CN108495659A

CN108495659A - 用于伤口愈合的组合物和方法

Info

Publication number: CN108495659A
Application number: CN201680063510.0A
Authority: CN
Inventors: 苏奇特拉·苏米特兰-霍尔格松
Original assignee: Verigraft AB
Current assignee: Verigraft AB
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2018-09-04
Also published as: AU2016349679A1; US20180303970A1; JP2018535749A; CA3003069A1; WO2017076782A1; EP3370787A1; KR20180090996A

Abstract

本发明涉及一种工程生物材料的组合物，包括哺乳动物组织的细胞外基质和多聚物；一种愈合伤口的方法；以及向所需受试者递送治疗剂、生长因子或用于伤口愈合的保湿的方法。

Description

用于伤口愈合的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年11月2日提交的美国临时申请序列号62/249,587的优先权的权益，其全部内容通过引用整体并入本文所述。

背景技术

作为人体的正常生理过程，伤口愈合通过四个精准且高度程序化的阶段实现：止血、炎症、增殖和重塑。为使伤口成功愈合，所有四个阶段必须按特定的顺序和时间窗出现。多个因素可干扰该过程的一个以上阶段，从而导致伤口愈合不良或受损。

愈合受损的伤口，包括延迟的急性伤口与慢性伤口，通常无法通过正常的愈合阶段进展。由于推迟的、不完全的或非协调性的愈合过程，这些伤口会频繁进入病理性炎症状态。大多数慢性伤口都是与缺血、糖尿病、静脉瘀血疾病或压力相关的的溃疡有关。在美国大约3百万至6百万人群受伤口未愈合而影响，其中65岁及以上的人群占该类事件的85％。伤口未愈合导致巨大的医疗保健支出，总费用估计每年超过30亿美元。

在成年人类中，最佳的伤口愈合涉及以下事件：(1)快速止血；(2)适当的炎症；(3)间充质细胞分化、增殖，并向伤口部位迁移；(4)合适的血管生成；(5)促进再上皮化(上皮组织在伤口表面的再生长)；和(6)适当的胶原蛋白合成、交联和排列，为愈合组织提供强度。

已经开发了多种基于细胞的疗法和组织工程策略来治疗慢性伤口或急性皮肤损伤的患者。然而，在实现慢性或急性伤口的持久伤口愈合方面，没有一种是最佳的。为实现持久的伤口闭合，功能性血管网的形成对于伤口床的再生是重要的。本发明提供用于伤口愈合的改进的组合物。

发明内容

本发明特别提供一种施用于伤口的包括哺乳动物组织的细胞外基质组分和多聚物的组合物(例如，工程生物材料)；一种愈合所需受试者伤口的方法，该方法包括施用该组合物(例如，工程生物材料)；一种将治疗剂递送至所需受试者伤口的方法，包括施用该组合物(例如，工程生物材料)；一种将生长因子递送至所需受试者伤口的方法，包括在受试者伤口施用包括哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分、多聚物、和生长因子的组合物(例如，工程生物材料)；和一种保湿(hydrating)所需受试者伤口的方法，该方法包括在受试者伤口施用包括哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分和多聚物的组合物(例如，工程生物材料)。哺乳动物组织可以是脱细胞哺乳动物组织。细胞外基质组分可从哺乳动物(例如，人类)组织中分离和/或纯化或利用重组DNA技术产生，包括编码相关ECM组分(例如，胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白多糖、抗菌剂、趋化因子、细胞因子和生长因子)的哺乳动物(例如人类)基因或基因片段，在合适的表达系统(原核或真核的(例如，昆虫或哺乳动物细胞))表达，以及后续利用本领域合适的方法分离和/或纯化。

组合物(例如，工程生物材料)中的细胞外基质组分可来自哺乳动物组织，例如，上皮和/或结缔组织，以及可从皮肤、胎盘和/或脐带中获得。组合物(例如，工程生物材料)可为凝胶组合物。组合物(例如，工程生物材料)中的多聚物可包括二糖聚合物，例如，透明质酸。组合物(例如，工程生物材料)可进一步包括血细胞或富含血小板的血浆。组合物(例如，工程生物材料)可包括人外周血单一核细胞。ECM组分可包括胶原蛋白、弹性蛋白、和/或硫酸化糖胺聚糖(GAGs)。ECM组分可混合合成的多聚物。

组合物(例如，工程生物材料)中的哺乳动物组织可从哺乳动物如猪、牛、羔羊、山羊、绵羊、或灵长类动物(例如，人类)中获得。哺乳动物组织可为脱细胞哺乳动物组织。哺乳动物可为猪。该哺乳动物，例如猪，可为α-Gal(Galα1，3-Galβ1-4-GlcNAc-R)表位基因敲除突变体。

伤口愈合方法包括愈合急性或慢性伤口、或皮肤伤口，包括皮肤撕裂、摩擦、闭合性冲击(impact)手术伤口、皮肤磨损、烧伤、皮肤切口、皮肤裂伤、皮肤挫伤、皮肤穿刺、压疮、静脉溃疡、动脉溃疡、神经病理性/糖尿病伤口、淋巴水肿或手术部位切口。

本发明的其他特点和优点可见于下述详细说明书和权利要求。

除非相反指出，否则所有本发明中的所有出版物、参考文献、专利和/或专利申请参考文献在此均以全文引用方式整体并入本文用于所有目的。

附图说明

图1A至1G示出猪皮总体形态和组织学示意图。Gal/gal敲除天然猪皮肤的表皮面(图1A)和真皮面(图1B)显示粉红色、存在毛发和皮下脂肪。图1C示出天然猪皮肤的苏木精-伊红染色，显示存在细胞核(蓝色)和细胞物质。图1D和1E示出脱细胞化9天后的脱细胞猪皮肤图像，其皮肤为苍白色。图1F示出脱细胞猪皮肤的苏木精-伊红染色图像，核与细胞物质完全消失。图1G示出利用脱细胞猪皮肤制备的含透明质酸和角化细胞培养基的凝胶图像(标尺-50μm)。

图2A至2F示出脱细胞猪皮肤特点的柱状图和示意图。图2A为去除细胞后，脱细胞猪皮肤粉显示存在残留细胞外基质的柱状图。图2B为显示天然(上图)和脱细胞(下图)猪皮肤胶原蛋白(蓝色)的马松三色(MT)染色图像。图2C为显示天然(上图)和脱细胞(下图)猪皮肤弹性蛋白(黑色)的伟郝夫范吉森(VVG)染色图像。图2D为粉末状猪皮肤的光学显微图，显示出对光线透明的丝状白色宏观外观。。图2E和2F为扫描电镜显微图，显示猪皮肤粉由形状和大小不同的带状纤维组成。纤维不规则地皱褶和扭曲，形成了易散束(标尺-200μm)。

图3A至3D示出裸鼠全层皮肤切创模型的伤口愈合总体形态系列示意图。发现与未处理(图3A)或透明质酸(HA)处理相比，在第15天单用猪皮凝胶(PSG)(图3C)或PSG+人外周血单一核细胞(PSG+hPBMC)(图3D)处理可显著加速小鼠愈合。此外，因为过度收缩，在第25天时未处理组仍可见深粉色瘢痕，在用透明质酸(图3B)和角化细胞培养基处理的动物上可见细长的瘢痕，而在用PSG(图3C)或PSG+hPBMC(图3D)处理的动物上可见显著清晰和几乎完全愈合的皮肤，有轻微瘢痕或无瘢痕。

图4A至4D示出裸鼠伤口愈合进展的皮肤活检的苏木精-伊红染色系列示意图。用组织学研究未处理的；或用透明质酸(HA)(图4B)、或猪皮凝胶(单用PSG)(图4C)或PSG+人外周血单一核细胞(PSG+hPBMC)(图4D)处理的全层皮肤切创模型的愈合进展。术后第5天，可见所有组的动物呈现大量炎性细胞。即使在第25天，对照组(未处理(图4A)和HA(图4B))的伤口仍有别于周围组织，未观察到明显的真皮层，而在单用PSG(图4C)和PSG+hPBMC(图4D)组，可清晰观察到角蛋白+真皮。这些动物的再生皮肤示出与正常皮肤类似的结构，而对照组的真皮层仍不完整。箭头指示所有图中的伤口区域，该区右侧可见宿主皮肤(标尺-200μm)。

图5A至5E示出未处理和猪皮凝胶处理的裸鼠伤口胶原蛋白染色的示意图和柱状图。在伤口愈合第25天，未处理(图5A)和HA处理(图5B)的动物中的伤口MT染色显示较弱的胶原蛋白(蓝色)染色，而单用PSG(图5C)和PSG+hPBMC(图5D)组显示胶原蛋白的强染色。第25天的再生皮肤胶原蛋白测量显示与未处理小鼠相比，PSG+hPBMC处理的动物有显著增加，p＜0.05；(标尺-100μm)(图5E)。

图6A至6F示出检测用猪皮凝胶和人外周血单一核细胞处理的动物伤口中人源细胞的示意图。利用人源特异性的抗线粒体抗体可以检测到用猪皮凝胶(PSG)和人外周血单一核细胞处理的动物表皮和真皮存在人源细胞。在未处理动物(图6A)中未发现阳性细胞，在阴性对照组(图6B)无背景染色。利用人源肝脏组织(图6C)作为阳性对照可说明抗体的特异性。在伤口愈合第五天，PSG+hPBMC处理的动物表皮和真皮皮肤活检(黑色箭头)存在阳性染色细胞说明存在人源细胞(图6D和6E)。从同一动物取得的皮肤活检显示在伤口愈合时新生血管中存在人源细胞(标尺-25μm)(图6F)。

图7A至7G示出用猪皮凝胶和人血细胞处理的动物伤口可检测到人源血管的示意图。利用免疫荧光可评估新生血管的分布和密度。在第5和10天用小鼠内皮细胞的小鼠特异性CD31抗体(绿色)检测宿主血管(图7A和7D)。在第5和10天用人源特异性CD31抗体(红色)测定是否人源细胞也有助于新生血管形成(图7B和7E)。图7C和7F分别为图7A和7B，以及图7D和7E的合并图片。与对照动物(图7G)相比，在PSG和人源细胞(上图)处理第5天的动物用小鼠CD31(绿色)和人源CD31(红色)染色可见宿主和人源血管数量的显著增加。然而在第10天，可见人源血管数量较低(下图)。

具体实施方式

本发明特别提供一种包括哺乳动物组织ECM组分和多聚物的组合物(例如，工程生物材料)；一种愈合所需受试者伤口的方法，该方法包括施用该组合物(例如，工程生物材料)；和一种将治疗剂递送至所需受试者伤口的方法，包括施用组合物(例如，工程生物材料)。哺乳动物组织可为脱细胞哺乳动物组织。

定义

为了理解本发明主体和构建附加的专利权要求书，包括以下定义。本文中所用缩写具有其在化学和生物领域的常规含义。

本发明所用的术语“生物材料”或“工程生物材料”指与生命系统相互作用的任何物质、表面、或构造，可为天然生成的或合成制得的。因此，本文中所用术语“生物材料”指被设计成具有单一或作为复杂系统部分形态的物质，被用于通过控制生命系统组分相互作用来指导任何治疗或诊断程序的过程。本发明所用术语“一个以上”指一种单一组分或两个或更多个组分的组合。

本发明所用的术语“凝胶”指一种不易流动的液体而非固体材料，例如半固体。凝胶可由天然生成的或合成材料形成。在实施例中，凝胶可由一种脱细胞皮肤开始制备的包括细胞外基质组分的粉末形成。

术语“细胞外基质”或“ECM”指一种天然或人工的细胞生长骨架。天然ECM(在多细胞生物如哺乳动物和人中发现的ECM)为结构性或非结构性生物分子的复杂混合物，包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白多糖、抗菌剂、趋化因子、细胞因子和生长因子。在哺乳动物中，ECM通常包含约90％的多种形式的胶原蛋白。ECM的组合物和结构根据组织来源的不同而变化。例如，小肠黏膜下层(SIS)、膀胱基质(UBM)与肝基质细胞外基质因为每个组织需要独特的细胞龛而在其整体结构和组合物中有所差别。美国专利案第8,361,503号描述了进一步的特征和细节，并通过引用并入本文。ECM的组分可从哺乳动物(例如人类)组织中分离和/或纯化或利用重组DNA技术产生，包括编码相关ECM组分(例如胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白多糖、抗菌剂、趋化因子、细胞因子和生长因子)的哺乳动物(例如人类)基因或基因片段，在合适的表达系统(原核或真核的(如昆虫或哺乳动物细胞))表达，以及后续利用本领域合适的方法分离和/或纯化。

本发明使用术语“脱细胞”是指去除了血管组织的细胞组分的物理的、化学的或酶的方法，或它们的任何组合。剩余的脱细胞组织包含天然血管组织的细胞外基质，并可包含但不限于血管组织中发现的弹性蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白和其他胞外蛋白或非蛋白质化合物；或任何本领域普通技术所知的组合物，在美国专利案第7,060,022号中有描述，并通过引用并入本文。

本发明所用的术语“透明质酸”或“HA”是指被称为糖胺聚糖的一类多聚物中的成员。HA是一种长链线性多糖，通常以钠盐形式存在并具有(C₁₄H₂₀NNaO₁₁)n的分子式，其中n可根据来源、分离程序和测定方法改变。然而，已报道有高达14×10⁶的分子量，并且之前在美国专利案第6,703,444号中有所描述。

本发明涉及的术语“多聚物”指一种由许多重复亚基组成的分子或大分子。因为其性能广泛，合成的和天然的多聚物在日常生活中扮演着重要和普遍的角色。多聚物的范围从熟悉的如聚苯乙烯的合成塑料到如为生物结构和功能基础的DNA和蛋白质的天然生物多聚物。天然的和合成的多聚物均由被称为单体的小分子通过聚合反应生成。它们相对于小分子化合物的大分子质量可产生独特的物理性质，包括韧性、粘弹性和形成玻璃和半晶体结构而非晶体的倾向。示例性的天然聚合材料包括虫胶、琥珀、羊毛、蚕丝、橡胶和纤维素。非天然的(例如合成的)多聚物包括合成橡胶、酚醛树脂、氯丁橡胶、尼龙、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯和有机硅。

可用的额外的合成的多聚物包括生物可降解聚合物，诸如聚丙交酯(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚丙交酯-乙交酯(PLGA)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酸酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯和可降解聚氨酯，以及非侵蚀性聚合物诸如聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物和其他酰基取代的纤维素乙酸酯及其衍生物，非侵蚀性聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、特氟隆和尼龙。不可吸收的聚乙烯醇海绵市售可得如Unipoint工业的艾氟隆(Ivalon)^TM。制造此材料的方法在美国专利案威尔逊(Wilson)第2,609,347号，汉姆(Hammon)第2,653,917号，汉姆第2,659,935号，威尔逊第2,664,366号，威尔逊第2,664,367号以及威尔逊第2,846,407号中有描述，其教程通过引用并入本文。

术语“血液细胞”或“血细胞”或“造血细胞”指一种通过造血作用产生的通常见于血液的细胞。在哺乳动物中，该类细胞分为三类：红血液细胞(红细胞)、白血液细胞(白细胞)和血小板(凝血细胞)。这三种血细胞合计占血组织总体积的45％，其余55％的体积由血液中的液体成分血浆组成。外周血单一核细胞(PBMCs)包括任何具有圆形核(与叶状核相对)的血液细胞、淋巴细胞或单核细胞。这些血液细胞在免疫系统中是对抗感染的组分。这些细胞可利用一种分离血液层的Ficoll从全血中提取，并梯度离心将血液分离成上层血浆，接着为一层PBMCs和底部多形核细胞(诸如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞部分。多形核细胞可进一步通过裂解红细胞分离。示例性的血液细胞包括红细胞、巨核细胞、单核细胞、和粒细胞。人外周血单一核细胞(PBMCs)为具有圆形核的人血细胞(例如淋巴细胞或单核细胞)。

本发明所用术语“瘢痕组织”和“瘢痕组织形成”包括任何纤维化病理状态，包括瘢痕瘤病、纤维囊性疾病和关节僵硬。该术语还包括术后粘连或挛缩、瘢痕疙瘩、形成于创伤后的增生性或肥大性肿块、由炎性反应引起的凹陷性瘢痕，包括痤疮、皱纹、脂肪团形成、肿瘤纤维化和其他在身体局部区域涉及成纤维细胞增殖和代谢的纤维化状态。本发明中的局部区域亦可指一个位点、部位或生物组织。

本发明所用术语“收缩”指伤口愈合和修复的阶段。如果收缩持续太长时间，可导致畸形(disfigurement)或功能缺失。因此人们对伤口收缩的生物学有很大的兴趣，可通过使用胶原凝胶收缩试验或真皮等效模型在体外进行模拟。收缩可以在伤后大约一周开始，此时成纤维细胞已经分化为肌成纤维细胞。收缩可持续数周且可在伤口完全上皮化后继续。取决于伤口区域组织的松散程度，伤口可以以每天最高0.75mm的速度收缩。收缩通常不会对称发生；相反，大多数伤口有一个“收缩轴”，其允许细胞与胶原更好的组织和排列。最初，收缩的产生不涉及肌成纤维细胞。随后，成纤维细胞在生长因子刺激下分化为肌成纤维细胞。因为具有平滑肌细胞中发现的同类肌动蛋白，肌成纤维细胞与平滑肌细胞相似，负责收缩。

本发明所描述的术语“急性”伤口是指突然而非随时间推移出现的皮肤损伤。急性伤口可在身体任何部位发生，从表面划伤到破坏血管、神经、肌肉或身体其他部位的深部伤口。许多动作都会引起急性伤口，包括：粗糙的表面刮擦和皮肤摩擦、尖锐物体诸如钉子、穿刺或戳刺入身体组织，锋利的边缘或刀刃，诸如小刀，整齐的皮肤刀割、受到任何物体的猛烈打击、和纯粹用力量粗暴地撕扯组织。急性伤口有两种主要类型：手术和外伤。手术伤口由健康护理专业人员有目的地切开并精确切割造成的，在伤口周围产生整齐的边缘。手术伤口可以是封闭的(用缝针、缝钉或胶粘剂)或保持开放愈合。手术伤口的愈合过程根据其感染的可能性进行分类。清洁的手术伤口被认为是无污染的，并且可能是在手术室或无菌手术环境中进行的。受污染的手术伤口是可能被细菌污染，但尚未被感染的。脏污的手术伤口是已经被细菌感染的。外伤伤口是被某些性质的力量引起的皮肤和底层组织的损伤。它们通过引起力的物体分类的(例如磨损、穿刺、撕裂或切口)。磨损可能是造成创伤和组织撕裂的粗糙表面擦伤或皮肤磨损，如沥青刮擦膝盖。穿刺可能发生在一个尖锐的物体刺入组织时，有时会造成深部多层次的创伤，比如脚踩在钉子上。当尖锐物体对组织进行猛烈的打击时，可能会发生撕裂，产生一种可以是锯齿状和不规则状的撕裂，例如腿撞在桌子上导致的皮肤破裂。当锋利的刀刃，如用刀割伤手指时，可能会导致皮肤的刀口切割出现切口。

本发明所描述的术语“慢性”伤口是指在大多伤口的方式中并非以有序阶段和可预测时间内愈合的伤口；不能在标准时间(例如三个月)内愈合的伤口通常被认为是慢性的。慢性伤口似乎被扣留在一个以上阶段的伤口愈合。慢性伤口似乎被滞留在一个以上伤口愈合的阶段。例如，慢性伤口经常长时间处于炎症期。在急性伤口中，生产和降解分子如胶原蛋白之间存在精确平衡；在慢性伤口中这种平衡丢失了，降解的起了太大的作用。

“患者”、“受试者”、“所需患者”和“所需受试者”在本发明内容中可互换使用，是指患有或易患一种疾病或病症，可以通过施用本发明所提供的方法和组合物治疗的活生物体。非限制性的例子包括人类、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴子、山羊、绵羊、奶牛、鹿和其他非哺乳类动物。在某些实施例中，患者为人类。体内或体外培养获得的生物实体的组织、细胞及其后代也考虑在内。

本发明中使用的术语“处理”、“处理中”或“治疗”和其他语法对等词，包括减轻、减少、改善或预防疾病、病症或症状，预防其他症状，改善或预防潜在的代谢症状，抑制疾病或病症，例如防止病情或病情发展，解除疾病或病症，引起疾病或病症的消退，减轻疾病或病症造成的状态，或停止疾病或病症的症状，意在包括预防。这些术语还进一步包括实现治疗益处和/或预防性益处。治疗益处意味着根除或改善被治疗的潜在疾病。此外，通过根除或改善与潜在疾病的一种以上生理症状，从而使患者的病情得到改善，尽管患者仍可能患有潜在疾病。如本发明所用，“伤口愈合”指治疗、缓解或改善伤口的情况，非限制性实例包括下列事件中的任何一个以上：(1)快速止血；(2)适当的炎症；(3)间充质细胞分化、增殖，并向伤口部位迁移；(4)合适的血管生成；(5)促进再上皮化(上皮组织在伤口表面的再生长)；和(6)适当的胶原蛋白合成、交联和排列，为愈合组织提供强度。

“对照”或“对照实验”根据其普遍含义使用，指除省略一种步骤、试剂或实验变量外，一项实验中实验的受试者或试剂如平行实验般处理。在某些情况下，对照被用作评估实验效果的比较标准。在某些实施例中，如本发明所描述的(包括实施例和举例)，对照是在缺少一种组成物的情况下对一种现象或效果的活性测量。

“接触”根据其普遍含义使用，指允许至少两种不同物种(如包括生物分子或细胞的化学化合物)充分接近以反应、相互作用或物理接触的过程。应该理解的是，所得的反应产物可以直接从添加试剂之间的反应或从反应混合物中产生的一种以上添加试剂的中间产物之间直接产生。在某些实施例中，接触包括允许一种本发明描述的组合物与受试者相互作用。

在本说明书的说明书和权利要求中，词语“构成”和其他形式的词，如“包含”和“包括”，意味着包括但不限于，并且不旨在于排除，例如其他组分。

术语“保湿(hydration)”或“保湿(hydrating)”伤口是指表皮角化细胞的湿润状态。角化细胞通过产生抗-纤维化或抗-纤维化可溶性因子调节成纤维细胞行为，且这些因子的产生依赖于角化细胞的湿润状态。

“共同施用”意指在在施用额外疗法相同时间、就在之前、或就在之后施用本发明描述的组合物。本发明组合物可以向患者单独或共同施用。共同施用意在包括同时或序贯施用单独的或组合的(不少于一种组合物或试剂)组合物。当有需求时，其制备也可与其他活性物质(例如用于伤口愈合)组合。

本发明所用“序贯施用”包括两种试剂(如本发明所描述的组合物)的施用在同一天单独发生或不在同一天发生(例如连续数日发生)。

本发明所用“并行施用”包括至少在一段时间内重叠。例如，当并行地施用两种试剂(如本发明所描述的具有生物活性的任何组合物)时，其施用在一定的期望时间内发生。试剂的施用可在同一天开始或结束。只要两种试剂均在同一天至少施用一次，一种试剂的施用也可以在第二天给药数天之前进行。类似的，只要两种试剂均在同一天至少施用一次，一种试剂的施用也可以延伸到第二种试剂施用之外进行。组合物/试剂不需要在同一天使用以包括并行施用。

本发明所用“间歇施用”包括在一段时间内(可看作是“首次施用期间”)进行试剂的施用，接着一段时间不使用或在更低维持剂量(可看作是“间歇期”)下使用试剂，然后再次施用试剂的期间(可看作是“第二施用期间”)。通常在施用第二阶段，试剂剂量水平将与在第一次施用期间给予的剂量相匹配，但可以根据医学需要增加或减少。

本发明所用“施用”指作为栓剂，局部接触(例如喷雾)，肠外、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下向受试者施用。施用是通过任何途径的，包括肠外和经粘膜(例如口腔、舌下、腭、牙龈、鼻腔、阴道、直肠、或经皮)。其他递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉输液、透皮贴剂等等。

本发明所用“有效量”或“治疗有效量”是影响期望生物学效果诸如包括临床结果的有益结果的充足量。因此，“有效量”取决于它所应用的环境。有效量可根据本领域所知因素改变，如正在治疗的个体的疾病状态、年龄、性别和体重。每天可施用多个分割剂量，或剂量可按治疗情况的紧急程度按比例减少。此外，本发明的组合物/制剂可按需要频繁地施用以达到治疗量。

除非特别相反说明的情况，一个组分的重量百分比是基于包含该组分的配方或组合物的总重量。

术语“约”指的是在制剂的配制和治疗疾病或病症中不改变制剂效力的试剂的浓度或量的任何最小变化。关于本发明试剂(例如治疗/活性试剂)浓度范围的术语“约”也指可以是规定数量或范围的任何变化，即有效量或范围。在实施例中，术语“约”可包括指定数值或数据点的±15％。

范围可以在本发明中表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一特定值。当表示这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似的，当通过使用前述“约”，值被表示为近似时，可以理解，特定值形成另一个方面。进一步理解，每个范围的终点相对于另一终点都是显著的，并且独立于另一终点。还可以理解，在本发明中公开了多个值，并且除了值本身之外，每个值也被公开为“约”该特定值。还可以理解，整个申请以多种不同的格式提供数据，并且该数据表示终点和起点以及数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了一个特定数据点“10”和一个特定数据点“15”，可以理解为公开了大于、大于等于、小于、小于等于、和等于10和15，以及10和15之间。还可以理解，也公开了任何两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13、和14。

组合物

一方面，本发明包括或可包括包含哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分和多聚物的组合物(例如，工程生物材料)。本发明提供一种用于治疗的包含ECM组分和多聚物的组合物(例如，工程生物材料)。本发明的组合物(例如，工程生物材料)是或可以是凝胶组合物。本发明组合物的哺乳动物组织可包括上皮和/或结缔组织。组织可以从哺乳动物获得，例如猪、牛、羔羊、山羊、绵羊或灵长类动物(例如人类)。组织可以从猪获得。组织可以是自体的或同种异体的。哺乳动物组织是或可以是脱细胞哺乳动物组织。组合物是或可包括哺乳动物组织和/或哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分、一种以上缓冲液，以及营养剂、生长因子、和/或聚合物中的一种以上。缓冲液是或可以是完全细胞培养基。细胞培养基是或可以是无血清或含血清培养基。该组合物是或可以包括角化细胞培养基和/或巯基乙酸盐的成分。营养剂可包括氨基酸、单糖、维生素、无机离子和微量元素、和/或盐中的一种以上。营养剂可以是氨基酸。营养剂可以是单糖。营养剂可以是维生素。营养剂可以是无机酸。营养剂可以是微量元素。营养剂可以是盐。作为营养剂包含的氨基酸可以是L-精氨酸HCl、L-胱氨酸2HCL、L-胱氨酸HCl H₂O、L-组氨酸HCl H₂O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸HCl、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸-2H₂O、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、和/或L-羟脯氨酸中的一种以上。营养剂中包含的维生素可以是K-Ca泛酸盐、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、生物素、维生素B12、对氨基苯甲酸、烟酸、抗坏血酸、α-生育酚磷酸酯、钙化醇、维生素K3、维生素A中的一种以上。其他化合物也可作为营养剂存在，例如D-葡萄糖、酚红、HEPES、丙酮酸钠、谷胱甘肽(还原型)、次黄嘌呤核苷钠(Hypoxantine.Na)、胸腺嘧啶、硫辛酸、腐胺2HCl、细菌蛋白胨、胸腺嘧啶、腺嘌呤硫酸酯、腺苷-5-三磷酸、胆固醇、2-脱氧-D-核糖、腺苷-5-磷酸、鸟嘌呤HCl、核糖、乙酸钠、吐温80、尿嘧啶、或黄嘌呤钠中的一种以上。作为营养剂加入的无机盐可以是CaCl₂、KCl、MgSO₄、NaCl、NaHCO₃、NaHPO₄、KNO₃、NaSeO₃、Ca(NO₃)₂、CuSO₄、NaHPO₄、MgCl₂、Fe(NO₃)₃、CuSO₄、FeSO₄、或KH₂PO₄中的一种以上。

本发明的组合物是或可以是工程生物材料。生物材料是或可包括天然生物材料，如胶原蛋白、纤维蛋白、蚕丝、肽、聚合物刷、琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸和壳聚糖。生物材料可以是透明质酸。生物材料可以是胶原蛋白。生物材料可以是蚕丝。生物材料可以是肽。生物材料可以是聚合物刷。生物材料可以是琼脂糖。生物材料可以是海藻酸盐。生物材料可以是壳聚糖。生物材料是或可以包括有机聚合物，如聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚丙交酯-乙交酯(PLGA)和/或聚乙二醇(PEG)中的一种以上。生物材料可以是聚乙醇酸(PGA)。生物材料可以是聚丙交酯(PLA)。生物材料可以是聚丙交酯-乙交酯(PLGA)。生物材料可以是聚乙二醇(PEG)。在实施例中，生物材料包括无极组分，如陶瓷、金属、和/或羟基磷灰石。生物材料是或可以包括胶原蛋白、纤维蛋白、蚕丝、肽、聚合物刷、琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、PGA、PLA、PLGA、PEG、陶瓷、金属、或羟基磷灰石中的一种以上。

本发明的生物材料可以是凝胶形式、海绵形式、泡沫形式、补片形式或半液体/流体形式。生物材料可以是凝胶形式的。

细胞外基质(ECM)由胶原蛋白、蛋白多糖、结构蛋白和基底膜(例如，从底层组织分离上皮细胞的蛋白纤维和糖胺聚糖的精细膜)构成，是正常皮肤的最大组分，提供了皮肤弹性、抗拉强度和压缩性的独特特性。再生过程中的一个重要步骤是合成相同的ECM，导致组织重塑和较少瘢痕的形成。为扩大和支持此天然过程，向伤口区域引入类似的模板可有效诱导细胞的迁移、增殖、分化并产生天然的ECM。非人源哺乳动物皮肤，如猪皮肤具有与天然人ECM相似的结构，并在猪皮肤中验证了几种相似的人皮肤ECM组分的存在。

ECM组分包括胶原蛋白、弹性蛋白和/或硫酸化糖胺聚糖(GAGs)。在实施例中，细胞外基质组分是或可以从哺乳动物(如人类)组织中分离和/或纯化或利用重组DNA技术产生，包括编码相关ECM组分(如胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白多糖、抗菌剂、趋化因子、细胞因子和生长因子)的哺乳动物(如人类)基因或基因片段，在合适的表达系统(原核或真核的(如昆虫或哺乳动物细胞))表达，以及后续利用本领域合适的方法分离和/或纯化。胶原蛋白是皮肤再生中最重要组分的之一。在实施例中，增加和组织化的胶原蛋白沉积与改善的伤口床成熟相关。

本发明组合物(例如工程生物材料)中可包括PBMCs。PBMCs可以是自体的PBMCs。人源PBMC的促血管生成和再生特性允许具有PBMCs的本发明组合物(例如工程生物材料)有改善的血管生成，从而加速成熟的、良好的血管化伤口床的形成。向组合物(例如工程生物材料)中添加PBMC显得安全可行，没有明显的不良系统性健康影响。将未培养的人源PBMC接种到真皮组合物(例如工程生物材料)中可以通过增加血管形成、成熟和基质重塑而增强组织整合效应。本发明中具有或不具有PBMCs的本发明组合物(例如工程生物材料)可在热烧伤后再生皮肤。利用未培养的细胞群可以促进潜在的临床应用。

本发明包括在用本发明(例如猪皮基凝胶(PSG))组合物(例如工程生物材料)处理的动物愈合皮肤活检中表达充足的胶原蛋白。本发明包括在用包含人源PBMC(hPBMC)(例如PSG+hPBMC)组合物(例如工程生物材料)处理的动物愈合皮肤活检中表达充足的胶原蛋白。在实施例中，脱细胞哺乳动物组织(例如皮肤)可保留如胶原蛋白和单性蛋白的细胞外基质蛋白，两者都是正常组织(例如皮肤)的重要组分。本发明的组合物(例如工程生物材料(例如凝胶组合物))中较高量的胶原蛋白可以促进宿主细胞更快速地渗透到伤口并更迅速地促进伤口的稳定。

本发明的组合物中使用的ECM组分其获得的组织来源来自哺乳动物。该哺乳动物可以是α-Gal(Galα1，3-Galβ1-4GlcNAc-R)表位基因敲除突变的猪。α-Gal(Galα1，3-Galβ1-4GlcNAc-R)表位，(也是一个主要的异种抗原)，是猪与人组织器官异种移植的第一道屏障。将半乳糖α1、3半乳糖(Gal/gal)敲除猪的皮肤移植物脱细胞化。脱细胞的过程可能不会导致所有细胞材料的完全去除。

本发明组合物(例如工程生物材料)是或可包括糖基聚合物。例如该多聚物可以为二糖多聚物。该二糖聚合物可以是如透明质酸。

本发明组合物(例如工程生物材料)可包括多聚物，该多聚物为糖基聚合物(如二糖)。该二糖聚合物可包括透明质酸。本发明组合物(例如工程生物材料)可包括血细胞或富血小板血浆。本发明组合物(例如工程生物材料)包括外周血单一核细胞(PBMCs)。本发明组合物中使用的PBMCs是或可以是自体人源PBMCs。

本发明组合物包括或可包括下述但不限于下述细胞，如骨髓衍生干细胞或祖细胞、骨髓单核细胞、间充质干细胞(MSC)、脐带衍生干细胞、多能成体祖细胞、全血衍生的干细胞或祖细胞诸如内皮干细胞、内皮祖细胞、平滑肌祖细胞、全血、外周血和可从全血中分离的任何细胞群。祖细胞被定义为致力于分化为一种类型细胞的细胞。例如，内皮祖细胞是指被编程分化为内皮细胞的细胞；平滑肌祖细胞是指被编程分化为平滑肌细胞的细胞。全血或外周血中的祖细胞包括非定向和/或定向细胞群，如多能细胞或全能细胞。

本发明组合物也可包括生长因子。本发明组合物中的生长因子是或可以是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-3、IL-4、嗜中性粒细胞(NT)-6、多效生长因子(HB-GAM)、肝素结合细胞因子(MK)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、血小板因子(PF)-4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES(CCL-5，趋化因子(C-C基序)配体5)、IL-8、IGFs，成纤维细胞生长因子(FGF)-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、转化生长因子(TGF)-β、VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)-A、PDGF-B、HB-EGF、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、胰岛素样生长因子(IGF)-I及其任意组合的一种以上。本发明组合物中的生长因子是或可以是GM-CSF。本发明组合物中的生长因子是或可以是IL-3。本发明组合物中的生长因子是或可以是IL-4。本发明组合物中的生长因子是或可以是NT-6。本发明组合物中的生长因子是或可以是HB-GAM。本发明组合物中的生长因子是或可以是MK。本发明组合物中的生长因子是或可以是IP-10。本发明组合物中的生长因子是或可以是PF-4。本发明组合物中的生长因子是或可以是MCP-1。本发明组合物中的生长因子是或可以是CCL-5。本发明组合物中的生长因子是或可以是IL-8。本发明组合物中的生长因子是或可以是IGFs。本发明组合物中的生长因子是或可以是(FGF)-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、或FGF-9。本发明组合物中的生长因子是或可以是转化生长因子(TGF)-β。本发明组合物中的生长因子是或可以是VEGF。本发明组合物中的生长因子是或可以是血小板衍生生长因子(PDGF)-A。本发明组合物中的生长因子是或可以是PDGF-B。本发明组合物中的生长因子是或可以是HB-EGF。本发明组合物中的生长因子是或可以是肝细胞生长因子(HGF)。本发明组合物中的生长因子是或可以是肿瘤坏死因子(TNF)-α。本发明组合物中的生长因子是或可以是胰岛素样生长因子(IGF)-I。

组合物(例如工程生物材料)中的ECM组分包括胶原蛋白、弹性蛋白和/或硫酸化糖胺聚糖(GAGs)。组合物(例如工程生物材料)课包括带状纤维。纤维宽度可为约1μm至约40μm(如约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm、约20μm、约21μm、约22μm、约23μm、约24μm、约25μm、约26μm、约27μm、约28μm、约29μm、约30μm、约31μm、约32μm、约33μm、约34μm、约35μm、约36μm、约37μm、约38μm、约39μm、或约40μm)，厚度约0.1μm至约10μm(如约0.1μm、约0.5μm、约1.0μm、约1.5μm、约2.0μm、约2.5μm、约3.0μm、约3.5μm、约4.0μm、约4.5μm、约5.0μm、约5.5μm、约6.0μm、约6.5μm、约7.0μm、约7.5μm、约8.0μm、约8.5μm、约9.0μm、约9.5μm、或约10.0μm)，和/或长度≥70μm至约≤4000μm(如约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm、约100μm、约125μm、约150μm、约175μm、约200μm、约225μm、约250μm、约275μm、约300μm、约325μm、约350μm、约375μm、约400μm、约425μm、约450μm、约475μm、约500μm、约525μm、约550μm、约575μm、约600μm、约625μm、约650μm、约675μm、约700μm、约725μm、约750μm、约775μm、约800μm、约825μm、约850μm、约875μm、约900μm、约925μm、约950μm、约975μm、约1000μm、约1250μm、约1500μm、约1750μm、约2000μm、约2250μm、约2500μm、约2750μm、约3000μm、约3250μm、约3500μm、约3750μm、或约4000μm)。纤维宽度可以约5μm至约30μm。纤维厚度可以约0.5μm至约5μm。纤维长度可以约≥75μm至约≤800μm。本发明包括所有干预数表示的范围。

最佳创伤修复取决于多个细胞过程(迁移、增殖、胶原合成和沉积)的协同作用，受炎症反应以及生长因子和细胞因子产生的影响。炎症过程与伤口愈合反应直接相关，炎性细胞因子刺激皮肤伤口的再上皮化并促进增殖角化细胞的生长。在实施例中，本发明包括由未培养PBMC和猪真皮成分构成的复合生物材料，用于诱导有效的炎症反应，从而导致成功和加速的伤口愈合。

本发明包括或可包括脱细胞异种组织以降低抗原性，并保留细胞外基质(ECM)组分的许多主要组分。本发明包括或可包括脱细胞哺乳动物组织(例如皮肤、胎盘、或脐带)，以产生用于愈合伤口的组合物。在实施例中，所述组合物是生物材料。本发明的组合物是或可以被加工以产生凝胶。凝胶可以是通过本发明描述方法制备的猪皮凝胶(PSG)。本发明在裸鼠全层皮肤切创模型中，研究了猪中获取的ECM用于伤口愈合的可行性和有效性。在本发明的组合物的制备方法中，将人外周血单一核细胞(hPBMC)包埋在凝胶(如PSG)中可进一步加速在急性皮肤伤口环境中组织良好的伤口组织的形成和成熟。

猪皮肤获得了由多种ECM成分和内源性生长因子组成的ECM凝胶被开发作为皮肤组织工程的生物材料。ECM凝胶是由Gal/gal敲除猪脱细胞、匀浆和冻干皮肤而制得的。制备本发明的组合物以直接涂于具有或没有人源细胞添加的伤口上。本发明的ECM凝胶组合物可在15天内有助于伤口愈合率，并且通过提供良好的细胞粘附性和有利的(例如湿润的)愈合环境以在需要的受试者中相互作用和保护伤口。在涂于伤口之前将人源细胞添加到凝胶中可显著改善伤口中的宿主血管形成，并显著加速伤口愈合过程。愈合是或可在将本发明组合物用于伤口的第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天内完成。伤口如皮肤撕裂、摩擦、闭合冲击手术伤口、皮肤磨损、烧伤(一度、二度、和/或三度)、皮肤切口、皮肤裂伤、皮肤挫伤、皮肤穿刺、压疮、静脉溃疡、动脉溃疡、神经性/糖尿病伤口、淋巴水肿或手术部位切口的愈合可在将本发明组合物用于伤口的第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天内完成。

在同组动物中，人源CD31的表达和人源特异性抗线粒体抗体阳性染色证明在第5和10天伤口中可发现人源血管。此外，qPCR检测系统确认了较低数量人源细胞的存在；然而，在有其他污染宿主(小鼠)细胞的高背景下去发现稀少的人源特异性细胞是困难的。本发明包含生物材料，包括人血细胞(例如hPBMCs)，致使人源细胞的存活和伤口的新生血管化。包括hPBMCs的生物材料促进伤口愈合。

本发明生物材料中的人外周血细胞和脱细胞哺乳动物组织ECM组分和多聚物由于组成特点，促进角化细胞和上皮细胞的迁移，以及新生血管形成，从而促进伤口愈合。

处理(treatment)或使用方法

一方面，本发明提供一种在受试者中愈合伤口的方法，该方法包括向受试者伤口施用(applying)包括哺乳动物组织ECM组分和聚合物的组合物(例如工程生物材料)。另一方面，本发明提供一种向所需受试者伤口递送治疗剂的方法，该方法包括向受试者伤口施用包括哺乳动物组织细胞外基质(ECM)、多聚物和治疗剂的组合物(例如工程生物材料)。哺乳动物组织可以是脱细胞哺乳动物组织。本发明提供了在伤口施用前向凝胶中添加人源细胞可明显改善伤口的宿主血管形成，并显著加速伤口愈合过程。愈合是或可在将本发明组合物用于伤口的第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天内完成。伤口如皮肤撕裂、摩擦、闭合冲击手术伤口、皮肤磨损、烧伤(一度、二度、和/或三度)、皮肤切口、皮肤裂伤、皮肤挫伤、皮肤穿刺、压疮、静脉溃疡、动脉溃疡、神经性/糖尿病伤口、淋巴水肿或手术部位切口的愈合可在将本发明组合物用于伤口的第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天内完成。伤口可以是皮肤撕裂。伤口可以是摩擦。伤口可以是闭合冲击手术伤口。伤口可以是皮肤裂伤。伤口可以是皮肤挫伤。伤口可以是皮肤穿刺。伤口可以是压疮。伤口可以是静脉溃疡。伤口可以是动脉溃疡。伤口可以是神经性/糖尿病伤口。伤口可以是淋巴水肿。伤口可以是手术部位切口。

在进一步方面，本发明提供了一种向所需受试者伤口递送生长因子的方法，该方法包括向受试者伤口施用包括哺乳动物组织细胞外基质(ECM)、多聚物和生长因子的组合物(例如工程生物材料)。哺乳动物组织可以是脱细胞哺乳动物组织。本发明的该方法所用生长因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-3、IL-4、嗜中性粒细胞(NT)-6、多效生长因子(HB-GAM)、肝素结合细胞因子(MK)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、血小板因子(PF)-4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES(CCL-5，趋化因子(C-C基序)配体5)、IL-8、IGFs，成纤维细胞生长因子(FGF)-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、转化生长因子(TGF)-β、VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)-A、PDGF-B、HB-EGF、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、胰岛素样生长因子(IGF)-I及其任意组合的一种以上。本发明的该方法所用生长因子是或可以是GM-CSF。本发明的该方法所用生长因子是或可以是IL-3。本发明的该方法所用生长因子是或可以是IL-4。本发明的该方法所用生长因子是或可以是NT-6。本发明的该方法所用生长因子是或可以是HB-GAM。本发明的该方法所用生长因子是或可以是MK。本发明的该方法所用生长因子是或可以是IP-10。本发明的该方法所用生长因子是或可以是PF-4。本发明的该方法所用生长因子是或可以是MCP-1。本发明的该方法所用生长因子是或可以是CCL-5。本发明的该方法所用生长因子是或可以是IL-8。本发明的该方法所用生长因子是或可以是IGFs。本发明的该方法所用生长因子是或可以是(FGF)-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、或FGF-9。本发明的该方法所用生长因子是或可以是转化生长因子(TGF)-β。本发明的该方法所用生长因子是或可以是VEGF。本发明的该方法所用生长因子是或可以是血小板衍生生长因子(PDGF)-A。本发明的该方法所用生长因子是或可以是PDGF-B。本发明的该方法所用生长因子是或可以是HB-EGF。本发明的该方法所用生长因子是或可以是肝细胞生长因子(HGF)。本发明的该方法所用生长因子是或可以是肿瘤坏死因子(TNF)-α。本发明的该方法所用生长因子是或可以是胰岛素样生长因子(IGF)-I。

在另一方面，本发明提供一种保湿所需受试者伤口的方法，该方法包括向受试者伤口施用包括哺乳动物组织细胞外基质(ECM)和多聚物的组合物(例如工程生物材料)。哺乳动物组织可以是脱细胞哺乳动物组织。

本发明前述部分公开的用于伤口愈合方法或向伤口递送治疗剂的组合物，在此部分通过引用整体并入本文所述。

伤口愈合是指细胞在体内再生和修复以减少受损或坏死区域的大小的过程。伤口愈合涉及包括损伤周围区域的炎症、细胞迁移和有丝分裂、血管生成和肉芽组织的发展、结缔组织的修复、细胞外基质的再生和重塑以使伤口愈合的一系列阶段。任何阶段具有其独特的机制并与其他阶段相互关联。这些单独阶段的持续时间根据伤口的强度和深度而改变。大多数伤口敷料治疗旨在通过提供潮湿环境、控制过度渗出物积累、以及防止可扰乱正常愈合的感染以促进这些伤口愈合阶段。

由多种物理因素或化学试剂引起的皮肤损伤可诱导伤口愈合和皮肤再生。然而，在广泛烧伤患者的治疗中，皮肤自体移植的供体部位数量有限是一个永恒的问题。尽管全层伤口用中厚皮自体移植进行表面重建，但深度真皮烧伤通常用生物或合成覆盖物(敷料)覆盖。伤口覆盖用作临时替代品。如果伤口不能自行愈合，就必须更换为病人自己的皮肤。

本发明提供一种伤口愈合的方法。伤口可以通过多种方法归类，包括其原因、位置、损伤类型(或症状)、伤口深度、和组织缺失或伤口临床表现。一般性伤口被归类为浅表(仅表皮损失)，部分厚度(表皮和真皮都受到影响)和全厚度(真皮、皮下脂肪、有时骨受到影响)。部分厚度的伤口可呈现粉红色，通常是疼痛的，并且没有观察到黄色组织。全层伤口可能损伤或损害所有层皮肤以及潜在的皮下组织和更深层组织，包括受损部位的骨骼、肌肉、肌腱、神经组织、血管组织、或内脏器官。

全层伤口或损伤可由以下至少一种原因引起：钝性创伤、穿透性创伤、枪伤、微生物感染、坏死性感染、细菌感染、真菌感染、低温、冻伤、缺血、组织缺氧、再灌注缺血组织、微血管疾病、与糖尿病相关的血管疾病、非活动性或不活动性、坏疽、败血症、感染性休克、骨髓炎、蜂窝织炎、血管炎、糖尿病、糖尿病溃疡、糖尿病足溃疡、癌症、白血病、肝硬化、慢性纤维化、动脉粥样硬化、水肿、镰状细胞病、动脉功能不全性疾病、免疫抑制、使用免疫抑制药、使用化疗药物、使用类固醇、极端温度暴露、生物毒素暴露、毒药暴露、蛇咬伤、昆虫叮咬(bite)、昆虫蛰(sting)、毒鱼螫、或水母螫。此外，受试者可能发展或可能存在以下病症中的至少一种：脓毒症、败血性休克、微生物感染、坏死性感染、坏死性筋膜炎、坏疽或骨髓炎。

全层伤口或损伤可以由感染引起或与其有关，例如以下一种以上：捻发音(crepitant)厌氧性蜂窝织炎、坏死性筋膜炎、非梭菌性肌坏死、梭状芽胞杆菌坏死、真菌坏死性蜂窝织炎、淋球菌性关节炎、非淋菌性关节炎、细菌性关节炎、肉芽肿性关节炎、血原性骨髓炎、局部聚集型(contiguous-focus)骨髓炎、慢性骨髓炎、细菌性骨髓炎、真菌性骨髓炎等等。可引起这些感染的示例性的生物包括以下的一种以上：类杆菌属、消化链球菌属、梭菌属、肠杆菌科、梭杆菌属、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、产气荚膜梭菌、诺维氏梭状芽胞杆菌、败血性梭菌、溶组织棱状芽胞杆菌、谲诈梭状芽胞杆菌、双酶梭菌、藻霉种、曲霉菌、根霉种、毛霉种、犁头霉属、淋病奈瑟氏菌、大肠杆菌、志贺菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、耶尔森氏菌属、念珠状链杆菌、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、芽生菌属、隐球菌属、孢子丝菌属、申克孢子丝菌、念珠菌属、绿脓杆菌。

本发明包括一种受试者中伤口愈合的方法，可减少瘢痕组织形成。与经含有透明质酸(HA)但缺少本发明组合物(例如工程生物材料)的组合物处理的伤口相比，本发明的方法可减少瘢痕组织形成。

本发明包括一种受试者中伤口愈合的方法，可减少愈合伤口的脱色(decoloration)。与经含有透明质酸(HA)但缺少本发明组合物(例如工程生物材料)的组合物处理的伤口相比，本发明的方法可减少脱色。

本发明的伤口愈合方法促进角化细胞和上皮细胞的迁移。本发明的伤口愈合方法促进伤口新生血管形成。本发明的伤口愈合方法在向伤口施用生物材料后的约5至10天内可促进新生血管形成。在本发明的伤口愈合方法中，新生血管形成导致伤口处的ECM重构。与经含有透明质酸(HA)但缺少本发明生物材料的组合物处理的伤口相比，在本发明的伤口愈合方法中，愈合伤口位置可见减少的细长瘢痕。生物材料产生表皮细胞并恢复表皮和真皮的双层结构。伤口可在向伤口施用生物材料的15-40天内愈合。伤口可在向伤口施用生物材料的25天内愈合。

结合第二种试剂的伤口愈合

一方面，本发明提供了联合本发明组合物(例如工程生物材料)和治疗剂的伤口愈合。一方面，本发明包括包含了哺乳动物组织细胞外基质(ECM)、多聚物和具有试剂有效剂量的伤口愈合或改善剂的药物组合物的组合物(例如工程生物材料)。哺乳动物组织可以是脱细胞哺乳动物组织。治疗剂可以作为药物组合物独立于伤口愈合组合物(例如工程生物材料)施用，与组合物(例如工程生物材料)联合使用、并行施用或序贯施用。在这种情况下，本发明包括可以通过口服、局部、静脉注射、腹腔注射、鼻腔、或吸入施用治疗剂。本发明治疗剂的药物组合物可包括药学上可接受的赋形剂。

第二种治疗剂可包括瘙痒剂(止痒剂)、镇痛剂(例如止痛剂)、抗菌剂和抗生素。本发明药物组合物中的治疗剂是或可以是伤口愈合试剂/分子。该试剂/分子可以以有效的预期的目的有效的量存在。

止痒剂可包括但不限于柳树皮提取物、水杨酸、抗组胺药(苯海拉明)、皮质类固醇(例如1％氢化可的松乳膏)、苯佐卡因局部治疗、薄荷油、甲醇、樟脑、氢氧化铵、苄基醇、盐酸普莫卡因。

示例性止痛剂可包括但不限于非麻醉剂(例如对乙酰氨基酚)、非甾体抗炎药(NSAIDs)(例如阿司匹林、双氯芬酸、右旋布洛芬、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟芬那酸、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、氯诺昔康、洛索洛芬、甲氯灭酸(melofenamic acid)、甲芬那酸、美洛昔康、萘普酮(nabumetne)、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、双水杨酸酯、舒林酸、替诺昔康、托美丁、和托芬那酸)。其他止痛剂包括COX-2抑制剂(例如塞来昔布、罗非昔布、伐地昔布和依替昔布)和阿片类药物(例如丁丙诺啡、布托啡诺、可待因、二氢可待因、二氢吗啡酮、左啡诺(levophanol)、美德林、美沙酮、吗啡、纳布啡、羟考酮、氧吗啡酮、喷他佐辛和丙氧芬)。

抗菌剂可包括但不限于乙醇(例如乙醇、1-丙醇、2-丙醇/异丙醇)、季铵化合物(苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶、苄索氯铵)、硼酸、亮绿、葡萄糖酸氯己定和过氧化氢(单独或与乙酸联合制作过氧乙酸)其他试剂可包括碘、麦卢卡蜂蜜、红汞、奥替尼啶二盐酸盐、苯酚、氯化钠、次氯酸钠、次氯酸钙和秘鲁香脂。

抗生素可包括但不限于以下的一种以上：庆大霉素、卡那霉素、新霉素、萘替米星、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、利福昔明、洛拉卡比、厄他培南、多尼培南、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢罗齐、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、万古霉素、泰拉万星、达巴万星、雷德唑来、特地佐利、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯咗西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺异恶唑、去甲金霉素、多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福喷丁、链霉素、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、甲砜霉素、和/或替硝唑。

试剂的有效剂量可在约0.001mg/kg至约100mg/kg。

治疗剂可向所需受试者施用，剂量为约0.001mg/kg至约0.01mg/kg之间的化合物、约0.01mg/kg至约0.1mg/kg之间的化学物、约0.1mg/kg至约1.0mg/kg之间的化学物、约1.0mg/kg至约5.0mg/kg之间的化学物、约5.0mg/kg至约10mg/kg之间的化学物、约10mg/kg至约15mg/kg之间的化学物、约15mg/kg至约20mg/kg之间的化学物、约20mg/kg至约25mg/kg之间的化学物、约25mg/kg至约30mg/kg之间的化学物、约30mg/kg至约35mg/kg之间的化学物、约35mg/kg至约40mg/kg之间的化学物、约40mg/kg至约45mg/kg之间的化学物、约45mg/kg至约50mg/kg之间的化学物、约50mg/kg至约55mg/kg之间的化学物、约55mg/kg至约60mg/kg之间的化学物、约60mg/kg至约65mg/kg之间的化学物、约65mg/kg至约70mg/kg之间的化学物、约70mg/kg至约75mg/kg之间的化学物、约75mg/kg至约80mg/kg之间的化学物、约80mg/kg至约85mg/kg之间的化学物、约85mg/kg至约90mg/kg之间的化学物、约90mg/kg至约95mg/kg之间的化学物、或95mg/kg至约100mg/kg之间的化学物。

本发明中的发明包括具有组合物有效剂量的组合物，其中治疗剂可在组合物重量/体积比的约0.1％至约20％之间。

例如，治疗剂的有效剂量可以在组合物重量/体积比的约0.001％-约0.01％之间、约0.01％-约0.1％之间、约0.1％-约1.0％之间、约1.0％-约2.0％之间、约2.0％-约3.0％之间、约3.0％-约4.0％之间、约4.0％-约5.0％之间、约5.0％-约6.0％之间、约6.0％-约7.0％之间、约7.0％-约8.0％之间、约8.0％-约9.0％之间、约9.0％-约10％之间、约10％-约11％之间、约11％-约12％之间、约12％-约13％之间、约13％-约14％之间、约14％-约15％之间、约15％-约16％之间、约16％-约17％之间、约17％-约18％之间、约18％-约19％之间、或约19％-约20％之间。

制备组合物的方法

一方面，本发明包括一种制备包括哺乳动物组织细胞外基质(ECM)组分和多聚物的方法，该方法包括将哺乳动物组织脱细胞化以制备包含细胞外基质组分的粉末，混合粉末和含缓冲液、营养剂、生长因子、聚合物的培养基，其中聚合物浸泡在培养基内从而制备该组合物。哺乳动物组织可以是脱细胞哺乳动物组织。在实施例中，ECM组分是或可以从哺乳动物(如人类)组织中分离和/或纯化或利用重组DNA技术产生，包括编码相关ECM组分(如胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白多糖、抗菌剂、趋化因子、细胞因子和生长因子)的哺乳动物(如人类)基因或基因片段，在合适的表达系统(原核或真核的(如昆虫或哺乳动物细胞))表达，以及后续利用本领域合适的方法分离和/或纯化。

本发明中用来制备本发明组合物的粉末可以通过用化学方法处理组织，冷冻干燥化学处理过的组织，匀浆冷冻干燥的组织来制备。在实施例中，粉末是丝状的。培养基是含血清、减血清或无血清的培养基。生长因子为下述一种以上：重组4-1BBL、重组6Ckine、6Ckine重组人源蛋白、ANGPT2(ANG2)、ANGPTL5、激活素A、激活素R1b、BAFF、BAMBI、CXCL13、BDNF、BLC、BMP2、BMP4、BMP5、BMP7、BMPR1A、CCL1、CCL17、CCL20(MIP-3)、CCL21、CD40、GM-CSF、IL-3、IL-4、NT-6、HB-GAM、MK、IP-10、PF-4、MCP-1、RANTEs、IL-8、IGFs、FGF 1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、TGF-β、VEGF、PDGF-A、PDGF-B、HB-EGF、HGF、TNF-α、IGF-I或其任何组合。营养剂可包括氨基酸、单糖、维生素、无机离子和微量元素、和/或盐中的一种以上。作为营养剂包含的氨基酸可以是L-精氨酸HCl、L-胱氨酸2HCL、L-胱氨酸HCl H₂O、L-组氨酸HCl H₂O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸HCl、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸-2H₂O、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、和/或L-羟脯氨酸中的一种以上。营养剂中包含的维生素可以是K-Ca泛酸盐、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、维生素B2、盐酸硫胺素、生物素、维生素B12、对氨基苯甲酸、烟酸、抗坏血酸、α-生育酚磷酸酯、钙化醇、维生素K3、维生素A中的一种以上。其他化合物也可作为营养剂存在，例如D-葡萄糖、酚红、HEPES、丙酮酸钠、谷胱甘肽(还原型)、次黄嘌呤核苷钠(Hypoxantine.Na)、胸腺嘧啶、硫辛酸、腐胺2HCl、细菌蛋白胨、胸腺嘧啶、腺嘌呤硫酸酯、腺苷-5-三磷酸、胆固醇、2-脱氧-D-核糖、腺苷-5-磷酸、鸟嘌呤HCl、核糖、乙酸钠、吐温80、尿嘧啶、或黄嘌呤钠中的一种以上。作为营养剂加入的无机盐可以是CaCl₂、KCl、MgSO₄、NaCl、NaHCO₃、NaHPO₄、KNO₃、NaSeO₃、Ca(NO₃)₂、CuSO₄、NaHPO₄、MgCl₂、Fe(NO₃)₃、CuSO₄、FeSO₄、或KH₂PO₄中的一种以上。

实施例

实施例1：制备猪皮骨架

Gal/gal猪皮肤从Avantea(克雷蒙娜，意大利)购得。从Gal/gal敲除猪解剖出一块大小为20×15cm的皮肤，真空密封至塑料袋内并冻存在-200℃直至使用。猪皮肤在室温下解冻，切除皮下脂肪组织进行清洁，移除毛发，最后用蒸馏水清洗。将皮肤置于5L的塑料容器内，与含有0.02％叠氮化钠(德国Sigma)和1.86％EDTA(德国Alfa Aesar)的0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)(Sigma，德国)一起在37℃，200 RPM持续摇动9天。SDS先在24小时后替换，然后每48小时替换一次。每次替换SDS时，将皮肤用蒸馏水洗1小时。

脱细胞化猪皮肤

Gal/gal敲除猪皮肤在用0.5％SDS持续处理9天后完全脱细胞化。图1A至1G示出猪皮肤在脱细胞化之前(图1A至1C)和之后(图1D至1F)的总体形态和组织学。在脱细胞猪皮内无细胞核(蓝色)或细胞残留存在(图1F)。用HA和角化细胞制备的猪皮肤凝胶颜色为白色(图1G)，并被用于所有的伤口皮肤愈合实验。

脱细胞猪皮肤粉末保留了皮肤胶原蛋白重生所需的一种重要ECM组分(66.545μg/mg)，以及弹性蛋白(3.598μg/mg)和硫酸化GAGs(4.555μg/mg)(图2A)。MT和VVG染色也确认了脱细胞化后保留了胶原蛋白和弹性蛋白(图2B和2C)。此外，粉末状猪皮肤的特征表明，脱细胞猪皮肤粉末具有丝状、白色的宏观外观、并且在光学显微镜下透光(图2D)。扫描电镜显示其具有多种形状和大小的带状纤维。主要纤维尺寸为宽度20至30μm，厚度1至3μm，长度可达2mm。纤维不规则地皱褶和扭曲，形成了易散束(图2E和2F)。猪皮肤粉末的无菌测试也显示在培养2周后光密度没有增加，说明伽玛辐照可用于猪皮肤粉末的杀菌。

细胞外基质的脱细胞化验证和表征

利用组织学和DNA定量来验证脱细胞化。两片来自于正常和脱细胞化的皮肤并在福尔马林中固定48小时，并包埋在石蜡中。用切片机切成5μm厚度切片并用苏木精伊红(HE)、马松三色(MT)(25088，Polysciences，美国)和伟郝夫范吉森(VVG)(25089，Polysciences，美国)法染色以鉴别细胞核、胶原蛋白和弹性蛋白的存在。从正常和脱细胞化皮肤切取25mg组织切片，并用Qiagen血液和组织DNA试剂盒(Qiagen，瑞典)根据制造商说明书分离全DNA，并用纳米滴定(nanodrop)在260nm波长进行定量。

脱细胞猪皮肤粉末的制备和表征

脱细胞化后，将皮肤在蒸馏水中清洗5天，每12小时换两次水。脱细胞皮肤切至3×3平方厘米的块，并冷冻干燥(冻干)72小时。冻干片用0.75μm筛在14000rpm内低温冷冻粉碎。获得的丝状粉于25kGy的伽马辐照杀菌3分钟25秒。

对猪皮肤粉末的细胞外基质胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖(GAG)进行定量。用光学和扫描电子显微镜(SEM)研究粉末结构和形态。用配备ColorView IIIu CCD相机(德国软成像系统有限责任公司(Soft Imaging System GmbH))和奥林巴斯Cell^D图像分析软件的的奥林巴斯SZX16立体显微镜摄取光学图像。用蔡司Supra 40VP仪器在第二电子检测模式下分析SEM。为降低SEM成像时的样品荷电，在Gatan PECS Mod 682仪器上，将粉末样品放置在碳垫上并用15nm厚的金/钯膜溅射镀膜。

制备猪皮肤凝胶(PSG)

通过混合50mg的脱细胞皮肤粉末和250μL的透明质酸(HA)(Sigma，德国)至凝胶状稠度以制备凝胶。透明质酸在角化细胞培养基中以1mg/mL构成(Lonza，美国)。

无菌性

将三个1mg的辐照粉末随机样本加入巯基乙酸肉汤(Fluka，美国)并在37℃孵箱培养2周。每隔一天收集200μL肉汤并用分光光度计(Synergy 2，Biotech，美国)在600nm波长测量光密度以验证其浊度。浊度的增加指示有污染。

动物实验

总共用72只7-8周龄、体重17-18g的BALB/c雌性裸鼠(Taconic，丹麦)研究伤口愈合率。在诱导全层皮肤伤口后，小鼠被分成四组：i)未处理；ii)用HA处理；iii)仅用PSG处理；和iv)用PSG+hPBMC(1×10⁶个细胞)处理。用异氟醚麻醉小鼠，术前及术后每天一次共两天腹腔注射给予10mg/kg的卡洛芬(力莫敌)(辉瑞，卢森堡)以缓解术后疼痛。用几滴化学汽油擦拭皮肤，在每个动物的上背部区域创造一个厚度为1×1cm的方形切除伤口。使用无菌木棒施用有或无细胞凝胶。向伤口处放置Tegaderm(3M^TM，德国)并使用4-0不可吸收单丝缝线(Ethicon，德国)缝合至皮肤上，以保护和保持凝胶的位置。进一步用氢化膜覆盖Tegaderm以防止动物移除Tegaderm。在手术当天，从健康人类供体中收集外周血并用淋巴细胞分离剂分离单一核细胞，分离的细胞用PBS洗三次并用角化细胞培养基悬浮。用Biorad自动细胞计数仪对细胞进行计数。处理后第5、10、15、和25天，处死动物，切除包括伤口的皮肤以进行组织学检查。皮肤伤口也会被拍照。

伤口的组织学和免疫组织化学

用切片机将所有组皮肤伤口的石蜡块切取5μm厚度切片，用标准步骤对5片覆盖了伤口全部区域的切片进行HE、MT和VVG染色。用莱卡SCN400显微镜扫描玻片。用人类特异性抗线粒体抗体1-100(默克密理博，斯德哥尔摩，瑞典)对皮肤切片染色以检测人源细胞。使用的二抗是过氧化物酶亲和山羊抗小鼠IgG F(ab)2片段，F(ab)2片段特异1∶500(JacksonImmunoResearch，西格罗夫，美国)。

免疫荧光

用切片机切取切5μm厚度切片。用到人源CD31(1∶25；10148-MM13，义翘神州)和小鼠特异性CD31(1∶400，LSC 348704，LSBio)抗体以及Alexa GαM 568二抗(1∶100；A11031，赛默飞世尔)和GαR FITC(1∶100；SC3825，圣克鲁斯)。简单来说，于-20℃用丙酮∶甲醇(4∶6)10分钟固定冰冻切片，并用PBS洗5分钟。用二抗宿主血清封闭玻片并在+4℃用一抗孵育过夜。玻片用PBS洗3次，在+4℃、黑暗中用二抗孵育45分钟。玻片用PBS洗3次并用一滴含有DAPI(H1500，Vector Laboratories)的封片剂封片。

胶原蛋白定量

使用密度计原理，对第25天(新形成皮肤)的所有动物组中的胶原蛋白的量根据MT染色中的蓝色染色胶原蛋白的强度进行定量。摄取5张代表性图像，并用BioPix iQ 2.1.8软件对每张图像中的蓝色总强度进行定量。以任意单位(a.u)读取胶原蛋白强度并计算每只动物的平均值。

伤口面积测量

为了计算伤口大小，在伤口部位放置一个测量标尺，用索尼α35数码相机拍摄所有小鼠。计算每只动物的未闭合(非瘢痕)伤口面积。展示每组未闭合伤口面积/每只动物的平均值。

基因分析

向冰冻皮肤样本中加入1mL冰冷Qiazol(Qiagen有限责任公司)以提取RNA。向每个样品中加入钢珠并在Qiagen组织细胞器中用25Hz匀浆样品2×5分钟，加入200μL氯仿并剧烈摇晃样品15秒，室温静置3分钟并在4℃以12,000g离心15分钟。离心后将350μL上清转移至新管中并与350μL 70％的酒精混合，小心吸打混合并加入到RNeasy Mini试剂盒(Qiagen有限责任公司)的微型柱(Mini Elute)中。其余步骤按照制造商说明书进行。

提取的RNA在Biorad CFX96仪器内使用TATAA GrandScript cDNA合成试剂盒(Tataa Biocenter)，在20μL的终反应体积中加入2μg的总RNA，根据制造商说明书进行逆转录。

在Biorad CFX384仪器中使用TATAA SYBR Grandmaster Mix(Tataa Biocenter)进行qPCR，温度方案为95℃下60秒，跟着有45个循环的95℃下5秒，60℃下30秒和72℃下10秒，跟着是0.5℃步进的从55℃到95℃的溶解曲线。每个反应中使用4μL cDNA，总反应体积为20μL。用qPCR进行了两种检测，一种直接针对人细胞色素b(hCytB)，另一种针对小鼠细胞色素b(mCytB)。qPCR在hCytB检测中重复进行，并在mCytB检测中进行单次测量。

统计学

所有数值代表该实验的平均值，绘制的图形是该组的中位数(mean)，而误差线是原始值的标准误差平均值。图形用Graph Pad Prism软件6.0版绘制。组间显著差异用Student t-test计算。P值＜0.05即认为显著。

实施例2：猪皮肤凝胶(PSG)和人外周血单一核细胞(hPBMC)在全层伤口愈合中的效果

为测定PSG的伤口愈合能力，不处理或用HA、仅用PSG或PSG+hPBMC处理在裸鼠背部制造的急性全层切创伤口。图3示出未处理伤口和仅用PSG或PSG+hPBMC处理后的伤口的伤口愈合过程。在术后第5和第10天，各组均观察到结痂。然而，在第15天，痂在PSG处理组中剥落，伤口充满再生皮肤。

仅用PSG和PSG+hPBMC处理的动物的伤口闭合

仅用PSG和PSG+hPBMC处理的动物关于伤口闭合可观察到清晰差异。在第15天，这些动物中的伤口展示出了伤口闭合的最显著差异。在第15天，与未处理中的0/3(0％)只小鼠和HA处理的小鼠相比，PSG+hPBMC处理的5/6只(83％，p＜0.05)和仅用PSG处理的4/6只(66％，p＜0.05)小鼠早已可见完全的伤口闭合。在第25天，所有组均可见完全的伤口愈合。仅用PSG和用PSG+hPBMC处理的小鼠中的愈合伤口与正常皮肤相似，而在对照组的愈合皮肤中因为过度收缩仍然可见细长的瘢痕。如图3所示，对照组和PSG处理组之间的差异在术后第15天非常明显(p＜0.05)，而在第25天不显著。

伤口大小测量

定量伤口图像以显示不同时间点的愈合面积。第15天的伤口大小测量显示与未处理(伤口面积26.58±4.42mm²)动物相比，PSG(7.95±1.96mm²；p＜0.05)和PSG+hPBMC(3.5±1.92mm²；p＜0.05)处理的动物具有显著更小的伤口。当与HA(13±8.88mm²)处理动物相比，PSG和PSG+hPBMC处理的动物伤口面积仍然较低(表1)。

表1：多个时间点在未处理和透明质酸(HA)、猪皮肤凝胶(PSG)或猪皮肤凝胶与人外周血细胞(PSG+hPBMC)处理的动物中测量的伤口大小。

*与未处理动物相比

伤口愈合过程和恢复组织的结构(如胶原蛋白沉积)

进行组织学染色以评估伤口愈合过程和恢复组织的结构(图4)。术后5天，所有组都呈现大量的炎性细胞。10天后，对照组的伤口可从邻近组织中辨别出来，未观察到可区分的角蛋白层。在PSG和PSG+hPBMC处理组，新上皮细胞已迁移至伤口边缘附近且角蛋白层明显可见。在第15和第25天，与未处理和HA处理组相比，PSG和PSG+hPBMC处理的伤口中愈合伤口横断面的H&E染色显示，新形成的表皮层在组织结构和形态上均显示出与周围的表皮极大的相似性。此外，在未处理和HA处理组中，迁移率受到限制，25天还不能桥接整个伤口表面，显示出了一个非角化中心(图4)。

因为增加的、有组织的胶原蛋白沉积与改善的伤口床成熟相关，所以用马松三色染色法评估伤口床中的胶原蛋白沉积程度。MT染色显示与对照相比，PSG和PSG+hPBMC处理组的皮肤活检中胶原蛋白表达明显增加(图5A至5D)。为验证该组织病理分析，用密度计对新生皮肤(术后第25天)进行了胶原蛋白定量。与未处理(127001±25429 a.u)组相比，PSG+hPBMC(245011±35832 a.u，p＜0.05)处理组的动物具有显著更高的胶原蛋白量。尽管与未处理组相比，PSG处理组(252314±70005 a.u，p＝0.07)的小鼠中胶原蛋白密度也显示一个较高的值，然而没有统计学意义。与未处理对照，HA处理组的密度为177239±31097 a.u，没有统计学意义(图5E)。

为了确定PSG中的人源细胞在创伤后是否存活，在第5天和第10天将部分愈合伤口的石蜡切片用人特异性抗线粒体抗体进行免疫染色。结果说明在对照(图6A和6B)中没有存在阳性染色细胞，但在人源肝脏组织(阳性对照，图6C)和PSG+hPBMC(图6D至6F)处理的动物真皮和表皮层存在。这些结果指示人源细胞通过促进新生血管加速了伤口皮肤的再上皮化。

实施例3：伤口的人源和宿主血管形成通过促进新生血管加速了伤口愈合。

术后第5和第10天的CD31染色显示了每个实验组的血管形成。在第5和第10天PSG+hPBMC处理组中可见大量宿主(小鼠)微血管，且与对照组相比该微血管密度高的多(对应为图7A、7D、和7G)。重要的是，当用人类特异性抗CD31抗体进行染色时，在第5天的PSG+hPBMC处理组中许多小血管有阳性染色(图7B)。但是人源CD31阳性染色的血管数在第10天数量减少(图7E)并且在第15天可以忽略不计。这个发现指示人源PBMCs通过促进新生血管加速了伤口愈合。

实施例4：在新形成皮肤中检测人源RNA

用qPCR分析从第5、10、15和25天获取的总共38个皮肤样本以检测人源细胞。23个样本取自hPBMC处理的小鼠，15个样本取自未用人源细胞处理的小鼠。在所有情况下小鼠qPCR检测的Cq值低，范围在10和14之间，而人源检测的Cq值在20循环以上，如所预期的那样，表明小鼠组织中存在少量人源细胞。在用人源细胞处理的23个样本中有20个检测出人源RNA，而有3个样本中未检测出人源RNA。在未用人源细胞处理的样本中，在15个样本的4个中可获得阳性的qPCR结果，其Cq值在相似范围内。

其他实施例

应当理解，虽然已经结合其详细描述对本发明进行了描述，前述描述旨在说明，而不是对本发明的范围的限制，由所附权利要求的范围限定的本公开的范围。其他方面、优点和修改在下面权利要求的范围内。

本发明的编号条款为：

1.一种组合物，其包含哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分和多聚物。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是工程生物材料。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物是凝胶组合物。

4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其进一步包括选自由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-3、IL-4、嗜中性粒细胞(NT)-6、多效生长因子(HB-GAM)、肝素结合细胞因子(MK)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、血小板因子(PF)-4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES(CCL-5，趋化因子(C-C基序)配体5)、IL-8、IGFs，成纤维细胞生长因子(FGF)-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、转化生长因子(TGF)-β、VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)-A、PDGF-B、HB-EGF、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、胰岛素样生长因子(IGF)-I及其任意组合所组成的组中的生长因子。

5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物组织包括上皮和/或结缔组织。

6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物组织从皮肤、胎盘和/或脐带中获得。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述多聚物是糖基多聚物。

8.如权利要求7中所述的组合物，其中所述多聚物是二糖多聚物。

9.如权利要求8中所述的组合物，其中所述二糖多聚物是透明质酸。

10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其进一步包括血细胞或富含血小板的血浆。

11.如权利要求10中所述的组合物，其中所述血细胞是外周血单一核细胞(PBMCs)。

12.如权利要求11中所述的组合物，其中所述PBMCs是人源细胞。

13.如权利要求12中所述的组合物，其中所述人源PBMCs是自体的。

14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述ECM组分包括胶原蛋白、弹性蛋白、和/或硫酸化糖胺聚糖(GAGs)。

15.如权利要求2至14中任一项所述的组合物，其中所述生物材料包括带状纤维。

16.如权利要求15中所述的组合物，其中所述纤维宽度约1μm至约40μm，厚度约0.1μm至约10μm，和/或长度约≥70μm至约≤4000μm。

17.如权利要求16中所述的组合物，其中所述纤维宽度约5μm至约30μm。

18.如权利要求17中所述的组合物，其中所述纤维厚度约0.5μm至约5μm。

19.如权利要求16中所述的组合物，其中所述纤维长度约≥75μm至约≤800μm。

20.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物组织从由猪、牛、羔羊、山羊、绵羊、和人类组成的组中的哺乳动物获得。

21.如权利要求20中所述的组合物，其中所述猪是α-Gal(Galα1，3-Galβ1-4-GlcNAc-R)表位基因敲除突变体。

22.一种所需受试者愈合伤口的方法，包括向所述受试者伤口施用包含哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分的组合物。

23.一种向所需受试者伤口递送治疗剂的方法，包括向所述受试者伤口施用包含哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分、多聚物和治疗剂的组合物。

24.一种向所需受试者伤口递送生长因子的方法，包括向所述受试者伤口施用包含哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分、多聚物和生长因子的组合物。

25.一种保湿所需受试者伤口的方法，包括向所述受试者伤口施用包含哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分和多聚物的组合物。

26.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述组合物是工程生物材料。

27.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述生物材料是凝胶组合物。

28.如权利要求24中所述的方法，其中生长因子选自由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-3、IL-4、嗜中性粒细胞(NT)-6、多效生长因子(HB-GAM)、肝素结合细胞因子(MK)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、血小板因子(PF)-4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES(CCL-5，趋化因子(C-C基序)配体5)、IL-8、IGFs，成纤维细胞生长因子(FGF)-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、转化生长因子(TGF)-β、VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)-A、PDGF-B、HB-EGF、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、胰岛素样生长因子(IGF)-I及其任意组合所组成的组中的生长因子。

29.如权利要求22至28中任一项所述的方法，其中所述伤口是急性伤口或慢性伤口。

30.如权利要求22至28中任一项所述的方法，其中所述伤口是皮肤伤口。

31.如权利要求22至28中任一项所述的方法，其中所述伤口是皮肤撕裂、摩擦、闭合性冲击手术伤口、皮肤磨损、烧伤、皮肤切口、皮肤裂伤、皮肤挫伤、皮肤穿刺、压疮、静脉溃疡、动脉溃疡、神经病理性/糖尿病伤口、淋巴水肿或手术部位切口。

32.如权利要求22至31中任一项所述的方法，其中哺乳动物组织包括上皮和/或结缔组织。

33.如权利要求22至32中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物组织从皮肤、胎盘、和/或脐带中获得。

34.如权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述多聚物是糖基多聚物。

35.如权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述多聚物是二糖多聚物。

36.如权利要求35中所述的方法，其中所述二糖多聚物是透明质酸。

37.如权利要求22至36中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括血细胞或富含血小板的血浆。

38.如权利要求37中所述的方法，其中所述血细胞是外周血单一核细胞(PBMCs)。

39.如权利要求38中所述的方法，其中所述PBMCs是人源细胞。

40.如权利要求39中所述的方法，其中所述人源PBMCs是自体的。

41.如权利要求22至40中任一项所述的方法，其中所述ECM组分包括胶原蛋白、弹性蛋白、和/或硫酸化糖胺聚糖(GAGs)。

42.如权利要求22至40中任一项所述的方法，其中所述组合物包括带状纤维。

43.如权利要求42中所述的方法，其中所述纤维宽度约1μm至约40μm，厚度约0.1μm至约10μm，和/或长度约≥70μm至约≤4000μm。

44.如权利要求43中所述的方法，其中所述纤维宽度约5μm至约30μm。

45.如权利要求43中所述的方法，其中所述纤维厚度约0.5μm至约5μm。

46.如权利要求43中所述的方法，其中所述纤维长度约≥75μm至约≤800μm。

47.如权利要求22至46中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物组织从由猪、牛、羔羊、山羊、绵羊、和人类组成的组中的哺乳动物获得。

48.如权利要求47中所述的方法，其中所述猪是α-Gal(Galα1，3-Galβ1-4-GlcNAc-R)表位基因敲除突变体。

49.如权利要求22至48中任一项所述的方法，其中所述方法减少瘢痕组织形成。

50.如权利要求49中所述的方法，其中减少的瘢痕组织形成对比于透明质酸(HA)处理的伤口。

51.如权利要求22至50中任一项所述的方法，其中所述方法减少愈合伤口的脱色。

52.如权利要求51中所述的方法，其中减少的脱色对比于透明质酸(HA)处理的伤口。

53.如权利要求39中所述的方法，其中所述方法促进角化细胞和上皮细胞的迁移。

54.如权利要求39中所述的方法，其中所述方法在伤口促进血管形成或新生血管形成。

55.如权利要求54中所述的方法，其中血管形成或新生血管形成在向伤口施用生物材料后5至10天内被促进。

56.如权利要求54中所述的方法，其中血管形成或新生血管形成导致伤口处ECM重构。

57.如权利要求39中所述的方法，其中与透明质酸处理的伤口相比，愈合伤口位置可见减少的细长瘢痕。

58.如权利要求22至57中任一项所述的方法，其中所述生物材料产生表皮细胞并恢复表皮和真皮的双层结构。

59.如权利要求58中所述的方法，其中在向伤口施用生物材料后15至40天内愈合所述伤口。

60.如权利要求59中所述的方法，其中在向伤口施用生物材料后25天内愈合所述伤口。

61.一种制备组合物的方法，所述组合物包括哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分和多聚物，该方法包括将哺乳动物组织脱细胞化以制备包含细胞外基质组分的粉末，混合所述粉末和含缓冲液、营养剂、生长因子或聚合物的培养基，其中所述粉末浸泡在培养基内从而制备该组合物。

62.如权利要求61中所述的方法，其中所述粉末可以通过用化学方法处理组织，冷冻干燥化学处理过的组织，和匀浆冷冻干燥的组织来制备。

63.如权利要求61至62中任一项所述的方法，其中所述粉末是丝状的。

64.如权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述培养基是含血清、减血清或无血清的培养基。

65.如权利要求61至64中任一项所述的方法，其中生长因子选自由重组4-1BBL、重组6Ckine、6Ckine重组人源蛋白、ANGPT2(ANG2)、ANGPTL5、激活素A、激活素R1b、BAFF、BAMBI、CXCL13、BDNF、BLC、BMP2、BMP4、BMP5、BMP7、BMPR1A、CCL 1、CCL 17、CCL20(MIP-3)、CCL21、CD40、GM-CSF、IL-3、IL-4、NT-6、HB-GAM、MK、IP-10、PF-4、MCP-1、RANTES、IL-8、IGFs、FGF 1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、TGF-β、VEGF、PDGF-A、PDGF-B、HB-EGF、HGF、TNF-α、IGF-I或其任何组合所组成的组。

66.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述ECM组分是重组ECM组分。

67.如权利要求66中所述的组合物，其中所述重组ECM组分是分离和/或纯化的ECM组分。

68.如权利要求22至65中任一项所述的方法，其中所述ECM组分是重组ECM组分。

69.如权利要求68中所述的方法，其中所述重组ECM组分是分离和/或纯化的ECM组分。

70.如权利要求1至21和66至67中任一项所述的组合物，或如权利要求22至65和68至69中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物组织是脱细胞哺乳动物组织。

Claims

12.如权利要求11中所述的组合物，其中所述PBMCs是人源细胞。

18.如权利要求16中所述的组合物，其中所述纤维厚度约0.5μm至约5μm。

21.如权利要求20中所述的组合物，其中所述猪是α-Gal(Galα1，3-Galβ1-4GlcNAc-R)表位基因敲除突变体。

22.一种如权利要求1至21中任一项所述的用于治疗的组合物。

23.一种组合物，其包括哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分、多聚物和治疗剂，用于向所需受试者伤口递送所述治疗剂。

24.一种组合物，其包括哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分、多聚物和生长因子，用于向所需受试者伤口递送所述生长因子。

25.一种组合物，其包括哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分和多聚物，用于保湿所需受试者伤口。

26.如权利要求23至25中任一项所使用的组合物，其中所述组合物是工程生物材料。

27.如权利要求23至25中任一项所使用的组合物，其中所述生物材料是凝胶组合物。

28.如权利要求24中所使用的组合物，其中生长因子选自由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-3、IL-4、嗜中性粒细胞(NT)-6、多效生长因子(HB-GAM)、肝素结合细胞因子(MK)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、血小板因子(PF)-4、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES(CCL-5，趋化因子(C-C基序)配体5)、IL-8、IGFs，成纤维细胞生长因子(FGF)-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、转化生长因子(TGF)-β、VEGF、血小板衍生生长因子(PDGF)-A、PDGF-B、HB-EGF、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、胰岛素样生长因子(IGF)-I及其任意组合所组成的组中的生长因子。

29.如权利要求22至28中任一项所使用的组合物，其中所述伤口是急性伤口或慢性伤口。

30.如权利要求22至28中任一项所使用的组合物，其中所述伤口是皮肤伤口。

31.如权利要求22至28中任一项所使用的组合物，其中所述伤口是皮肤撕裂、摩擦、闭合性冲击手术伤口、皮肤磨损、烧伤、皮肤切口、皮肤裂伤、皮肤挫伤、皮肤穿刺、压疮、静脉溃疡、动脉溃疡、神经病理性/糖尿病伤口、淋巴水肿或手术部位切口。

32.如权利要求23至31中任一项所使用的组合物，其中哺乳动物组织包括上皮和/或结缔组织。

33.如权利要求23至32中任一项所使用的组合物，其中所述哺乳动物组织从皮肤、胎盘、和/或脐带中获得。

34.如权利要求23至33中任一项所使用的组合物，其中所述多聚物是糖基多聚物。

35.如权利要求23至33中任一项所使用的组合物，其中所述多聚物是二糖多聚物。

36.如权利要求35中所使用的组合物，其中所述二糖多聚物是透明质酸。

37.如权利要求22至36中任一项所使用的组合物，其中所述组合物进一步包括血细胞或富含血小板的血浆。

38.如权利要求37中所使用的组合物，其中所述血细胞是外周血单一核细胞(PBMCs)。

39.如权利要求38中所使用的组合物，其中所述PBMCs是人源细胞。

40.如权利要求39中所使用的组合物，其中所述人源PBMCs是自体的。

41.如权利要求23至40中任一项所使用的组合物，其中所述ECM组分包括胶原蛋白、弹性蛋白、和/或硫酸化糖胺聚糖(GAGs)。

42.如权利要求23至40中任一项所使用的组合物，其中所述组合物包括带状纤维。

43.如权利要求42中所使用的组合物，其中所述纤维宽度约1μm至约40μm，厚度约0.1μm至约10μm，和/或长度约≥70μm至约≤4000μm。

44.如权利要求43中所使用的组合物，其中所述纤维宽度约5μm至约30μm。

45.如权利要求43中所使用的组合物，其中所述纤维厚度约0.5μm至约5μm。

46.如权利要求43中所使用的组合物，其中所述纤维长度约≥75μm-约≤800μm。

47.如权利要求23至46中任一项所使用的组合物，其中所述哺乳动物组织从由猪、牛、羔羊、山羊、绵羊、和人类组成的组中的哺乳动物获得。

48.如权利要求47中所使用的组合物，其中所述猪是α-Gal(Galα1，3-Galβ1-4GlcNAc-R)表位基因敲除突变体。

49.如权利要求22至48中任一项所使用的组合物，其中所述方法减少瘢痕组织形成。

50.如权利要求49中所使用的组合物，其中减少的瘢痕组织形成对比于用透明质酸(HA)处理的伤口。

51.如权利要求22至50中任一项所使用的组合物，其中所述方法减少愈合伤口的脱色。

52.如权利要求51中所使用的组合物，其中减少的脱色对比于用透明质酸(HA)处理的伤口。

53.如权利要求39中所使用的组合物，其中所述方法促进角化细胞和上皮细胞的迁移。

54.如权利要求39中所使用的组合物，其中所述方法在伤口处促进血管形成或新生血管形成。

55.如权利要求54中所使用的组合物，其中在向所述伤口施用所述生物材料后5至10天内促进所述血管形成或新生血管形成。

56.如权利要求54中所使用的组合物，其中所述血管形成或新生血管形成导致伤口处ECM重构。

57.如权利要求39中所使用的组合物，其中与用透明质酸处理的伤口相比，愈合伤口位置处可见减少的细长瘢痕。

58.如权利要求22至57中任一项所使用的组合物，其中所述生物材料产生表皮细胞并恢复表皮和真皮的双层结构。

59.如权利要求58中所使用的组合物，其中在向所述伤口施用所述生物材料后15至40天内愈合所述伤口。

60.如权利要求59中所使用的组合物，其中在向所述伤口施用所述生物材料后25天内愈合所述伤口。

61.一种制备组合物的方法，所述组合物包括哺乳动物组织的细胞外基质(ECM)组分和多聚物，该方法包括将哺乳动物组织脱细胞化以制备包含细胞外基质(ECM)组分的粉末，混合所述粉末和含缓冲液、营养剂、生长因子或聚合物的培养基，其中所述粉末浸泡在培养基内，从而制备该组合物。

65.如权利要求61至64中任一项所述的方法，其中所述生长因子选自由重组4-1BBL、重组6Ckine、6Ckine重组人源蛋白、ANGPT2(ANG2)、ANGPTL5、激活素A、激活素R1b、BAFF、BAMBI、CXCL13、BDNF、BLC、BMP2、BMP4、BMP5、BMP7、BMPR1A、CCL1、CCL17、CCL20(MIP-3)、CCL21、CD40、GM-CSF、IL-3、IL-4、NT-6、HB-GAM、MK、IP-10、PF-4、MCP-1、RANTES、IL-8、IGFs、FGF 1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、TGF-β、VEGF、PDGF-A、PDGF-B、HB-EGF、HGF、TNF-α、IGF-I或其任何组合所组成的组。

66.如权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述ECM组分是重组ECM组分。

68.如权利要求23至60中任一项所使用的组合物，其中所述ECM组分是重组ECM组分。

69.如权利要求68中所使用的组合物，其中所述重组ECM组分是分离和/或纯化的ECM组分。

70.如权利要求1至60和66至69中任一项所述的组合物，或如权利要求61至65中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物组织是脱细胞哺乳动物组织。

71.如权利要求22中所述的组合物，其中所述组合物用于所需受试者愈合伤口。