将一种溶液包封在器官内实现对该器官的初始处理后，将该器官浸泡在第二溶液中，从而产生穿过该器官壁的透壁渗透流，还可能将该器官从第二溶液中取出并浸泡在第三溶液中作进一步处理(但非必需)，从而再次产生透壁渗透流。透壁渗透流的方向优选在两个处理阶段期间同向(即，从内腔到外腔表面，或从外腔到内腔表面)。进一步处理前或期间无需取出该器官内包封的溶液。 

因此，在示范性实施方式中，将含有NaCl(例如，约4M NaCl)的低渗溶液包封在哺乳动物器官(或其一部分)内。然后将该器官浸泡在含有Triton X-200和EDTA(例如，约0.028%Triton X-200和0.1%EDTA)的低渗溶液中。再将该器官浸泡在含有SDS(例如，约0.1%SDS或约0.028%SDS)的低渗溶液中。根据需要溶液对所处理组织产生的影响来选择溶液。例如，含有Triton X-200和EDTA的低渗溶液靶向分解上皮和固有粘膜下层之间的基底膜，而含有SDS的低渗溶液主要用于实现去细胞化。在STOF方法中利用SDS溶液加速除去细胞壁和细胞碎片。因此，可采用多轮STOF处理以实现多种不同处理溶液所赋予的益处。 

在另一示范性实施方式中，采用STOF方法分离和去细胞化反刍动物前胃 的组织层以产生FM。可对，例如牛、山羊或绵羊的前胃应用该方法。可采用STOF方法从瘤胃、网胃或重瓣胃产生FM。在示范性实施方式中，采用该方法从绵羊(Ovis aries)的前胃产生FM。前胃的上皮表面是紧密结合基底膜的角化复层鳞状上皮。由于其耐受磨损破坏，难以采用其它手工或机械方法除去。在优选的实施方式中，产生穿过前胃从内腔到外腔表面的透壁渗透流，从而模拟该器官的天然流动。 

在本发明的另一示范性实施方式中，采用STOF方法，以适时方式将3种特定溶液用于前胃组织分离和细胞去除。溶液A含有约4M NaCl，溶液B含有约0.028%Triton X-200和0.1%EDTA，溶液C含有约0.1%SDS。溶液A相对于溶液B和溶液C是高渗的。利用这些溶液处理前胃组织，用约10L溶液A填充翻转的前胃，用缆绳结封闭。然后可将填充的瘤胃浸泡在溶液B中约16小时。该组合旨在分解上皮和固有粘膜下层之间的基底膜。透壁渗透流和肌肉层接触溶液A还导致肌肉纤维软化，从而有助于物理分离。然后可将填充的前胃浸泡在溶液C中约4小时以实现去细胞化。 

STOF方法加速除去细胞壁和细胞碎片。与传统处理方法相比，采用该方案压缩了处理时间，因为流动不是简单地局限于布朗运动。此外，可在低温下(例如，4℃或更低)进行该方法以限制内源性蛋白酶活性和微生物生长。能在低温和短时间内处理组织使得最终支架中ECM的天然生物分子(例如，生长因子、纤丝蛋白、粘着蛋白、糖胺聚糖等)的回收水平高于采用其它方法的处理。因此，与通过其它方法分离的支架相比，采用STOF方法产生的ECM支架具有独特的生物化学特征。 

以下实施例进一步说明了本发明，这些实施例不应理解成限制性的。 

实施例

实施例1：通过封闭透壁渗透流(STOF)制备前胃基质(FM) 

从本地屠宰场获得不到两岁羊羔的前胃。翻转前胃从而将上皮表面外露，而肌肉层在内侧。用10L4M NaCl填充该器官使其膨胀，用缆绳结封闭。然后将该前胃悬浮在含0.1%EDTA和0.028%Triton X-200的溶液中16小时，然后将其转移入含0.1%SDS的溶液中，再维持4小时。小心以 确保该器官不接触可限制渗透流的其它表面，包括相互接触。该方法允许Triton X-200/EDTA和SDS溶液通过组织，从而导致基底膜的去细胞化和有效破坏。 

取出STOF方法的前胃并排空内含物。然后切割它以打开该器官，从而能分层肌肉和上皮表面。这可通过，例如手工或机械刮擦进行以分离FM。室温下，用水洗涤FM30分钟并搅拌，然后转移至5%乙醇配制的0.1%过氧乙酸，1M NaCl中。混合60分钟，然后是用水(15分钟)、PBS pH7.2(15分钟)、水(15分钟)和PBS pH7.2(15分钟)的4个无菌洗涤步骤。然后将FM冷冻干燥，无菌包装，最终用环氧乙烷灭菌。STOF方法的该实施方式概述于图4。苏木精和曙红(H&E)-染色切片的组织学检测证实去细胞化是有效的。通过比较前胃组织和FM支架中的DNA浓度进一步得到确认。将木瓜蛋白酶消化样品与Hoechst33258染料(10μg/mL,美国密苏里州西格玛公司(Sigma–Missouri,USA))一起温育，利用微量滴定板读数计定量测定相对荧光单位。从小牛胸腺DNA(西格玛公司-美国密苏里州)的标准曲线计算DNA总浓度。如图5所示，与前胃组织相比，FM支架中的核酸含量显著降低，表明FM支架去细胞化。 

实施例2：STOF方法期间的流动特性和组织取向的影响 

进行以下实验以确定前胃表面积与进入前胃的水的渗透流之间的关系。在该项研究中，利用4M NaCl和水建立穿过前胃组织的渗透梯度。可根据球的表面积(4πr²)近似得到前胃的表面积。利用STOF之前和之后前胃中的液体体积计算内部溶液的体积变化(L)。STOF之前的前胃表面积(膨胀程度)与进入前胃的水流(体积改变)之间有线性相关性，如图6所示。如其中所示，进入前胃的水的渗透流随着封闭前胃的表面积增加而增加。通常观察到渗透流速随时间而降低，其中最大流动在STOF的首个24小时期间获得。 

检测应用透壁渗透流之前和之后的前胃重量作为证明STOF处理期间穿过前胃的流动是沿渗透梯度的手段。STOF设置与实施例1和图3所述相似。STOF期间前胃的重量随着流体进入组织而增加。该过程开始时前胃的 重量是789+/-45g，而该过程结束时同一前胃重达1160+/-92g以上。进入前胃组织的流体导致重量随着组织水合增加而增加。这些结果示于图7。 

组织取向显著影响STOF可获得的结果。采取天然的生理流动方向(即，从上皮流向肌肉，例如从前胃的内腔表面到外腔表面)产生穿过前胃的渗透梯度成功地除去了前胃的肌肉层、上皮层和细胞。相反，当对抗天然的生理流动方向(即，从肌肉流向上皮，例如从前胃的外腔表面到内腔表面)产生渗透梯度时，该组织变得脱水并发粘，随后更难以除去肌肉和上皮层。该数据总结于表2。流动的方向还影响处理结束时的组织外观。 

表2.组织取向和流动特性 

实施例3：利用粘合剂聚合物制备层叠前胃基质 

可将本文所述FM支架制成单一薄片，或可层叠形成FM的多-叠层层叠组合物。以下实施例描述了利用胶原聚合物粘合剂或从聚乙烯醇或羟丙基纤维素制备的粘合剂层制备层叠FM支架。为制备胶原粘结的层叠物，首先从亲代FM支架制备胶原聚合物的凝胶。该胶原凝胶保留了与亲代物质相同的生物化学质量，在组织再生中用作层叠FM支架的一部分时其经历重塑。对亲代FM支架采用热变性来制备胶原聚合物凝胶。在纯水或PBS中将细粉化FM(10%w/v)在95℃加热90分钟。35℃，以10k rpm离心该混合物30分钟以除去颗粒物，保留上清液。静置并冷却至室温后，该溶液固化成凝胶。胶原悬液的胶凝是可逆的，因此，在作为凝胶直接应用于FM薄片之前先加热(>37℃)从而作为两个(或更多个)薄片之间的层。冷却和干燥后，胶原凝胶使FM薄片有效层叠从而产生2-叠层层叠物。 

由于聚合层有助于层叠支架的总体性能特征，改变聚合粘合剂层的性质能产生该层叠物的不同强度和操作特征。此外，采用改变聚合层来改变层叠物的水合率、其蛋白水解稳定性和生物活性剂的递送。 

将聚乙烯醇和羟丙基纤维素聚合粘合剂层作为干燥薄膜施加，其在接触湿FM支架后再水合。随后冷冻干燥含聚乙烯醇和羟丙基纤维素的层叠物使得聚合层脱水形成层叠夹层。 

按照实施例13检验2-叠层层叠物的单轴强度。结果总结于表3。聚乙烯醇和羟丙基纤维素层叠FM支架显著强于胶原层叠FM支架。然而，强度增加被聚乙烯醇和羟丙基纤维素层叠FM支架的弹性降低抵消，反映在弹性模量增加和最大伸长降低。依据屈服应力(归一化为样品厚度的术语)，聚乙烯醇层叠FM支架表现最佳。 

本实施例证明由于聚合层有助于层叠支架的总体性能特征，改变聚合粘合剂层的性质能产生该层叠物的不同强度和操作特征。 

表3.采用胶原、聚乙烯醇和羟丙基纤维素聚合粘合剂层层叠的FM支架的生物物理学表征 

误差代表5次实验的标准误差。 

实施例4：缝合成层叠物的FM支架 

本文所述的FM支架具有使得FM支架薄片能缝合或缝制在一起以形成层叠物的固有物理特性(例如，大小、厚度、强度)。可利用或不利用位于各FM薄片之间的聚合物将层叠物缝合或缝制在一起。以下实施例描述了利用棉丝将FM层缝合在一起以制备2-叠层层叠FM支架。 

利用棉丝将FM支架缝合在一起以形成2-叠层层叠物。利用锁线装订机产生穿过两层FM支架薄片的直针(约2mm针脚长度)。利用平针将2-叠层层叠物缝合在一起，间隔约5mm，穿过层叠物的长度。采用实施例13所述的方案对缝合层叠物进行单轴强度检验，将缝合层叠物与利用聚合胶原粘合剂层产生的未缝合2-叠层层叠物比较。结果示于表4。如最大负载和屈服应力所述，缝合层叠物的强度胜过基于胶原的层叠物。然而，与基于胶原的层叠物相比，随着强度增加，缝合层叠物的弹性和伸长降低。 

表4.用胶原层叠的FM支架与缝合的FM支架层叠物的生物物理学表征的比较 

误差代表5次实验的标准误差。 

实施例5：胶原IV和层粘联蛋白在断裂基底膜中的分布 

通过在7%中性缓冲福尔马林中浸渍来固定按照实施例所示方法获得的FM支架以及在前胃组织的分层期间除去的上皮，并包埋在石蜡中。用切片机切割10μm厚的切片，然后在热水中使切片松弛并安装在APE-包被的载玻片上。通过在低聚甲醛中浸渍10分钟将切片固定于载玻片，室温无尘条件下储存。在100%二甲苯洗液中浸渍4次，每次5分钟以溶解载玻片的石蜡，通过降低浓度的乙醇进行再水合，然后浸渍在50mM TBS(pH7.4)中。利用70%甲醇配制的5%H₂O₂淬灭内源性过氧化物酶30分钟。按照卡米康公司(Chemicon)DAB二级检测试剂盒的方案实施染色过程。用TBS洗涤切片3次，每次5分钟，然后在阻断血清中温育30分钟以阻断非特异性结合。随后将切片与合适的一抗(即，识别层粘联蛋白或胶原IV的抗体，例如兔抗绵羊一抗)温育，稀释度为1:100(先在组织中优化两种一抗再用于本试验)。环境温度下，将切片在加湿室中与一抗温育30分钟。然后用含0.1%Triton X-100的TBS(TrTBS)洗涤切片，随后用TBS各洗涤5分钟。室温下，将切片与所述DNA二级检测试剂盒提供的第二抗体温育10分钟。然后用TrTBS洗涤切片一次，用TBS洗涤两次，随后在室温下与链霉亲和素-生物素偶连物(载体实验室(Vector Laboratories)，美国)温育10分钟。先用TBS洗涤载玻片3次，再与发色剂二氨基联苯胺四氯化物(DAB)温育5分钟以使抗原染色最高而背景染色最低。用dH₂O洗涤切片以停止DAB标记。然后用苏木精复染切片，用流动的自来水再洗涤，在升高浓度的乙醇中脱水，用二甲苯澄清，利用DPX封固剂封固，室温下储存直至观察。标记的蛋白质呈棕色，而苏木精标记的核呈蓝色。通过在以上过程中省去第 一和/或第二抗体作阴性对照。利用光学显微镜观察切片，利用AnalySIS软件获取照片。 

FM支架的免疫组织化学性质显示，胶原IV和层粘联蛋白定位于上皮和血管基底膜，还存在于固有层深处的基质的致密层中。FM支架的层粘联蛋白和胶原IV染色显示基底膜不是连续的表面，而是不连续或断裂的。在组织分层后获得的上皮样品中还见到胶原IV和层粘联蛋白。上皮组织染色显示，胶原IV和层粘联蛋白定位于基底膜的片段。FM支架的上皮层和内腔表面均存在层粘联蛋白好胶原IV表明，基底膜在前胃组织分层期间断裂。处理期间基底膜的断裂和破裂导致上皮释放。FM支架的固有层中存在层粘联蛋白和胶原IV的存在提供了组织再生期间这些重要细胞粘附分子的来源。 

实施例6：基底膜断裂和破裂 

将含有NaCl的绵羊前胃悬浮在含有0.028%Triton X-200和0.1%EDTA的低渗处理溶液中16小时，导致上皮从其下的固有粘膜下层上脱落，同时基底膜断裂。 

从上皮层取得的切片的免疫组织化学分析显示，在FM和脱落的上皮层上的基底膜残留物中均有胶原IV和层粘连蛋白存在(如上所述)。依据上文，显然处理溶液使得基底膜的结构断裂，从而导致基底膜破裂和上皮层释放。处理后，上皮成片从下部固有-粘膜下层剥离。STOF期间在Triton X-200和EDTA溶液中浸渍后产生上皮的“薄片”。 

蛋白质印迹显示，STOF期间层粘连蛋白(基底膜的主要组分)释放入溶液。这点在STOF期间对0.028%Triton X-200或0.028%Triton X-200+0.1%EDTA的溶液取样时是显而易见的。通过凝胶电泳分离样品中的蛋白质，利用抗-层粘连蛋白抗体观察(图8)。含0.028%Triton X-200的溶液(泳道2和4，图8)或0.1%SDS(泳道5，图8)的溶液溶解层粘连蛋白，但含NaCl(泳道3，图8)不是。 

处理期间FM支架和脱落的上皮层的生物化学分析显示两种成分中均存在层粘连蛋白(主要的基底组分)。按照以下实施例7，采用ELISA定量测 定FM支架和上皮组织中的层粘连蛋白。FM支架和上皮组织中层粘连蛋白的浓度分别是5.87±2.16和17.3±1.1μg/g。检测到层粘连蛋白在脱落的上皮组织中的浓度较高这一事实进一步支持了STOF处理期间前胃组织的基底膜断裂从而导致上皮层丧失的观察结果。 

实施例7：FM支架的生物化学组成 

采取广泛研究以了解FM支架，例如按照实施例1所示方法获得的支架的主要和次要组分。该产物在宏观上视作支持细胞填实和分化的胶原基质。然而，将该制备方法开发成保留次要生物学活性组分，例如生长因子和糖胺聚糖(GAG)的形式。这些次要组分在伤口愈合中起着同样重要的作用，它们在FM支架中存在赋予产物有利的伤口愈合特性。 

在所有情况中，将FM支架的生物化学组成与猪小肠粘膜下层(SIS)和原料绵羊前胃作比较。 

在所有情况中，首先将组织样品冷冻在液氮中，用调味品研磨器研磨以产生细小颗粒。按照已有的方法提取粉末并分析生物化学大分子。主要组分的生物化学分析见表5。 

通过酶消化粉末状样品(5mg/mL胃蛋白酶，0.5M乙酸，37℃，16小时)定量测定可溶性总胶原，然后离心，利用英国安特里姆郡生色公司(Biocolor-County Antrim,UK)的Sircol^TM可溶性胶原试剂盒分析上清液。从大鼠尾胶原I(美国加利福尼亚州GI公司(Gibco Invitrogen))的标准曲线计算样品的可溶性总胶原。绵羊前胃、FM支架和SIS中可溶性总胶原的浓度大致相等。 

虽然可溶性胶原定量测定可代表生理上可用胶原的相对丰度，但其不考虑基质的胃蛋白酶-不可溶性胶原组分。因此，为了解测试样品中的总胶原含量，按照已有方法进行羟脯氨酸分析。样品在6M HCl中水解(120℃，60分钟)，然后使羟脯氨酸残基反应形成可用吸光度定量测定的吡咯生色团。从羟脯氨酸(美国密苏里州西格玛公司(Sigma))的标准曲线计算总胶原，其中假定羟脯氨酸与总胶原之比是7.14。在FM和SIS支架中，根据组成胶原约为80-80%。胃蛋白酶-可溶性胶原如预计那样仅占样品中存在的总胶 原的一小部分。 

胶原IV是基底膜中促进细胞粘着和增殖的重要组分。FM的基底膜是部分完整的，提示该特征可能赋予产物有利的增殖特性。将胶原IV溶解于含4%SDS(37℃，16小时)的提取缓冲液中，用PBS透析，采用直接ELISA定量测定(用抗胶原IV抗体(澳大利亚昆士兰的AA公司(Abacus ALS)–Queensland,Australia)探查)，用偶联于HRP的二抗(澳大利亚昆士兰的AA公司)检测。相对于部分纯化的牛胶原IV(美国马萨诸塞州CM公司(Chemicon Millipore))的标准曲线定量测定胶原IV。胶原IV占基质中总胶原的一小部分(约2%)。 

弹性蛋白是构成ECM内弹性纤维网络以提供弹性、质地、耐久性和伸长后缩回能力的重要结构蛋白。可溶性弹性蛋白原单体的广泛交联形成广泛的共价阵列赋予了蛋白质弹性。由于其广泛的赖氨酸交联，弹性蛋白尤其不可溶，因此难以在生物学样品中定量测定。为了解弹性蛋白的相对水平，定量测定“可溶性”和“不可溶”的弹性蛋白。将基质样品溶解于0.25M草酸(105℃,16小时)，离心以沉淀不可溶的物质，然后按照生产商的推荐利用英国安特里姆郡生色公司的Fastin^TM弹性蛋白试剂盒分析上清液。相对于部分纯化的牛弹性蛋白的标准曲线定量测定溶解的弹性蛋白。与SIS相比，FM中可溶性弹性蛋白组成的浓度约低10倍。按照已有的方法，采用质量平衡试验定量测定不可溶弹性蛋白。简言之，用(1)乙醇/乙醚(1:1,15分钟，室温)；(2)0.3%SDS(16小时，室温)；和(3)0.1M NaOH(15分钟，100℃)提取样品。各提取步骤后离心样品，弃去上清液。提取过程后不可溶弹性蛋白保留；因此，通过比较提取前后样品的干重来计算总的不可溶弹性蛋白。FM中，不可溶弹性蛋白的总浓度低于SIS中(分别是3.0%和5.3%)。 

包括硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素在内的糖胺聚糖分子(GAG)与生长因子和细胞因子结合，并控制ECM内的水分保持和凝胶特性。许多细胞表面受体和许多生长因子(例如，FGF家族、VEGF)的乙酰肝素结合特性使得富含乙酰肝素的GAG成为组织修复支架的极其理想组分。木瓜蛋白酶(125μg/mL)消化粉末状样品后，采用比色染料结合试验(Blyscan硫酸葡糖胺试 剂盒；英国安特里姆郡生色公司)定量测定总GAG。从硫酸软骨素(美国密苏里州西格玛公司)的标准曲线计算GAG浓度。SIS的硫酸GAG总浓度高于绵羊前胃和FM(分别是7.3±0.4、3.9±0.1和0.6±0.1mg/g)。FM和SIS的硫酸乙酰肝素浓度分别是0.2mg/g和2.1±0.1mg/g。定量测定硫酸乙酰肝素的更详细讨论见下文。利用美国犹他州EB公司(Echelon Biosciences–Utah,USA)的ELISA试剂盒测定三种样品中各自的透明质酸(HA)浓度。发现所有三种样品中HA的存在浓度低。 

制备FM的关键特征是使ECM去细胞化的步骤，从而降低宿主对异体移植物的任何负面反应。一般通过洗涤剂介导的细胞膜破裂以致细胞裂解和细胞组分溶解来实现去细胞化。核酸的存在用作基质细胞构成(cellularity)的替代标志。DNA片段本身也导致引发宿主介导免疫应答的一定风险。采用荧光染料结合试验定量测定总DNA。木瓜蛋白酶消化的样品与Hoechst33258染料(10μg/mL,美国密苏里州西格玛公司)温育，利用微量滴定板读数计定量测定荧光单位。从小牛胸腺DNA(美国密苏里州西格玛公司)的标准曲线计算DNA总浓度。FM中的DNA浓度低于SIS中的(分别是0.2%和0.4%)。与绵羊前胃原始材料相比，FM中的DNA如预计那样显著减少(分别是0.2%和2.6%)。 

发现组织脂质主要在细胞膜中，因此提供了可用于评估ECM基质去细胞化程度的另一种替代品。依次采用质量平衡和醚提取样品来测定FM基质的脂质含量。FM和SIS支架均具有约6%的脂质组成，而绵羊前胃具有14.4%的脂质组成。 

表5：绵羊前胃和FM及SIS组织支架的主要生物化学组分 

¹误差代表一式三份实验的标准误差。²误差代表至少三份独立生产批次的标准误差，一式三份检验。³组成百分比，根据羟脯氨酸分析的总胶原，仅排除了胶原III、胶原IV和可溶性胶原。⁴N.D.=未检测。⁵组成百分比，排除了硫酸乙酰肝素，因为其包括在总GAG中。⁶从不可溶弹性蛋白测定–质量平衡试验。 

分析FM和SIS组织支架以及绵羊前胃的次要生物化学组分，纤连蛋白、层粘连蛋白和生长因子VEGF、FGF2、TGFβ1和TGFβ2。结果总结于表6。 

纤连蛋白是遍布ECM的糖蛋白，在细胞生长粘着、迁移和分化中起重要作用。纤连蛋白结合胶原和乙酰肝素，重要的是，为细胞表面整联蛋白受体的粘着提供配体从而导致细胞连接和增殖。透析用4%SDS提取的样品后，利用美国马萨诸塞州CM公司的QuantiMatrix人纤连蛋白ELISA试剂盒定量测定纤连蛋白。FM中纤连蛋白的浓度显著高于SIS，分别是13.67±1.64和5.00±0.05μg/g。 

层粘连蛋白是能结合IV型胶原分子、硫酸乙酰肝素和整联蛋白受体从而在细胞和基底膜或ECM之间形成重要连接的ECM蛋白。利用美国马萨诸塞州CM公司的QuantiMatrix人层粘连蛋白ELISA试剂盒定量测定用4%SDS提取样品中的层粘连蛋白，相对于人层粘连蛋白标准品测定浓度。FM和SIS中层粘连蛋白的浓度大致相等。 

碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)是多功能的，在伤口愈合中起重要作用，包括促进血管生成期间的内皮细胞分化及许多细胞类型的细胞分化和迁移。利用美国新泽西州派普罗泰克公司(Peprotech–New Jersey,USA)的人FGF-碱性ELISA开发试剂盒分析样品中FGF2存在与否。用4%SDS提取缓冲液提取支架样品，用PBS透析。然后用人FGF2作为标准品定量测 定FGF2。绵羊前胃和FM中FGF2的浓度低于SIS中显示的浓度(分别是1.70±1.38、0.74±0.0.09和4.85±0.84)。 

按照生产商(BM公司(Bender Medsystems)和派普罗泰克公司)的使用说明书，利用市售可得的ELISA试剂盒定量测定生长因子VEGF、TGFβ1和TGFβ2。首先，用2M脲(37℃，48小时)或4M盐酸胍(37℃，48小时)提取粉末状FM。离心样品，过滤上清液，然后进行ELISA定量测定。还按照已有的方法，采用蛋白质印迹定量测定生长因子TGFβ2和VEGF。因此利用针对生长因子的抗体和阳性对照(有阳性对照可用时)；这些包括兔抗-TGFβ2多克隆

TGFβ2单克隆(Invitrogen^TM)和兔多克隆抗-VEGF

。此外，利用兔多克隆抗

和纯化的TGFβ1(Invitrogen^TM)作为阳性对照，采用斑点印迹定量测定TGFβ1。 

表6.绵羊前胃和FM及SIS支架的次要生物化学组分 

¹误差代表一式三份实验的标准误差。²误差代表至少三份独立生产批次的标准误差，一式三份检验。N.T.=未检验。 

实施例8：FM支架含有硫酸糖胺聚糖(GAG)乙酰肝素 

N-硫酸化GAG乙酰肝素硫酸酯是重要的ECM-结合GAG，其作为FGF2生物学活性的辅因子而起重要作用。硫酸乙酰肝素是FGF2的生物活性所需，因为其在FGF2存在下直接结合FGF2受体，因而稳定FGF2-受体复合物。硫酸乙酰肝素还结合游离FGF2，从而稳定该生长因子并延长其循环半 衰期。根据U.S.4,902,508和U.S.6,099,567，小肠粘膜下层含有硫酸乙酰肝素，而胃粘膜下层不含。胃粘膜下层不含硫酸乙酰肝素可限制源自胃粘膜下层的ECM支架中FGF2相关的任何生物活性。 

分析前胃粘膜下层以测定硫酸乙酰肝素存在与否。按照已有的方法，通过纤维素乙酸GAG凝胶电泳分辨FM的木瓜蛋白酶消化样品。FM样品中存在的GAG与硫酸乙酰肝素的标准样品类似迁移，与硫酸软骨素B或透明质酸不类似。通过分析阿辛蓝染色凝胶的密度，可能定量测定FM样品中硫酸乙酰肝素的存在量。硫酸乙酰肝素浓度约为0.2mg/g。 

还采用定量方法测定硫酸乙酰肝素水平。如上所述，利用市售Blyscan GAG检测试剂盒定量测定总GAG。采用该方法可能测定样品中的GAG总浓度(N-硫酸化和O-硫酸化GAG)，包括硫酸软骨素(4-和6-硫酸化)、硫酸角质素(碱敏感性和耐受性形式)、硫酸皮肤素(含有艾杜糖醛酸和葡糖醛酸)和硫酸乙酰肝素(包括乙酰肝素)。改进该方法可能在有O-硫酸化GAG存在下采用亚硝酸处理将N-硫酸化乙酰肝素硫酸酯聚合物切割成其组成单体。采用此方式可能将硫酸乙酰肝素定量测定为样品中存在的总GAG百分比。采用该方法，证明SIS的硫酸乙酰肝素浓度为2.1±0.1mg/g。出乎意料的是，相同条件下，未能在FM或绵羊前胃组织中检测到硫酸乙酰肝素。 

Blyscan试验的亚硝酸改进对于分辨FM提取物中的硫酸乙酰肝素可能无效。因此，采用其它方法进一步验证FM基质中硫酸乙酰肝素存在与否。 

通过类肝素酶消化FM提取物，然后采用Blyscan试验分析总GAG证实有硫酸乙酰肝素存在。24℃，利用乙酰肝素裂合酶I(0.5mU)、II和III(均是0.5mU)(SG公司(Seikagaku Corporation)，日本)将木瓜蛋白酶处理的FM提取物消化(24小时)成组成型二糖。24小时后，进行额外的裂合酶消化以确保样品的完全消化。采用Blyscan试验分析裂合酶消化前后样品的总GAG。二糖对Blyscan GAG试验没反应。结果总结于表7。 

表7：类肝素酶消化FM提取物 

采用Blyscan试验测定到乙酰肝素裂合酶消化样品显著降低总GAG浓度(表7)。例如，裂合酶消化前后，硫酸乙酰肝素标准品(制备成50μg/mL)的浓度分别是52μg/mL和15μg/mL。处理样品24或48小时没有明显差异，提示首个24小时温育后裂合酶消化基本完成。裂合酶消化硫酸乙酰肝素标准品降低样品对Blyscan试剂的反应性，但对背景水平没影响。这可以解释为乙酰肝素标准品中存在对类肝素酶消化不敏感的其它GAG和/或类肝素酶消化标准品将乙酰肝素转化成其组成型二糖不是100%有效。乙酰肝素裂合酶消化FM提取物显著降低消化样品中存在的总GAG(例如，裂合酶消化前后分别是70μg/mL、42μg/mL)。依据该分析，裂合酶敏感性硫酸乙酰肝素约占FM中存在的总GAG的40%。这表示硫酸乙酰肝素浓度是0.2mg/g，假定裂合酶消化前GAG总浓度是0.7mg/g。该发现符合上述凝胶电泳分析，硫酸乙酰肝素浓度测定为0.2mg/g。 

通过HPLC进一步分析FM提取物以确定硫酸软骨素(预计FM基质中可能存在的另一种主要GAG)的存在。在Tris缓冲液(50mM pH8.0,0.4M乙酸钠,0.1%BSA)中，用5U/mL软骨素酶ABC(SG公司(Seikagaku Corporation)，日本)消化木瓜蛋白酶消化的FM提取物(20小时，37℃)将软骨素聚合物水解成组成型单体，即，非-硫酸化软骨素、软骨素6-硫酸、软骨素4-硫酸、软骨素2,6-硫酸、软骨素2,4-硫酸和软骨素2,6-硫酸。还通过HPLC分析软骨素酶消化的样品，从而采用提取物中软骨素单体的浓度推算软骨素酶消化前硫酸软骨素的浓度。离心样品，通过RP-HPLC分析上清液。22℃，注射(20μL)至Phenosphere^TMSAX5um柱(美国加利福尼亚州菲诺蒙克斯公司(Phenomenex))。采用HCl(pH3.5)配制的水性HCl(pH3.5)/1.5M NaCl梯度，以1.0毫升/分钟的流速拆分混合物。在232nm检测诸峰。 

采用该HPLC方法，预计的硫酸软骨素单体无一检测到，提示硫酸软骨素不是FM中检测到的总GAG的主要组分。 

综合这些结果暗示FM支架中存在硫酸乙酰肝素，但水平低于SIS中发现的(表8)。值得注意的是FM的GAG总浓度测定为0.6±0.1mg/g，提示提取物中可能存在硫酸软骨素以外的凝胶电泳未分辨的其它GAG组分。 

表8：采用亚硝酸水解和1,9-二甲基-亚甲基蓝检测来定量测定硫酸乙酰肝素 

¹由裂合酶预处理提取物的凝胶电泳分析和Blyscan试验测定。²由亚硝酸预处理提取物的Blyscan试验测定。³误差代表一式三份实验的标准误差。N.T.=未检验。 

实施例9：FM组织双形支架结构 

采用实施例1概述的方法制备绵羊FM。还通过分层肌肉和上皮与粘膜下层，然后将支架浸泡在水中2小时以连接细胞而从腺胃制备绵羊腺胃粘膜下层。采用标准技术制备苏木精和曙红(H&E)染色载玻片以供组织学分析。 

(i)总体外观：腺胃粘膜下层的内腔和外腔表面具有相似的宏观外观。相反，FM支架在基质的内腔和外腔侧之间表面轮廓明显不同。内腔侧的乳突显示结构特征非常类似于正常皮肤的表皮突，而除去肌层留下的外腔侧是光滑的。该支架的双形(bimodal)性质对于其在愈合部位与不同细胞类型的相互作用至关重要。 

(ii)组织学：固有-粘膜下层是反刍动物前胃独有的，其它胃肠组织中不存在。腺胃和小肠的固有层是粘膜各腺体之间的松散网眼层，主要在分层过程中除去。称为肌层粘膜的一层组织分开小肠和腺胃中的固有层和粘膜下层。前胃的瘤胃中不存在肌层粘膜，因而固有层和粘膜下层混合形成固有-粘膜下层。FM支架由基底膜和固有-粘膜下层的残余物构成。显微镜分析支架显示FM在固有-粘膜下层的固有层内具有致密的ECM层，占基质厚度最多约20%。FM支架的外腔侧具有更开放的网状结构。FM支架具有浮雕状内腔表面，内腔侧上具有致密的固有层，而在外腔侧上，粘膜下层的ECM更开放且是网状的。因此，FM支架具有双形结构。当用作组织再生的医学装置时，该结构使得FM极其适于促进基质的致密内腔侧的上 皮再生和基质的致密度较低外腔侧的成纤维细胞侵入。 

(iii)扫描电子显微术(SEM)：对1周龄小牛和6个月羊羔的冻干组织进行FM和腺胃粘膜下层的扫描电子显微照相以比较内腔和外腔表面。采用本文所示的方法制备羊羔的FM支架。通过除去上皮和肌肉层制备“未处理”的前胃固有-粘膜下层，但不对组织实施STOF方法。通过分层肌肉和上皮与粘膜下层，然后将支架浸泡在水中2小时以裂解细胞来制备羊羔腺胃的腺胃粘膜下层。比较新生牛FM、绵羊FM和腺胃的SEM图像明显看出FM具有两个不同表面，边缘清晰，而腺胃粘膜下层的两侧非常相似。 

FM和腺胃粘膜下层的截面SEM图像证明FM固有-粘膜下层的内腔表面上存在厚而致密的ECM层，相比之下，腺胃粘膜下层的结构更薄且更均匀。值得注意的是，腺胃粘膜下层不存在致密的ECM层。 

实施例10：FM组织基质的表面积 

从本地屠宰场收集6个月羊羔的6个前胃和6个腺胃。总体上，前胃是基本上大于腺胃的器官，因此对于产生大表面积的支架是理想的。 

为比较大小的差异，检测前胃和腺胃各自的体积。发现前胃体积通常是12-15升，而腺胃体积局限于2.5-3升。依据球体表面积的近似值，这表示前胃的面积约为405cm²，而相比之下腺胃是104cm²。 

表9总结了源自绵羊前胃和腺胃的ECM支架之间的差异。这些ECM薄片的典型尺寸示于表9以说明从前胃和腺胃获得的支架尺寸中大致的差异。还注意到腺体粘膜下层基质具有易碎、精致的结构，难以分离，而FM更为结实，易于获得。 

表9.比较绵羊前胃和腺胃的表面积 

与其它已知组合物相比，FM的显著优点在于可从单一器官(例如，前胃)产生大构建物。例如，对于任何年龄或体重的动物，从前胃产生的FM薄片通常比从腺胃产生的那些大3-4倍，进而通常比从膀胱产生的那些大。从管状器官，例如小肠获得的ECM薄片的宽度受限于该器官的周长。例如，市场重量猪的小肠粘膜下层的宽度因小肠的周长而局限于不到10cm。 

实施例11：FM支架的厚度 

从重约25kg的4只5-6个月大的羊羔的前胃制备FM支架的4个薄片。4份样品中，各自检测FM薄片中充分间隔的13处厚度。结果见表10。 

表10.源自5-6个月大的羊羔FM薄片的厚度 

源自重量超过180kg的猪的小肠粘膜下层(如US5,372,821所示)通常仅100μm厚。以上检测值证明大小小于成熟猪的20%的不成熟羊羔提供的ECM薄片的厚度至少是猪小肠粘膜下层获得的厚度的3倍。此类较厚的支架具有有利特性，例如体内植入后强度较高、耐久性较长。随着动物年龄和体重的增加，可产生较厚的FM支架。 

实施例12：FM支架的双轴强度 

如实施例3所述，利用一层胶原聚合物层叠1-叠层FM支架的样品得到2-、3-、4-和8-叠层层叠物。此外，分别手工分离前胃和腺胃的前胃固有-粘膜下层和腺胃粘膜下层。这些“未处理”的样品不接触实施例1所述的STOF方法。 

球爆强度提供了在施加双轴作用力时生物材料对负载的耐受性的度量。通过将测试材料夹在环形孔板中并迫使金属球穿过样品的中心直至该 样品衰坏从而允许该球通过来进行该检验。利用材料衰坏时的作用力比较材料的相对强度，称为“最大压缩负载”(牛顿，N)。样品的最大压缩负载取决于样品的弹性和强度以及样品的厚度。球-爆检验测定双轴强度，藉此在所有方向同等施加作用力。相比之下，单轴强度(见下文)测定仅在一个方向衰坏的负载。 

该检验按照编织物破裂强度的标准检验方法：恒速穿越(CRT)球爆检验(ASTM D3797-89)，利用Instron1122机器将24.5mm抛光的钢半球推向ECM薄片直至衰坏。最大压缩负载确定为使薄片破裂所需的作用力。各ECM检验至少6(n=6)份样品。结果示于表11和图9。FM支架的强度与未处理前胃固有-粘膜下层的一样(分别是92.8±12.7和114.3±8.1N)(表11和图9)，两种前胃ECM材料均显著强于源自肠组织和腺胃组织的那些。 

表11.比较FM支架和其它ECM支架的球爆强度 

a.Freytes等.,“储存对源自膀胱的冻干猪胞外基质的材料特性的影响(Effect of Storage Upon Material Properties of Lyophilized Porcine Extracellular Matrix Derived from the Urinary Bladder)”(2005)J.Biomed.Mater.Res.B:Appl.Biomater.b.Freytes等.,“最终灭菌的猪膀胱基质支架的单轴和双轴特性(Uniaxial and Biaxial Properties of Terminally Sterilized Porcine Urinary Bladder Matrix Scaffolds)”(2007)J.Biomed.Mater.Res.B:Appl.Biomater.c.美国专利号6,099,567 

随着层叠额外薄片以产生一系列多-叠层器件(2-、3-和4-叠层)，观察到FM层叠物的强度的显著增加。例如，4-叠层绵羊FM的最大压缩负载为361.5±24.9N，而1-叠层FM的最大压缩负载为92.8±12.7N，如图10所示。 

将4-叠层FM层叠物的双轴强度与市售ECM产品，Alloderm^TM(LC公司(LifeCell Corporation))、Strattice^TM(LC公司)和Surgisis^TM(考克生物技术 公司(Cook Biotechnology))的公布球爆数据进行比较(见表12)。4-叠层FM的最大压缩负载低于其它植入物产品。然而，比较球爆强度时，考虑测试材料的厚度也是重要的，因为该尺寸会显著影响观察到的最大压缩负载。例如，Alloderm^TM的报道厚度是1.9±0.13mm，而4-叠层FM产品约薄75%，为0.47±0.01mm。为考虑ECM产品的不同厚度并因此对ECM产品的双轴强度作有意义的比较，将产品的最大压缩负载(N)归一化为它们的厚度(mm)。采用该分析，发现4种产品的相对双轴强度在统计学上类似(参见表12和图11)。 

表12.比较4-叠层FM和市售ECM植入物产品的球爆特性 

误差代表至少5份样品的，或公布数据的标准误差。Surgisis^TM未报道厚度误差。 

实施例13：单轴抗张强度 

单轴强度检测生物材料的一维作用力耐受性(one-dimensional force tolerance)，其中将材料带的任一端夹住并施加相对作用力。材料衰坏时的作用力称为“最大负载”(N)。样品的最大负载取决于测试材料固有的强度以及测试样品的大小和厚度。利用Instron1122机器进行单轴检验。如前所述，将样品切割成中间宽度为1cm的狗-骨形样品(参见Freytes等.,“储存对源自膀胱的冻干猪胞外基质的材料特性的影响”(2005)J.Biomed.Mater.Res.B:Appl.Biomater.和Freytes等.,“最终灭菌的猪膀胱基质支架的单轴和双轴特性”(2007)J.Biomed.Mater.Res.B:Appl.Biomater.，二者均通过引用全文纳入本文)。 

按照实施例1制备FM支架。此外，手工制备“未处理”前胃固有-粘膜下层和胃粘膜下层。这些未处理的样品不接触STOF方法。将所有样品固定于Instron测试设备，以20毫米/分钟的恒定速度牵引至衰坏。各ECM测试至少8份(n=8)样品。 

如表13和图12所示，结果证明未处理的前胃固有粘膜下层的强度远胜同一动物的胃粘膜下层。此外，如美国专利号6,099,567所报道的，6个月(约25kg)的绵羊FM支架强于源自成熟动物(约50kg)的猪胃粘膜下层。该数据表明FM支架的强度远胜于胃粘膜下层，而无论该动物的年龄和由此的体重。因此，与源自胃的ECM相比，FM在组织加强应用中用作单片时，不大可能遭破坏或机械衰坏。当需要将ECM的薄片层叠在一起以获得高抗张强度的组合物时，还应该知道与其它源自胃肠或泌尿生殖的ECM支架相比，所需的FM薄片较少，从而使得该方法更简单而省成本。 

FM固有的强度实际上也可利用从胎儿或新生组织分离的FM，然而其它胎儿或新生粘膜下层组织来源产生的组织因其薄且不成熟的状态而非常弱。 

表13.比较ECM支架的单轴强度 

a.Freytes等.,“储存对源自膀胱的冻干猪胞外基质的材料特性的影响”(2005)J.Biomed.Mater.Res.B:Appl.Biomater.b.Freytes et al.,“最终灭菌的猪膀胱基质支架的单轴和双轴特性”(2007)J.Biomed.Mater.Res.B:Appl.Biomater. 

除了以上数据，还测定了单一和多-叠层FM支架的最大单轴负载以及最大切线刚度(N/mm)、致衰坏的伸长(mm)、弹性模量(GPa)和屈服应力(MPa)。屈服应力是归一化为测试样品尺寸的术语，可用于比较厚度不同的相似产品。该术语是材料固有强度的量度。弹性模量或杨氏模量是材料弹性势的量度，即，其变形而不衰坏以及回复其原始状态的能力。弹性模量 是材料的固有特性，因此能比较不同大小的样品。对于弹性模量，数值较低表明弹性较大。例如，橡胶的模量是0.01-0.1Gpa。 

1-叠层与4-叠层FM的单轴强度特性比较见图13。增加产品的层叠状态和由此导致的厚度如预期那样显著提高单轴强度和刚度。然而，层叠不显著改变最大伸长或弹性模量。这表明层叠过程增加产品的强度，但不改变其柔韧性，从而提示对1-和多-叠层产品的操作是类似的。 

为评估绵羊FM产品的相对单轴强度，检索文献以鉴定和提取其它ECM-样产品强度的相关数据。将1-和2-叠层FM支架的单轴强度特性和厚度与硬脑膜修复产品DuraGuard^TM和Durarepair^TM的公布数据作比较(表14和图14)。1-和2-叠层FM支架具有统计学上相当的屈服应力(分别是10.15±1.81和9.77±1.68MPa)。这是将屈服应力归一化为样品厚度时所预计到的，从而自同一材料制备但厚度不同的两种样品应得到相同的屈服应力。1-和2-叠层FM产品的屈服应力与Dura-Guard^TM(13.5±3.34MPa)相似，所有3种产品均胜过DuraDerm^TM(6.27±4.20MPa)。Durarepair是最强的产品，其屈服应力为22.7±2.83Mpa。1-和2-叠层FM支架(杨氏模量分别为0.04±0.01和0.05±0.01GPa)的特性特性优于Dura-Guard^TM和Durarepair^TM(分别是0.08±0.02和0.07±0.01MPa)。DuraDerm^TM显示最佳的弹性势(模量为0.002±0.009GPa)，但如上所述，其是所研究产品中最弱的。 

该分析提示FM支架的强度和弹性特征等于或优于目前市售的硬脑膜修复产品。该分析表明4-叠层FM支架的强度等于市售硬脑膜产品。 

表14.比较1-叠层和2-叠层FM支架与市售硬脑膜修复产品的单轴强度 

误差代表至少5份样品的，或公布值的标准误差。 

为评估层叠FM支架对于植入的适合性，比较源自单轴强度测试的支架的生物物理特性与市售可得产品Alloderm^TM的相似公布数据(参见表15)。从公布的数据看，文献中对于Alloderm^TM的真实强度和弹性势显然未达成共识。这可能反映了该产品的尸体来源，从而导致产品的不规则性，包括观察到厚度差异。Alloderm^TM报道的屈服应力从7.00±1.00到16.79±2.10Mpa。为作出有意义的比较，数据的中点计算为11.90Mpa，其与4-叠层层叠物的屈服应力相当(11.97±1.16MPa)。Alloderm^TM的两个报道弹性模量彼此相差一个数量级，从而难与4-叠层产品比较。然而，该4-叠层产品保留1-和2-叠层产品的弹性特性，与硬脑膜修复产品Dura-Guard^TM和Durarepair^TM的那些相似(参见上文)。 

因此，本文进行的研究表明FM支架的强度特征与制造Alloderm^TM所用材料的相等。具体地说，该数据表明多-叠层FM支架具有合适的强度和弹性特性以供植入应用，其中固有强度是植入材料的前提要求。 

表15.比较4-叠层FM支架与Alloderm^TM的单轴强度特性。 

N.D=无数据。误差代表至少5份样品的，或公布值的标准误差。 

实施例14：缝合线保留强度 

缝合线保留测试是确定生物材料对缝合线拉出(pull-out)的阻力的实际临床考量。测试方案类似于单轴强度，然而，在本实施例中，夹住测试材料的一边，而将另一边经穿过测试材料的缝合线固定于反向夹具。该缝合线以指定的“咬合深度”(即，缝合线侧与测试材料边缘的距离)固定于生物材料。以恒定速度施加相反作用力，直至该材料衰坏，缝合线拉出测试材料。材料衰坏时的负载称为“最大负载”(N)，其取决于测试材料的固有强度、咬合深度和样品的厚度。 

检验一系列层叠FM支架的缝合线保留。层叠FM薄片如预期那样增加产品对缝合线拉出的阻力，如图15所示。例如，1-叠层FM的衰坏负载是5.91±0.60N，而较强(以上单轴和球爆检验所测定的)的4-叠层FM支架的衰坏负载是15.96±1.30N。 

如图15所示，观察到的缝合线保留强度取决于样品厚度。因此，为利用公布的数据比较绵羊FM层叠物与市售产品的缝合线保留强度，将最大负载归一化为样品厚度。FM支架和硬脑膜修复产品Durarepair^TM和Dura-Guard^TM的比较分析示于表16和图16。1-(4.7±0.4N)和2-叠层(7.1±0.5N)FM支架的缝合线保留强度低于Dura-Guard^TM(10.02±1.35N)和Durarepair^TM(12.38±2.10N)。然而，考虑到通过归一化缝合线保留的4种产品的相对厚度，该4种产品对于耐受缝合线拉出具有相当的势能。 

表16.比较FM支架与市售可得硬脑膜修复基质的缝合线保留强度 

误差代表5份样品的，或公布数据值的标准误差。 

扩展比较研究以测定层叠FM支架相对于市售可得植入物产品Alloderm^TM、Strattice^TM和Surgisis^TM的性能。结果示于表17和图17。重要的是注意到，虽然缝合线保留测试的ASTM标准规定了2mm咬合深度，但这些研究中采用约2mm到约10mm的各种咬合深度(表17)。测试期间增加咬合深度可提高观察到的最大负载，因为需要更大的作用力将缝合线进一步拉过样品直至到达边缘并观察到拉出。4-叠层FM层叠物支架对于缝合线拉出的阻力明显高于Surgisis^TM产品(归一化的缝合保留强度分别是34.2±2.8和18.0N/mm)。Alloderm^TM和Strattice^TM的报道缝合线保留强度均利用改进的ASTM标准，采用10mm的咬合深度(表17)。这些产品的归一化缝合线保留强度分别是71.2±10.71和40.2±3.43N/mm。相比之下，采用2mm的咬合深度，4-叠层FM支架的归一化缝合线保留强度为34.2±2.8N/mm。该数据表明如果在并列实验中采用相等的咬合深度测试所有3种产品，4-叠层FM支架的缝合线保留强度可能等于Alloderm^TM和Strattice^TM。单轴测试中观察到4-叠层FM支架具有相似的屈服应力(参见表15)和3种产品具有相似的归一化球爆强度(参见表12)证实了该观点。 

表17.比较层叠FM支架和市售可得植入物基质的缝合线保留强度 

误差代表至少5份样品的，或公布数据的标准误差。Surgisis^TM未报道误差。 

实施例15：FM支架的流体静力学渗透性指数(PI) 

可植入ECM支架的渗透性可影响细胞渗透进出和分子扩散进出外源性植入物的速度。植入物的所需渗透性取决于应用领域。例如，硬脑膜置换的植入物器件通常应相对不可渗透以防可能的脑脊液损失。组织重建的 植入物需要较高的渗透性以便有利生长因子的交换和细胞渗入及伤口渗出液的释放。因此，组织支架技术(例如本发明提供的)能根据目标应用所需改变渗透性是理想的。 

为评估单一和多-叠层绵羊FM产品的水性渗透性程度，按照已有的方法(Freytes,Tullius等.2006)，利用流体静力学渗透性测试设备来测定渗透性指数(PI)。假定FM支架是各向异性的，具有源自上皮连接和肌肉连接的各面，本项研究试图根据穿过该各向异性材料的流动方向确定1-叠层支架是否具有差异渗透性。过去已注意到生物来源ECM的“偏手性”导致渗透性差异。表18比较了1-叠层FM支架的渗透性与源自猪膀胱基质的ECM的公布渗透性指数。结果显示FM支架对水性溶液是可渗透的。值得注意的是，1-叠层FM支架在两个方向上的渗透性比膀胱基质低约10倍。 

扩展本项研究以测定天然牛硬脑膜与1-和4-叠层FM支架的水性渗透性。硬脑膜从约2岁母牛提取，并采用已有方法测试硬脑膜的渗透性。据称，硬脑膜是相对不可渗透的膜，因为进化出硬脑膜是为防止哺乳动物中枢神经系统渗漏和外来物体侵入。硬脑膜的渗透性类似于1-叠层FM支架(分别是0.0022±0.0003和0.0031±0.0005毫升/厘米²/分钟)，而4-叠层FM支架的渗透性约低10-倍(0.00010±0.00001毫升/厘米²/分钟)。因此，1-叠层支架提供的渗透性优点极其类似于天然硬脑膜。2-叠层和4-叠层FM支架之间的差异可能反映了用于层叠诸薄片的聚合物的性质。因此，可开发具有“调节的”渗透性的后续层叠产品，该特征与硬脑膜植入物产品尤其相关。 

表18.1-叠层和4-叠层FM支架的渗透性指数，与膀胱和牛硬脑膜相比 

误差代表至少5份样品的，或公布数据的标准误差。N.A.=不适用. 

实施例16：FM支架在伤口愈合啮齿类模型中的体内功效 

进行以下研究以显示FM在伤口愈合中的功效。将从1周龄小牛制备的前胃基质切割成椭圆形植入物(25x12mm)。获得平均重量为370g的12只20-23周龄的雄性Lewis大鼠。用0.5%氯己定和70%乙醇消毒大鼠的皮肤。沿脊柱轴量出距离颅骨底部6cm的头盖边缘之后，用无菌12mm活检穿孔器产生全厚度伤口。将基质植入，使其覆盖该伤口并在头盖边缘皮下延伸。利用无菌PBS再水合该基质，用Intrasite Gel(史密斯叔侄公司(Smith and Nephew))覆盖伤口。用无菌盐水处理6只有相似伤口的大鼠作为对照。在实验的头4天中，与对照相比，FM处理大鼠的愈合速度更快。此后，FM伤口的愈合速度慢于对照，估计是因为支架降低伤口收缩的程度。23天时，FM处理伤口和对照未处理伤口不到初始大小的20%。伤口或皮下植入物区域中未见炎性或免疫反应的证据。 

实施例17：FM支架在伤口愈合猪模型中的体内功效 

为进一步评估FM支架的体内性能并测定其刺激组织再生的效力和经历重塑的能力，在猪模型系统中进行全面的伤口愈合研究。通常认为猪伤口愈合模型是研究愈合过程和临床或治疗干预效力的可接受动物模型(Lindblad2008)。这是因为猪真皮的愈合与人的愈合过程最相似。例如，伤口挛缩是啮齿类动物中伤口闭合的主要机制，而在猪和人中，伤口闭合主要通过组织缺陷的填实而发生(Lindblad2008)。 

重要的是注意到虽然目前的研究致力于伤口愈合的急性猪模型，但本发明的FM支架可用于急性和慢性适应症。如下所示进行研究。在第0天，利用真皮穿孔器，在6周龄麻醉雌性猪(约18-20kg)的背部通过外科手术产生总共20个全厚度20mm直径的伤口。产生的伤口为4列、5行，间隔3cm，如图18所示。该项研究利用总共5只动物(总共100个伤口位点)。 

各个伤口或是不处理，或是用无菌1-叠层FM、2-叠层层叠FM，或用 已有的ECM基产品，SIS进行处理。在每种情况中，将前述支架之一的环形片(20mm直径)施用于伤口，通过施加无菌盐水原位再水合。为平均化任何位置偏倚，改变各个动物间4种处理的位置，从而没有两只动物接受相同的处理布局。处理和未处理伤口作相同包扎。 

在第0、3、7、14、28和42天，对所有伤口数码成像，记录伤口面积和深度(高度，如果合适的话)。此外，活检各个动物的一行伤口。活检组织通过外科手术切除，包括伤口床(wound bed)以及伤口边缘的一部分正常组织。所有活检组织作福尔马林固定，切片并染色以供分析。用H&E、Verhoff von Gieson和高氏(Gomori)三色染色剂染色切片的组织。还采用免疫组织学方法，利用细胞分化、内皮化和免疫应答标记染色组织。 

(A)伤口愈合期间FM支架的重塑和细胞浸润 

检查研究期间取得的固定组织活检表明，愈合过程中细胞浸润FM支架。ECM基质在高氏三色染色的切片中呈绿色带状，ECM基质在第7天特别突出。在第7天，外源性ECM基质中明显可见细胞。FM支架基质和市售产品SIS在约14-28天均可见，随后基质完全降解，成熟的胶原在重塑过程中沉积。 

(B)FM基质在所处理伤口中的耐久性 

评估猪伤口愈合模型中FM支架的耐久性。为定性ECM处理在愈合的伤口中的耐久性，分别检查Verhoff van Gieson(弹性蛋白)染色的各组织切片中基质或基质片段的外观。在弹性蛋白染色的切片中，支架(1-叠层和2-叠层FM或SIS)显示可与再生伤口明显区别的红-黑带状。取样时支架的耐久性总结于图19。 

在较早的时间点(第3和第7天)，在伤口的顶部1/3处明显可见支架，通常与再生上皮和/或痂有关。随着时间进展，支架显示移入伤口床并经历降解。3种支架处理的寿命几乎相同，在第14-28天，大多数伤口中不见支架。在第42天没有可见的基质。 

(C)FM支架在再生伤口内促进细胞增殖的程度高于源自小肠粘膜下层的基质 

再生伤口内的细胞增殖可以是伤口处理效力的有用指标，因为细胞增 殖是有益的免疫应答以及成纤维细胞和/或角化细胞迁移及增殖的指标。为定量测定细胞增殖，利用细胞标记Ki67进行上述猪伤口愈合研究期间获得的活检组织的免疫组织化学分析。Ki67在细胞周期的所有活性阶段表达，因此，是细胞增殖和细胞活性的有用标记。静息细胞中不表达Ki67。 

将福尔马林固定的活检组织包埋在石蜡中，以15μm切片，然后进行柠檬酸缓冲液表位检索。然后利用1:50稀释度的Ki67一抗检测活细胞，用HRP-偶联的二抗和DAB，利用莱卡微系统仪器公司(Leica Microsystems Instruments)的Bond Max^TM自动IHC/ISH染色系统染色。然后用迈尔苏木精轻微复染切片。以40倍放大倍数对免疫染色载玻片数码成像，从上皮层获取3个随机视野(第3、7、14、28和42天)，从再生真皮层活性获取3幅图像(第7、14、28和42天)。利用ImageJ软件(国立卫生研究)处理图像以定量测定每个框中的Ki67-阳性细胞数。首先，对图像去卷积以分离棕色DAB染色与图像中存在的其它颜色组分，然后通过阈值功能扣除背景。Ki67-阳性细胞鉴定为尺寸范围是300-4500个像素的黑色簇，并据此计数。 

细胞增殖的定量测定示于图20，表示为每个组织切片的3个上皮框和3个真皮框中鉴定的Ki67-阳性细胞总数。在指定的天对4个处理组各自取样。第3天真皮层中的Ki67-阳性细胞未定量，因为缺乏真皮层。对于所有4个处理组，真皮细胞增殖通常在第7和第14天达到顶峰。在第7和第14天，FM支架处理的伤口的细胞增殖明显高于SIS-处理和未处理的组(参见图20；P<0.01，单向ANOVA，利用GraphPad Prism)。在整个时间阶段可分辨该增殖阶段，在第42天所有处理组中的Ki67-阳性细胞回复至“基线”。 

(D)与源自小肠粘膜下层的支架相比，FM支架增加愈合伤口的血管化 

伤口中存在功能性血供对于伤口闭合和愈合至关重要。因此，增加愈合伤口的血管化作为改善伤口，特别是慢性伤口的愈合速度和伤口愈合质量的手段受到广泛关注。在上述猪伤口愈合模型中测定利用绵羊FM支架和小肠粘膜下层支架处理后的血管化(例如，血管生成)程度。为定量测定愈合伤口中内皮化和血管产生的程度，联用免疫组织化学与数字定量方法。以15μm切片固定的活检组织，包埋并经EDTA缓冲表面活性剂处理。用1:100稀释的抗-CD34抗体染色内皮细胞，利用HRP-偶联的二抗和DAB染 色目测观察，然后用迈尔苏木精轻微复染。由于缺乏边界清晰的真皮层，该项分析排除第3天获得的组织活检。记录各组织切片的4个随机选择的再生真皮层框，以40倍放大倍数对染色的载玻片数码成像。利用ImageJ软件对各图像的DAB颜色通道(CD34-阳性细胞)去卷积。过滤单色的棕色图像以除去不代表血管的较小的非特异性染色颗粒和小的CD34-阳性簇(<300μm²)。然后采用以下标准计数血管数量；‘小血管’=300-500μm²，‘中等血管’=500-1500μm²和‘大血管’>1500μm²。 

实验期间4个处理组各自的每框平均血管总数示于图21A(排除第3天)。与未处理的伤口相比，用任一种绵羊FM支架处理的伤口中血管数量呈统计学显著的增加。与未处理伤口相比，在第14(P<0.011-叠层FM和2-叠层FM)、28(P<0.011-叠层FM和2-叠层FM)和42天(P<0.011-叠层FM和P<0.052-叠层FM)的血管总数增加明显。相比之下，SIS处理相比于未处理对照未增加血管总数。 

在第7天，用任一绵羊FM支架处理产生的小血管数量高于用SIS处理产生的，或未处理组的，该趋势在整个实验进程中进展(图21C)。在进程中第7天，4个处理组的中等和大尺寸血管的数量大致相等(图21D和图21E)。在第14、28和42天，绵羊FM处理与SIS和未处理伤口的不同之处在于中等和大血管的数量更大。例如，在第42天，与SIS-处理和未处理伤口相比，绵羊FM支架处理的大血管数量大致翻倍(图21E)。 

通过定量小、中等和大血管的数量，可以理解4个处理组对所得血管的相对尺寸分布的影响。小(约40%)、中等(约45%)和大(约15%)血管的比例在4个处理组之间不随时间改变(图21B)。这些发现表明绵羊前胃基质处理增加血管总数，但处理不影响所形成血管的相对尺寸分布。 

实施例18：层叠的生物活性FM支架 

如上所述，开发的层叠FM支架包含粘合聚合物。该聚合物结合毗邻的FM支架薄片以形成层叠的薄片。如本文所述，该聚合物还用作递送生物活性分子的载体，并可用于微调生物活性分子在组织接触部位的释放。将FM支架层叠物制备成在聚合物层中含有以下生物活性剂之一：生长因 子FGF2或神经生长因子(NGF)或抗微生物剂多西环素、阿莫西林和聚-L-赖氨酸。随后检验含有生物活性聚合物层的FM支架层叠物以测定该层叠物的生物活性。 

具体地说，如实施例3所述制备胶原凝胶。一旦形成，给凝胶掺加人重组FGF2或NGF。将无菌FM支架薄片切割成8mm圆片，将掺加生长因子的胶原凝胶(10μL)施加于一个表面。将第二FM支架圆片施加于胶原层以产生层叠物夹层(即，FM支架/生物活性胶原聚合物/FM支架)。25℃，生物活性FM支架层叠物脱水2小时以产生结合的层叠物。产生含0、250或500ng/圆片FGF2或NGF的FM层叠物。37℃，先将生物活性FM支架在DMEM(1mL)中温育24小时以提取结合的生长因子，再施加于细胞单层。将PC12细胞在DMEM(1mL)中以20k细胞/孔接种在24-孔板上，37℃温育24小时。除去细胞中的培养基，替换为与生物活性FM支架层叠物培育过的DMEM(1mL)。用50ng/mL终浓度的FGF2或NGF溶液处理阳性对照细胞。温育细胞48小时。此后，利用倒置显微镜获取细胞单层的图像(每孔3个框)。计数每个框的总细胞以及每个框的细胞突(cell process)总数。细胞突是外源性生长因子刺激细胞分化的标志。细胞突定义为细胞体的细胞延伸部分，其长度是细胞体宽度的两倍。生长因子刺激的细胞分化表示为细胞突数量/细胞/框。结果示于表19。NGF和FGF2掺加的层叠物均引发PC12细胞的细胞反应。此外，反应是剂量依赖性的，因而掺加500ng生长因子(FGF2或NGF)的层叠物的细胞反应高于掺加了250ng的层叠物。 

表19.定量测定含FGF2和NGF的FM支架层叠物的生物活性 

误差代表指数6份样品的标准误差。 

如上所述通过给胶原凝胶掺加所需的生物活性剂，还制备了含有抗微生物小分子多西环素或聚合物聚-L-赖氨酸的FM支架层叠物的圆片。将多 西环素掺加的圆片制备成终浓度为30、15、5、2.5、1和0微克/圆片，而将聚-L-赖氨酸掺加的圆片制备成5、2、1、0.5、0.1和0微克/圆片。通过将多西环素(终浓度30微克/圆片)或聚-L-赖氨酸(终浓度5微克/圆片)的溶液点样在无菌滤纸圆片上来制备阳性对照。制备马-欣二氏琼脂平板，用100微升10⁸个金黄色葡萄球菌(S.aureus)划线，静置干燥5-10分钟。采用无菌技术将圆片转移至平板，35℃温育各平板24小时。24小时后，对平板数码成像，相对于阳性对照给各圆片周围抑制的抗-微生物区评分。层叠FM支架抵御金黄色葡萄球菌的生物活性见表20。给测试品的生物活性评分，其中“+++”表明生物活性与阳性对照相当，“-”表明无生物活性。 

表20.与多西环素或聚-L-赖氨酸层叠的FM支架抵御金黄色葡萄球菌的生物活性 

先前与含多西环素的胶原聚合物层叠的FM支架圆片对于金黄色葡萄球菌培养物有生物活性。多西环素层叠FM支架的生物活性是浓度依赖性的，从而30微克/圆片的层叠圆片的生物活性与对照圆片的大致相等，而1和0微克/圆片的层叠物不显示生物活性。含有聚-L-赖氨酸的FM支架的生物活性不如多西环素FM支架层叠物的显著。然而，在所测试聚-L-赖氨酸的最高浓度(5微克/圆片)观察到的生物活性与对照圆片的相当。 

这些体外研究的结果证明，生长因子蛋白或抗微生物小分子和聚合物随时间从聚合粘合剂层扩散的能力。因此，结果表明包含含有生物活性剂的聚合物层的层叠FM薄片可用于各种治疗目的。依据具体临床应用和物理性能的所需程度，层叠物可以是2-叠层或15-叠层或更高(例如，2-30叠层)。 

在体内，生物活性FM支架层叠物类似地将生物活性剂从聚合物层扩 散至周围组织。通过改变聚合物层的类型和该层内生物活性剂的配方，可以控制生物活性剂从层叠物到局部组织的扩散。 

实施例19：绵羊FM支架的生物相容性 

按照实施例1制备绵羊FM支架，切割成4x4cm见方的器件，最后利用环氧乙烷灭菌。按照蓝皮书备忘录(Blue Book Memorandum)G95-1和ISO10993-1:2003检验FM支架器件的生物相容性。测试包括细胞毒性、致敏作用和刺激性/皮内反应性。为检测FM支架器件导致的任何微生物感染和/或检测任何免疫学或炎性反应，扩展所需测试以包括30-天体内植入试验。还定量测定这些器件的内毒素浓度。 

按照ISO10993-12:2007‘物质器件的生物学评估，第12部分：样品制备和参比物质(Biological Evaluation of Medical Devices,Part12:Sample Preparation and Reference Materials)’制备所有器件和对照。生物相容性测试的结果总结于表21，表明FM支架的生物相容性特征使得它们适于体内递送。 

表21.FM支架的生物相容性测试 

实施例20：绵羊FM支架制备期间的病毒灭活 

以下导致FM支架制备期间的病毒灭活：1)洗涤剂(Triton X-200和SDS)处理期间病毒蛋白变性和/或病毒包膜的病毒脂质破裂；2)过氧乙酸(PAA)处理期间活性氧物质的释放；和3)环氧乙烷的最终灭菌。利用3种模型病毒作研究以检查STOF过程和PAA处理期间的病毒灭活。 

采用规模缩小的制备方法检验病毒灭活水平。这涉及将3种模型病毒各自的高滴度病毒储备物掺加入代表制备过程两个不同阶段的样品，并对这些掺加的样品实施对应于制备步骤的类似处理。通过比较各处理后从掺加样品回收的病毒滴度与未处理样品的病毒回收(滴度)来测定各处理期间的病毒灭活水平。 

选择模型病毒以包括具有不同物理-化学特征的病毒，例如包膜是否存在、核酸基因组的类型(DNA或RNA)和环境存活/对消毒的耐受性(表22)。通过终点滴定测定样品中感染性病毒的存在量，病毒滴度表示为组织培养感染剂量，50%(TCID₅₀)。 

该研究中采用的模型系统显示STOF和PAA处理灭活模型病毒，病毒滴度总的理论降低超过6个log TCID₅₀(表22)。 

洗涤剂处理有效灭活有包膜病毒(PI-3和FHV-1)，但灭活无包膜病毒BEV作用不大。该结果乃意料之中，因为无包膜病毒通常不受洗涤剂处理的影响。相反，PAA处理有效灭活所有3种模型病毒(表22)。 

表22.FM支架的规模缩小制备方法期间3种模型病毒的理论灭活 

所用的缩写:PI-3：3型副流感病毒(副粘病毒科)；FHV-1：1型猫科疱疹病毒(疱疹病毒科)；BEV：牛肠病毒(微小RNA病毒科)；TCID50：组织培养感染剂量，50%；PAA：过氧乙酸。*有渗透梯度存在下，用两种洗涤剂溶液处理后模型病毒的灭活。洗涤剂溶液包含0.1%EDTA/0.028%Triton X-200和0.1%SDS。^**用PBS配制的0.3%PAA/5%乙醇处理后模型病毒的灭活。当病毒回收的下限受样品对哺乳动物细胞的细胞毒性的限制时，结果表示为“大于或等于”。 

实施例21：乳房重建器件的制造 

将天然凹陷FM支架的湿薄片对齐并彼此连续层叠以产生4-叠层、6-叠层和8-叠层层叠物。各薄片采用支持和补充FM支架的天然轮廓的弯曲形式彼此层叠。冻干层叠物以产生结合的层叠物。然后利用直针vicryl缝合线将这些层叠物缝合在一起，针脚长度约3mm。按照层叠物的曲率沿直线缝制层叠物。此类直线间隔约10mm。乳房层叠物分别如图2A和2B所示呈新月形或椭圆形。可利用缝合线或U形钉使乳房层叠物贴合于天然组织。 

参考文献 

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等价方式

本文仅参考某些实例和实施方式描述了本发明。并未试图穷尽描述本发明所有可能的实例和实施方式。实际上，本领域技术人员应知道可对上述实例和实施方式作出各种添加、删除、改进和其它改变而不脱离以下权利要求所引述的本发明构思和范围。所有此类添加、删除、改进和其它改变应包括在以下权利要求的范围内。 

通过引用纳入本文

本文引用的所有专利、公布的专利申请、网址和其它参考文献的全部内容通过引用全文纳入本文。 

Claims (50)

1.一种将组织整体或其一部分内的诸层分离或去细胞化的方法，包括在所述组织的两侧之间产生透壁渗透流，从而将组织整体或其一部分内的诸层分离或去细胞化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，从所述组织的内腔到非内腔侧产生透壁渗透流。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括除去选自下组的组织层的整体或其一部分：上皮组织、基底膜、肌层和它们的组合。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织包含角化复层鳞状上皮。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：将第一溶液包封在组织或其一部分内，并将该组织或其一部分浸入相对于第一溶液高渗的第二溶液内。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：从所述第二溶液中取出该组织或其一部分，并将该组织或其一部分浸入相对于第一溶液也是高渗的第三溶液中。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：将第一溶液包封在组织或其一部分内，并将该组织或其一部分浸入相对于第一溶液低渗的第二溶液内。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：从所述第二溶液中取出该组织或其一部分，并将该组织或其一部分浸入相对于第一溶液也是低渗的第三溶液中。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含水，任选包含至少一种缓冲液、洗涤剂或盐。

10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第一溶液包含4M NaCl。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.028%Triton X-200和0.1%EDTA，所述第三溶液包含0.028%SDS。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.1%SDS，所述第三溶液包含0.028%Triton X-200和0.1%EDTA。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在2℃-4℃的温度下进行不到36个小时。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在4℃下进行。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进行不到24小时。

16.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.028%Triton X-200、0.1%EDTA和0.1%SDS。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法在18℃-24℃的温度下进行。

18.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述方法进行不到6小时。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织或其一部分膨胀以增加所述透壁渗透流。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织是整个器官或其一部分。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织源自反刍动物的前胃。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述组织是瘤胃。

23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述反刍动物属于选自下组的属：山羊属、牛属、鹿属和绵羊属。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述反刍动物是绵羊。

25.按照权利要求1-24中任一项所述方法产生的组织支架。

26.一种形成组织支架的方法，包括实施权利要求1-24中任一项所述的方法。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述组织支架包含反刍动物前胃的固有-粘膜下层的胞外基质。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述固有-粘膜下层来自瘤胃。

29.如权利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的去细胞化组织：上皮、基底膜、肌层和它们的组合。

30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的纤丝蛋白：胶原I、胶原III、弹性蛋白和它们的组合。

31.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的生长因子：FGF-2、TGFb1、TGFb2、VEGF和它们的组合。

32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的糖胺聚糖：透明质酸、硫酸乙酰肝素及它们的组合。

33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的粘连蛋白：纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原IV和它们的组合。

34.如权利要求27-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架具有浮雕状内腔表面。

35.如权利要求27-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架制成单一或层叠的薄片。

36.如权利要求27-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架包含2-12个层叠的薄片。

37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述组织支架在两个或更多个层叠薄片之间还包含聚合物。

38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述聚合物选自下组：胶原、壳聚糖、藻酸盐、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和它们的组合。

39.如权利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述聚合物还包含生物活性分子。

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子分散在整个聚合物层中。

41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子非共价连接于所述聚合物。

42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子共价连接于所述聚合物。

43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子是小分子或多肽。

44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子选自下组：生长因子、抗微生物剂、镇痛剂、止血剂、促血管生成剂、抗血管生成剂和它们的组合。

45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子选自下组：FGF2、NGF、多西环素、聚-L-赖氨酸和它们的组合。

46.如权利要求36-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述层叠的薄片通过缝线或缝合线固定在一起。

47.如权利要求27-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述薄片的宽度是至少10cm，长度是至少10cm。

48.如权利要求27-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述薄片的平均破裂强度是至少80N。

49.如权利要求27-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述反刍动物属于选自下组的属：山羊属(Capra)、牛属(Bos)、鹿属(Cervus)和绵羊属(Ovis)。

50.如权利要求27-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述反刍动物是绵羊。

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