CN1953657A - 来源于缺乏任何功能性α1,3半乳糖基转移酶表达的动物的组织产品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了来源于动物的组织，所述动物缺乏任何功能性α1，3半乳糖基转移酶(α－1，3.GT)表达。所述组织可以用于异种移植领域，如整形外科重建和修复、皮肤修复和内部组织修复，或用作医学设备。

Description

来源于缺乏任何功能性α1，3半乳糖基转移酶表达的 动物的组织产品

本申请要求2004年3月17日提交的美国临时专利申请No.60/553,895和2004年4月6日提交的美国临时专利申请No.60/559,816的优先权。

发明领域

本发明提供了来源于缺乏任何功能性α1，3半乳糖基转移酶(α1，3GT)表达的动物的组织。所述组织可以用于异种移植领域，如整形外科重建和修复、皮肤修复和内部组织修复，或用作医学设备。

发明背景

反刍动物，如猪、羊和牛被认为很可能是异种移植器官和组织的来源。猪异种移植物得到了最多的关注，因为猪的供应是充足的，繁殖程序已经确立，并且它们的大小和生理与人类相容。其它反刍动物来源，如牛或羊也已经被建议作为硬和软组织异种移植物的来源。但是，必须克服一些障碍，才能将这些器官或组织成功转移到人体中。最重要的是免疫排斥。第一种免疫障碍是“超急性排斥”(HAR)。HAR是由高滴度的预先形成的与外来组织结合的天然抗体的普遍存在而确定的。认为这些天然抗体与供体组织内皮上靶表位的结合是HAR的起始事件。在受体血灌注到供体组织的数分钟内发生该结合，随后是补体激活、血小板和纤维蛋白沉积，最后是间质水肿和供体器官内出血，所有这些都导致受体中组织的排斥(Strahan et al.(1996)Frontiers inBioscience 1，e34-41)。

最常移植到人体中的组织是骨(J.M.Lane et al. CurrentApproaches to Experimental Bone Grafting，18 Orthopedic Clinics ofNorth America(2)213(1987))。仅仅在美国，每年进行超过100,000次骨移植或植入程序，以修复或替代创伤、感染、先天畸形或恶性肿瘤导致的骨缺损。人类的骨是硬结缔组织，由包埋在矿质化的基质和胶原纤维中的细胞组成(Stedman′s Medical Dictionary，Williams&Wilkins，Baltimore，Md.(1995))。

骨移植物和植入物通常由自体骨形成。但是，通常不能提供用于大的缺损的可移植自体骨组织，特别在儿童中更是如此。此外，自体骨移植可能导致术后疾病，如供体部位的疼痛、出血、伤口问题、美观问题、感染或神经破坏。此外，从移植的自体骨组织制造需要的功能形状是困难的，会导致骨缺损的填充不能达到最佳效果。

也常常将软组织，如腱、韧带、软骨、皮肤、心脏组织和瓣膜、以及粘膜下组织移植到人体中。通过使用异种移植材料，最初组织的许多结构和许多特性可以保留在移植物中。如果可以经过加工而安全移植到人体，异种移植物组织代表了可获得的材料的无限供应。

一旦植入到个体中，异种移植物激发了免疫反应，如异种移植物的慢性和超急性排斥。由于该排斥，骨异种移植物表现出骨折、重吸收和不愈合的比例增加。采用动物组织，如猪、牛或羊组织作为人类植入物的主要免疫障碍是天然的抗半乳糖α1，3-半乳糖抗体，其包含大约1％的人和猴抗体。

除了古代猴、猿和人，大多数哺乳动物在它们的细胞表面携带含有半乳糖α1，3-半乳糖表位的糖蛋白(Galili et al.，J.Biol.Chem.263：17755-17762，1988)。相反，在其它哺乳动物，如猪的细胞上发现含有半乳糖α1，3-半乳糖的糖蛋白。人、猿和古代猴不具有半乳糖α1，3-半乳糖，并且具有大量产生的天然存在的抗半乳糖α1，3-半乳糖抗体(Cooper et al.，Lancet 342：682-683，1993)。它与携带α1，3-半乳糖的糖蛋白和糖脂特异性结合。

哺乳动物中″α-1，3 GT表位″和抗Gal抗体(即与携带半乳糖α1，3-半乳糖的糖蛋白和糖脂结合的抗体)的不同分布是进化过程的结果，该进化过程在祖先的古代灵长类动物和人类中选择具有灭活的(即，突变的)α-1，3-半乳糖基转移酶的物种。因此，人类是α-1，3-GT“天然敲除体”。该事件的直接结果是异种移植物的排斥，如最初通过HAR导致的移植到人体中的猪器官的排斥。

已经实施了多种策略来去除或调节猪异种移植导致的抗Gal体液应答，包括具有α-半乳糖苷酶的表位的酶促去除(Stone et al.，Transplantation 63：640-645，1997)、特异性抗gal抗体去除(Ye et al.，Transplantation 58：330-337，1994)、用其它碳水化合物部分给表位加帽，这些策略没能去除α-1，3-GT表达(Tanemura et al.，J.Biol.Chem.27321：16421-16425，1998和Koike et al.，Xenotransplantation 4：147-153，1997)，所述策略还包括补体抑制蛋白的导入(Dalmasso et al.，Clin.Exp.Immunol.86：31-35，1991，Dalmasso et al. Transplantation 52：530-533(1991))。Costa等人(FASEB J 13，1762(1999))报道了H-转移酶转基因猪中α-1，3-GT的竞争性抑制仅仅导致了表位数目的部分减少。类似地，Miyagawa等人(J Biol.Chem 276，39310(2001))报道了尝试阻断N-乙酰基葡糖氨基转移酶III转基因猪的gal表位表达也仅仅导致了gal表位数目的部分减少，并且不能显著延长灵长类受体中的移植物存活。

Badylak等开发了从猪小肠分离粘膜下组织的方法，用于多种组织移植物，包括结缔组织移植物，以修复关节韧带(前交叉韧带)和修复肩转子套(rotator cuff)。用化学和酶促步骤处理小肠粘膜下(SIS)材料，以剥离存活细胞的组织，留下促进宿主细胞向内生长和组织再生的无细胞的细胞外基质(参见，例如，美国专利Nos.4,902,508，4,956,178和5,372,821)。该方法目前用于人类组织移植。但是，尽管采用了化学处理步骤，半乳糖α1，3半乳糖残基保持包膜在移植物中，并且导致人类患者中的免疫激活和炎症(Allman et al. 2001，Transplantation 71，1631-1640；Mcpherson et al.，2000，TissueEngineering 6(3)，233-239)。

Stone等开发了在移植前处理猪软组织和骨组织以去除细胞材料，然后用α半乳糖基酶处理以去除半乳糖α1，3-半乳糖的方法(Stoneet al.Transplantation 1997：63：646-651；Stone et al. Transplantation1998：65：1577-83)。该方法是许多患者应用的目标，其讨论了将所述组织用于多种应用，如前交叉韧带修复、半月板修复、关节软骨异种移植物、粘膜下异种移植物和骨基质异种移植物、心脏瓣膜置换和软组织异种移植物，参见例如美国专利Nos.5,865,849，5,913,900，5,984,858，6,093,204，6,267,786，6,455,309，6,683,732，5,944,755，6,110,206，6,402,783和5,902,338；美国专利申请Nos.2002/0087211，2001/0051828，2001/0039459，2003/0039678，2003/0023304和2003/0097179；以及PCT公开Nos.WO 00/47131，WO 00/47132，WO 99/44533，WO 02/076337，WO 99/51170，WO 99/47080，WO 03/097809，WO 02/089711，WO 01/91671和WO 03/105737。

因此，本领域需要提供不导致对人类的有害作用的组织移植物。

Costa等人(FASEB(2003)17：109-111)报道了通过软骨中α1，2-岩藻糖基转移酶的转基因表达(HT转基因)减少了移植到野生型和α-1，3-半乳糖基转移酶敲除小鼠中的猪软骨的迟发排斥。

已经报道了猪细胞和活动物中α-1，3-GT基因座的单等位基因敲除。Denning等人(Nature Biotechnology 19：559-562，2001)报道了绵羊中α-1，3-GT基因的一个等位基因的靶定的基因缺失。Harrison等人(Transgenics Research 11：143-150，2002)报道了杂合的α-1，3-GT敲除的猪胚胎成纤维细胞体细胞的产生。在2002年，Lai等人(Science 295：1089-1092，2002)和Dai等人(Nature Biotechnology 20：251-255，2002)报道了α-1，3-GT基因的一个等位基因被成功灭活的猪的产生。Ramsoondar等人(Biol of Reproduc 69，437-445(2003))报道了杂合的α-1，3-GT敲除的猪的产生，该猪表达HT和α-1，3-GT表位，也表达人类α-1，2-岩藻糖基转移酶(HT)。

Austin研究所的PCT公开No.WO 94/21799和美国专利No.5,821,117；Bresatec的PCT公开No.WO95/20661；以及BioTransplant，Inc和The General Hospital Corporation的PCT公开No.WO95/28412，美国专利No.6,153,428，美国专利No.6,413,769和美国公开No.2003/0014770提供了基于α-1，3-GT基因的cDNA的了解(不了解基因组组构或序列)而产生α-1，3-GT阴性猪细胞的讨论。但是，在这些申请的申请日之前没有证据表明所述细胞确实产生，并且实施例都是预言性的。

成功产生杂合的α-1，3-GT阴性猪细胞的第一次公开发生在1999年7月的Lake Tahoe转基因动物会议上(David Ayares，PPL Therapeutics，Inc.，″Gene Targeting in Livestock″，Transgenic Animal ResearchConference，July 1999，Abstract，pg.20；Ayares，IBS News Report，Nov.1999：5-6)。直到最近，还没有发表或公开杂合的α1，3 GT阴性猪细胞的产生。此外，由于目前还不能获得猪胚胎干细胞，目前仍然不能使用α-1，3-GT杂合胚胎干细胞来试图制备活的纯合α1，3GT敲除猪。

在2003年2月27日，Sharma等人(Transplantation 75：430-436(2003)发表了一篇报道，其中证明了成功产生了纯合的α-1，3-GT基因敲除的猪胚胎成纤维细胞。

PPL Therapeutics的PCT公开No.WO 00/51424描述了用于核转移的体细胞的遗传修饰。该专利申请公开了猪体细胞中α-1，3-GT基因的遗传破坏，以及随后用这些缺乏至少一个拷贝的α-1，3-GT基因的细胞的核进行核转移。

Cooper&Koren的美国专利No.6,331,658要求保护表达唾液酸转移酶或岩藻糖基转移酶蛋白的遗传工程化的哺乳动物，但其中并没有证实该动物的实际产生。该专利指出该遗传工程化的哺乳动物将表现出哺乳动物细胞表面上的半乳糖基化蛋白的减少。

密苏里大学校产管理董事的PCT公开No.WO03/055302证实了产生用于异种移植的杂合α1，3 GT敲除幼猪。该申请广泛涉及包含破坏的α-1，3-GT基因的敲除猪，其中与野生型相比，敲除猪中功能性α-1，3-GT的表达减少。该申请没有提供关于使得猪能够用于异种移植时α-1，3-GT必须减少的程度。此外，该申请并未提供任何关于产生的杂合猪表现出功能性α1，3 GT的表达减少的证据。此外，尽管该申请提到了纯合的α1，3GT敲除猪，在该申请中没有证据表明所述猪是实际产生或可以产生的，更没有提及得到的后代是否可以存活或表型上可以用于异种移植。

很明显，包含半乳糖α1，3-半乳糖的糖蛋白的完全去除是产生用于异种移植的猪的最佳方法。理论上可能的是可以通过两种方法产生双敲除体或两个拷贝的α1，3GT基因被都破坏：1)使两只单等位基因敲除动物杂交以产生后代，在此情况下，可以基于孟德尔遗传学预测，四分之一是双敲除体，或2)在具有预先存在的单敲除的细胞中进行第二个等位基因的遗传修饰。实际上，通过以下事实证明了这是非常困难的，即，尽管在1993年提交了关于敲除猪细胞的第一个专利申请，直到2002年7月才产生第一只纯合的α1，3GT敲除猪(本文中描述)。

从经验上说，转基因小鼠(不是猪)是研究对哺乳动物生理的遗传修饰效果的优选模型，这是因为一些原因，尤其是因为可以得到小鼠胚胎干细胞，而得不到猪胚胎干细胞。小鼠是用于基础研究应用的理想动物，因为它们相对容易操作，它们繁殖迅速，并且它们可以在分子水平进行遗传操作。科学家用小鼠模型研究从结肠癌到智力迟钝的多种基于遗传学的疾病的分子生理。迄今为止已经建立了成千上万的遗传修饰的小鼠。BioMedNet建立了“小鼠敲除和突变数据库”，以提供关于小鼠敲除和经典突变的表型和基因型信息的全面数据库(http://research.bmn.com/mkmd；Brandon et al Current Biology 5[7]：758-765(1995)；；Brandon et al Current Biology 5[8]：873-881(1995))，迄今为止该数据库提供了关于超过3000个独特基因的信息，所述基因靶定于小鼠基因组。

根据用小鼠获得的广泛经验，已经了解到转基因技术具有一些显著的限制。由于发育缺陷，很多遗传修饰的小鼠，特别是通过基因敲除基础建立的裸小鼠在胚胎期就死亡，使得研究者没有机会将该模型用于研究。即使小鼠存活，它们会产生显著改变的表型，这会使得它们严重残疾、畸形或虚弱(Pray，Leslie，The Scientist 16[13]：34(2002)；Smith，The Scientist 14[15]：32，(2000)；Brandon et al Current Biology 5[6]：625-634(1995)；Brandon et al Current Biology 5[7]：758-765(1995)；Brandon et al Current Biology 5[8]：873-881(1995)；http://research.bmn.com/mkmd)。此外，已经了解到不能预测特定的基因是否在生物体发育中起关键作用，因此，不能预测基因的去除是否会导致致死或改变的表型，除非成功建立敲除体，并且产生存活的后代。

已经对小鼠进行了遗传修饰以去除功能性α-1，3-GT表达。已经制备了双敲除α-1，3-GT小鼠。它们可发育存活，并且具有正常器官(Thallet al.J Biol Chem 270：21437-40(1995)；Tearle et al.Transplantation 61：13-19(1996)，也参见美国专利No.5,849,991)。但是，这些小鼠中的两种表型异常是明显的。首先，所有小鼠发生致密的皮质性白内障。其次，α-1，3-GT基因的两个等位基因的去除显著影响小鼠的发育。α-1，3-GT基因杂合的小鼠的交配产生的基因型比例显著偏离预测的孟德尔的1∶2∶1比例(Tearle et al.Transplantation 61：13-19(1996))。

猪的含有半乳糖α1，3-半乳糖的细胞表面糖蛋白的水平比小鼠中的水平高100-1000倍(Sharma et al.Transplantation 75：430-436(2003)；Galili et al.Transplantation 69：187-190(2000))。因此，α1，3-GT活性在猪中比在小鼠中更关键和更充足。

尽管已经进行了预测和预言，没有人知道破坏α-1，3-GT基因的两个等位基因是否会致死或是否会影响猪发育或导致表型改变(Ayares etal.Graft 4(1)80-85(2001)；Sharma et al.Transplantation 75：430-436(2003)；Porter&Dallman Transplantation 64：1227-1235(1997)；Galili，U.Biochimie 83：557-563(2001))。实际上，本领域的很多专家对纯合的α-1，3-GT敲除猪是否会存活表示了怀疑，更不用说正常发育。因此，除非产生了存活的双α-1，3-GT敲除猪，根据当时本领域技术人员的理解，不可能确定(i)后代是否将存活，或(ii)后代是否将展示允许将器官移植到人体中的表型。

一直存在所述忧虑，直到产生了双敲除猪。在2003年，Phelps等人(Science 299：411-414(2003))报道了缺乏α1，3半乳糖基转移酶的任何功能性表达的第一头存活的猪的产生，其代表了异种移植中的主要突破。

Revivicor，Inc提交的PCT公开No.WO 04/028243描述了缺乏任何功能性α1，3半乳糖基转移酶表达的存活的猪以及来源于其的器官、细胞和组织的成功产生。Immerge Biotherapeutics，Inc.提交的PCT公开No.WO 04/016742也描述了α1，3半乳糖基转移酶敲除猪的产生。

因此，本发明的一个目的是提供可以移植到人，而不导致显著排斥的组织产品。

本发明的另一个目的是提供用于人的整形外科重建和修复、皮肤修复和内部组织修复的来自动物的组织。

发明概述

本发明是来自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物、用作异种移植物的组织产品。该组织可以是硬组织，如骨，或软组织，如皮肤。该硬组织和软组织可以用作修复物，例如，用于整形外科重建和修复、皮肤修复和/或内部组织修复。动物可以是反刍动物或有蹄动物，如牛、猪或羊。在一种特定实施方案中，动物是猪。来自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物的组织可以获自出生前、新生、不成熟、或完全成熟的动物，如猪、牛或羊。可以根据此处描述的方法制备用于动物，如人组织修复的组织。

在本发明的实施方案中，提供了这样的组织，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活，使得得到的α-1，3-GT酶不能在细胞表面产生半乳糖α1，3-半乳糖。在一种实施方案中，α-1，3-GT基因可以转录为RNA，但不翻译为蛋白。在另一种实施方案中，α-1，3-GT基因可以转录为无活性的截短形式。这种截短的RNA可能不翻译，或可以翻译为非功能性蛋白。在另一种实施方案中，可以以不发生基因转录的方式灭活α-1，3-GT。

在本发明的一个方面，提供了这样的组织，其中通过基因靶定事件灭活了α-1，3-GT基因的至少一个等位基因。在本发明的另一方面，提供了来自动物的组织，其中通过基因靶定事件灭活了α-1，3-GT基因的两个等位基因。可以通过同源重组靶定基因。在另一个实施方案中，可以破坏基因，即，可以改变遗传密码的一部分，从而影响基因该片段的转录和/或翻译。例如，通过取代、缺失(“敲除”)或插入(“敲入”)技术，可以发生基因的破坏。也可以插入调节存在的序列转录的所需蛋白或调节序列的其它基因。

作为本发明的一方面，提供了来自动物的组织，其在α-1，3-GT基因中携带至少一个点突变。所述动物不含抗生素抗性基因，因此具有制造用于人类的更安全产品的可能。因此，本发明的另一方面是来自纯合α-1，3-GT敲除的组织，其不具有抗生素抗性或其它选择标记基因，如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、hisD或杀稻瘟菌素。在一种实施方案中，该点突变可以通过基因靶定事件发生。在另一种实施方案中，该点突变可以是天然存在的。在进一步的实施方案中，可以通过诱变剂在α-1，3-GT基因中诱导突变。在一种特定实施方案中，点突变可以是发生在α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基的T到G的突变(参见Phelps et al.Science 299：411-414(2003)的图2)。在其它实施方案中，可以存在至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少20个点突变，使得α-1，3-GT基因无活性。在其它实施方案中，提供这样的组织，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都含有防止任何功能性α-1，3-GT表达的点突变。在一种特定实施方案中，提供了这样的组织，其在α-1，3-GT基因的两个等位基因都含有发生在外显子9的第二个碱基的T到G的突变。在进一步的实施方案中，通过基因靶定事件灭活一个等位基因，由于在α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基存在T到G的点突变灭活了另一个等位基因。在一种特定的实施方案中，提供了来自动物的组织，其中通过针对外显子9的靶定构建体灭活了一个等位基因，由于在α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基存在T到G的点突变灭活了另一个等位基因(参见Phelps etal.Science 299：411-414(2003)的图2)。

在进一步的实施方案中，可以从缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物获得硬或软组织，其也可以含有其它的遗传修饰。所述遗传修饰可以包括其它基因的添加和/或缺失，以防止排斥，促进伤口愈合，和/或减少或消除有害的病原体(如，例如，朊病毒或逆转录病毒)。

在一种实施方案中，组织可以以其“天然”形式(直接从动物中取出)使用。或者，可以对组织进行进一步处理或修饰。在本发明的具体实施方案中，提供了来源于此处描述的动物或组织的去细胞的组织。其它实施方案提供了从缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物制备和获得组织的方法和过程。

在某些实施方案中，制备组织的方法可以包括以下步骤：剥离或杀死所有存活的细胞(去细胞)，仅仅留下无细胞的基质或支架，用于组织修复和重塑，以及任选进行交联和消毒处理。在具体实施方案中，提供了任何去细胞的硬或软组织，其来源于此处公开的动物。在一种实施方案中，提供了去细胞的软组织，即皮肤组织。在另一种实施方案中，提供了去细胞的粘膜下组织。在其它实施方案中，所述去细胞的材料免疫原性较低。在进一步的实施方案中，所述去细胞的组织可以用作支架或基质，以修复和/或重建特定的人体部分。在一种实施方案中，去细胞的组织可以用于修复以下部位，包括，但不限于，疝、腹壁、转子套、美容手术或任何本领域技术人员公知或此处公开的其它软组织缺损。在具体实施方案中，提供了粘膜下和/或皮肤去细胞材料。

可以进一步修饰或处理组织和组织的动物来源；减少或清除有害的病原体，如传染性疾病的传播(如朊病毒和逆转录病毒)；加入生长因子以促进组织重塑、稳定组织，和/或改进组织的生物机械或物理特性。所述处理可以是化学处理，如醇或过氧化物处理、机械或物理处理，如酶处理和/或暴露于气体、紫外线辐射或γ射线辐射。

在另一实施方案中，来自于缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物的组织可以与其它惰性材料，如塑料、金属(包括但不限于不锈钢和钛)组合，以便给受体患者提供额外的机械强度或其它益处。

在另一实施方案中，来自于缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物的组织可以用作支架，其将受体的细胞募集到移植的材料的部位。该支架也可以含有细胞外基质(ECM)成分，如可以任选来源于缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物的ECM成分。或者，该组织可以用作完整的组织置换物，例如，使得移植的组织与其替代或修复的组织起相同的生物机械功能。在进一步的实施方案中，可以在移植前对组织进行预调节(化学和/或机械调节)以使得移植后组织可以有最佳的活动范围，或使得对于受体是“适于客户的”，或提供最优的生物或生物机械特性。

在本发明的一种实施方案中，来自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬和软组织可以用于整形外科重建和修复。所述组织包括结缔组织、腱、韧带、肌肉、软骨、骨和骨衍生物。在一种实施方案中，组织可以用于关节修复，如前交叉韧带(ACL)或后交叉韧带(PCL)置换。在另一实施方案中，组织可以用于骨-腱-骨移植物、转子套修复或作为缝合栓。骨组织可以用作完整或部分的骨置换物、骨栓、骨螺丝或骨片(包括这样的制备物，其中骨片可以制备为糊)。骨组织也可以用于牙周应用或作为脊椎间隔物。

在进一步的实施方案中，来自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬和软组织可以用于皮肤修复，例如，修复皮肤的深度组织烧伤。皮肤组织包括，但不限于，真皮或表皮组织或其衍生物。

在本发明的另一方面，来自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬和软组织可以用于内部组织修复，如腹壁修复、疝修复、心脏瓣膜修复或置换、美容手术/修复、颌面修复、妇产或泌尿组织修复和硬脑膜修复。内部组织包括心包组织、心脏瓣膜和粘膜下组织。在一种实施方案中，粘膜下组织可以用于修复或置换结缔组织。

附图简述

图1描述了来自胎680B1-4的细胞上补体的相对裂解作用。

图2描述了α-1，3-GT基因(参见GenBank Acc.No.L36152)的编码区的短片段，其中通过毒素A选择点突变。上面的序列存在于野生型中，下面的序列显示了由于第二个等位基因中的点突变导致的改变。

图3是牛α1，3 GT的UDP结合位点的3维模型的示意图。可以发现酪氨酸残基的芳香环(最显著的位置，白色)紧邻UDP的尿嘧啶碱基(灰色标尺)。

图4是通过本发明的方法产生的、出生于2002年7月25日的纯合的α-1，3-GT缺陷的克隆猪的照片。

图5描述了在α-1，3-GT KO小鼠中注射小猪胰岛样细胞簇(ICC)之前和之后的抗α-1，3-gal IgM水平。每只小鼠在4天中接受连续3次ICC腹膜内注射(每次注射200-500 ICC)。野生型(WT)小猪ICC的3个受体均表现出抗α1，3Gal IgM滴度的显著升高，随后在ICC植入后4周返回基线。在35天的观察期中，注射了α-1，3-GT DKO小猪ICC的所有3只小鼠的抗α-1，3-gal IgM滴度都维持在低基线水平(Phelps etal.，Science 299：411-414，2003，图S4)。

图6是猪α-1，3-GT基因座的图示，该基因座相当于可以在α-1，3-GT敲除载体中用作5′和3′臂的α-1，3-GT基因组序列，也示出了同源重组后靶定的基因座的结构。用于3′PCR和长距离PCR的引物的名称和位置用箭头表示。短柱表示用于α-1，3-GT Southern印迹的探针。也示出了内源性α-1，3-GT基因座和α-1，3-GT靶定的基因座的BstEII消化的Southern条带的预测大小。

图7提供了关节的解剖的概括图。其显现弯曲位的右膝的正面观。

发明详述

本发明是来自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物、用作异种移植物的组织产品。该组织可以是硬组织，如骨，或软组织，如皮肤。该硬组织和软组织可以用作异种移植物，例如，用于整形外科重建和修复、皮肤修复和内部组织修复。动物可以是反刍动物或有蹄动物，如牛、猪或羊。在特定实施方案中，动物是猪。来自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物的组织可以获自出生前、新生、不成熟、或完全成熟的动物，如猪、牛或羊。

在本发明的实施方案中，使α-1，3-GT基因的等位基因无活性，使得得到的α-1，3-GT酶不能在细胞表面产生半乳糖-α1，3-半乳糖。

来自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物的组织可以获自出生前、新生、不成熟、或完全成熟的动物，如猪、牛或羊。在一种实施方案中，组织可以以其“天然”形式(直接从动物取出)使用。或者，组织可以进行进一步处理或修饰。

在本发明的一种实施方案中，来自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬组织和软组织可以用于整形外科重建和修复。在进一步的实施方案中，来自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬组织和软组织可以用于皮肤修复。在进一步的实施方案中，来自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬组织和软组织可以用于内部组织修复。

定义

此处用到(如“遗传修饰的(或改变的)动物”中用到)的术语“动物”包括任何非人动物，特别是任何非人哺乳动物，包括但不限于猪、绵羊、山羊、牛、鹿、骡、马、猴、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼和昆虫。在本发明的一种实施方案中，提供了遗传改变的猪及其制备方法。

此处用到的“器官”是有组织的结构，其可以由一种或多种组织构成。“器官”行使一种或多种特定的生物功能。器官包括，但不限于，心脏、肝、肾、胰、肺、甲状腺和皮肤。

此处用到的“组织”是有组织的结构，包括细胞和围绕它们的细胞内物质。单独的或与其它细胞或组织组合的“组织”可以行使一种或多种生物功能。组织可以是硬组织或软组织。“组织产品”包括此处描述的组织和/或组织碎片或组织衍生物。“组织产品”可以用于置换或修复人组织。可以根据此处描述的方法对所述“组织”进行修饰，例如，但不限于去细胞。

此处用到的术语“猪”是上位术语，是指相同类型的动物，而不论其性别、体型或品种。

此处用到的术语修复物或修复装置是指制成合适的形状用于身体修复的硬组织或软组织。在一种实施方案中，修复的身体可以是人体。在其它实施方案中，可以修复哺乳动物的身体部分，如马、狗、猫或其它家养动物。

I.组织的类型和制备

来自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物的组织可以获自出生前、新生、不成熟、或完全成熟的动物，如猪、牛或羊。

在一种实施方案中，组织可以以其“天然”形式(直接从动物中取出)使用。在替代的实施方案中，可以对组织进行进一步处理或修饰。可以对组织和组织的动物来源进行进一步修饰或处理，以促进伤口愈合；减少或消除有害的病原体，如传染性疾病的传播(例如，朊病毒或逆转录病毒)；加入生长因子以促进组织重塑、稳定组织，和/或改进组织的生物机械或物理特性。

在一种实施方案中，处理的类型可以是化学、机械或物理处理，如酶处理和/或暴露于气体、环氧乙烷处理、环氧乙丙烷处理、等离子体气体消毒、过乙酸消毒、紫外线辐射或γ射线辐射。本发明的方法包括单独或组合的辐射处理、一个或多个周期的冻融、化学交联剂处理、醇或臭氧处理。当将一种以上的所述处理用于异种移植物时，这些处理可以以任何顺序进行。

在一种实施方案中，可以通过暴露于紫外线辐射，例如，暴露于紫外线辐射大约15分钟而处理异种移植物组织。在另一种实施方案中，组织可以暴露于γ射线辐射。组织可以暴露于0.5，1.0， 1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.0，10，15或20兆拉德的γ射线辐射。在进一步的实施方案中，异种移植物可以进行臭氧处理。在另一种实施方案中，可以根据接受的消毒标准进行处理，例如，参见American NationalStandard，ANSI/AAMI/ISO 11137-1994，Sterilization of health careproducts-Requirements for validation and routine control-Radiationsterilization，1994，American National Standard，ANSI/AAMI ST32-1991，Guidelines for Gamma Radiation Sterilization，1991，Scholla，M.H.and Wells，M.E.″Tracking Trends in Industrial Sterilization.″Medical Device and Diagnostic Industry，September 1997，pp.92-95，AAMI Recommended Practice-″Process Control Guidelines for GammaRadiation Sterilization of Medical Devices，″ISBN No.0-91027538-6，pp.7-21，1984，American National Standard，ANSI/AAMT/ISO 11137-1994，Sterilization of health care products-Requirements for validationand routine control-Radiation sterilization，1994，American NationalStandard，ANSI/AAMI ST32-1991，Guideline for Gamma RadiationSterilization，1991，American National Standard，ANSI/AAMI ST31-1990，Guideline for Electron Beam Radiation Sterilization of MedicalDevices，1990，Genova，Hollis，Crowell and Schady，″A Procedure forValidating the Sterility of an Individual Gamma Radiation SterilizedProduction Batch，″Journal of Parenteral Science and Technology，Volume.41，No.1，pp.33-36，Jan 1987，和Gaughran and Morrissey，″Sterilization of Medical Products，″Volume 2，ISBN-0-919868-14-2，pp35-39，1980。

在另一种实施方案中，可以在醇溶液中浸泡处理异种移植物组织。可以用任何醇溶液进行该处理，包括，但不限于，一元醇、二元醇、三元醇、多元醇、高级醇、芳香醇，如苯酚、杂芳香醇、乙醇、甲醇、丙醇、甲基丙醇、异丙醇、2-丙醇、环丁醇、1，2乙二醇、4，4-二甲基-2-戊醇、4-戊-2-醇、4-氨基-3-异丙基己醇、5-巯基-2，4-环己二烯醇。醇溶液可以是10，20，30，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98或99％的醇。例如，70％的异丙醇溶液。可以在室温下(例如，约20-30℃或25℃)或低温下(例如约0-20℃)使用醇溶液。

在进一步的实施方案中，可以通过冻/融循环处理异种移植物组织。例如，可以用任何冷冻方法对异种移植物组织进行冷冻。在一种实施方案中，组织是完全冷冻的，使得不保留含有未冷冻组织的内部暖点。在一种实施方案中，异种移植物组织可以浸泡在液氮中一段时间。可以将组织浸泡大约至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或15分钟。在另一实施方案中，异种移植物可以是冷冻的。例如，组织可以放置在冷冻装置中，或将组织暴露于0℃或0℃以下的温度。然后，在接下来的冻/融循环处理中，可以通过浸泡在合适的溶液，例如等渗盐水浴中而使异种移植物组织解冻。水浴的温度可以是大约在室温，例如，约25℃。可以将组织浸泡在盐水浴中一段时间，使得其解冻，例如，浸泡至少5分钟、至少10分钟或至少15分钟。在其它实施方案中，可以在冻-融处理前或过程中用冷冻保护剂处理组织。

在进一步的实施方案中，可以将异种移植物暴露于化学试剂以进行鞣制，或使细胞外基质内的蛋白交联。可以将任何鞣制或交联试剂用于该处理，可以进行一个以上交联步骤，或可以用一种以上的交联剂获得高度交联。交联剂可以通过例如以下途径起作用：将一个生物分子上的胺基团与第二个生物分子上的硫醇基团偶联，在生物聚合物的胺之间形成交联、使胺和硫醇交联，在胺和羧酸或硫醇和羧酸之间形成交联。

在一种实施方案中，可以用醛，如戊二醛、甲醛、低聚甲醛、福尔马林、醛、己二醛、在酸性pH下鞣制等来交联组织的细胞外基质内的胶原。在另一种实施方案中，可以将脂族和芳香二胺、碳二亚胺、二异硫氰酸酯和其它本领域公知的材料用作交联剂。在一种实施方案中，可以用戊二醛处理异种移植物组织。例如，可以将组织放置于缓冲的溶液中，该溶液中含有至少0.25，0.5，1，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，9，10，15或20％或约0.05-约5.0％；约1-3％或约2-7％戊二醛。该溶液的pH可以是大约7.4、7.5或7.6.可以使用任何合适的缓冲液，如磷酸缓冲液或三羟基甲基氨基甲烷。在替代的实施方案中，可以用蒸气形式的交联剂处理异种移植物组织。在一种实施方案中，交联剂可以是汽化的醛交联剂，例如，汽化的甲醛。在一种实施方案中，组织可以暴露于浓度为至少0.25，0.5，1，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，9，10，15或20％或约0.05-约5.0％；约1-3％或约2-7％的汽化的交联剂。在另一种实施方案中，汽化的交联剂的pH可以是大约7.4、7.5或7.6。在另一种实施方案中，可以用交联剂处理组织至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15或至少16天。在特定的实施方案中，可以用交联剂处理组织3、4或5天。

交联剂也可以选自包括但不限于以下交联剂的组：二硫苏糖醇(DTT，D-1532)、三-(2-羧乙基)膦(TCEP，T-2556)、三-(2-氰乙基)膦(T-6052)、3-(2-吡啶基二硫)丙酸琥珀酯(SPDP，S-1531)、乙酰基硫代乙酸琥珀酯(SATA，S-1553)、巯基色氨酸、组合的SPDP/DTT、组合的SPDP/TCEP、dibromobimane(D-1379)、BODIPY FL二-(亚甲基碘乙酰胺)(D-10620)、二-((N-碘乙酰基)哌嗪基)砜罗丹明(B-10621)、二(亚氨酯)、二(琥珀酰酯)、二异硫氰酸酯、二酸式氯化物、二-(4-羧基哌啶基)砜罗丹明、二(琥珀酰酯)(B-10622)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC，E-2247)、6-((丙烯酰)氨基)己酸(丙烯酰-X，SE；A-20770)的琥珀酰酯，以及链亲和素丙烯酰胺(S-21379，Section7.5)。

在另一种实施方案中，来自缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物的组织可以与其它惰性材料，如塑料、生物聚合物和金属(包括但不限于不锈钢和钛)组合，以便提供额外的机械强度或给受体患者提供其它应用益处。生物聚合物包括，但不限于纤维素、藻酸、脱乙酰壳多糖、胶原、弹性蛋白和网硬蛋白，及其类似物和混合物。

在其它实施方案中，修复物可以进一步包括合成材料，如聚合物和陶瓷。合适的陶瓷包括，例如，羟磷灰石、氧化铝、石墨和热解碳。合适的合成材料包括水凝胶和其它不能承受严重脱水的合成材料。异种移植物也可以包含合成聚合物和纯化的生物聚合物。这些合成聚合物可以编织或编结成网，以形成基质或相似结构。或者，合成聚合物材料可以模塑或铸造成合适的形状。

合适的合成聚合物包括，但不限于，聚酰胺(如尼龙)、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯基聚合物(如聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚二甲基硅氧烷、乙酸纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯乙酸乙烯酯、聚砜、硝基纤维素和相似的共聚物。也可以使用可生物重吸收的聚合物，如右旋糖苷、羟乙基淀粉、明胶、明胶衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、聚(羟酸)、聚(ε-己内酯)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(二甲基乙醇酸)、poly(hydroxy buterate)和相似的共聚物。这些合成聚合物材料可以编织或编结成网，以形成基质或相似结构。或者，合成聚合物材料可以模塑或铸造成合适的形状。

生物聚合物可以是天然存在的或者通过发酵等或通过重组基因工程而体外制备。可以用重组DNA技术对几乎任意的多肽序列进行工程化，然后在细菌或哺乳动物细胞中扩增和表达蛋白。通过诸如编织、编结、铸造、模塑、挤压、细胞排列和磁排列的技术，可以使纯化的生物聚合物合适地形成基质。合适的生物聚合物包括，但不限于，胶原、弹性蛋白、丝、角蛋白、明胶、多氨基酸、多糖(如纤维素和淀粉)及其共聚物。

在一种实施方案中，该组织可以用作完整的组织置换物，例如，使得移植的组织与其置换或修复的组织起相同的生物机械功能。在进一步的实施方案中，可以在移植前对组织进行预调节(化学和/或机械调节)以使得移植后组织可以有最佳的活动范围，或使得对于受体是“适于客户的”。在进一步的实施方案中，可以按照上文所述进一步处理和/或加工组织，以形成去细胞的产品，例如，一旦植入，可以将其用作支架。

A.组织重建、修复和/或置换

在本发明的一种实施方案中，来自于缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬和软组织可以用于手术应用。在一种实施方案中，组织可以用于整形外科重建和修复。所述组织包括软组织，如结缔组织、腱、韧带、肌肉和软骨，以及硬组织，如骨和骨衍生物。在一种实施方案中，组织可以用于关节修复，如前交叉韧带(ACL)或后交叉韧带(PCL)置换。在另一实施方案中，组织可以用于骨-腱-骨移植物、转子套修复或作为缝合栓。骨组织可以用作完整或部分的骨置换物、骨栓、骨螺丝或骨片(包括这样的制备物，其中骨片可以制备为糊)。骨组织也可以用于牙周应用、美容和/或颌面修复。该组织也可以用作脊柱修复中使用的脊椎间隔物。该组织也可以用于置换耳组织，如听小骨、鼓膜、连接了锤骨的鼓膜、耳骨栓、颞骨、肋软骨和硬脑膜)，其可以任选用于内耳重建。

1.骨组织

在一种实施方案中，本发明提供了制备用于植入或移植到人的骨异种移植物的方法，该方法包括从动物取出骨的至少一部分或整片的骨，以提供异种移植物。

可以从任何非人动物获得骨，以制备本发明的异种移植物。在一种实施方案中，可以从牛、羊或猪获得骨。在另一种实施方案中，从未成熟的猪、牛或小羊获得骨。幼年动物的骨具有更多的松质骨，通常没有老年动物的骨易碎。在另一种实施方案中，从6-18月龄的动物获得骨。

可以从动物的骨取出完整的骨部分。可以从新处死的动物收集骨。或者，可以从活动物手术取出骨。取出的骨可以包括，但不限于颅骨，如前、侧或后颅骨；脊椎，如颈椎(寰椎、枢椎、典型颈椎)、胸椎(上、下)、腰椎(上、下、侧)、骶骨、骨盆、胸廓、胸骨、肋骨、上肢骨、肩胛骨、腹骨、背骨、锁骨、肱骨(前或后)、桡-尺骨(前或后)、手骨(背侧或掌侧)、股骨(前或后)、胫-腓骨(前或后)和/或足(背侧或外侧)。在一种实施方案中，取出后，可以将骨放置于合适的无菌等渗溶液或其它组织保存液中。屠宰后对骨部分的获取可以在屠宰后尽早进行，并且可以在低温下进行。例如，约5℃-约20℃，约0℃-约20℃，约0℃-约10℃或约0℃-约25℃。

然后可以在无菌的、任选冷的水中清洗，以除去残留的血液蛋白和水溶性材料。在一种实施方案中，随后可以在例如上文所述的条件下将异种移植物组织浸泡在醇中。异种移植物可以进行如上文所述的化学、机械或生物处理。

在一种实施方案中，可以将获得的骨部分切割成条或块。在另一种实施方案中，获得的骨可以制成任何有用的骨移植物构型，包括，但不限于骨销、脊椎间隔物、骨栓、骨片、骨螺丝、骨水泥、D形间隔物和皮质环。可以制备条、块或其它骨移植物，使得松质骨附着于皮质骨。或者，可以制备条、块或其它骨移植物，使得松质骨不附着于皮质骨。

骨水泥和骨栓

在本发明的其它实施方案中，提供了来自缺乏任何功能性α-1，3-GT表达的骨水泥和骨栓。

骨水泥组合物可以用于植入材料的粘结或固定，以及加强破坏的天然骨。所述应用在例如整形外科、牙科和相关医学学科的领域中有用。整形外科领域处理由于骨折、骨肿瘤和骨的其它疾病导致的骨缺损。处理可能需要手术切除骨的全部或部分。在牙科应用中，可能由于拔牙、癌症或其它疾病导致颚骨缺损。植入材料在修复或重建所述骨缺损的切除后保留的骨中有用。在所述程序中使用的植入材料可以是金属、陶瓷和聚合物。骨水泥可以和其它植入材料一起使用，用于将植入物粘结和固定到保留的存活骨。例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)已经广泛地与硬件一起用于整形外科中。

尽管常规PMMA骨水泥在整形外科手术中的应用已经超过了40年，它还远远不是理想的，因为1)它不促进骨向内生长，2)它是比骨皮质弱的工具，和3)它具有高的放热曲线和单体毒性。因此，本发明提供了基质材料，如此处描述的那些，其可以配制为骨水泥。所述骨水泥可以表现出迅速的硬化时间和/或化学粘结，以固定人工生物材料(如植入材料)。该水泥可以表现出体内生物活性，保持机械强度，特征在于足够的硬度和模数，和/或通过其物理和化学作用改进骨量。骨水泥可以包括粉末和液体成分。在一种实施方案中，在包含粉末相材料和液相材料的粉末-液相中提供生物活性骨水泥。在另一种实施方案中，在包含两种分离的糊材料的糊-糊相中提供生物活性骨水泥。此外，此处提供的骨水泥材料可以与其它类型的骨水泥成分，如PMMA骨水泥混合。可以用任何常规方式使用骨水泥，如经注射器注射。本发明的骨水泥可以用于，例如通过注射器注射而进行的脊柱手术中。注射器注射通过注射器和大孔针头的使用，提供了侵入性最小的送递技术。其也允许水泥精确适合放置其的部位。此外，可以将骨水泥或糊与生长因子或细胞因子混合，包括，但不限于骨形态发生蛋白(BMPs)。

骨栓可以用于长期或暂时阻塞长骨中的管道。为了固定内修复物或人工关节，例如骨内的人工髋关节修复物，将修复物的茎插入填充了骨水泥的长骨中的骨髓内管道。为了防止骨水泥在管道中的突出超过固定茎所必须的程度，并且为了保证骨水泥仅仅存在于茎和骨的内壁之间，并且为了防止骨水泥进一步渗漏到骨髓内管道，用骨栓阻塞茎下的管道(参见，例如，美国专利6,669,733，6,494,883)。

可以将骨栓模塑为各种大小，并且具有多种高与直径的比例，以便适合多种软骨置换情况。骨栓的横切面可以是多边形或圆形。例如，骨栓可以是具有从平片到圆柱形状的圆形装置。对于每种应用，可以考虑多种因素，如要植入骨置换栓的位置、要修复的骨缺损的大小和要植入软骨置换栓的空腔的大小和形状，所述空腔是最初通过切除缺损形成的，或通过随后对腔进行的手术造型而形成的。

也可以使用骨水泥栓，这种装置是本领域公知的。骨水泥栓可以与骨水泥分配器一起使用，以便在将修复装置固定在骨管道之前将骨水泥压实到骨管道中。举例说明，骨水泥栓可以与骨水泥分配器一起使用，以便在将人工髋的股骨茎固定在管道中之前，将骨水泥压实到股骨的骨髓内管道中。更具体地，在全关节置换手术中，如髋和肩置换手术中，可以用骨水泥将修复装置的茎固定到关节骨的骨髓管道中。在此方面，通常发现如果在修复装置的茎放置到骨管道中之前将骨水泥很好地装填到骨管道中，则修复装置将更牢固地固定在骨管道中。在一个实例中，在最初准备和清洁骨管道后，通常用栓阻塞管道的远端部分。骨水泥栓可以限制骨水泥不受控制地流入骨管道的远端部分。在一种特定实施方案中，骨水泥栓可以限制骨水泥柱在超过修复物茎的远端尖大约1-2cm的范围内。栓设置在骨管道的远端部分后，可以用具有长喷嘴的骨水泥分配器将骨水泥注入邻近栓的阻塞的骨管道的最远端部分。然后可以以倒退方式用骨水泥填充骨管道，这是通过将骨水泥分配器的喷嘴从骨管道的远端拉到骨管道的近端，此时从喷嘴释放出水泥。这种倒退填充有助于避免将空气包裹在骨管道的最远端部分。用骨水泥填充骨管道后，可以将骨管道加压器连接于骨水泥分配器。加压器对骨的开口端施加压力，以便阻塞骨管道的近端。然后可以通过加压器，在压力下将更多的水泥注入骨管道中。在所述加压条件下，骨管道中的水泥突出到限定骨管道的骨壁内表面的空隙中。当此后骨水泥固定后，可以在水泥和骨壁内表面的不规则物之间建立微联锁。这可以显著增强修复装置在骨管道中的固定。

在一种实施方案中，骨水泥栓可以很容易在骨管道中需要的深度放置，有效关闭该骨管道，并且，在骨水泥栓随后需要取出的情况下，容易从骨管道的远端取回。

多种骨水泥栓都是本领域公知的。参见，例如，美国专利Nos.4,245,359；4,276,659；4,293,962；4,302,855；4,344,190；4,447,915；4,627,434；4,686,973；4,697,584；4,745,914；4,936,859；4,950,295；4,994,085；5,061,287；5,078,746；5,092,891；5,376,120；4,011,602；4,523,587；4,904,267，6,299,642，6,306,142和5,383,932，以及WO94/15544。

用于移植骨栓的手术技术可以包括通过在破坏部位钻或切割一个孔而取出破坏的骨组织，用骨栓栓塞该孔。可以用手术器具从缺乏任何功能性α-1，3-GT的动物获取或拔取骨栓。然后可以在受体部位将骨栓植入预先形成的孔。常规的获取器具可以包括在远端具有切割缘的管。为了拔取栓，可以将仪器伸入供体部位的骨中，然后取出，其上带有骨组织栓。

骨螺丝

在另一实施方案中，提供了来源于缺乏任何功能性α-1，3-GT表达的动物的骨螺丝。

减少骨折的一种方法可以使用外部固定装置，其允许骨折加固为高度临界的区域，特别是接近于关节的那些，或者允许处理涉及皮肤组织严重破坏的骨折，这种骨折用传统的打石膏法可能是不合适或不可行的。这种装置通常具有复杂的构造并且以多种构型提供，以便适于最不可预测的偶然状况，这种装置具有相对的两端，扣紧在破裂骨各自的未破坏的部分，这种扣紧是通过使用牢固设置在这些部分的骨材料中的螺丝而实现的。因此，例如在胫骨骨折的情况下，跨骨折区固定相应(胫骨)固定装置的相对末端。在其它情况下，当骨折涉及关节如踝关节时，相应外部固定装置的骨螺丝设置在胫骨和距骨中。

用于扣紧外部固定装置，并因此确保装置有效的骨螺丝可以包括设计用于由合适的驱动装置啮合的螺丝头，和具有螺纹部分的螺丝杆，其通常朝着所述头相对端的螺丝尖逐渐变细。螺丝头可以由平行于螺丝轴延伸的平面形成，磨铣在螺丝杆的一侧上。骨螺丝可以是各种长度，使得螺丝适合其可以插入的骨的特定大小和形状。

脊椎间隔物

在本发明的其它实施方案中，提供了来自缺乏任何功能性α-1，3-GT表达的动物的脊椎骨的任何部分。所述成分包括，但不限于脊椎间隔物、椎间盘、髓核和/或纤维环。

脊椎融合适于为脊椎运动疼痛和诸如结构畸形、创伤性不稳定、退化性不稳定和切除术后因治疗而引起的不稳定的病症提供脊柱的稳定化。融合或关节固定术是通过在相邻的运动区段之间形成骨桥而实现的。这可以在椎间盘间隙、前部在连续的椎体之间或后部在连续的横突、椎板或其它在后的部位之间实现。成功的融合需要成骨细胞或有成骨潜能的细胞、重组的血液供应、足够的炎症反应和合适的局部骨准备的存在。

可以进行融合或关节成形术来治疗涉及椎间盘的畸形。位于相邻椎骨的终板之间的椎间盘使脊柱稳定，在椎骨间分布力，并且衬垫椎体。正常的椎间盘包括半凝胶状成分即髓核，其由更外部的纤维状的环围绕和限制，所述环称作纤维环。在健康的、未受破坏的脊柱中，纤维环防止髓核突出到椎间盘间隙外。

椎间盘可以由于创伤、疾病或衰老而易位或破坏。纤维环的破坏使得髓核突出到椎管中，这种状况通常称作椎间盘突出或椎间盘破裂。突出的髓核可以压迫脊神经，导致神经破坏、疼痛、麻木、肌肉萎缩和瘫痪。椎间盘也可以由于正常衰老过程或疾病而破坏。随着椎间盘脱水和硬化，椎间盘间隙高度将减少，导致脊柱不稳定，运动性降低和疼痛。这些状况的一种治疗方法是椎间盘切除术，或手术去除椎间盘的一部分或全部，然后融合相邻的椎骨。破坏的或不健康的椎间盘的去除可以使得椎间盘间隙塌陷。椎间盘间隙塌陷会导致脊柱不稳定、关节力学异常、关节或神经破坏的过早发生、以及严重疼痛。通过椎间盘切除术和关节固定术缓解疼痛，需要保留椎间盘间隙，并且最终融合受影响的运动区段。

可以用骨移植物或脊椎间隔物填充椎间隙，以防止椎间盘间隙塌陷，并且促进相邻椎骨跨椎间盘间隙的融合。很多在除去椎间盘后恢复椎间盘间隙的尝试都依赖于金属装置(参见，例如，美国专利4,878,915，5,044,104；5,026,373，4,961,740；5,015,247，5,147,402和5,192,327)。

可以根据常规方法制备来自缺乏功能性α-1，3-GT表达的动物的脊椎成分。可以从动物获得骨，然后进行清洁以除去组织和血液。可以用诸如醇和过氧化物的试剂或上文描述的其它试剂处理骨，以除去细胞物质、脂肪和非胶原蛋白。可以处理骨材料以除去游离胶原，留下结合的或结构胶原。用于除去游离胶原和任何残留脂肪的一种试剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。

2.软组织

软组织连接、支持或围绕身体的其它结构和器官。软组织包括，例如，肌肉、腱、脂肪、血管、淋巴管、神经、围绕关节的组织、皮肤或除骨之外的任何其它组织。

可以从动物的关节提取软组织，如结缔组织、腱、半月板、韧带、肌肉和软骨。可以从新处死的动物收集组织来源。或者，可以从活动物手术取出组织。任何关节都可以作为软组织来源。在本发明的实施方案中，来自相应供体关节的组织可以用于制备异种移植物组织。例如，来自股骨-胫骨关节的软骨可以用于制备植入关节的软骨异种移植物。在另一实例中，来自供体动物髋关节的软骨可以用于制备人髋关节的软骨异种移植物。

在一种实施方案中，可以从膝关节提取软骨组织。关节是含有空间上相关的骨、韧带和软骨结构的复杂关节，骨、韧带和软骨结构相互作用，产生多种运动。具体地，股骨髁与胫骨的平台通过软骨性的内侧和外侧半月板形成关节，所有这些成分都由多个韧带保持位置。基本上有四条独立的韧带稳定膝关节(参见，例如，图7)。关节的两侧是内侧副韧带(MCL)和外侧副韧带(LCL)，其作为关节的侧向稳定的稳定物。MCL是较宽的韧带，其实际上由两个韧带结构组成，即，深和浅成分，而LDL是独特的索样结构。在关节中心的前部是前交叉韧带(ACL)。该韧带是胫骨上的股骨的非常重要的稳定物，并且防止胫骨在迅速运动、跳和减速活动中旋转和向前滑。ACL后面紧接是其相对的后交叉韧带(PCL)。PCL防止胫骨滑到后面。

内侧和外侧半月板是包含称作纤维软骨细胞的细胞、蛋白胶原的纤维形成的间隙基质和蛋白聚糖形成的基质的结构。未受破坏的半月板通过确保膝关节内相互作用的骨面的合适的力分布、稳定和润滑而提供震荡缓冲，其通常暴露于正常运动期间重复的压迫负荷。内侧和外侧半月板的许多震荡缓冲功能来源于软骨固有的弹性特征。当半月板由于损伤、疾病或炎症而受到破坏时，膝关节中发生关节改变，随后丧失功能。

关节的前交叉韧带(ACL)的功能是防止所有弯曲位时胫骨从股骨向前易位。ACL也防止伸展过度，并且在胫骨内旋和外旋过程中有助于完全伸展的膝关节的旋转稳定性。ACL可能在本体感受中起作用。ACL由包含细胞、水、胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白、弹性蛋白和其它糖蛋白的结缔组织结构组成(参见，例如，Cyril Frank，M.D.et al.，Normal Ligament：Structure，Function，and Composition.Injury andRepair of the Musculoskeletal Soft Tissues，2：45-101)。结构上，ACL连接于胫骨髁间隆突前面的凹陷，向后向上延伸到外侧股骨髁的内侧壁。ACL的部分或完全撕裂是非常常见的，每年在美国有大约30,000次门诊。

关节软骨覆盖了形成人和动物关节的所有骨的末端。软骨由称作纤维软骨细胞的细胞和胶原纤维形成的细胞外基质以及多种蛋白聚糖组成。软骨在关节中作为力分布的机制并且作为骨接触区中的润滑剂。没有关节软骨，压力聚集和摩擦将发生到使关节不易运动的程度。失去关节软骨通常导致疼痛性关节炎和关节运动减少。由于成人中的关节软骨在破坏时不天然变性到显著的程度，已经通过包括修复、置换或切除的多种手术干预治疗了受到破坏的成人关节软骨。

在一种实施方案中，可以通过首先切断膝腱而从关节提取半月板软组织，然后可以解剖出不含粘连组织的半月板。任选地，小量的骨可以保持与角连接，所述角例如骨的基本为圆柱形的栓，例如骨栓。在一个特定实例中，骨栓的直径可以是大约5毫米，深度是大约5毫米。在一种实施方案中，随后可以鉴定半月板滑膜连接处，并且与半月板组织分离，以形成基质材料。在另一种实施方案中，可以将完整的半月板软组织用于移植。

在另一种实施方案中，可以从关节提取关节软骨软组织。在一种实施方案中，可以鉴定带有一小层软骨下骨的一薄层关节软骨，并且从供体关节刮下，这可以形成基质材料。在另一实施方案中，可以将完整的关节软骨软组织用于移植。

在进一步的实施方案中，可以从关节提取韧带软组织，如前交叉韧带、后交叉韧带、外侧副韧带或内侧副韧带。为了取出韧带，可以用标准手术技术打开关节。在一种实施方案中，可以获取带有连接于一端或两端的一块骨的韧带。在一个实例中，可以提取带有韧带的代表基本上为圆柱形的栓的一块骨，骨栓可以是直径大约9-10mm，长度大约20-40mm。在另一种实施方案中，获取不带有骨的韧带。在进一步的实施方案中，可以获得不带有骨的韧带，然后解剖出来，使其不带有粘连的组织，以获得基质材料。在另一种实施方案中，可以将完整的韧带软组织用于移植。

取出后，可以将组织放置于合适的无菌等渗溶液或其它组织保存溶液中。屠宰动物后对组织的获取可以在屠宰后尽早进行，并且可以在低温下进行。例如，约5℃-约20℃，约0℃-约20℃，约0℃-约10℃或约0℃-约25℃。

胶原

在另一实施方案中，本发明的胶原组织可以用于治疗胶原病。由胶原蛋白的异常基因或异常加工导致的胶原结构改变导致了多种疾病，如Larsen综合征、坏血病、成骨不全和Ehlers-Danlos综合征。Ehlers-Danlos综合征实际上是与至少10种不同的病症相关的名称，所述病症在生化和临床上是不同的，但都表现出由于胶原结构的缺陷导致的结缔组织结构缺陷。成骨不全也包括不止一种病症。已经鉴定了至少4种生化和临床上可区分的病症，它们的特征都在于多发性骨折和导致的骨畸形。马凡氏综合征自身表现为结缔组织的病症，并且认为是异常胶原的结果。但是，最近的证据表明马凡氏综合征是由细胞外蛋白即肌原纤蛋白的突变导致的，该肌原纤蛋白是细胞外基质的非胶原性微纤维的组成部分。

表3：胶原病

病症	胶原缺陷	症状
			Ehlers-Danlos IV	III型胶原减少	动脉、间质和子宫破裂，皮肤薄，容易擦伤
Ehlers-Danlos V	交联减少	皮肤和关节伸展性过高
			Ehlers-Danlos VI	羟赖氨酸减少	伤口愈合差，肌肉-骨骼畸形，皮肤和关节伸展性过高
Ehlers-Danlos VII	N-末端肽原未除去	皮肤容易擦伤，髋关节脱臼，伸展性过高
			成骨不全	I型胶原减少	蓝色巩膜、骨畸形
坏血病	羟脯氨酸减少	伤口愈合差，生长缺陷，毛细血管脆弱

软骨栓

在其它实施方案中，提供了从缺乏任何功能性α-1，3-GT表达的动物获得的软骨栓。软骨栓可以用于填充天然软骨中的空缺。天然软骨中的空缺可能是由于创伤或慢性疾病。或者，软骨栓可以用于将可流动的聚合物锚定到软骨下骨。可以将软骨栓制成适于需要的移植物的任何大小、形状和轮廓。可以使用单个或多个软骨栓来填充用于任何应用的任何大小的空缺。软骨栓可以由分层的结构形成，或者包含分层的结构，以便匹配修复位点的生理需要。此外，可以在每个栓的周围形成脊，以促进其锚定到围绕的软骨、骨和/或邻近的栓(参见，例如美国专利No.6,632,246)。

软骨栓的横切面可以是多边形或圆形。多边形或圆形横切面可以包括约小于1∶1到约20∶1、约30∶1或约40∶1的高与直径的比例。可以将栓模塑为多种大小以及具有多种高与直径的比例，以适合多种软骨置换状况。例如，栓可以是圆形装置，具有从平片到圆柱形状的圆形装置。对于每种应用，可以考虑多种因素，如要植入软骨置换栓的位置、要修复的软骨缺损的大小和要植入软骨置换栓的空腔的大小和形状，所述空腔是最初通过切除缺损形成的，或通过随后对腔进行的手术造型而形成的。例如，具有平坦的圆片形状的软骨置换栓装置最适用于较广泛但是浅的缺损，而高与直径的比例大的装置适于具有小的表面积，但是在软骨和/或软骨下骨层中延伸得更深的缺损。

可以处理本发明的软骨栓的表面，以暴露多孔或粗糙的表面。通过处理栓的表面使其粗糙或具有纹理，可以增强细胞附着并且允许细胞迁移和组织层的过度生长。具有了合适的表面粗糙度，得到的细胞可以通过向上和向内生长到栓的表面而附着，从而增强固定。所述细胞向内生长可以最终转化为与栓形成的骨界面，并且认为是需要的特征。该转化的重要性是负荷物如何从装置转移到周围的组织。栓和周围组织之间的畸形中的大的错配，会导致栓周围的纤维组织层尽管是柔性的，但不能提供需要的固定。当考虑生物固定时，孔隙度与粗造度一样，可以是重要和有益的。

缝合锚

本发明中提供的软组织可以用于形成缝合锚，所述缝合锚可以用于固定关节重建手术和关节镜手术程序过程中在骨内形成的开口内的缝线。可以将该锚放置在骨中，并且连接于原本不能固定于致密的骨材料的缝线。所述缝合锚可以用于例如在膝、肩和肘重建和修复手术中将韧带或腱锚定到骨。骨锚的重要特性在于它们容易插入，并且提供了牢固的锚。手术后锚的无意脱落具有严重的不良后果，因此锚抵抗连接的缝线施加的牵引力或拉力的能力非常重要(参见，例如，美国专利4,738,255，4,013,071，4,409,974，4,454,875和5,236,445)。

本发明还提供了将缝线锚定于骨的方法。首先，可以在骨中钻一个孔。然后可以插入骨锚，首先插入其远端。可以通过锚的开口的近端将扩展工具，如具有长方形或椭圆形横切面的杆插入扩展室。然后旋转该工具，随着工具旋转，使工具与壁接触，从而扩展骨锚的槽式近端。工具的长方形或椭圆形横切面允许其在接触壁之前通过至少一部分回转而旋转，使得骨锚不容易随着工具旋而转。在一种实施方案中，工具的远端尖安装在扩增室远端的相应凹槽中。凹槽提供了固定的支点，杆可以围绕该支点旋转以扩展锚。

3.支架

在某些实施方案中，准备组织的方法可以包括以下步骤：剥离或杀死所有存活的细胞(去细胞)，仅仅留下无细胞的基质或支架，用于组织修复和重塑，以及任选进行交联和消毒处理。在具体实施方案中，提供了任何去细胞的硬或软组织，其来源于此处公开的动物。在一种实施方案中，提供了去细胞的软组织，即皮肤组织。在另一种实施方案中，提供了去细胞的粘膜下组织。在其它实施方案中，所述去细胞的材料免疫原性较低。在进一步的实施方案中，所述去细胞的组织可以用作支架或基质，以修复和/或重建特定的人体部分。在一种实施方案中，去细胞的组织可以用于修复以下部位，包括，但不限于，疝、腹壁、转子套、美容手术或任何本领域技术人员公知或此处公开的其它软组织缺损。在具体实施方案中，提供了粘膜下和/或皮肤去细胞材料。

在本发明的一方面中，可以取得(获取)来源于这些α1，3GT动物的组织，然后进一步加工以形成去细胞的组织，例如，用作支架。在一种实施方案中，组织可以进行多步加工，包括，但不限于用稳定溶液处理组织、除去细胞和任何残留的抗原性组织成分的去细胞加工、酶处理、交联以改进组织的结构完整性或除去任何残留的抗原组织成分、消毒以除去和/或灭活天然病毒，和/或长期保存方法。在一种实施方案中，稳定溶液可以含有合适的缓冲液、一种或多种抗氧化剂、一种或多种渗透压调节剂(oncotic agent)、抗生素，并且可以包含一种或多种蛋白酶抑制剂。

在其它实施方案中，加工组织以产生去细胞的组织可以包括，例如，除去可以导致组织排斥和移植失败的细胞，而不破坏基质。去细胞过程具有以下优点：使得组织与合成物的强度一样，但更柔韧，保留张力和功能性特征，有助于防止粘附、减少感染和移植物排斥，并且促进周围宿主组织的重塑。在其它实施方案中，可以用许多化学处理完成去细胞，包括在某些盐、去污剂或酶中温育，和/或真空/压力处理。在一种实施方案中，去污剂可以是Triton X-100(Rohm and HaasCompany of Philadelphia，Pa.)。在某些实施方案中，Triton X-100除去细胞膜，参见，例如，美国专利4,801,299。其它去细胞的去污剂包括，但不限于，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇一油酸酯和聚氧乙烯(80)失水山梨糖醇一油酸酯(Tween 20和80)、脱氧胆酸钠、3-[(3-氯酰氨基丙基)-二甲基氨基1-1-丙烷-磺酸酯、辛基-葡糖苷和/或十二烷基硫酸钠或本领域技术人员公知的任何其它去污剂。在另一种实施方案中，可以用酶完成去细胞。在某些实施方案中，酶可以选自包括但不限于以下酶的组：分散酶II、胰蛋白酶和/或嗜热菌蛋白酶或任何其它本领域技术人员公知的酶。这些酶可以与胶原和细胞间连接的不同成分反应。例如，分散酶II可以攻击IV型胶原，IV型胶原是基底膜的致密层和锚定原纤维的成分。在另一实施方案中，嗜热菌蛋白酶可以攻击角质形成细胞的基底层的半桥粒中的bulbous phemphigoid抗原。在进一步实施方案中，胰蛋白酶可以攻击细胞之间的桥粒复合体。

在额外或替代的实施方案中，去细胞的异种移植物可以暴露于化学试剂以进行鞣制，或使细胞外蛋白内的蛋白交联，以便进一步消除或减少异种移植物中存在的免疫原性决定簇。可以将任何鞣制或交联试剂用于该处理，可以进行一个以上交联步骤，或可以用一种以上的交联剂，以便确保完全交联，因此，最佳地减少异种移植物的免疫原性。例如，可以用醛，如戊二醛、甲醛、己二醛等来交联细胞外胶原。其它合适的交联剂包括脂族和芳香二胺、碳二亚胺、二异硫氰酸酯等。或者，可以将异种移植物暴露于蒸气形式的交联剂，包括，但不限于汽化的醛交联剂，例如，汽化的甲醛。交联反应应当持续，直到免疫原性决定簇基本从异种移植物组织除去，但反应应当在异种移植物的机械特性显著改变之前终止。交联剂可以是本领域技术人员公知的或此处描述的任何试剂。

在某些实施方案中，可以用来源于所述软组织的基质材料形成支架或修复装置。可以将基质材料转化为干燥的多孔基质，可以任选对其一部分进行交联。修复装置的多孔基质促进细胞的向内生长，所述细胞如半月板纤维软骨细胞、内皮细胞、成纤维细胞和正常占据细胞外基质并且合成和沉积细胞外基质成分的其它细胞。可以将细胞外基质纤维如胶原、弹性蛋白、网硬蛋白、其类似物及其混合物加入基质材料。也可以从缺乏任何功能性α-1，3-gal表达的动物获得这些纤维。在一种实施方案中，纤维可以在基质中随机定向。或者，纤维可以基本向四周延伸，或基本通过在基质中放射状延伸定向。基质的纤维密度可以是均匀或非均匀的。在非均匀构型中，可以在预期的高压力点建立相对高密度的纤维。

基质材料可以含有其它类型的材料，如上文所述的生物聚合物。基质材料可以含有糖胺聚糖分子(GAGs)，例如，但不限于4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、透明质酸及其混合物，它们可以作为基质材料的成分。此外，基质材料可以含有在纤维中散布的GAGs。GAGs可以在纤维中作为各个分子均匀散布，或它们可以在装置的不同区域以不同的量存在。

在另一种实施方案中，上文所述的从缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物形成的支架也可以含有细胞外基质(ECM)成分。在一种实施方案中，所述ECM成分可以来源于缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达的动物。细胞外基质材料可以来源于任何组织，包括，但不限于皮肤、泌尿组织、膀胱或器官粘膜下组织。支架可以作为修复装置。可以从断裂的ECM成分合成支架，或者，在优选实施方案中，支架是通过天然组织的去细胞或加工而得到的，由此除去活细胞并且留下ECM作为预先形成的具有与天然组织相似的三维结构和纤维构型的支架。支架或装置可以来源于从缺乏任何功能性α-1，3-Gal表达的动物的软组织获得的基质材料。软组织可以包括，但不限于真皮、器官粘膜下层(即，小肠粘膜下层(SIS))、从膝关节取出的外侧半月板、从任何关节取出的关节软骨、韧带和/或腱，如跟腱。可以按照下文所述对组织进行加工，以获得基质材料，如生物相容和可生物重吸收的纤维。

细胞外基质(ECM)是围绕和支持存在于哺乳动物组织内的细胞的复杂结构实体。ECM也可以称作结缔组织。ECM包含结构蛋白，如胶原和弹性蛋白、特化的蛋白，如原纤蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白，以及蛋白聚糖。糖胺聚糖(GAGs)是形成ECM的非常复杂的高分子量成分的重复二糖单位的长链。这些二糖单位含有N-乙酰化的己糖胺，并且提供润滑和交联。GAGs的实例包括但不限于4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸肝素和透明质酸。

表1：由脊椎动物细胞产生的代表性基质类型

胶原	锚	蛋白聚糖	细胞表面受体	细胞
					I	纤连蛋白	硫酸软骨素和硫酸皮肤素	整联蛋白	成纤维细胞
II	纤连蛋白	硫酸软骨素	整联蛋白	软骨细胞
					III	纤连蛋白	硫酸肝素和肝素	整联蛋白	静止的肝细胞、上皮细胞；缔合的成纤维细胞
IV	层粘连蛋白	硫酸肝素和肝素	层粘连蛋白受体	所有上皮细胞、内皮细胞、再生的肝细胞
					V	纤连蛋白	硫酸肝素和肝素	整联蛋白	静止的成纤维细胞
VI	纤连蛋白	硫酸肝素	整联蛋白	静止的成纤维细胞

胶原是动物界中最充足的蛋白。它是包含ECM的主要蛋白。存在至少12型胶原。I、II和III型是最充足的，并且形成具有相似结构的原纤维。IV型胶原形成二维的网状物，并且是基底层的主要成分。胶原主要由成纤维细胞合成，但上皮细胞也合成这些蛋白。胶原的基本的更高级结构是长和细直径的杆状蛋白。例如，I型胶原的长度是大约300nm，直径是1.5nm，由3个包含两个α1(I)链和一个α2(I)链的卷曲的亚基组成。每条链由1050个以特征性右旋三螺旋彼此盘绕的氨基酸组成。每圈螺旋有3个氨基酸，第3个氨基酸是鸟嘌呤。胶原也富含脯氨酸和羟脯氨酸。三螺旋的外侧存在脯氨酸的大pyrollidone环。胶原的三螺旋的外侧相互作用导致直径大约50nm的原纤维的形成。胶原的包装使得相邻的分子代替它们长度的大约四分之一(67nm)。这种交错的阵列产生了可以在电子显微机下观察到的条纹状效果。

胶原是作为称作原胶原的更长的前体蛋白合成的。I型原胶原在N末端含有额外的150个氨基酸，在C末端含有额外的250个氨基酸。这些原结构域是球形的，并且形成多个链内二硫键。二硫键稳定蛋白原，使得形成三螺旋切面。胶原纤维开始在内质网(ER)和高尔基复合体组装。除去信号序列，在胶原链中发生许多修饰。特定的脯氨酸残基可以被脯氨酰4-羟化酶和脯氨酰3-羟化酶羟化。特定的赖氨酸残基也可以被赖氨酰羟化酶羟化。脯氨酰羟化酶依赖于维生素C作为辅因子。O-连接的类型的糖基化也在高尔基体转运过程中发生。在完成加工后，原胶原被分泌到细胞外空间中，由细胞外酶在此除去原结构域。然后，胶原分子聚合形成胶原原纤维。伴随原纤维形成的是由细胞外酶-赖氨酰氧化酶对某些赖氨酸残基的氧化，形成活性醛。这些活性醛在两条链之间形成特异性交联，从而稳定原纤维中胶原的交错阵列。

表2：胶原的类型

类型	链组成	结构细节	位置
				I	[a1(I)]2[α(I)]	300nm，67nm的条带状原纤维	皮肤、腱、骨等
II	[α1(II)]3	300nm，小的67nm的原纤维	软骨，房水
				III	[α1(III)]3	300nm，小的67nm的原纤维	皮肤，肌肉，通常与I型一起
IV	[α1(IV)2[α2(IV)]	390nm的C末端球形结构域，非原纤维	都在基底层
				V	[α1(V)][α2(V)][α3(V)]	390nm的N末端球形结构域，小纤维	大多数在间质组织，与I型缔合
VI	[α1(VI)][α2(VI)][α3(VI)]	150nm，N+C末端球形结构域，微原纤维，100nm的条带状原纤维	大多数在间质组织，与I型缔合
				VII	[α1(VII)]3	450nm，二聚体	上皮
VIII	[α1(VIII)]3	------	一些内皮细胞
				IX	[α1(IX)][α2(IX)][α3(IX)]	200nm，N末端球形结构域，结合的蛋白聚糖	软骨，与II型缔合
X	[α1(X)]3	150nm，C末端球形结构域	肥厚和矿化的软骨
				XI	[α1(XI)][α2(XI)][α3(XI)]	300nm，小纤维	软骨
XII	α1(XII)	------	与I和III型相互作用

纤连蛋白的作用是将细胞连接于多种细胞外基质。纤连蛋白将细胞连接于除IV型胶原之外的所有基质，IV胶原将层粘连蛋白作为粘附分子。纤连蛋白是两个相似肽的二聚体。每条链的长度是大约60-70nm，厚度是2-3nm。已经鉴定出至少20种不同的纤连蛋白链，它们由来自于单个纤连蛋白基因的一级转录物的可变RNA剪接产生。纤连蛋白含有至少6个紧密折叠的结构域，每个结构域具有对不同底物，如硫酸肝素、胶原(I、II和III型的独立结构域)、纤维蛋白和细胞表面受体的高亲和力。细胞表面受体结合域含有共有的氨基酸序列RGDS。

所有的基底层含有共同的一组蛋白和GAGs。这些是IV型胶原、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白和层粘连蛋白。基底层通常称作IV型基质。基底层的每种成分由存在于其上的细胞合成。层粘连蛋白将细胞表面锚定于基底层。

在一种实施方案中，上文描述的任何ECM成分或其组合都可以用于形成支架，该支架可以任选用作修复装置。来源于ECM的支架可以替代地由来自于α1，3 gal敲除猪的组织的机械、化学或酶处理产生，使得所有细胞和碎片都被除去，留下非常适于宿主细胞募集和组织再生的纤维模式的ECM。由生物相容和可生物重吸收的纤维制造的支架或修复装置可以手术植入位于受试者的两个骨之间并且连接所述骨的区域，以便提供正常的运动和强度(对于手术植入，参见，例如，美国专利6,042,610，5,735,903，5,479,033，5,624,463，5,306,311，5,108,438，5,007,934和4,880,429)。修复装置可以作为组织再生的支架，因为支架的物理特征促进新组织的向内生长。这可以得到受试者宿主身体区域的复合材料，并且得到具有与天然身体区域基本相同的体内外表面轮廓的修复装置。

可以将该装置植入位于受试者的两个骨之间并且/或者连接所述骨的区域，由受试者身体区域形成的复合材料和装置可以具有与受处理的天然区域基本相同的体内外表面轮廓。该装置可以建立适于纤维软骨细胞、成纤维细胞或软骨细胞(如半月板纤维软骨细胞、脊椎动物纤维软骨细胞等)向内生长的生物相容和部分可生物重吸收的支架。支架与向内生长的细胞一起可以支持区域中的天然负荷力。

在另一种实施方案中，提供了制造在体内具有需要的形状(如半月板的区段性缺损)的修复装置的方法。该方法包括从缺乏任何功能性α-1，3-gal表达的动物的组织获得纤维基质材料，并且将该生物相容和部分可生物重吸收的纤维基质置于限定需要的形状的模具中(该模具限定装置的外表面以补充需要的身体区域)。然后可以冻干纤维和/或与化学交联剂接触，使得纤维具有模具的形状。或者，在模塑完成后，可以切下在模具中形成的结构或基质，使得其外表面与区段性缺损互补。该方法可以产生适于具有与半月板中的区段性缺损的外表面轮廓互补的外表面轮廓的基质。该类型的基质可以植入，以校正半月板的区段性缺损，或作为半月板扩大装置，该基质可以建立生物相容和至少部分可生物重吸收的支架，用于半月板纤维软骨细胞的向内生长，并且用于支持天然半月板负荷力。

4.硬和软组织移植物

在本发明的另一方面，提供了可以用于整形外科手术的骨腱骨移植物。骨腱骨移植物可以含有一个或多个骨块和连接于骨决的腱。骨块可以切割以提供足够容纳固定螺丝的沟。或者，提供含有一个或多个骨块和连接于骨块的腱的骨腱骨移植物，其中骨块预先成形为销钉。也提供了获得骨腱骨移植物的方法，由此首先切下连接了腱或韧带的第一个骨栓，然后切下连接了腱或韧带的第二个骨栓；使得第一个骨栓和第二个骨栓来源于连续的骨材料，并且重叠，这样第一个骨栓或第二个骨栓的切割在随后切割的骨栓中形成了一个沟。

在其它实施方案中，提供了含有腱和一个骨块的骨腱骨移植物。腱可以环绕骨，以建立可以与缝线保持在一起的腱、骨、腱层。其也可以含有腱的两个拖曳部分，用于固定移植物。该类型的移植物可以增加组织强度，同时减少可能导致组织衰竭的剪切力，这是通过利用与腱运动相关的天然环状滑动从而以滑轮型方式平衡相对力而实现的。

5.皮肤修复

在本发明的进一步的方面，来自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶的动物的硬和软组织可以用于皮肤修复。

皮肤可以分为三层：表皮、真皮和皮下层。表皮分为四层，从底到顶是基底细胞层、棘层、颗粒层和角质层。

表皮的基底细胞层含有分裂并分化为表皮中其它细胞的基底细胞和产生使皮肤带有颜色的黑色素的黑色素细胞。棘层位于基底细胞层上，由角质形成细胞，即产生一种蛋白-角蛋白的细胞组成。角蛋白是角质层以及毛发和甲的重要成分。颗粒层中的细胞是扁平的，并且含有暗颗粒，该颗粒被排出，并且提供将细胞一起保持在覆盖其的角质层中的“水泥”。表皮的该最上层实际上是由填充了角蛋白的紧密包装的死细胞层组成，其形成皮肤的主要物理屏障。角质层在诸如承受每日的摩擦和撕扯的手掌和足底的区域中比身体其它部分中厚。表皮也含有朗格罕细胞，其作为皮肤抗感染防御的一部分。真皮-表皮连接处是表皮与真皮接触的部位。基底膜区作为这两层之间的“胶水”。

真皮分为上层的乳头状真皮和下层的网状真皮。真皮的结构成分包括胶原、弹性纤维和基质。神经和血管也穿透真皮。皮肤附属物是外泌汗腺和顶泌汗腺、毛囊、皮脂腺和甲。除甲外，所有的皮肤附属物都位于真皮中。

汗液从外泌汗腺的释放是身体冷却的过程。汗液在真皮中的卷曲小管中产生，并且由汗液导管转运通过真皮以便分泌。整个体表具有大约2百万-3百万个外泌汗腺，每天可以产生最多达10L汗液。

在人类中，顶泌汗腺没有已知的功能，由于对我们的祖先有用，将其称作痕迹汗腺。它们主要位于前臂和生殖区。同外泌汗腺类似，顶泌汗腺也在真皮中的卷曲小管中产生，但顶泌导管将汗液引流到毛囊中，在此处到达皮肤表面。

毛发由角蛋白组成，角蛋白也形成甲和真皮的顶层(角质层)。位于毛发根的不同细胞产生角蛋白和使得毛发带有颜色的黑色素。人类有两类毛发：绒毛(轻和细)和终毛(暗和厚)。皮脂腺分泌一种油性物质，称作皮质，引流到毛囊的管道中到达皮肤表面。总体上，毛囊及其相关的皮脂腺称作毛皮脂单位。毛囊在身体各处分布，手掌和足底除外。在人类中，毛发主要是装饰作用，但也起保护作用。眉毛和睫毛保护眼睛防止灰尘和日光，而鼻毛阻断外来物质进入鼻子。头发提供一些温度绝缘。

皮脂腺产生一种油性物质，称作皮脂。它们在头皮、面部和上躯干的皮肤中最明显，而在手掌和足底则不存在。作为毛皮脂单位的一部分，皮脂腺分泌引流到毛囊管道中的皮脂，最终引流到皮肤表面。皮脂腺反应于青春期激素水平，特别是雄酮的升高而增大并产生更多的皮脂。它们在粉刺的产生中起重要作用。

皮下层位于真皮和下面的覆盖肌肉的筋膜之间。该层由多组由纤维隔膜隔开的脂肪细胞组成。它起着三种主要作用：使身体与寒冷隔绝，吸收创伤和缓冲更深层的组织，以及作为身体保留燃料的储存库。

甲是唯一不位于真皮而是位于手指和脚趾末端的皮肤附属物。甲板由死的角蛋白组成，其形成大约0.3-0.65mm厚的保护结构。角蛋白通过表皮细胞的分裂在甲基质中形成。甲床是紧密连接于甲板底部的上皮层。甲床的血管使得甲表现为粉红色。近端的甲襞或外皮保护甲的基底部免受致微感染生物的感染。甲的平均生长速度是每天0.1mm，趾甲比指甲生长慢。

在进一步的实施方案中，可以将来自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬和软组织用于皮肤修复。来源于所述动物的任何成分或皮肤成分的组合可以用于包括，但不限于，表皮组织、基底细胞层、棘层、颗粒层、角质层、真皮组织、上乳头状真皮组织、下网状真皮组织、胶原、弹性纤维、基质、外泌汗腺、顶泌汗腺、毛囊、皮脂腺、甲、毛发和皮下组织。所述组织可以用于修复人类皮肤，例如，修复皮肤的深层组织烧伤。

皮肤组织包括，但不限于真皮或表皮组织或其衍生物。皮肤下是脂肪性的皮下组织。在一种实施方案中，皮肤异种移植物可以包括表皮。在另一种实施方案中，皮肤异种移植物可以包括表皮和真皮。真皮可以以多种厚度提供，如1、5、10或20mm。此外，提供了包含表皮、真皮和皮下组织的皮肤移植物。在一种实施方案中，包含表皮、真皮和皮下组织的皮肤移植物可以用于置换覆盖骨区或覆盖腱的皮肤。

在另一种实施方案中，以天然形式或去细胞的形式使用皮肤组织，作为转子套修复或置换、腹内壁修复、妇产或泌尿组织修复的支架、作为修复或置换韧带或腱的过程的一部分或用于其它软组织应用(例如表6中的描述)。皮肤组织异种移植物可以是永久的置换物或作为临时置换物，直到患者可以再次长出新的皮肤。在一种实施方案中，皮肤移植物可以用作临时替代物。临时皮肤替代物可以愈合部分厚度的烧伤，促进伤口愈合和防止感染，并且可以在患者不够健康因此不能进行重建手术时使用。在另一种实施方案中，提供了永久皮肤移植物。

在进一步的实施方案中，提供了不同类型的皮肤异种移植物。在一种实施方案中，移植物是部分厚度的移植物。部分厚度的移植物可以仅仅包括真皮，带有一部分表皮，并且可以在烧伤或大伤口上使用。在另一种实施方案中，移植物是完整厚度的移植物。完整厚度的移植物可以包括表皮和真皮，并且可以用于覆盖小区域。在进一步的实施方案中，移植物可以是带蒂皮瓣或移植物。带蒂皮瓣或移植物可以包括表皮、真皮和皮下组织。带蒂皮瓣或移植物可以用于覆盖需要额外手术来修复骨、腱或神经组织的伤口或其它区域。

6.内部组织修复

在本发明的另一方面，来自缺乏任何功能性α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的硬和软组织可以用于内部组织修复，如疝修复、腱滑轮、滑动表面、血管吻合、心脏瓣膜修复或置换和硬脑膜修复。内部组织包括心包组织、心脏瓣膜和粘膜下组织。在一种实施方案中，粘膜下组织可以用于修复或置换结缔组织。

在另一种实施方案中，从来源于动物器官粘膜下层，优选来自α1，3GT敲除猪的器官粘膜下层的分层剥离的区段制备异种移植物组织。在一种优选实施方案中，粘膜下层来源于动物的肠组织。区段可以包括粘膜下层和粘膜的基底组织，通常包括粘膜肌层和致密层。粘膜下层和基底粘膜组织可以从肠组织段的粘膜肌层和粘膜的腔部分分层剥离。该加工可以得到三层的肠组织区段，其是管状的、非常坚韧的、纤维状的胶原材料(参见，例如，美国专利Nos.4,902,508和4,956,178)。在另一实施方案中，从成熟动物，如重量是400-600磅的母猪提取该组织。三层的肠区段可以用于形成异种移植物或可以对其进行纵切或侧切以形成长的组织区段。以任意形式，所述区段具有中间部分和相对末端部分以及相对外侧部分，可以形成这些部分，以便用手术可接受的技术与存在的生理结构手术连接(也参见美国专利No.5,372,821)。在相关的实施方案中，软组织来源于真皮或皮肤组织，其也可以形成或切割，并且用于与存在的生理结构进行手术连接。

在另一种实施方案中，本发明提供了制备或加工用于移植到人的软组织的方法。可以从动物的任何组织取出组织的完整部分。在一种实施方案中，可以从动物取出完整的心脏，然后可以切除心脏瓣膜组织，或可以获得心包。在其它实施方案中，组织可以包括，但不限于，上皮、结缔组织、血液、骨、软骨、肌肉、神经、腺样组织、脂肪、网形组织、骨、褐色脂肪、骨松质、肌肉、cartaginous、海绵组织、软骨样组织、嗜铬组织、肉膜组织、弹性组织、上皮组织、脂肪组织、透明纤维组织、纤维组织、Gamgee组织、凝胶状组织、颗粒组织、肠道相关淋巴样组织、Haller氏血管、硬造血组织、未分化组织、间质组织、包被组织、胰岛、淋巴组织、淋巴样组织、间充质组织、中肾组织、粘液结缔组织、多腔脂肪组织、骨髓组织、鼻根点组织、生肾组织、结节组织、骨组织、成骨组织、骨样组织、顶体周围组织、网状组织、网形组织、橡皮组织、骨骼肌、平滑肌和皮下组织。

在一种实施方案中，可以从新处死的动物收集组织。或者，可以从活动物手术取出组织。在一种实施方案中，取出组织后，可以将其置于合适的无菌等渗溶液或其它组织保存溶液中。屠宰动物后对组织的获取可以在屠宰后尽早进行，并且可以在低温下进行。例如，约5℃-约20℃，约0℃-约20℃，约0℃-约10℃或约0℃-约25℃。可以解剖出获取的组织和瓣膜，使其不带有周围的组织。在一种实施方案中，可以解剖出组织或心脏瓣膜或其部分，使其不带有粘附的组织、斑块、钙化等。或者，可以解剖出带有部分周围组织的组织或瓣膜。

在一种特定实施方案中，可以切下作为独立小叶的三尖瓣。在另一种实施方案中，可以切下作为完整瓣膜的三尖瓣，其包括围绕房室孔的纤维环和腱索。在另一种实施方案中，在解剖瓣膜后，可以用支架、环等支持瓣膜或瓣膜部分。在另一种实施方案中，可以根据本领域技术人员熟知的程序获取腹膜或心包，以形成心脏瓣膜异种移植物或基质材料(例如，参见Lauren的美国专利No.4,755,593)。

可以将软组织异种移植物用于多种应用中，用于修复或重建人体部分，例如，表6中描述的那些。

心脏瓣膜

在一种实施方案中，从缺乏任何α-1，3-Gal表达的动物提取心脏瓣膜。来自缺乏任何功能性α-1，3-Gal表达的动物的牛、羊或猪心脏，特别是猪心脏可以作为心脏瓣膜的来源。心脏瓣膜包含纤维软骨细胞和胶原、弹性纤维以及多种蛋白聚糖组成的细胞外基质。心脏瓣膜的类型包括，但不限于二尖瓣、心房瓣、主动脉瓣、三尖瓣、肺动脉瓣、肺动脉斑(plumonic patch)、胸主动脉降支、主动脉非瓣膜导管、具有LPA和RPA的肺动脉非瓣膜导管、具有或不具有完整尖端的右或左肺半动脉、隐静脉、髂动脉、股静脉、股动脉和/或半月瓣。在某些实施方案中，可以用工具将心脏瓣膜修复物固定于动脉壁。工具可以包括扣件和/或加强物。在特定实施方案中，心脏瓣膜修复物可以具有柔性小叶。在一种实施方案中，可以从天然材料如组织、合成材料如聚合物或其组合构建心脏瓣膜修复物。在另一种实施方案中，瓣膜修复物可以是组织瓣膜，并且可以额外包括支架，或不含支架，并且可以是猪、牛或其它动物组织来源的。根据本发明制备的心脏瓣膜异种移植物可以具有天然心脏瓣膜异种移植物的普通外观。心脏瓣膜异种移植物也可以是瓣膜区段，如各个小叶，每个小叶可以植入受体心脏。或者，可以用猪心包形成本发明的心脏瓣膜异种移植物。

心脏是中空的肌肉器官，其通过有节律的收缩使血液循环通过动物身体。在哺乳动物中，心脏具有四个室，其定位使得右心房和心室与左心房和心室完全分开。正常情况下，血液从体静脉流入右心房，然后流入右心室，从右心室经肺动脉驱动到肺。当从肺返回时，血液进入左心房，然后流入左心室，从左心室驱动到体动脉中。

四个主要的心脏瓣膜防止节律收缩时血液倒流：三尖瓣、肺动脉瓣、二尖瓣和主动脉瓣。三尖瓣分隔右心房和右心室，肺动脉瓣分隔右心房和肺动脉，二尖瓣分隔左心房和左心室，主动脉瓣分隔左心室和主动脉。通常，具有心脏瓣膜异常的患者的特征在于具有瓣膜性心脏病。

由于不能正常打开(狭窄)或渗漏(反流)，心脏瓣膜可以出现功能障碍。例如，具有主动脉瓣功能障碍的患者可以诊断为具有主动脉瓣狭窄或主动脉瓣反流。在任何一种情况下，通过手术方法进行的瓣膜置换是可能的治疗。置换瓣可以是自体移植物、同种异体移植物或异种移植物，以及机械瓣或部分由猪瓣膜制造的瓣。有趣的是，冷冻保存的同种异体移植物在移植后多年中在受体患者内保持存活。不幸的是，置换瓣容易出现诸如变性、血栓形成和钙化的问题。

本发明的心脏瓣膜异种移植物或其区段可以由本领域技术人员采用公知的手术技术，如通过打开心脏的手术，或最小介入的技术，如内窥镜手术和经腔植入而植入受损的人或动物心脏。进行所述手术技术的特定仪器是本领域公知的，其确保心脏瓣膜植入物的准确和可重复的植入。

在特定实施方案中，作为修复物的心脏瓣膜可以用于具有多种形式的心脏和/或瓣膜疾病的患者。可以从可出售重量的猪(例如，超过120kg的猪)获得猪心脏。在无菌磷酸缓冲液中清洗后，可以现场解剖心脏(除去心尖)并且于4℃在无菌PBS中运输。所有心脏可以到达加工中心，例如，在动物屠宰后24小时内到达。可以解剖主动脉和肺动脉瓣的根部。在特定实施方案中，这些组织可以进行减少生物负载的步骤，包括48℃下在抗生素和抗真菌药的混合物中温育大约48小时。去感染的组织可以冷冻保存(例如在10％(v/v)DMSO和10％(v/v)胎牛血清中，-1℃/分钟)或可以通过包括用低渗培养基处理，然后用脱氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶A的混合物消化的程序去细胞。12天后，可以冷冻保存或化学固定去细胞的瓣膜，例如，在磷酸缓冲液(pH7.4)中2mmHg的0.35％(w/v)戊二醛中总共固定7天(低压固定确保维持胶原基质天然皱褶的维持)。在一种实施方案中，固定的组织不进行冷冻保存，但可以储存在交联固定溶液中，如戊二醛溶液(如0.35％的戊二醛)中。

基于组织的瓣膜修复物可以保持其天然形式的结构元件，如小叶，和/或通过不同片组织的组装，结构元件可以掺入修复物。例如，瓣膜修复物可以从猪心脏瓣膜、从牛心包或从其组合组装。可以用此处描述的工具将猪组织瓣膜，例如St.Jude Medical，Inc.St.Paul，Minn.出售的Toronto SPV^TM瓣膜植入患者。Toronto SPV.RTM瓣膜设计用于植入主动脉瓣位置，例如，参见David et al.，J.Heart Valve Dis.1：244-248(1992)。本发明的工具适用于任何瓣膜，特别是适于植入患者的任何组织瓣膜修复物。

心脏瓣膜修复物包括获取的组织瓣膜，如交联的猪瓣膜。修复物可以进一步包括缝合覆盖物。瓣膜可以具有三个小叶，其通常包括圆柱形底和三个支持小叶的合缝处。

在进一步的实施方案中，可以用扣件将心脏瓣膜，如主动脉瓣修复物固定到血管壁。扣件通常在心脏瓣膜修复物的植入程序中固定到血管壁。扣件可以具有与针头或钉子相似的形状，但也可以具有多个锋利的尖端。此外，扣件可以具有一个或多个位于扣件尖端附近的倒钩。扣件可以包括伸长的具有尖端的部分。扣件也可以在与尖端相对的末端具有任选的头。在其它实施方案中，倒钩可以位于尖端处或附近。扣件可以包括两个或更多个从扣件的相同或不同侧延伸的倒钩。可以用生物相容性材料形成扣件。扣件的优选生物相容性材料产生例如耐久性、机械强度和柔性/刚性方面的需要的机械特性。扣件可以具有足够的刚性，以便当医生施加压力插入扣件时保持其形状。当施加压力插入时，不具有足够刚性的扣件可能弯曲。只要扣件能够穿透材料，一定程度的弯曲是可以忍受的。不具有足够刚性的扣件可能不能正确插入，从而使得修复物受损、主动脉壁受损、修复物的不适当连接和/或交叉夹紧次数增加的倾向增加。植入后，扣件可以保留在患者中，以便在修复物的寿命期内固定瓣膜修复物，或如果将可生物重吸收的材料用于扣件，至少保留到愈合过程通过细胞生长将瓣膜固定到血管上。可以用例如金属、陶瓷、聚合物或其组合制造扣件。合适的金属包括，例如，钛和不锈钢。合适的陶瓷包括，例如，羟磷灰石，如骨碎片、碳材料，如石墨，以及矾土。合适的聚合物包括具有足够刚性的聚合物，如聚醚醚酮(PEEK)。扣件也可以由诸如上文描述的可生物重吸收的聚合物制成，使得在足够的组织再生以便在没有扣件的情况下固定瓣膜修复物后，扣件随时间被重吸收。

扣件的长度可以是大约2毫米(mm)-大约8mm，例如，大约4mm-大约7mm。在一种实施方案中，扣件的伸长的部分的直径可以小于大约2mm，例如，大约0.2mm-大约1.5mm，或大约0.2mm-大约1mm。

在其它实施方案中，将心脏瓣膜修复物连接于血管壁的方法可以基于扣件和上文描述的加强物。加强物自身可以用扣件或其它装置固定。可以配置扣件以便同时固定所有元件，或在最后配置扣件之前，一种或多种成分可以彼此连接，或与瓣膜修复物连接。

在一种实施方案中，可以在例如打开心脏的程序中将心脏瓣膜插入心脏。在一种实施方案中，可以通过给受试者，如人患者或灵长类动物或其它大动物模型如羊提供合适的生命支持和通过打开胸腔使得可以接近心脏而起始该过程。然后，可以进行主动脉横切术，使得能够通过血管如主动脉接近天然瓣膜。在一种实施方案中，血管是主动脉，打开主动脉的位置可以取决于修复物的精确结构。对于典型的修复物，通常可以在距离窦管(sinotubular)连接处大约1cm的部位切割主动脉。切除受损或病变的天然瓣膜，优选一起切除所有的钙和钙化碎片。主动脉瓣修复物可以置于主动脉环(即主动脉连接心脏的略微缩窄处)和窦管连接处(即紧接冠状动脉下游的主动脉的略微缩窄处)之间。但是，修复物可以延伸超过主动脉环和/或窦管连接处。对于在主动脉环处的放置，修复物可以沿切断的主动脉呈降落伞状向下。

在额外的实施方案中，心脏瓣膜修复物可以位于植入的部位，邻近合适的脉管系统，例如，主动脉。在一种实施方案中，可以缝合瓣膜的流入缘或在用此处描述的扣件固定流出缘之前进行固定，但流入缘也可以在流出缘之后固定。此外，可能需要在施加此处描述的扣件之前钉住合缝处。在特定实施方案中，扣件、加强物(如果有)和修复物在植入程序起始时可以是分开的。或者，可以预先组装各元件。在另一种实施方案中，一旦正确排列了修复物，可以将加强物放置到位，并且可以通过修复物和通过主动脉壁，依次将扣件插入加强物的孔中。当通过一个加强物将所有扣件插入时，用扣件相似地固定任何额外的加强物。可以用指压、钳子、推进工具、锤等插入扣件。可以使用特别地与扣件的头吻合的特定的钳子。如果没有加强物，将扣件置于需要的位置，类似地，通过修复物和主动脉壁插入。

在一些实施方案中，可以在植入程序开始之前将扣件插入加强物。可以将加强物提供给外科医生，通过或部分通过加强物中的孔插入扣件。在这些实施方案中，扣件的头或钝端可以从加强物的表面伸出。这样，相对于在程序开始前所有的成分都分开的程序来说，该程序可以在某种程度上简化。在这些实施方案中，一旦修复物在血管中正确定位，可以在需要的位置排列具有扣件的加强物，可以推动扣件通过修复物和通过主动脉壁，从而直接配置扣件。可以依次插入扣件，以此方法固定多个加强物。

在替代的实施方案中，可以在植入程序开始前将一个或多个加强物连接于修复物。可以由制造商将加强物固定于修复物。可以用缝线、生物相容性粘合剂或其它合适的扣件将加强物固定到修复物。合适的生物相容性粘合剂包括，例如，纤维蛋白胶和其它手术胶。一旦将修复物正确定位，可以依次或同时将扣件放置在加强物中的孔内，并且通过修复物和主动脉的壁插入。可以持续进行该步骤直到配置了所有的扣件。

在其它实施方案中，可以提供修复物，其中在合适的位置具有加强物，并且在加强物中插入了扣件。可以采用经过加强物和至少部分经过修复物插入的扣件将加强物固定于修复物。或者，可以用缝线、粘合剂或其它扣件将加强物固定于修复物。一旦修复物位于动物或患者中的合适位置，每个扣件可以被推动通过血管壁，以便固定修复物。在其它实施方案中，可以将有效而简单的常规缝线作为扣件。

7.异种移植物的其它应用

在本发明的进一步的方面，来源于缺乏功能性α-1，3-GT表达的动物的组织产品可以用于重建人类的身体部分。在某些实施方案中，可以按照例如表6的描述使用去细胞的或有细胞的皮肤组织、骨、韧带、腱、心脏瓣膜、髓核、软骨、半月板、血管、心包或此处描述的其它组织。在特定实施方案中，可以将组织用于人类整形外科重建或修复，如转子套修复、人类皮肤修复和/或人类软组织修复。可以在多种动物模型中检验异种移植物，如灵长类或非灵长类动物，如羊模型。

可以用通常用于组织移植物应用的常规手术程序应用异种移植物。在一种实施方案中，例如，用于非血管组织移植物应用时，管状移植物材料可以纵切并且铺开，以形成组织“斑片”。在另一种实施方案中，可以在组织，如肠组织的“斑片”上进行组织分层，所述斑片是通过纵切肠段，并且将其“铺开”以形成移植前斑片而制备的。制备的移植物组织斑片例如可以用作皮肤移植物材料，用于硬脑膜修复或用于修复其它身体组织缺损，所述缺损导致其自身需要具有该移植物组合物的物理和功能特征的组织移植物斑片的手术应用。

表6：从缺乏任何功能性α-1，3-GT表达的动物获取的组织的应用/用途
	有细胞或去细胞的皮肤组织：应用：疝腹壁修复转子套修复治疗尿失禁的吊带美容手术，包括乳腺重建、面部缺陷、唇重建、眼睑间隔物移植物、凹陷的斑痕的修复烧伤，皮肤置换粘膜移植物鼻唇沟口表面重修腮腺切除术鼻整形术鼻中隔穿孔修复临时的伤口敷料伤口覆盖物鼓膜成形术前庭成形术其它软组织缺损皮肤组织可以与以下额外的材料组合：促进更快愈合、募集细胞(支架)，组合促进造血的生长因子抗瘢痕形成(纤维蛋白原、纤维蛋白I)骨应用：用于骨折和小的骨骼缺损修复以及骨缺损、骨中的裂隙、脊柱修复、颌面重建、牙植入物糊

骨栓骨植入物片螺丝环(肱骨、腓骨、加工的楔子)销(单层皮质的、有条纹的皮质销)块(三层皮质的髂骨块、单层皮质的块、两层皮质的块、多孔块)楔(皮质楔、髌骨皮质楔)可模塑的条多孔片粉末椎骨融合物股骨干半股骨干腓骨干肱骨干胫骨干三层皮质的髂骨条多孔的皮质条皮质条插入的移植物，包括有或没有软骨的股骨头、全部或部分股骨、近端或远端股骨、近端或远端胫骨多孔的皮质片全关节置换物脱矿化的骨基质脊柱前突的皮质块骨组织可以与以下任何额外的材料组合：用于非联合骨折修复的生长因子(BMP)作为送递基质的猪明胶

韧带/腱应用ACL修复/置换PCL修复/置换髌骨腱，包括骨后胫骨肌腱前胫骨肌腱半腱肌腱骨薄肌腱心脏瓣膜应用/类型：修复/置换主动脉瓣肺动脉瓣肺动脉斑胸主动脉降支主动脉非瓣膜导管具有LPA和RPA的肺动脉非瓣膜导管具有或不具有完整尖端的右或左肺半动脉隐静脉髂动脉股静脉股动脉心脏瓣膜可以与以下任何额外的材料组合：用环状材料进行手术插入髓核应用：椎骨间修复/置换

软骨(细胞)应用软骨置换(置换或作为支架促进新软骨生长)软骨可以与以下任何额外的材料组合：促进细胞浸润的生长因子半月板应用：修复/置换具有骨桥的外侧半月板具有骨桥的内侧半月板半月板可以与以下任何额外的材料组合：促进植入的塑料或金属血管应用：血管修复/置换，排除与移植的完整器官相关或作为其一部分的血管颈动脉置换/修复心包应用：当需要组织再生时用于手术程序中的斑片；作为手术部位的稳定和保护屏障起作用与其它材料组合：促进更快愈合、募集细胞(支架)，组合促进造血的生长因子抗瘢痕形成(纤维蛋白原、纤维蛋白I)小肠粘膜下层应用：转子套修复疝

腹壁修复转子套修复治疗尿失禁的吊带烧伤皮肤置换美容手术，包括乳腺重建、面部缺陷、唇重建、眼睑间隔物移植物、凹陷的斑痕的修复、粘膜移植物、鼻唇沟、口表面重修、腮腺切除术、鼻中隔穿孔修复、鼻整形术临时的伤口敷料、伤口覆盖物鼓膜成形术前庭成形术其它软组织缺损血管移植物，包括静脉、动脉或毛细血管其它软组织校正足外翻和弓形腿畸形的HTO楔校正尿失禁的筋膜

II.缺乏任何功能性α-1，3半乳糖基转移酶表达的动物

提供了来自缺乏任何功能性α-1，3半乳糖基转移酶表达的动物的组织。在一种实施方案中，动物是猪。在另一种实施方案中，动物是牛或羊。在其它实施方案中，提供了这样的动物，其中通过基因靶定事件灭活了α-1，3-GT基因的一个等位基因。在本发明的另一方面，提供了这样的动物，其中通过基因靶定事件灭活了α-1，3-GT基因的两个等位基因。在一种实施方案中，可以通过同源重组靶定基因。在其它实施方案中，可以破坏基因，即，可以改变遗传密码的一部分，从而影响基因该片段的转录和/或翻译。例如，通过取代、缺失(“敲除”)或插入(“敲入”)技术，可以发生基因的破坏。也可以插入调节存在的序列转录的所需蛋白或调节序列的其它基因。

除了古代猴和人，具有α-1，3-GT基因的两个无活性等位基因的动物，如猪，不是天然存在的。出乎意料地发现，在试图通过基因靶定事件敲除α-1，3-GT基因的第二个等位基因时，鉴定了使第二个等位基因无活性的点突变。

因此，在本发明的另一方面，可以通过至少一个点突变使α-1，3-GT基因无活性。在一种实施方案中，可以通过至少一个点突变使α-1，3-GT基因的一个等位基因无活性。在另一实施方案中，可以通过至少一个点突变使α-1，3-GT基因的两个等位基因都无活性。在一种实施方案中，可以通过基因靶定事件发生该点突变。在另一种实施方案中，该点突变可以是天然存在的。在一种特定实施方案中，点突变可以是位于α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基的T到G的突变。携带α-1，3-GT基因中天然存在的点突变的猪能够产生不具有抗生素抗性基因的α1，3 GT缺陷的猪，因此具有制备用于人类的更安全产品的潜能。在其它实施方案中，可以存在至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少20个点突变，使得α-1，3-GT基因无活性。在其它实施方案中，提供这样的猪，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都含有防止任何功能性α-1，3-GT表达的点突变。在一种特定实施方案中，提供了这样的猪，其在α-1，3-GT基因的两个等位基因都含有发生在外显子9的第二个碱基的T到G的突变。

本发明的另一方面提供了这样的动物，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活，从而通过基因靶定事件灭活了一个等位基因，通过天然存在的点突变灭活了另一个等位基因。在一种实施方案中，提供了猪动物，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活，从而通过基因靶定事件灭活了一个等位基因，由于在外显子9的第二个碱基存在T到G的点突变灭活了另一个等位基因。在一个特定实施方案中，提供了猪动物，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活，从而通过针对外显子9的靶定构建体灭活了一个等位基因，由于在外显子9的第二个碱基存在T到G的点突变灭活了另一个等位基因。

α-1，3-GT基因的基因靶定

可以进行遗传修饰的动物细胞可以获自多种不同的器官和组织，例如，但不限于皮肤、间充质、肺、胰腺、心脏、肠、胃、膀胱、血管、肾、尿道、生殖器官和完整或部分胚、胎或成年动物的解聚的制备物。在本发明的一种实施方案中，细胞可以选自，但不限于上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、单核细胞(monocytes、mononuclear cells)、心肌细胞、其它肌细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、胰岛细胞、血细胞、血前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、原始干细胞、肝细胞、角质形成细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星形细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、库否氏细胞、平滑肌细胞、施旺细胞和上皮细胞、红细胞、血小板、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、肿瘤细胞、胶质细胞、星形细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、视杆细胞、视锥细胞、心脏细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、肌细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、睾丸间质细胞、管周细胞、足细胞、黄体细胞、宫颈细胞、子宫内膜细胞、乳腺细胞、卵泡细胞、粘液细胞、纤毛细胞、未角化的上皮细胞、角化的上皮细胞、肺细胞、杯细胞、柱状上皮细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞和破骨细胞。

在一种替代的实施方案中，可以使用胚胎干细胞。可以使用胚胎干细胞系或者可以从诸如猪动物的宿主新鲜获得胚胎干细胞。细胞可以在合适的成纤维细胞饲养层上生长或者在白血病抑制因子(LIF)存在下生长。在一种优选实施方案中，细胞可以是成纤维细胞；在一种特定实施方案中，细胞可以是胎成纤维细胞。成纤维细胞是优选的体细胞类型，因为它们可以从发育中的胚胎和成年动物中大量获得。这些细胞在体外容易繁殖，具有迅速的加倍时间，并且可以无性繁殖，用于基因靶定程序中。

靶定构建体

同源重组

同源重组允许内源基因中的定点修饰，因此，可以将这种新的改变工程化到基因组中。在同源重组中，进入的DNA与基因组中含有基本同源的DNA序列的位点相互作用，并且整合到该位点。在非同源(“随机”或“非惯例”)整合中，进入的DNA不存在于基因组中同源序列的位置，而是整合到其它位置，位于许多可能的位置之一。概言之，用高级红细胞进行的研究发现同源重组的频率远远低于随机整合的频率。这些频率的比值直接表明了依赖于通过同源重组进行的整合的“基因靶定”(即外源“靶定DNA”和基因组中相应的“靶DNA”之间的重组)。

许多文章描述了在哺乳动物细胞中使用同源重组。这些文章的示例是Kucherlapati et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3153-3157，1984；Kucherlapati et al.，Mol. Cell.Bio.5：714-720，1985；Smithies et al，Nature 317：230-234，1985；Wake et al.，Mol.Cell. Bio.8：2080-2089，1985；Ayares et al.，Genetics 111：375-388，1985；Ayares etal.，Mol.Cell.Bio.7：1656-1662，1986；Song et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6820-6824，1987；Thomas et al. Cell 44：419-428，1986；Thomasand Capecchi，Cell 51：503-512，1987；Nandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3845-3849，1988；和Mansour et al.，Nature 336：348-352，1988.Evans and Kaufman，Nature 294：146-154，1981；Doetschmanet al.，Nature 330：576-578，1987；Thoma and Capecchi，Cell 51：503-512，4987；Thompson et al.，Cell 56：316-321，1989。

本发明的一方面使用同源重组来灭活细胞，如上文描述的细胞中的α-1，3-GT基因。DNA可以包含特定基因座上的至少一部分基因，其中在天然基因的至少一个拷贝，任选两个拷贝中导入了改变，以防止功能性α1，3 GT的表达。改变可以是插入、缺失、取代或其组合。当将改变导入仅仅一个拷贝的被灭活基因时，扩增具有单个突变拷贝的靶基因的细胞，并且可以进行第二个靶定步骤，其中改变可以与第一个改变相同或不同，通常是不同的，并且其中涉及缺失或取代，可以与最初导入的改变的至少一部分重叠。在第二个靶定步骤中，可以使用具有相同同源臂，但含有不同哺乳动物选择标记的靶定载体。筛选得到的转化体中不存在功能性靶抗原的那些，并且可以进一步筛选细胞的DNA，以确保不存在野生型靶基因。或者，通过对突变而言是杂合的宿主进行配种，可以获得表型方面的纯合性。

靶定载体

可以通过将DNA导入细胞而产生细胞中被靶定的基因座的修饰，其中所述DNA与靶基因座具有同源性，并且包括标记基因，使得能够选择包含整合的构建体的细胞。靶载体中的同源DNA将与靶基因座上的染色体DNA重组。标记基因两侧的侧翼可以是同源DNA序列、3’重组臂和5’重组臂。本领域描述了构架靶定载体的方法，例如，Dai etal.，Nature Biotechnology 20：251-255，2002；WO 00/51424。

可以制备多种用于靶基因座的同源重组的构建体。构建体可以包括与靶基因座同源的至少50bp，100bp，500bp，1kbp，2kbp，4kbp，5kbp，10kbp，15kbp，20kbp或50kbp的序列。该序列可以包括猪α-1，3-GT基因的任何连续的序列(参见，例如，GenBank Acc.No.L36152，University of Pittsburgh of the Commonwealth System of HigherEducation的W0 0130992；Alexion，Inc.的WO 01/123541)。

在确定靶DNA序列的同源性程度中涉及多种考虑，例如，靶基因座的大小、序列的可接近性、靶基因座上双交换事件的相对频率和靶序列与其它序列的相似性。

靶定DNA可以包括这样的序列，其中基本上等基因的DNA位于用要修饰的基因组中相应的靶序列进行的需要的序列修饰侧翼。基本上等基因的序列可以与相应的靶序列(除了需要的序列修饰)具有至少大约95％，97-98％，99.0-99.5％，99.6-99.9％或100％的同一性。靶定基因和靶基因优选可以共有至少约75、150或500个碱基对的具有100％同一性的DNA段。因此，靶定DNA可以来源于与被靶定的细胞系密切相关的细胞；或靶定DNA可以来源于与被靶定的细胞相同的细胞系或动物的细胞。

可以设计DNA构建体来修饰内源的靶α1，3GT。用于靶定该构建体的同源序列可以具有一个或多个缺失、插入、取代或其组合。改变可以是插入符合读框地与靶基因的上游序列融合的选择标记基因。

合适的选择标记基因包括，但不限于：赋予在某些培养基底物上生长的能力的基因，如tk基因(胸苷激酶)或赋予在HAT培养基(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)上生长的能力的hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)；使得能够在MAX培养基(霉酚酸、腺嘌呤和黄嘌呤)上生长的细菌gpt基因(鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)。参见例如Song，K-Y.，et al.Proc.Nat′1 Acad.Sci.U.S.A.84：6820-6824(1987)；Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，Chapter16。选择标记的其它实例包括：赋予对诸如抗生素的化合物的抗性的基因、赋予在选择的底物上生长的能力的基因、编码产生可检测的信号如荧光的蛋白，如绿色荧光蛋白、增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的基因。多种这样的标记是公知并且可获得的，包括，例如，抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因(neo)(Southern，P.，and P.Berg，J.Mol.Appl.Genet. 1：327-341(1982))和潮霉素抗性基因(hyg)(Nucleic AcidsResearch 11：6895-6911(1983)，和Te Riele，H.，et al.，Nature 348：649-651(1990))。其它选择标记基因包括：乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)及其衍生物。存在多种选择标记，其赋予对氨苄青霉素、博莱霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲喋呤、phosphinothricin、嘌呤霉素和四环素的抗性。

用于掺入抗生素抗性基因和负选择因子的方法是本领域技术人员熟悉的(参见，例如，WO 99/15650；美国专利No.6,080,576；美国专利No.6,136,566；Niwa et al.，J.Biochem。113：343-349(1993)；和Yoshida et al.，Transgenic Research 4：277-287(1995))。

也可以使用选择标记的组合。例如，对于靶α1，3GT，可以将neo基因(有或没有其自身的启动子，如上文的讨论)克隆到与α-1，3-GT基因同源的DNA序列中。为了使用标记的组合，可以克隆HSV-tk基因，使得它位于靶定DNA外(如果需要，可见将另一选择标记置于对侧)。将DNA构建体导入要靶定的细胞后，可以用合适的抗生素选择细胞。在该特定实例中，抗G418和更昔洛韦的细胞最容易通过同源重组而出现，在所述同源重组中，neo基因被重组到α-1，3-GT基因中，但丢失了tk基因，因为它位于双交换区外。

缺失可以是至少约50bp，更通常是至少约100bp，通常不超过约20kbp，其中正常情况下缺失可以包括编码区的至少一部分，其包括一个或多个外显子的一部分、一个或多个内含子的一部分，并且可以包括或不包括侧翼的非编码区，特别是5’非编码区(转录调节区)的一部分。因此，同源区可以延伸超过编码区进入到5’非编码区或进入3’非编码区。插入通常不超过10kbp，一般不超过5kbp，通常是至少50bp，更常见是至少200bp。

同源区可以包括突变，其中突变可以通过提供移码或改变关键氨基酸而进一步灭活靶基因，或者突变可以校正功能异常的等位基因等。突变可以是微小改变，不超过同源侧翼序列的约5％。当需要基因突变时，标记物基因可以被插入内含子或外显子。

可以根据本领域公知的方法制备构建体，可以将多个片段一起导入合适的载体，进行克隆、分析，然后进一步操作，直到获得需要的构建体。可以对序列进行多种修饰，以便进行限制分析、切割、鉴定探针等。可以按照需要导入沉默突变。在多个阶段，可以采用限制分析、测序、用聚合酶链反应扩增、引物修复、体外诱变等。

可以用包括原核复制系统，如大肠杆菌可识别的起点的细菌载体制备构建体，在每个阶段可以克隆和分析该构建体。可以采用与用于插入的标记相同或不同的标记，该标记可以在导入靶细胞之前除去。一旦完成了含有构建体的载体，可以对其进行进一步操作，如去除细菌序列、线性化、在同源序列中导入短的缺失。在最终操作后，可以将构建体导入细胞。

本发明进一步包括含有α-1，3-GT基因的序列的重组构建体。构建体包含载体，如质粒或病毒载体，其中以正向或反向插入了本发明的序列。构建体也可以包含调节序列，包括，例如与序列可操作性连接的启动子。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员公知的，并且是可以商购的。举例提供了以下载体。细菌载体：pBs，pQE-9(Qiagen)，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体：pWLneo，pSv2cat，pOG44，pXTl，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPv，pMSG，pSVL(Pharmiacia)，病毒来源的载体(M13载体、噬菌体1载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体)，高、低和可调节拷贝数的载体、与单个宿主(pACYC184和pBR322)和真核附加型复制载体(pCDM8)组合的具有相容性复制子的载体。其它载体包括原核表达载体，如pcDNA II，pSL301，pSE280，pSE380，pSE420，pTrcHisA，B和C，pRSET A，B和C(Invitrogen，Corp.)，pGEMEX-1和pGEMEX-2(Promega，Inc.)，pET载体(Novagen，Inc.)，pTrc99A，pKK223-3，pGEX载体，pEZZ18，pRIT2T和pMC1871(Pharmacia，Inc.)，pKK233-2和pKK388-1(Clontech，Inc.)，以及pProEx-HT(Invitrogen，Corp.)及其变体和衍生物。其它载体包括真核表达载体，如pFastBac，pFastBacHT，pFastBacDUAL，pSFV和pTet-Splice(Invitrogen)，pEUK-C1，pPUR，pMAM，pMAMneo，pBI101，pBI121，pDR2，pCMVEBNA和pYACneo(Clontech)，pSVK3，pSVL，pMSG，pCH110和pKK232-8(Pharmacia，Inc.)，p3′SS，pXT1，pSG5，pPbac，pMbac，pMC1neo和pOG44(Stratagene，Inc.)，以及pYES2，pAC360，pBlueBacHis A，B和C，pVL1392，pBlueBacIII，pCDM8，pcDNA1，pZeoSV，pcDNA3 pREP4，pCEP4和pEBVHis(Invitrogen，Corp.)及其变体或衍生物。其它可以使用的载体包括：pUC18，pUC19，pBlueScript，pSPORT，粘粒，噬菌粒，YAC′s(酵母人工染色体)，BAC′s(细菌人工染色体)，P1(大肠杆菌噬菌体)，pQE70，pQE60，pQE9(quagan)，pBS载体，PhageScript载体，BlueScript载体，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，pcDNA3(Invitrogen)，pGEX，pTrsfus，pTrc99A，pET-5，pET-9，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pSPORT1，pSPORT2，pCMVSPORT2.0和pSV-SPORT1(Invitrogen)，来自Invitrogen的pTrxFus，pThioHis，pLEX，pTrcHis，pTrcHis2，pRSET，pBlueBacHis2，pcDNA3.1/His，pcDNA3.1(-)/Myc-His，pSecTag，pEBVHis，pPIC9K，pPIC3.5K，pAO815，pPICZ，pPICZ□，pGAPZ，pGAPZ□，pBlueBac4.5，pBlueBacHis2，pMelBac，pSinRep5，pSinHis，pIND，pIND(SP1)，pVgRXR，pcDNA2.1，pYES2，pZErO1.1，pZErO-2.1，pCR-Blunt，pSE280，pSE380，pSE420，pVL1392，pVL1393，pCDM8，pcDNA1.1，pcDNA1.1/Amp，pcDNA3.1，pcDNA3.1/Zeo，pSe，SV2，pRc/CMV2，pRc/RSV，pREP4，pREP7，pREP8，pREP9，pREP10，pCEP4，pEBVHis，pCR3.1，pCR2.1，pCR3.1-Uni和pCRBac；来自Pharmacia的□ExCell，□gtll，pTrc99A，pKK223-3，PGEX-1□T，pGEX-2T，pGEX-2TK，pGEX-4T-1，pGEX-4T-2，pGEX-4T-3，pGEX-3X，PGEX-5X-1，pGEX-5X-2，pGEX-5X-3，pEZZ18，pRIT2T，pMC1871，pSVK3，pSVL，pMSG，pCH110，pKK232-8，pSL1180，pNEO和pUC4K；来自Novagen的pSCREEN-1b(+)，pT7Blue(R)，pT7Blue-2，pCITE-4abc(+)，pOCUS-2，pTAg，pET-32LIC，pET-30LIC，pBAC-2cp LIC，pBACgus-2cp LIC，pT7Blue-2 LIC，pT7Blue-2，□SCREEN-1，□BlueSTAR，pET-3abcd，pET-7abc，pET9abcd，pET11abcd，pET12abc，pET-14b，pET-15b，pET-16b，pET-17b-pET-17xb，pET-19b，pET-20b(+)，pET-21abcd(+)，pET-22b(+)，PET-23abcd(+)，pET-24abcd(+)，PET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET-28abc(+)，pET-29abc(+)，pET-30abc(+)，pET-31b(+)，pET-32abc(+)，pET-33b(+)，pBAC-1，pBACgus-1，pBAC4x-1，pBACgus4x-1，pBAC-3cp，pBACgus-2cp，pBACsurf-1，plg，Signal plg，pYX，Selecta Vecta-Neo，Selecta Vecta-Hyg和Selecta Vecta-Gpt；来自Clontech的pLexA，pB42AD，pGBT9，pAS2-1，pGAD424，pACT2，pGADGL，pGAD GH，pGAD10，pGilda，pEZM3，pEGFP，pEGFP-1，pEGFP-N，pEGFP-C，pEBFP，pGFPuv，pGFP，p6xHis-GFP，pSEAP2-Basic，pSEAP2-Contral，pSEAP2-Promoter，pSEAP2-Enhancer，p□gal-Basic，p□gal-Control，p□gal-Promoter，p□gal-Enhancer，pCMV□，pTet-Off，pTet-On，pTK-Hyg，pRetro-Off，pRetro-On，plRES1neo，pIRES1hyg，pLXSN，pLNCX，pLAPSN，pMAMneo，pMAMneo-CAT，pMAMneo-LUC，pPUR，pSV2neo，pYEX4T-1/2/3，pYEX-S1，pBacPAK-His，pBacPAK8/9，pAcUW31，BacPAK6，pTrip1Ex，□gt10，□gt11，pWE15和□Trip1Ex；来自Stratagene的Lambda ZAP II，pBK-CMV，pBK-RSV，pBluescript II KS+/-，pBluescript II SK+/-，pAD-GAL4，pBD-GAL4 Cam，pSurfscript，Lambda FIX II，Lambda DASH，LambdaEMBL3，Lambda EMBL4，SuperCos，pCR-Scrigt Amp，pCR-ScriptCam，pCR-Script Direct，pBS+/-，pBC KS+/-，pBC SK+/-，Phagescript，pCAL-n-EK，pCAL-n，pCAL-c，pCAL-kc，pET-3abcd，pET-11abcd，pSPUTK，pESP-1，pCMVLacI，pOPRSVI/MCS，pOPI3 CAT，pXT1，pSG5，pPbac，pMbac，pMC1neo，pMC1neo Poly A，pOG44，pOG45，pFRT□GAL，pNEO□GAL，pRS403，pRS404，pRS405，pRS406，pRS413，pRS414，pRS415和pRS416及其变体或衍生物。双杂合体和反向双杂合载体也可以使用，例如，pPC86 pDBLeu，pDBTrp，pPC97，p2.5，pGAD1-3，pGAD10，pACt，pACT2，pGADGL，pGADGH，pAS2-1，pGAD424，pGBT8，pGBT9，pGAD-GALA，pLexA，pBD-GAL4，pHISi，pHISi-1，placZi，pB42AD，pDG2O2，pJK202，pJG4-5，pNLexA，pYESTrp及其变体和衍生物。只要可以在宿主中复制和存活，可以使用任何其它质粒和载体。

可以用于使DNA构建体进入宿主细胞的技术包括磷酸钙/DNA共沉淀、DNA微注射到细胞核中、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、转染或本领域公知的任何其它技术。DNA可以是单链或双链、线性或环状、放松的或超螺旋的DNA。对于转染哺乳动物细胞的多种技术，参见，例如Keown et al.，Methods in Enzymology Vol.185，pp.527-537(1990)。

在一种特定实施方案中，可以通过用含有从等基因的DNA分离的α-1，3-GT序列的敲除载体转染原代胎成纤维细胞而产生杂合的敲除细胞。如Dai等(Nature Biotchnology，20：451-455)的描述，5’臂可以是4.9kb，并且可以包含内含子8的大片段和外显子9的5’末端。3’臂可以是并且可以包含外显子9序列。可以用例如IRES(内部核糖体进入位点)在载体中掺入启动子包载策略，以起始Neor基因的翻译。

同源重组细胞的选择

然后，可以在合适选择的培养基中生长细胞，以鉴定提供合适整合的细胞。插入α-1，3-GT基因中的选择标记基因的存在确立了靶构建体在宿主基因组中的整合。然后可以通过限制分析、电泳、Southern分析、聚合酶链反应等进一步分析需要的表型，以便分析DNA，从而确定发生了同源重组还是非同源重组。这可以通过以下方法确定：使用插入片段的探针，然后对侧翼于插入片段的5’和3’区域进行测序，分析延伸超过构建体的侧翼区的α-1，3-GT基因的存在，或在导入缺失时鉴定所述缺失的存在。也可以使用与构建体内的序列互补并且与构建体外并且位于靶基因座上的序列互补的引物。以此方式，如果发生了同源重组，仅仅可以获得具有存在于互补链中的全部两个引物的DNA双链体。通过证明引物序列或预期大小的序列的存在，支持了同源重组的发生。

用于筛选同源重组事件的聚合酶链反应是本领域公知的，参见，例如Kim and Smithies，Nucleic Acids Res.16：8887-8903，1988；和Joyner et al.，Nature 338：153-156，1989.已经由Thomas and Capecchi，supra，1987；Nicholas and Berg(1983)in Teratocarcinoma Stem Cell，eds.Super，Martin and Strikland(Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor，N.Y.(pp.469-497)；和Linney and Donerly，Cell 35：693-699，1983表明突变多瘤病毒增强子和驱动新霉素基因的胸苷激酶启动子在胚胎干细胞和EC细胞中都是有活性的。

从第一轮靶定获得的细胞系很可能对于靶定的等位基因是杂合的。可以通过多种途径获得两个等位基因都被修饰的纯合性。一种方法是生长许多细胞，其中一个拷贝进行了修饰，然后用不同的选择标记对这些细胞进行另一轮靶定。或者，可以根据传统孟德尔遗传学对修饰的等位基因是杂合的动物配种而获得纯合子。在一些情况下，需要具有两个不同的修饰的等位基因。这可以通过连续轮的基因靶定或通过杂合子的配种而实现，所述杂合子的每一个携带需要的修饰等位基因之一。

α-1，3-GT基因座中诱导的突变

在某些其它实施方案中，本发明的方法包括通过诱变剂有意导入突变。本领域公知并且适用于本发明的诱变剂的实例包括，但不限于化学诱变剂(如DNA嵌入化学物质或DNA结合化学物质，如N-乙基-N-硝基脲(ENU)、甲磺酸乙酯(EMS)、芥子气、ICR191等；参见，例如，E.C.Friedberg，G.C.Walker，W.Siede，DNA Repair andMutagenesis，ASM Press，Washington DC(1995)、物理诱变剂(如UV放射、放射、X线)、生物化学诱变剂(如限制酶、DNA修复诱变剂、DNA修复抑制剂和易错DNA聚合酶和复制蛋白)、以及转座子插入。根据本发明的方法，培养中的细胞可以暴露于这些试剂之一，例如可以通过暴露于毒素A而选择导致细胞表面的半乳糖α1，3-半乳糖缺失的任何突变。

用于在细胞中诱导突变的化学诱变剂的优选剂量是本领域公知的，或者可以由普通技术人员采用本领域公知的诱变测定容易地确定。通过用多种剂量的诱变剂处理细胞和/或控制暴露于试剂的时间，可以完成细胞的体外化学诱变。通过滴定诱变剂暴露和/或剂量，可以为预定的目的进行最优程度的诱变，从而使每个靶细胞中需要数目的基因突变。例如，ENU的有用剂量可以是0.1-0.4mg/ml，大约1-2小时。在另一实例中，有用的EMS剂量可以是0.1-1mg/ml，大约10-30小时。此外，也可以用更低和更高的剂量以及暴露时间来达到需要的突变频率。

不表达功能性α-1，3-GT的细胞的鉴定

在一种实施方案中，选择程序可以基于细菌毒素，以选择缺乏功能性α1，3 GT表达的细胞。在另一种实施方案中，可以用细菌毒素，即艰难梭菌产生的毒素A选择缺乏细胞表面表位，即半乳糖1，3-半乳糖的细胞。暴露于艰难梭菌毒素可以导致在细胞表面具有该表位的细胞聚拢，将细胞从板基质释放出来。可以用该选择方法检测被靶定的基因敲除体和使酶不具有功能或表达的突变。然后可以用缺乏细胞表面半乳糖1，3-半乳糖表位表达的细胞产生α1，3 GT的两个等位基因都无活性的动物，其中所述细胞是用描述的毒素A介导的选择鉴定的，或用包括基因靶定的标准基因灭活方法产生的。

在一种实施方案中，选择方法可以直接检测α1，3 GT表位的缺失，该缺失是由于同源重组导致的α1，3 GT基因的靶定的敲除或由于基因中导致酶无功能或不表达的突变。通过抗生素抗性进行的选择最常用于筛选(参见上文)。该方法可以检测靶定载体上抗性基因的存在，但不能直接表明整合是被靶定的重组事件还是随机整合。某些技术，如聚腺苷酸和启动子包载技术，增加被靶定的事件的可能性，但不产生获得了需要的表型的直接证据，所述需要的表型是细胞表面galα1，3gal表位缺陷的细胞。此外，可以用阴性形式的选择来选择被靶定的整合；在这些情况下，对细胞致死的因子的基因被插入，插入的方式使得只有被靶定的事件才导致细胞避免死亡。然后可以测定由这些方法选择的细胞中的基因破坏、载体整合、以及最终检测α1，3 gal表位缺失。在这些情况下，由于选择是基于靶定载体整合的检测而不是改变的表型，仅仅可以检测被靶定的敲除体，而不是点突变、基因重排或截短或其它修饰。

在另一种实施方案中，可以用含有补体因子和galα1，3 gal表位的天然抗体的血清进行选择程序(参见，例如，Koike et al.，Xenotransplantation 4：147-153，1997)。暴露于含有抗Gal抗体的人或非人灵长类动物的血清会导致细胞裂解，这是由于展示galα1，3 gal表位的细胞中的特异性抗体结合和补体激活。因此，α-1，3-GT缺陷的细胞将保持存活，因此可以被选择。

可以进一步鉴定认为缺乏功能性α-1，3-GT表达的动物细胞。所述鉴定可以通过以下技术完成，包括，但不限于：PCR分析、Southern印迹分析、Northern印迹分析、特异性凝集素结合测定和/或测序分析。

可以用本领域描述的PCR分析(参见，例如Dai et al.NatureBiotechnology 20：431-455)确定靶定载体的整合。在一种实施方案中，可以在抗生素抗性基因中起始扩增引物，并且延伸到载体序列外的区域中。也可以用Southern分析(参见，例如，Dai et al.NatureBiotechnology 20：431-455)鉴定基因座中的总体修饰，如靶定载体在α1，3GT基因座中的整合。可以用Northern分析鉴定由每个等位基因产生的转录物。

用来自Griffonia(Bandeiraea)simplicifolia的GSL IB4凝集素(Vector Labs)，即特异性结合碳水化合物部分galα1，3 gal的凝集素进行的特异性凝集素结合和结合的FACS(荧光抗体细胞分选)分析，可以确定细胞上是否存在α1，3 gal表位。这种类型的分析包括在细胞中添加荧光素标记的GSL-IB4凝集素和随后的细胞分选。

此外，也可以采用由RNA转录物产生的cDNA的测序分析确定α1，3GT等位基因中任何突变的精确位置。

另一方面，本发明提供了生产活动物如猪的方法，所述动物中α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活。在一种实施方案中，用来自α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活的细胞的供体核，通过克隆生产动物。在一种实施方案中，通过基因靶定事件灭活了α-1，3-GT基因的两个等位基因。在另一种实施方案中，由于点突变的存在灭活了α-1，3-GT基因的两个等位基因。在另一种实施方案中，通过基因靶定事件灭活了一个等位基因，通过点突变灭活了另一个等位基因。在进一步的实施方案中，通过基因靶定事件灭活了一个等位基因，由于在α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基存在T到G的点突变灭活了另一个等位基因。在一种特定实施方案中，通过针对外显子9的靶定构建体灭活了一个等位基因，由于在α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基存在T到G的点突变灭活了另一个等位基因。在另一种实施方案中，克隆诸如猪的所述动物的方法包括：给卵细胞去核，将卵母细胞与来自α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活的细胞的供体核融合，并且将来源于核转移的胚植入代孕母亲。

或者，提供了通过灭活胚胎干细胞中α-1，3-GT基因的两个等位基因而生产缺乏任何功能性α-1，3-GT表达的活动物的方法，然后可以用所述动物产生后代。

通常，可以通过直接修饰合子而制备改变的动物。对于动物，随后可以将修饰的合子导入能够携带动物到足月的假孕雌性动物的子宫中。例如，如果需要完整的缺乏α-1，3-GT基因表达的动物，则可以靶定来源于该动物的胚胎干细胞，随后导入胚泡，以便使修饰的细胞生长为嵌合动物。对于胚胎干细胞，可以使用胚胎干细胞系或新获得的干细胞。

在本发明的合适的实施方案中，全能细胞是胚胎干(ES)细胞。从胚泡分离ES细胞、建立ES细胞系和它们随后的培养是按照例如由以下文献描述的常规方法进行：Doetchmann et al.，J.Embryol.Exp.Morph.87：27-45(1985)；Li et al.，Cell 69：915-926(1992)；Robertson，E.J.″Tetracarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，″ed.E.J.Robertson，IRL Press，Oxford，England(1987)；Wurst andJoyner，″Gene Targeting：A Practical Approach，″ed.A.L.Joyner，IRLPress，Oxford，England(1993)；Hogen et al.，″Manipulating the MouseEmbryo：A Laboratory Manual，″eds.Hogan，Beddington，Costantiniand Lacy，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1994)；和Wang et al.，Nature 336：741-744(1992)。在本发明的另一个合适的实施方案中，全能细胞是胚胎生殖(EG)细胞。胚胎生殖细胞是功能上与ES细胞等同的未分化细胞，也就是说，它们可以在体外培养和转染，然后得到嵌合体的体细胞和生殖细胞系(Stewart et al.，Dev.Biol.161：626-628(1994))。EG细胞是通过以下方法得到的：培养原始生殖细胞，即配子的祖细胞，培养中组合了生长因子：白血病抑制因子、青灰因子和碱性成纤维细胞生长因子(Matsui et al.，Cell 70：841-847(1992)；Resnick et al.，Nature 359：550-551(1992))。EG细胞的培养可用本领域技术人员公知的方法来进行，所述方法例如描述于Donovan etal.，″Transgenic Animals，Generation and Use，″Ed.L.M.Houdebine，Harwood Academic Publishers(1997)及其中引用的原始文献。

用于本发明的四倍体胚泡可通过天然合子生产和发育来获得，或者通过公知方法，由二细胞胚的电融合和随后进行培养来获得，所述公知方法例如由以下文献描述James et al.，Genet.Res.Camb.60：185-194(1992)；Nagy and Rossant，″Gene Targeting：A PracticalApproach，″ed.A.L.Joyner，IRL Press，Oxford，England(1993)；或Kubiak and Tarkowski，Exp.Cell Res.157：561-566(1985)。

ES细胞或EG细胞导入到胚泡中可通过本领域公知的任何方法来进行。用于本发明目的的合适的方法是Wang et al.，EMBO J.10：2437-2450(1991)描述的微注射方法。

或者，可以由修饰的胚胎干细胞产生转基因动物。可以将遗传修饰的胚胎干细胞注射到胚泡中，然后根据常规技术在雌性宿主哺乳动物中生长到足月。然后可以用诸如PCR或Southern印迹的技术筛选杂合后代中靶基因座的位点中改变的存在。与相同物种的野生型宿主交配后，随后可以杂交得到的嵌合后代，以得到纯合宿主。

用靶定载体转化胚胎干细胞以改变α-1，3-GT基因后，可以将细胞铺到合适的培养基，如胎牛血清增强的DMEM中的饲养层上。通过采用选择培养基可以检测含有构建体的细胞，在足够集落生长的时间后，可以挑选集落，并且分析同源重组的存在。可以用构建体序列内或构建体序列外但位于靶基因座的引物进行聚合酶链反应。然后可以用表现出同源重组的那些集落进行胚胎操作和胚泡注射。可以从超数排卵的雌性获得胚泡。然后可以用胰蛋白酶消化胚胎干细胞，将修饰的细胞加入含有胚泡的小滴中。可以将至少一个修饰的胚胎干细胞注射到胚泡的囊胚腔中。注射后，可以将至少一个胚泡返回到假孕雌性的每个子宫角。然后使雌性到足月，筛选得到的同窝动物中具有构建体的突变细胞。选择胚泡，得到来自转化的ES细胞的不同亲本。通过提供胚泡和ES细胞的不同表型，可以容易检测嵌合后代，然后可以进行基因型分析，以探测修饰的α-1，3-GT基因的存在。

体细胞核转移，以生产克隆的转基因后代

本发明提供了通过体细胞核转移克隆缺乏功能性α-1，3-GT基因的动物，如猪。概言之，可以通过包括以下步骤的核转移过程生产动物：获得需要的分化细胞作为供体核的来源；从动物获得卵母细胞；对所述卵母细胞去核；通过融合或注射将需要的分化细胞或细胞核转移到去核的卵母细胞以形成NT蛋白；活化得到的NT单位；将所述培养的NT单位转移到宿主动物中，使得NT单位发育成胎儿。

核转移技术或核移植技术是本领域公知的(Dai et al. NatureBiotechnology 20：251-255；Polejaeva et al Nature 407：86-90(2000)；Campbell et al，Theriogenology，43：181(1995)；Collas et al，Mol.Report Dev.，38：264-267(1994)；Keefer et al，Biol.Reprod.，50：935-939(1994)；Sims et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：6143-6147(1993)；WO 94/26884；WO 94/24274和WO 90/03432，美国专利Nos.4,944,384和5,057,420)。

将经过修饰以改变α-1，3-GT基因的供体细胞核转移到受体卵母细胞。该方法的使用不限于特定的供体细胞类型。供体细胞可以是例如以下文献中描述的那些：Wilmut et al Nature 385 810(1997)；Campbellet al Nature 380 64-66(1996)；Dai et al.，Nature Biotechnology 20：251-255，2002或Cibelli et al Science 280 1256-1258(1998)。可以使用能够成功用于核转移的所有正常核型的细胞，包括胚、胎和成年体细胞。胎成纤维细胞是特别有用的一类供体细胞。通常合适的核转移方法描述于Campbell et al Theriogenology 43 181(1995)，Dai et al.NatureBiotechnology 20：251-255，Polejaeva et al Nature 407：86-90(2000)，Collas et al Mol.Reprod.Dev.38 264-267(1994)，Keefer et al Biol.Reprod.50 935-939(1994)，Sims et al Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 906143-6147(1993)，WO-A-9426884，WO-A-9424274，WO-A-9807841，WO-A-9003432，美国专利No.4,994,384和美国专利No.5,057,420。也可以使用分化的或至少部分分化的供体细胞。供体细胞也可以是，但不一定是培养中的细胞，可以是静止的。静止的核供体细胞是可以经过诱导进入静止或在体内以静止状态存在的细胞。现有技术的方法也将胚胎细胞类型用于克隆程序中(Campbell et al(Nature，380：64-68，1996)和Stice et al(Biol.Reprod.，20 54：100-110，1996)。

可以从多种不同的器官和组织获得核供体体细胞，所述器官和组织例如，但不限于皮肤、间充质、肺、胰腺、心脏、肠、胃、膀胱、血管、肾、尿道、生殖器官和完整或部分胚、胎或成年动物的解聚的制备物。在本发明的合适的实施方案中，核供体细胞选自上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T)、巨噬细胞、单核细胞(monocytes、mononuclear cells)、心肌细胞、其它肌细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞或内皮细胞。在另一种实施方案中，核供体细胞是胚胎干细胞。在一种优选实施方案中，可以将成纤维细胞用作供体细胞。

在本发明的另一种实施方案中，本发明的核供体细胞是动物的生殖细胞。胚、胎或成年阶段的动物物种的任何生殖细胞都可以用作核供体细胞。在合适的实施方案中，核供体细胞是胚胎生殖细胞。

核供体细胞可以停滞在细胞周期的任何阶段(G0，G1，G2，S，M)，以确保与受体细胞协调。本领域公知的任何方法都可以用于操作细胞周期阶段。控制细胞周期阶段的方法包括，但不限于，培养的细胞的接触抑制诱导的静止，除去血清或其它必须营养物诱导的G0静止，衰老诱导的G0静止，添加特定生长因子诱导的G0静止；物理或化学方法，如热激、高压或用化学物质、激素、生长因子或其它物质进行的其它处理诱导的G0或G1静止；通过用干扰复制程序的任何点的化学试剂处理进行的S期控制；用荧光活化的细胞分选进行选择以进行M期控制、有丝分裂摆脱、用微管破坏剂处理或破坏有丝分裂进展的任何化学物质进行处理(也参见Freshney，R.I，.″Culture of Animal Cells：AManual of Basic Technique，″Alan R.Liss，Inc，New York(1983)。

分离卵母细胞的方法是本领域公知的。基本上，该方法可以包括从动物的卵巢或生殖道分离卵母细胞。容易获得的卵母细胞来源是屠宰场材料。对于诸如基因工程、核转移和克隆的技术的组合，在卵母细胞可以用作核转移的受体细胞之前，并且在它们由精细胞受精以发育成胚胎之前，通常必须使这些细胞在体外成熟。该过程通常需要从哺乳动物卵巢，如在屠宰场获得的牛卵巢收集未成熟(I期前)卵母细胞，在受精或去核前在成熟培养基中使卵母细胞成熟，直到卵母细胞达到中期II阶段，在牛卵母细胞的情况下通常在抽吸后大约18-24小时发生。该阶段称作“成熟阶段”。在某些实施方案中，从小母猪获得卵母细胞。“小母猪”是从未生育过的母猪。在其它实施方案中，从大母猪获得卵母细胞。“大母猪”是以前生育过的母猪。

中期II阶段卵母细胞可以是受体卵母细胞，在此阶段，认为卵母细胞可以是或者是足够“活化的”，以便像处理受精的精子那样处理导入的细胞核。已经将体内成熟的中期II阶段卵母细胞成功用于核转移技术。基本上，可以在动情期开始后或注射人类绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素后35-48或39-41小时从非超数排卵或超数排卵的动物手术收集成熟的中期II卵母细胞。可以将卵母细胞置于合适的培养基，如透明质酸酶溶液中。

在一般为大约10-40小时，大约16-18小时，大约40-42小时或大约39-41小时的固定的成熟时间后，可以对卵母细胞去核。在去核前可以取出卵母细胞，置于合适的培养基，如含有1毫克/毫升透明质酸酶的HECM中，然后除去卵丘细胞。然后可以筛选剥离的卵母细胞的极体，然后将通过极体的存在确定的选择的中期II卵母细胞用于核转移。随后去核。

可以通过例如美国专利No.4,994,384中描述的公知方法进行去核。例如，可以将中期II卵母细胞置于任选含有7.5毫克/毫升细胞松弛素B的HECM中用于立即去核，或置于合适的培养基，例如诸如添加了10％动情期牛血清的CR1aa的胚胎培养基中，然后在稍后去核，优选不超过24小时后，更优选16-18小时后。

可以用微量滴定板通过显微手术完成去核，以除去极体核邻近的细胞质。然后可以筛选卵母细胞，以鉴定成功去核的那些。筛选卵母细胞的一种途径是用HECM中的1毫克/毫升33342 Hoechst染料对卵母细胞染色，然后在紫外线下观察卵母细胞不超过10秒。然后可以将成功去核的卵母细胞置于合适的培养基，如添加了10％血清的CR1aa中。

然后可以将与去核卵母细胞相同物种的单个哺乳动物细胞转移到使用的去核卵母细胞的卵周隙中，以产生UT单位。可以根据本领域公知的方法，用哺乳动物细胞和去核的卵母细胞制备UT单位。例如，可以通过电融合对细胞进行融合。电融合是通过提供足够导致细胞质膜瞬时破裂的电脉冲而实现的。细胞质膜的该破裂是非常短暂的，因为膜迅速重新形成。因此，如果两个邻近的膜被诱导破裂，并且在重新形成时脂双层混合，可以在两个细胞之间打开小通道。由于所述小开口的热动力学不稳定性，它不断扩大直到两个细胞成为一个。例如，参见Prather等的美国专利No.4,997,384。可以使用多种电穿孔介质，包括，例如葡萄糖、甘露糖、山梨糖醇和磷酸缓冲液。也可以用仙台病毒作为致融合剂来完成融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。同样，可以将细胞核直接注射到卵母细胞中，而不是使用电穿孔融合。参见，例如，Collas and Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38：264-267(1994)。融合后，将得到的融合的NT单位置于合适的培养基中直到活化，例如，CR1aa培养基。通常可以在融合后的短时间进行活化，例如，融合后不超过24小时，或约4-9，或最佳是1-2小时。在一种优选的实施方案中，在融合后至少1小时并且在成熟后40-41小时发生活化。

可以通过公知方法活化NT单位。所述方法包括，例如，在低于生理温度下(大体上通过施加冷，或实际上凉的温度刺激)培养NT单位。通过在室温下培养NT单位可以方便地进行该方法，室温相对于胚胎在正常情况下暴露的生理温度条件是低温。或者，可以通过施用公知的活化剂获得活化。例如，已经表明受精过程中精子对卵母细胞的穿透活化了预先融合的卵母细胞，在核转移后产生更大数目的存活的妊娠和多个遗传上相同的小牛。同样，可以用诸如电和化学刺激的处理在融合后活化NT胚胎。参见，例如Susko-Parrish等的美国专利No.5,496,720。可以通过以下方法诱导融合和活化：施加5V的AC脉冲5秒，然后施加两个1.5kV/cm的DC脉冲60微秒，每个脉冲都是用ECM2001 Electrocell Manipulator(BTX Inc.，San Diego，CA)产生的。此外，可以通过增加卵母细胞中的二价阳离子水平和减少卵母细胞中细胞蛋白的磷酸化而同时或依次实现活化。这通常可以通过以例如离子载体的形式将二价阳离子，如镁、锶、钡、钙导入卵母细胞的细胞质而实现。增加二价阳离子水平的其它方法包括使用电休克、用乙醇处理和用笼式螯合剂处理。可以通过公知方法减少磷酸化，例如通过添加激酶抑制剂，如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如6-二甲基-氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。或者，通过将磷酸酶如磷酸酶2A和磷酸酶2B导入卵母细胞，可以抑制细胞蛋白的磷酸化。

然后，可将活化的NT单位或“融合的胚胎”在合适的体外培养基中培养至产生细胞集落。适合于胚胎的培养和成熟的培养基是本领域公知的。可用于胚胎培养和维持的公知培养基的实例包括Ham′s F-10+10％胎牛血清(FCS)、组织培养基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、蒂罗德-清蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco磷酸缓冲液PBS)、Eagle′s和Whitten′s培养基。在一个特定实例中，可以在5％CO2的潮湿气氛下，在38.6℃将活化的NT单位在NCSU-23培养基中培养1-4小时。

之后，可清洗一个或多个培养的NT单位，然后置于装在孔板中的合适培养基中，所述板优选还含有合适的铺满饲养层。合适的饲养层举例说包括成纤维细胞和上皮细胞。将NT单位在饲养层上培养，直到NT单位的大小达到适合转移到雌性受体中，或者适合获得可用来产生细胞集落的细胞。这些NT单位优选可培养直到至少约2-400个细胞，约4-128个细胞，或至少约50个细胞。

然后可将活化的NT单位转移(胚胎转移)到母猪的输卵管中。在一个实施方案中，母猪可以是动情期同步的受体小母猪。可使用杂交小母猪(大白猪/Duroc/Landrace)(280-400磅)。可通过口服给予混合在饲料中的18-20mg Regu-Mate(Altrenogest，Hoechst，Warren，NJ)，使小母猪同步为受体动物。Regu-Mate可连续喂饲14天。然后在最后一次Regu-Mate处理后约105小时，可肌内给予一千单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG，Intervet America，Millsboro，DE)。hCG注射后约22-26小时，则可进行胚胎转移。在一个实施方案中，妊娠可进行到足月，生出活后代。在另一个实施方案中，妊娠可提前5天结束，收获胚胎细胞。

需要的杂合敲除动物的配种

另一方面，本发明提供了通过将α-1，3-GT基因杂合的雄性与α-1，3-GT基因杂合的雌性配种而生产缺乏任何功能性α-1，3-GT表达的活动物的方法。在一种实施方案中，由于α-1，3-GT基因的一个等位基因的遗传修饰以防止该等位基因的表达，动物是杂合的。在另一种实施方案中，由于α-1，3-GT基因的一个等位基因存在点突变，动物是杂合的。在另一种实施方案中，点突变可以是α-1，3-G基因的外显子9的第二个碱基上的T到G的突变。在一种特定实施方案中，提供了生产缺乏任何功能性α-1，3-GT表达的动物的方法，其中在α-1，3-G基因的外显子9的第二个碱基上含有T到G的突变的公猪与在α-1，3-G基因的外显子9的第二个碱基上含有T到G的突变的母猪配种。

在一种实施方案中，可以将从α-1，3-GT基因中携带双敲除的供体细胞进行核转移生产的性成熟动物进行交配，检测它们的后代的纯合敲除。然后可以将这些纯合敲除动物配种，生产更多的动物。

在另一种实施方案中，可以用来自两个遗传上不同的猪品系的野生型精于对来自性成熟的双敲除动物的卵母细胞进行体外受精，将胚胎植入合适的代孕母亲。可以检测这些交配的后代中敲除的存在，例如，可以通过cDNA测序、毒素A敏感性和/或凝集素结合对其进行检测。然后，可以在性成熟期对这些同窝动物进行交配。

在本发明这方面的某些方法中，可以提前终止妊娠，使得可以分离胎成纤维细胞，并且进一步进行表型和/或基因型鉴定。然后，可以根据此处描述的方法(也参见Dai et al.)将缺乏α-1，3-GT基因表达的成纤维细胞用于核转移，以生产携带需要的双敲除的多个胚胎和后代。

III.遗传修饰的动物的类型/额外的遗传修饰

在本发明的一方面，提供了通过基因靶定事件灭活了α-1，3-GT基因的一个等位基因的动物。在本发明的另一方面，提供了猪动物，其中通过基因靶定事件灭活了α-1，3-GT基因的两个等位基因。在一种实施方案中，可以通过同源重组靶定基因。在另一种实施方案中，可以破坏基因，即，可以改变遗传编码的一部分，从而影响基因的该片段的转录和/或翻译。例如，通过取代、缺失(“敲除”)或插入(“敲入”)技术，可以发生基因的破坏。也可以插入调节存在的序列转录的所需蛋白或调节序列的其它基因。

因此，在本发明的另一方面，可以通过至少一个点突变使α-1，3-GT基因无活性。在一种实施方案中，可以通过至少一个点突变使α-1，3-GT基因的一个等位基因无活性。在另一实施方案中，可以通过至少一个点突变使α-1，3-GT基因的两个等位基因都无活性。在一种实施方案中，可以通过基因靶定事件发生该点突变。在另一种实施方案中，该点突变可以是天然存在的。在一种特定实施方案中，点突变可以是位于α-1，3-GT基因的外显子9的第二个碱基的T到G的突变(图1)。携带α-1，3-GT基因中天然存在的点突变的猪能够产生不具有抗生素抗性基因的α1，3 GT缺陷的猪，因此具有制备用于人类的更安全产品的潜能。在其它实施方案中，可以存在至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个或至少20个点突变，使得α-1，3-GT基因无活性。在其它实施方案中，提供这样的猪，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都含有防止任何功能性α-1，3-GT表达的点突变。在一种特定实施方案中，提供了这样的猪，其在α-1，3-GT基因的两个等位基因都含有发生在外显子9的第二个碱基的T到G的突变(图1)。

本发明的另一方面提供了这样的动物，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活，从而通过基因靶定事件灭活了一个等位基因，通过天然存在的点突变灭活了另一个等位基因。在一种实施方案中，提供了猪动物，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活，从而通过基因靶定事件灭活了一个等位基因，由于在外显子9的第二个碱基存在T到G的点突变灭活了另一个等位基因。在一个特定实施方案中，提供了猪动物，其中α-1，3-GT基因的两个等位基因都被灭活，从而通过针对外显子9的靶定构建体(图6)灭活了一个等位基因，由于在外显子9的第二个碱基存在T到G的点突变灭活了另一个等位基因。

在进一步的实施方案中，可以从缺乏任何功能性α-1，3-GT基因表达并且也含有其它遗传修饰的动物获得组织。所述遗传修饰可以包括其它基因的添加和/或缺失，以防止排斥、促进伤口愈合和/或减少或消除有害的病原体(如朊病毒或逆转录病毒)。

PERV是指一种逆转录病毒家族，目前已经鉴定了其具有三种主要的类型：PERV-A(Genbank登记号AF038601)，PERV-B(EMBL登记号PERY17013)和PERV-C(Genbank登记号AF038600)(Patience et al1997，Akiyoshi et al 1998)。PERV-A、B和C的gag和pol基因是高度同源的，在不同类型的PERV(如PERV-A，PERV-B，PERV-C)之间不同的是env基因。最近也鉴定了PERV-D(参见，例如，美国专利No 6,261,806)。

在本发明的一方面，可以通过干扰RNA分子(iRNA)的表达调节猪内源逆转录病毒(PERV)基因。例如，可以使用至少两个iRNA分子，使得PERV病毒的表达被功能性消除或低于检测水平(参见例如USSN 60/523,938)。在进一步的实施方案中，通过同源重组或使用抑制性RNA(RNAi)方法灭活或下调其它病毒，包括，但不限于猪呼吸和生殖综合征(PRRS)病毒。在用RNAi下调的情况下，编码小的抑制性RNAs的基因序列作为转基因表达，并且通过微注射、ICSI、核转移或用精子介导的核转移导入猪。

在另一种实施方案中，可以消除或减少负责异种移植物排斥的其它基因的表达。所述基因包括但不限于CMP-NEUAc羟化酶基因、isoGloboside 3核酶基因和Forssman合酶基因。此外，负责阻抑补体介导的裂解的补体相关蛋白的编码基因或cDNA也可以在本发明的动物和组织中表达。所述基因包括但不限于CD59，DAF，MCP和CD46(参见例如WO 99/53042；Chen et al.Xenotransplantation，Volume 6 Issue 3Page 194-August 1999，其描述了表达CD59/DAF转基因的猪；Costa Cet al，Xenotransplantation.2002 Jan；9(1)：45-57，其描述了表达人CD59和H-转移酶的猪；Zhao L et al.，；Diamond LE et al.Transplantation.2001 Jan 15；71(1)：132-42，其描述了人CD46转基因猪。

其它修饰可以包括以下物质的表达：组织因子途径抑制剂(TFPI)、肝素、抗凝血酶、水蛭素、TFPI、蜱抗凝肽或蛇毒因子，如标题为“锚定于细胞膜的抗凝融合蛋白”的WO 98/42850和美国专利No.6,423,316中的描述；或通过细胞下调细胞粘附分子表达的化合物，如抗体，如标题为“通过下调细胞粘附分子抑制异种移植物排斥”的WO 00/31126中的描述，和例如通过给来自异种移植供体生物的可溶形式的CTLA-4的器官受体施用而防止信号2的共刺激的化合物，如标题为“通过阻断T细胞共刺激信号2(B7/CD28)而进行的免疫抑制”的WO 99/57266中的描述。

在下文的非限制性实施例中更详细描述了本发明的某些方面。

实施例

实施例1：

产生α-1，3-GT基因杂合的猪细胞

原代猪胎成纤维细胞的分离和转染

在妊娠第33天从同一次妊娠的10个胎分离胎成纤维细胞(PCFF4-1到PCFF4-10)。除去头和内脏后，用Hanks平衡盐溶液(HBSS；Gibco-BRL，Rockville，MD)清洗胎，置于20ml HBSS中，并且用小手术剪剪碎。沉淀组织，重悬于装有40ml DMEM和每胎100 U/ml胶原酶(Gibco-BRL)的50ml试管中。在37℃的振荡水浴中将试管温育40分钟。使消化的组织沉降3-4分钟，将富含细胞的上清液转移到新的50ml试管中并且沉淀。然后将细胞重悬于40ml含有10％胎牛血清(FCS)、1X非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和2ng/ml bFGF的DMEM中，并且接种到10cm的平皿中。在达到铺满时对所有的细胞进行冷冻保存。在妊娠第28天从10个胎分离SLA-1到SLA-10细胞。用弯曲的手术钳捣碎胎，缓慢通过60目的金属筛，以便不产生过多的热。然后沉淀细胞悬浮液，重悬于30ml含有10％FCS、1X非必需氨基酸、2ng/mlbFGF和10μg/ml庆大霉素的DMEM中。将细胞接种到10cm的平皿中，培养1-3天，并且冷冻保存。对于转染，通过电穿孔将10μg线性化的载体DNA导入2百万个细胞中。在转染后48小时，将转染的细胞以每孔2000个细胞的密度接种到48孔板中，用250μg/ml G418进行选择。

敲除载体构建

从两种原代猪胎成纤维细胞SLA1-10和PCFF4-2细胞的等基因DNA构建两个α-1，3-GT敲除载体pPL654和pPL657。通过PCR分别从SLA1-10细胞和PCFF4-2细胞的纯化DNA制备包含大部分内含子8和外显子9的6.8kb的α-1，3-GT基因组片段。将位于外显子9的5’末端的独特EcoRV位点转化为SalI位点，将1.8kb的IRES-neo-poly A片段插入SalI位点。IRES(内部核糖体进入位点)作为neo蛋白的翻译起始位点。因此，两种载体都具有4.9kb的5’重组臂和1.9kb的3’重组臂(图6)。

3’PCR和长程PCR

将大约1000个细胞重悬于5μl胚胎裂解缓冲液(ELB)(40mMTris，pH 8.9，0.9％Triton X-100，0.9％NP40，0.4mg/ml蛋白酶K)，在65℃温育15分钟以裂解细胞，在95℃加热10分钟以灭活蛋白酶K。对于3’PCR分析，用Expand High Fidelity PCR系统(Roche MolecularBiochemicals)在25μl反应体积中扩增片段，采用以下参数：35个循环的94℃下1分钟，60℃下1分钟和72℃下2分钟。对于LR-PCR，用AKARA LA系统(Panvera/Takara)在50μl反应体积中扩增片段，采用以下参数：30个循环的94℃下10秒，65℃下30秒，68℃下10分钟+20秒增加/循环，然后是一个68℃下7分钟的最终循环。纯化的DNA的3′PCR和LR-PCR条件与细胞相同，只是将1μl纯化的DNA(30μg/ml)与4μl ELB混合。

细胞样品的Southern印迹分析

60℃下在裂解缓冲液(10mM Tris，pH7.5，10mM EDTA，10mMNaCl，0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸钠，1mg/ml蛋白酶K)中将大约106个细胞裂解过夜。然后用BstEII消化DNA，在1％琼脂糖凝胶上分离。电泳后，将DNA转移到尼龙膜上，用3’末端洋地黄毒苷标记的探针进行探测。用化学发光的底物系统(Roche Molecular Biochemicals)检测条带。

结果

用neo442S和αGTE9A2作为正向和反向引物，通过3’PCR筛选抗生素(G418)抗性集落。Neo442S位于neo基因的3’末端，αGTE9A2位于3’重组臂外的序列中外显子9的3’末端(图6)。因此，仅仅通过成功靶定α1，3GT基因座，才能获得预期的2.4kb的PCR产物。从4个不同细胞系的总共7次转染中挑选出1105个G418抗性集落，其中100个(9％)在最初的3’PCR筛选中是α1，3 GT基因破坏阳性的(范围是2.5-12％)。集落657A-A8，657A-I6和657A-I11表现出了预期的2.4kb条带，而对照PCFF4-6细胞和另一个G418抗性集落，即657A-P6是阴性的。随后立即将每个3’PCR阳性集落的一部分作为几个小等分物进行冷冻，以便以后用于NT实验，而扩增其余细胞用于长程PCR(LR-PCR)和Southern分析。

由于检测重组连接的PCR分析或mRNA分析(RT-PCR)会产生假阳性结果，进行了包括完整被靶定区的长程PCR。LR-PCR覆盖了从外显子8到外显子9末端的7.4kb的α1，3GT基因组序列，两个引物(αGTE8S和αGTE9A2)都位于重组区外(图2)。对照PCFF4-6细胞和3’PCR阴性集落657A-P6仅仅表现出来自野生型α1，3GT基因座的内源性7.4kb片段。相反，3′PCR阳性集落中的三个，即，657A-A8，657A-I6和657A-I11，表现出7.4kb的内源性条带和新的9.2kb的条带，其大小是预期的1.8kb IRES-neo盒在α1，3GT基因座中的靶定的插入。

成功扩增了大约一半(17/30)的LR-PCR阳性集落，以产生足够的细胞数目(1×10⁶个细胞)用于Southern分析。预期集落对于α1，3 GT基因座上的敲除是杂合的，因此它们应该具有α1，3 GT基因的一个正常的经过修饰的基因拷贝和一个破坏的拷贝。采用BstEII消化，α1，3GT敲除细胞应该具有两个条带：一个7kb条带，其大小是预期的内源α1，3 GT等位基因的大小，以及一个9kb条带，其是在α1，3 GT基因座中插入IRES-neo序列的特征性条带(图2)。通过敲除体的Southern分析证实了所有17个LR-PCR阳性集落。用neo的特异性序列重新探测相同的膜，用neo探针检测9kb条带，从而证实了IRES-neo盒在α1，3GT基因座中的靶定的插入。

实施例2：

制备α-1，3-GT基因杂合的猪细胞

按照上文所述从妊娠第32天的胎分离杂合α-1，3-GT敲除的胎成纤维细胞(657A-I11 1-6)细胞(也参见Dai et al.Nature Biotechnology 20：451(2002))。除去头和内脏后，用Hanks平衡盐溶液(HBSS；Gibco-BRL，Rockville，MD)清洗一些胎，置于20ml HBSS中，并且用小手术剪剪碎。沉淀组织，重悬于装有40ml DMEM和每胎100U/ml胶原酶(Gibco-BRL)的50ml试管中。在37℃的振荡水浴中将试管温育40分钟。使消化的组织沉降3-4分钟，将富含细胞的上清液转移到新的50ml试管中并且沉淀。然后将细胞重悬于40ml含有10％胎牛血清(FCS)、1X非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠(Gibco-BRL)和2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)的DMEM中，并且接种到10cm的平皿中。在达到铺满时对所有的细胞进行冷冻保存。除去头和内脏后，用Hanks平衡盐溶液(HBSS；Gibco-BRL，Rockville，MD)清洗一些胎，置于20ml HBSS中，并且用小手术剪剪碎。用弯曲的手术钳捣碎胎，缓慢通过60目的金属筛(Sigma，St.Louis，MO)，以便不产生过多的热。然后沉淀细胞悬浮液，重悬于30ml含有10％FCS、1X非必需氨基酸、2ng/ml bFGF和10μg/ml庆大霉素的DMEM中。将细胞接种到10cm的平皿中，培养1-3天，并且冷冻保存。对于转染，通过电穿孔将10μg线性化的载体DNA导入2百万个细胞中。在转染后48小时，将转染的细胞以每孔2000个细胞的密度接种到48孔板中，用250μg/ml G418(Gibco-BRL)进行选择。构建靶定ATG(起始密码子)的α-1，3-GT敲除载体(pPL680)，其也含有neo基因，以敲除α-1，3-GT基因的第二个等位基因。通过电穿孔用pPL680转染这细胞，并且用纯化的艰难梭菌毒素A选择α1，3Gal阴性表型(描述于下文)。

实施例3：

用艰难梭菌毒素A选择α-1，3-GT基因纯合的猪细胞

毒素A细胞毒性曲线

将猪细胞(PCFF4-6)在毒素A的10倍系列稀释液(0.00001μg/ml-10μg/ml)中暴露1小时或过夜。在24孔板中培养细胞，在37℃下用毒素温育1小时或过夜。该暴露的结果详述于表2。明显地，暴露于1μg/ml毒素A1小时，导致对＞90％的细胞的细胞毒性作用。因此，选择1μg/ml或略高于1μg/ml的毒素A浓度来选择遗传改变的细胞。

表2.暴露1小时和暴露过夜的毒素A毒性

[毒素A]，μg/ml	温育1小时	温育过夜
			0	100％铺满	100％铺满
.00001	100％铺满	100％铺满
			.0001	100％铺满	100％铺满
.001	100％铺满	100％铺满
			.01	100％铺满	50％铺满，50％聚拢
.1	90％铺满	与10μg/ml相同
			1	＞90％聚拢	与10μg/ml相同
10	所有细胞聚拢	所有细胞聚拢，一些抬起

通过电穿孔，用10μg/ml线性化的载体DNA(启动子包载)转染来自猪胚胎的解聚的细胞(I-11：1-6)，该细胞在galα-1，3-GT基因的一个等位基因含有以前鉴定的被靶定的敲除(Dai et al.)。48小时后，将细胞以每孔2000个细胞的密度接种到48孔板中，用250μg/ml G418进行选择。转染后5天，从孔取出培养基，更换为含有2μg/ml毒素A的培养基(高葡萄糖的DMEM，其中含有2.8ng/ml bFGF和20％FCS)。37℃下将细胞暴露于毒素A的选择作用，持续2小时。取出含有毒素A的培养基以及任何从板释放出来的受影响的细胞，用新鲜培养基清洗剩余的细胞，更换了不含毒素A的培养基。10天后，再次将细胞暴露于培养基中的1.3μg/ml的毒素A。除去培养基、毒素A和溶液中的任何细胞，清洗剩余的细胞，更换培养基。

转染后16天，收获表现出毒素A不敏感的单集落，称作680B1，将其一部分用于DNA分析和凝集素染色。DNA分析表明毒素A不敏感不是由于第二靶载体的整合，但是，细胞没有被GSL IB-4凝集素染色，表明发生了基因座的功能性敲除。将680B1双敲除细胞用于核转移到5个受体中，得到三个妊娠。这些妊娠中的两个在第一个月同时流产；在妊娠第39天从剩余的妊娠收获4个胎，将细胞解聚，接种到组织培养物中。在37℃下将这些胎细胞(680B1-1，680B1-2，680B1-3，680B1-4)暴露于1μg/ml的毒素A1小时，然后取出培养基，清洗细胞，更换不含毒素A的培养基。第1、2和4个胎不受毒素A的影响，而大多数来自第3个胎的细胞聚拢，表明该胚胎对毒素A的细胞毒性作用敏感。

FACS分析表明，第1、2和4个胎不结合GS IB4凝集素(参见表3)，而第3个胎不结合凝集素。这表明第1、2和4个胎不携带该特定凝集素特异的表位α1，3 gal.

表3.用GS-IB4凝集素进行的680B1-1至680B1-4细胞的FACS结果

                   GS IB4凝集素阳性细胞(％)

细胞	未染色	50μg/ml IB4凝集素	100μg/mlIB4凝集素
				HeLa细胞(阴性CTL)	1％	2％	2.8％
PCFF4-6细胞(阳性CTL)	0.2％	76％	91％
				PFF4细胞(阳性CTL)	1.5％	82％	94％
680B1-1细胞	0.6％	0.8％	0.9％
				680B1-2细胞	1.2％	1.2％	1.1％
680B1-3细胞	8％	35％	62％
				680B1-4细胞	0.6％	0.8％	0.9％

在来自所有4个胎的细胞上进行补体固定测定。补体裂解测定开发为缺乏αgal表达的生物测定。人血清含有高水平的预先形成的抗αgal抗体和全部的补体调节蛋白(C3途径)。抗αgal抗体结合时细胞表面αgal的存在激活了补体级联，导致补体介导的细胞裂解。αgal阴性细胞将抗补体介导的裂解。在三个独立的测定中，将B1和对照猪细胞暴露于含补体的人血清，进行测定以评估对α-gal引起的补体介导的细胞裂解的敏感性或抗性。用B1-1、B1-2和B1-4细胞以及杂合GTKO细胞(B1-3，gal阳性)进行测定，用野生型α-gal(+)PCFF4-6猪细胞作为对照。将细胞暴露于三种处理之一；两个阴性对照，即牛血清白蛋白(BSA)和热灭活的人血清(HIA-HS)不含有任何功能性补体蛋白，因此预期不会导致任何显著的细胞裂解；第三种处理，即未进行热灭活的人血清(NHS)含有功能性人补体以及抗gal特异性抗体，因此预期将裂解细胞表面含有半乳糖α1，3半乳糖的细胞。

图1所示结果明确证明了B1-1，B-2和B1-4细胞抗人补体介导的裂解，而α1，3 Gal阳性的B1-3细胞与野生型PCFF4-6细胞一样，对人血浆仍然是敏感的。

来自所有胎的cDNA的测序结果表明，第1、2和4个胎在第二个α1，3 GT等位基因含有点突变，即可以产生功能障碍酶的改变(参见图2)。该突变发生在编码区的bp424，具体地，发生在α-1，3-GT(GGTA1)基因(GenBank登记号L36152)的外显子9的第二个碱基对，其胸腺嘧啶残基转变为鸟嘌呤残基，导致在第142位的氨基酸由酪氨酸取代为天冬氨酸。

这是一个显著的转变，因为亲水氨基酸酪氨酸是α1，3GT的UDP结合位点的关键成分(参见图3)。牛α-1，3-GT蛋白的晶体结构的分析表明，该酪氨酸是酶的催化结构域的中心，参与UDP-Gal结合(Gastinel et.al.，EMBO Journal 20(4)：638-649，2001)。因此，预期从酪氨酸(疏水氨基酸)改变为天冬氨酸(亲水氨基酸)将导致αGT功能的破坏(如所观察到的)。

为了证实突变的cDNA不会产生功能性αGT蛋白，将来自所有4个细胞的第二个等位基因的cDNA克隆到表达载体中，将该GT表达载体转移到人成纤维细胞(HeLa细胞)中，以及转移到原代猕猴细胞中。由于人和古代猴缺乏功能性α1，3 GT基因，HeLa细胞在细胞表面将不具有α1，3半乳糖(如通过凝集素结合实验所测定的)。结果表明，当用获自B1-1，B1-2和B1-4细胞的cDNA转染时，通过IB4-凝集素染色测定出仍然是α1，3 Gal阴性的，而用来自B1-3的cDNA转染的猕猴细胞产生了功能性α1，3 GT转录物，并且因此是α1，3 Gal阳性的。明显地，具有天冬氨酸突变(代替酪氨酸)的细胞不能产生功能性α1，3半乳糖基转移酶。

实施例4：

用纯合α1，3 GT缺陷的胎成纤维细胞作为核供体产生克隆猪

制备用于核转移的细胞

按照上文的普遍描述，对供体细胞进行遗传操作，产生对于α1，3GT缺陷是纯合的细胞。通过本领域公知的方法进行核转移(参见，例如Dai et al.，Nature Biotechnology 20：251-255，2002；和Polejaeva etal.，Nature 407：86-90，2000)。

在hCG注射后46-54小时，通过用预热的含有牛血清白蛋白(BSA；4g/l)的Dulbecco′s磷酸缓冲液(PBS)对输卵管反向冲洗，收集卵母细胞(如Polejaeva，I.A.，et al.(Nature 407，86-90(2000)的描述)。按照Polejaeva，I.A.，et al.(Nature 407，86-90(2000))的描述，在成熟后40-42小时开始进行体外成熟的卵母细胞(BioMed，Madison，WI)的去核。38℃下在含有4g/l的BSA的PBS中清洗回收的卵母细胞，38℃下转移到不含钙的磷酸盐缓冲的NCSU-23培养基中，用于转移到实验室。为了去核，我们将卵母细胞在含有5μg/ml细胞松弛素(Sigma)和7.5μg/ml Hoechst 33342(Sigma)的不含钙的磷酸盐缓冲的NCSU-23培养基中38℃下温育20分钟。然后用18μM玻璃移液管(Humagen，Charlottesville，Virginia)吸出直接位于第一极体下的少量细胞质。我们将吸出的核体暴露于紫外光，以证实赤道板的存在。

为了核转移，将单个成纤维细胞置于透明带下与每个去核的卵母细胞接触。通过施加5V的AC脉冲5秒，然后施加两个1.5kV/cm的DC脉冲60微秒诱导融合的活化，每个脉冲都是用ECM2001Electrocell Manipulator(BTX Inc.，San Diego，CA)产生的。38.6℃下在潮湿的5％CO₂气氛下在NCSU-23培养基中将融合的胚培养1-4小时，然后转移到动情期同步的受体小母猪的输卵管中。通过口服给予混合在饲料中的18-20mg Regu-Mate(Altrenogest，Hoechst，Warren，NJ)，使杂交小母猪(大白猪/Duroc/Landrace)(280-400磅)同步为受体。Regu-Mate连续喂饲14天。在最后一次Regu-Mate处理后约105小时，肌内给予一千单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG，Intervet America，Millsboro，DE)。hCG注射后22-26小时，则进行胚胎转移。

然后将毒素A用于选择作为核供体的猪成纤维细胞，其是通过上文详细描述的方法产生的。

胚胎转移和得到存活的出生

在通过核转移生产活的α-1，3-GT dKO猪的最初尝试中，用遗传操作的供体细胞进行总共16个胚胎的转移。建立了9个最初的妊娠，但是仅有两个超过了妊娠第75天。5只小猪出生于2002年7月25日。一只小猪在出生后立即死亡，另外4只在出生后存活，并且是正常的(图4)。

实施例5：

纯合α-1，3-GT敲除猪的分析

从所有5只双敲除的小猪获得尾成纤维细胞和脐组织区段，按照上文所述用GS-IB4凝集素染色。没有观察到染色，表明这些动物完全缺乏组织表面上的半乳糖α1，3半乳糖表位(数据未示出)。从死亡小猪(761-1)分离的主动脉内皮细胞和肌肉和尾成纤维细胞是GS-IB4凝集素染色阴性的。小猪761-1的肌肉成纤维细胞的FACS分析也表现出GS-IB4结合的阴性结果。获自小猪761-1的肝脏、肾、脾、皮肤、肠、肌肉、脑、心脏、胰腺、肺、主动脉、舌、脐和尾的组织区段都是GS-IB4染色阴性的，表明完全缺乏可检测的细胞表面α1，3Gal表位(Phelps etal.，Science 299：411-414，2003，包括图S3)。

我们用α1，3GT敲除小鼠进行了体内免疫原性检测。我们将分离自小猪761-1的胰腺的胰岛样细胞簇(ICCs)腹膜内注射到α1，3GT敲除小鼠中。我们用来自新生野生型小猪的ICCs作为对照。如图5所示，在注射来自α1，3GT DKO小猪的ICCs后，在α1，3GT敲除小鼠中没有观察到针对α1，3Gal的免疫球蛋白M(IgM)的滴度增加，相反的是，在注射了野生型小猪ICCs的小鼠中观察到了IgM滴度的显著增加(Phelps et al.，Science 299：411-414，2003，包括图S4)。该结果明确证明了DKO小猪细胞不产生任何α1，3Gal表位。

如在用于克隆这些动物的680B1-2细胞中所观察到的，从所有5只小猪获得的DNA的测序证明了在GGTA1基因的bp424存在突变(图2)。

由于这是第一次成功产生了一窝α-GT dKO猪，通过核转移又产生了随后的两窝dKO小猪，一种情况下(窝662)采用dKO胎成纤维细胞作为核供体细胞。用来自窝761的一个成员的尾成纤维细胞作为核供体，通过核转移产生了窝660。这些出生概括于表4。

表4：通过核转移产生的α-GT双敲除体出生的概括

细胞系	窝数	产生的活小猪
			A	8	14
B	2	2
			C	1	1
总数		17

^*PM＝通过点突变进行的GT等位基因敲除；Neo＝通过同源重组和Neo选择标记基因的插入进行的GT等位基因敲除。该表中列出的所有猪都是纯合的GT敲除体。

实施例6：

对杂合α1，3 GT单敲除(SKO)公猪和母猪进行配种，

建立双敲除(DKO)猪的小群体

Southern印迹证实产生了克隆的GT-SKO母猪和克隆的公猪。通过天然配种和人工受精(AI)对杂合(单基因α1，3GT敲除猪)公猪和母猪进行配种，产生用于临床前研究和人类临床试验的DKO猪群体。

实施例7：来自双敲除动物的皮肤组织的去细胞

要加工的生物组织首先从上文描述的功能性α1，3GT被灭活的动物供体如猪获得或获取。用皮刀或本领域技术人员公知的其它装置从供体动物切下皮肤组织。将组织置于稳定转运溶液中，所述溶液阻止和防止渗透压、缺氧、自溶和蛋白水解引起的降解、防止细菌污染和减少可能发生的机械损害。稳定溶液通常包含此处描述或本领域技术人员公知的合适的缓冲液、一种或多种抗氧化剂、一种或多种渗透压调节剂、抗生素、一种或多种蛋白酶抑制剂。

然后在加工溶液中温育组织，以便从结构基质除去活的抗原性细胞(包括上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞)而不破坏基底膜复合体或胶原基质的结构完整性。加工溶液通常含有此处描述或本领域技术人员公知的合适的缓冲液、盐、抗生素、一种或多种去污剂、一种或多种蛋白酶抑制剂和/或一种或多种酶。用该加工溶液处理组织是在一定的浓度下进行一定时间段，从而避免基底膜复合体的降解并且保持包含胶原纤维和弹性蛋白的基质的结构完整性，以产生去细胞的组织。

对组织去细胞后，将其温育在冷冻保存溶液中。该溶液通常包含一种或多种冷冻保护剂，使得冷冻过程中可能发生的对结构基质的冰晶损害最小，还包含一种或多种干燥保护成分，使得干燥过程中的结构破坏改变最小，并且可以包含在冷冻过程中不膨胀也不收缩的有机溶液和水的组合。在该冷冻保存溶液中温育后，将组织包装到无菌容器中。作为附加或替代的方法，用诸如戊二醛的交联剂固定去细胞的组织，并且在移植前储存。

实施例8：从双敲除动物获取异种移植物的韧带

要加工的生物组织首先从上文描述的功能性α1，3GT被灭活的动物供体如猪获得或获取。用合适的手术技术从供体动物切下韧带组织。在第一步中，从非人动物的关节取出完整的韧带。从新处死的动物收集作为韧带来源的关节，立即置于合适的无菌等渗或其它组织保存溶液中。在屠宰动物后尽快获取关节，并且在低温下进行，即，在大约5℃-大约20℃的大致范围进行，使得韧带组织的酶降解最少。可以获取单独的韧带或获取带有连接于一端或两端的一块骨的韧带。一块骨代表基本上为圆柱形的骨栓，骨栓可以是直径大约9-10mm，长度大约20-40mm，其连接于韧带。仔细鉴定韧带，并且进行解剖，使其不带有粘附的组织。然后在大约10倍体积的无菌冷水中清洗，除去残留的血液蛋白和水溶性材料。然后在室温下将异种移植物浸入乙醇中大约5分钟，以便对组织消毒并且除去非胶原材料。

浸过乙醇后，将异种移植物植入关节。或者，对异种移植物进行至少一种以下处理：放射处理、用乙醇或臭氧处理、一个或多个冷冻和融化的循环，和/或用化学交联剂处理。在冻/融循环处理中，通过在室温下(大约25℃)将融化的异种移植物浸入等渗盐水浴大约10分钟而使异种移植物融化。没有使用外部热或放射源，以使纤维降解最少。

此外或者替代地，对异种移植物进行细胞破坏处理，以便在用糖苷酶体外消化异种移植物之前杀死韧带的细胞。从有核细胞和细胞外成分除去表面碳水化合物部分后，有核细胞，即活细胞，重新表达表面碳水化合物部分。

此外或者替代地，在杀死韧带细胞之前或之后，用糖苷酶体外消化异种移植物，酶促消除抗原性表面碳水化合物部分。也可以使用其它酶，以便除去任何残留的非-αgal碳水化合物部分。

在植入前，用诸如无花果蛋白酶或胰蛋白酶的蛋白水解酶消化处理本发明的韧带异种移植物，以便增加组织柔性，或用抗钙化剂、抗血栓形成包衣、抗生素、生长因子或本领域公知的其它药物包被，以便增强异种移植物掺入到受体关节中。此外或者替代地，用公知的方法，如额外的戊二醛或甲醛处理、环氧乙烷消毒、环氧丙烷消毒等进一步对韧带异种移植物进行消毒。冷冻储存异种移植物，直到需要使用。

采用公知的关节镜手术技术，由本领域技术人员将韧带异种移植物或其区段植入到受损的人膝关节中。用于进行关节镜技术的特殊仪器是本领域技术人员公知的，其确保准确和可重复地放置韧带植入物。最初，用公知的方法完成膝关节的完整诊断性关节镜检查。用手术刮刀除去不能恢复地破坏的韧带。确定韧带的解剖插入部位，钻孔以容纳骨栓。骨栓的大小是大约9-10mm宽，大约9-10mm深，大约20-40mm长。将异种移植韧带通过钻孔放入，用干涉螺丝固定。进行常规关闭。

实施例9：来源于纯合α1，3 Gal敲除猪的

小肠粘膜下层(SIS)的组织移植物

组织移植物材料来源于缺乏任何功能性α1，3 GT表达的动物，如猪，并且包含粘膜下组织和基底粘膜组织，所述组织是从小肠的一段，如空肠分层剥离的，空肠是在十二指肠和回肠之间延伸的小肠的一部分。

通过首先切除一段自生的近端空肠，然后进行中线开腹手术切口，制备获自α1，3 gal缺陷猪的小肠的SIS移植物。然后将切除的空肠段包裹在生理盐水中浸渍过的手术纱布中。完成肠吻合后，通过摩擦肠组织以除去包括浆膜和粘膜肌层的外层和至少包括粘膜的腔部分的内层而制备切下的肠段。在轻摩擦的条件下在致密层和固有层之间分层剥离粘膜。更具体地，在利用Adson-Brown钳和Metzenbaum剪从肠段除去肠系膜组织后，通过用解剖刀柄和湿纱布进行纵向擦拭运动，从肠段分层剥离浆膜和粘膜肌层(外组织层)。翻转肠段后，用相同的擦拭运动从下面的组织分层剥离粘膜的腔部分。小心防止粘膜下层穿孔。也除去保留在移植物表面的来自分层剥离的各层的组织“标志”。任选地，可以首先翻转肠段，然后剥离腔层，然后重新插入到最初的方向，以便除去浆膜和粘膜肌层。移植物材料是发白的、半透明的组织管，大约0.1mm厚，通常由粘膜和附着的粘膜肌层和致密层组成。对于血管移植物制备，使制备的移植物翻转到其最初的方向，使得致密层作为移植物的腔面。

通常用盐水清洗制备的移植物材料，并且置于10％的硫酸新霉素溶液中大约20分钟，此后移植物材料可以进行使用。用通常用于组织移植物应用的常规手术程序施用移植物。用于非血管组织移植物应用时，管状移植物材料可以纵切并且铺开，以形成组织“斑片”。可以在肠组织的“斑片”上进行上述完整的组织分层程序，所述斑片是通过纵切肠段，并且将其“铺开”以形成移植前斑片而制备的。制备的移植物组织斑片例如可以用作皮肤移植物材料，用于硬脑膜修复或用于修复其它身体组织缺损，所述缺损导致其自身需要具有该移植物组合物的物理和功能特征的组织移植物斑片的手术应用。Gal KO SIS斑片的其它应用包括用于转子套修复、疝气、腹壁修复、治疗尿失禁的吊带、烧伤、皮肤置换、美容手术，包括乳腺重建、面部缺陷、唇重建、眼睑间隔物移植物、凹陷的斑痕的修复、粘膜移植物、鼻唇沟、口表面重修、腮腺切除术、鼻中隔穿孔修复、鼻整形术临时的伤口敷料、伤口覆盖物、鼓膜成形术、前庭成形术和其它软组织缺损。

对用于血管移植物，移植物的直径大约与受体血管的直径相同。这是通过以下步骤实现的：操作组织移植物以确定具有与受体血管大约相同的直径的圆柱形，并且缝合或以其它方式将组织移植物纵向固定，形成所述血管移植物。因此，例如，血管移植物是通过以下方法制备的：选择具有与受体血管相同的外径的无菌玻璃杆，并且将玻璃杆插入移植物腔。然后聚集冗余的组织，通过沿移植物的长度缝合(例如，用两根连续的缝线或单根中断的缝线)或通过采用其它本领域公知的组织固定技术获得需要的腔直径(也参见美国专利No 4,956,178)。

本文描述的本发明可在不存在本文中没有明确公开的任何要素或限制条件下实施。已采用的术语和表达用作描述性用语而不是限制性用语，且并非意图使用这种术语和表达来排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同方案，不过应认识到，在要求保护的本发明范围内可能有各种修改方案。因此，应当理解，尽管本发明已在本文中明确地公开，本领域技术人员可采用本文公开概念的任选特征、修改或变化，并且这种修改或变化被认为落入后附权利要求书所定义的本发明范围内。此外，在本发明特征或方面以马库什组方式描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员子集的方式来描述。

Claims (28)

1.一种修复物，包含来源于缺乏任何α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的组织产品。

2.权利要求1的修复物，其中所述组织是硬组织。

3.权利要求1的修复物，其中所述组织是软组织。

4.权利要求1的动物，其中所述动物是有蹄动物。

5.权利要求4的动物，其中所述有蹄动物是猪。

6.权利要求2的修复物，其中所述硬组织是骨或其片段或衍生物。

7.权利要求3的修复物，其中所述软组织选自皮肤、真皮、粘膜下层、韧带、腱和软骨或其片段或衍生物。

8.权利要求1的修复物，其中所述组织是硬组织和软组织的组合。

9.权利要求8的组织，其中所述组织是骨-腱-骨移植物。

10.来源于缺乏任何α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的去细胞的组织产品。

11.权利要求9的组织，其中所述动物是有蹄动物。

12.权利要求10的组织，其中所述有蹄动物是猪。

13.权利要求9的去细胞的组织，其中所述组织是软组织。

14.权利要求9的组织，其中所述软组织是皮肤组织。

15.权利要求9的组织，其中所述软组织是粘膜下组织。

16.权利要求11的组织，其中所述粘膜下组织来源于小肠。

17.权利要求9的组织用作支架的用途。

18.来源于缺乏任何α-1，3-半乳糖基转移酶表达的动物的组织产品用于重建或修复人体部分的用途。

19.权利要求18的组织，其中所述动物是有蹄动物。

20.权利要求18的组织，其中所述有蹄动物是猪。

21.权利要求18的组织的用途，其中所述组织用于人类整形外科重建或修复。

22.权利要求21的组织用于转子套修复的用途。

23.权利要求21的组织用于修复或重建选自骨、腱、韧带和软骨的组织的用途。

24.权利要求21的组织的用途，其中所述组织是骨-腱-骨移植物。

25.权利要求18的组织的用途，其中所述组织用于人类皮肤修复。

26.权利要求18的组织的用途，其中所述组织用于人类软组织修复。

27.权利要求18的组织的用途，其中所述组织是去细胞的。

28.权利要求27的去细胞的组织的用途，其中所述组织用作支架以重建或修复人体部分。

Images