CN108697828A - 用于稳定包含胶原蛋白的组织产品防止酶降解的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于产生交联的组织基质的方法，由此类方法产生的交联的组织基质，以及包含此类组织基质的组织产品。该方法包括：(1)使包含胶原蛋白的组织基质脱水，以形成脱水的包含胶原蛋白的组织基质；并且(2)照射脱水的包含胶原蛋白的组织基质，使得脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联。

Description

用于稳定包含胶原蛋白的组织产品防止酶降解的方法
本专利申请要求于2016年2月11日提交的美国临时专利申请序列号62/294,042的优先权，其在此全文以引用方式并入本文。
本公开涉及通过交联来稳定包含胶原蛋白的细胞外组织基质以防酶降解的方法。本公开还涉及由此类方法产生的交联的包含胶原蛋白的细胞外组织基质，以及由此类基质产生的组织产品。
包含胶原蛋白的组织产品常被用于再生、修复、补充、或以其它方式处理患病或受损的组织和器官。当植入患者或动物之中或之上时，这些组织产品随时间推移经历酶降解，从而破坏胶原蛋白和/或其它蛋白质，并且导致组织产品的各种机械性能(例如断裂载荷、强度、弹性、缝合保持强度、刚度等)降低或改变。
胶原蛋白基材料的一些机械性能可通过引入分子间交联来增加。此外，交联可降低对某些酶的酶敏感性。因此，可通过交联使包含胶原蛋白的组织稳定化以防酶降解和随之降低的机械性能。胶原蛋白可经由化学方法，诸如通过使用包含醛、异氰酸酯和/或碳二亚胺官能团的化学交联剂进行交联。然而，使用化学交联剂可能引起生物相容性问题。
作为另外一种选择，可例如采用紫外(UV)光经由照射对包含胶原蛋白的组织进行交联。用UV光交联迅速而有效，并且不具有与诱导的细胞毒性相关联的风险。然而，由于其天然湿润条件以及任何添加的交联剂(诸如核黄素)的存在，UV光随着其跨越包含胶原蛋白的组织基质而变得高度衰减。换言之，随着基质的厚度增大，渗透到基质较深部分中的UV光就越弱。因此，UV光迄今尚未有效地用于交联厚度大于200μm的基于胶原蛋白的基质。
因此，需要一种用UV光交联包含胶原蛋白的组织基质，特别是厚度大于200μm的基质的改善的方法，从而使其稳定化而防止酶降解，同时还避免与某些化学交联剂相关的潜在生物相容性问题。本公开提供了此类方法，并提供了交联组织基质、以及由此类方法产生的该交联组织基质的产品。
根据各种实施方案，提供了用于产生交联组织基质的方法。该方法可包括以下步骤：(1)使包含胶原蛋白的组织基质脱水，以形成脱水的包含胶原蛋白的组织基质，以及(2)用UV光照射脱水的包含胶原蛋白的组织基质，使得脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分发生交联。在一些实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质是脱细胞组织基质。在某些实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质是皮肤组织基质。在某些其它实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质来源于选自以下的组织：筋膜、肌肉(平滑肌、心肌、或横纹肌)、心包组织、硬脑膜、脐带组织、胎盘组织、心脏瓣膜组织、韧带组织、肌腱组织、动脉组织、静脉组织、神经结缔组织、膀胱组织、输尿管组织以及肠组织。
在一些实施方案中，该方法还包括在步骤(1)之前，用光活化交联剂浸渍包含胶原蛋白的组织基质。在某些实施方案中，光活化交联剂是核黄素-5'-磷酸酯。在这些实施方案的某些中，通过使包含胶原蛋白的组织基质浸泡在包含核黄素-5'-磷酸酯的水溶液中来用核黄素-5'-磷酸酯对其进行浸渍。在这些实施方案的某些中，水溶液包含0.1％至1.0％的核黄素-5'-磷酸酯。在这些实施方案的某些中，水溶液是磷酸盐缓冲盐水溶液。在一些实施方案中，该方法还包括步骤(3)使交联的包含胶原蛋白的组织基质再水化。
在一些实施方案中，UV光是UV-A光。在某些实施方案中，UV-A光具有约370nm的波长。
在一些实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质具有大于200μm的厚度。在某些实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质具有800μm或更大的厚度。
在一些实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质经由真空干燥、空气干燥、或经惰性气体处理进行脱水。
在一些实施方案中，将整个脱水的包含胶原蛋白的组织基质用UV光照射。在其它实施方案中，将包含胶原蛋白的组织基质的一个或多个选择区域用UV光照射。在另一些实施方案中，通过掩模用UV光照射包含胶原蛋白的组织基质上的线和/或点的阵列。在另一些实施方案中，将包含胶原蛋白的组织基质用UV光照射，使得获得交联的包含胶原蛋白的组织基质的图案。在这些实施方案的某些中，图案选自蛇形图案、幅材状图案、圆形图案、网格图案、线性图案以及它们的组合。
根据其它实施方案，提供了由以上方法产生的交联组织基质。在一些实施方案中，交联组织基质呈片形式。
根据其它实施方案，提供了包含以上交联组织基质的组织产品。在一些实施方案中，组织产品是疝修复网。
根据其它实施方案，提供了包含脱细胞的包含胶原蛋白的组织基质的组织产品。组织基质可为具有大于200μm的厚度的柔性片，其中组织基质交联至距组织基质的表面大于200μm的深度，并且其中组织基质不含细胞毒性残余物。在某些实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质是皮肤组织基质。在某些其它实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质来源于选自以下的组织：筋膜、肌肉(横纹肌、平滑肌、或心肌)、心包组织、硬脑膜、脐带组织、胎盘组织、心脏瓣膜组织、韧带组织、肌腱组织、动脉组织、静脉组织、神经结缔组织、膀胱组织、输尿管组织以及肠组织。
在一些实施方案中，组织基质在整个组织基质的厚度上交联。
在一些实施方案中，包含胶原蛋白的组织基质具有800μm或更大的厚度。
在一些实施方案中，采用光活化交联剂对包含胶原蛋白的组织基质进行交联。在某些实施方案中，光活化交联剂是核黄素-5'-磷酸酯。
在一些实施方案中，使整个包含胶原蛋白的组织基质交联。在其它实施方案中，使包含胶原蛋白的组织基质的一个或多个选择区域交联。在另一些实施方案中，使包含胶原蛋白的组织基质上的线和/或点的阵列交联。在另一些实施方案中，使包含胶原蛋白的组织基质以一定图案交联。在这些实施方案的某些中，图案选自蛇形图案、幅材状图案、圆形图案、网格图案、线性图案以及它们的组合。
附图说明
当结合附图阅读时，根据以下示例性实施方案的描述将更全面理解本公开所提供的上述和其它特征和优点。
图1示出了根据某些实施方案，在(1)用0.1％和1％核黄素-5'-磷酸酯溶液处理，(2)真空干燥，(3)UV-A交联2小时，以及(4)在PBS缓冲液中再水化之后，基于胶原蛋白的非细胞皮肤基质(ADM)的照片。
图2图示地描述了对于实施例1、3和5以及比较例1、3和5的基于胶原蛋白的ADM对体外胶原酶消化的敏感性，湿与干UV-A处理的相对效应。
具体实施方式
除非另外特别说明，本专利申请中所用的单数形式包括复数形式。除非另行指出，本专利申请中所用的“或”意指“和/或”。此外，所用的术语“包括”以及其它形式，如“包含”和“含有”并非限制性的。本文所述的任何范围将理解为包括端值和端值之间的所有值。
本文所用的任何小节标题仅仅是为了有条理，而不应解释为限制所述主题。不论出于何目的，本专利申请中所引用的所有文献或文献的一部分包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论著，它们在此全文清楚地以引用方式并入。
本公开提供用于产生交联组织基质的方法。这些交联的组织基质通过包括以下步骤的方法产生：首先(1)使包含胶原蛋白的组织基质脱水，以形成脱水的包含胶原蛋白的组织基质，然后(2)用UV光照射脱水的包含胶原蛋白的组织基质，使得脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联。在脱水步骤(1)之前，可用光活化交联剂浸渍包含胶原蛋白的组织基质。在照射步骤(2)之后，可采用水或pH缓冲液(诸如PBS)使交联的包含胶原蛋白的组织基质再水化，并随后灭菌。例如，可通过使本公开的交联再水化的包含胶原蛋白的组织基质暴露于γ辐射来进行灭菌。
如本文所用，术语“组织基质”是指包含细胞外基质蛋白的任何人或动物组织。细胞外基质蛋白的示例包括但不限于胶原蛋白、变性胶原蛋白和重组胶原蛋白。根据本公开的组织基质可包含任何类型(即I型至XVIII型)的胶原蛋白。在某些实施方案中，本公开的组织基质包含I型胶原蛋白。
本公开的组织基质可为任何适用于产生组织产品的厚度、尺寸和形状，该组织产品可用于再生、修复、补充、加强和/或处理人组织。此类厚度的具体示例包括但不限于50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1,000μm、1,500μm、2,000μm、2,500μm、3,000μm、3,500μm、4,000μm、4,500μm、5,000μm、5,500μm、6,000μm、6,500μm、7,000μm、7,500μm、8,000μm、8,500μm、9,000μm、9,500μm、10,000μm、10,500μm、11,000μm、11,500μm、12,000μm、12,500μm、13,000μm、13,500μm、14,000μm、14,500μm、15,000μm、15,500μm、16,000μm、16,500μm、17,000μm、17,500μm、18,000μm、18,500μm、19,000μm、19,500μm、20,000μm、20,500μm、21,000μm、21,500μm、22,000μm、22,500μm、23,000μm、23,500μm、24,000μm、24,500μm、25,000μm、25,500μm、26,000μm、26,500μm、27,000μm、27,500μm、28,000μm、28,500μm、29,000μm、29,500μm、30,000μm、30,500μm、31,000μm、31,500μm、32,000μm、32,500μm、33,000μm、33,500μm、34,000μm、34,500μm、35,000μm、35,500μm、36,000μm、36,500μm、37,000μm、37,500μm、38,000μm、38,500μm、39,000μm、39,500μm、40,000μm、40,500μm、41,000μm、41,500μm、42,000μm、42,500μm、43,000μm、43,500μm、44,000μm、44,500μm、45,000μm、45,500μm、46,000μm、46,500μm、47,000μm、47,500μm、48,000μm、48,500μm、49,000μm、49,500μm或50,000μm。在某些实施方案中，本公开的组织基质为200μm或更大。在其它实施方案中，本公开的组织基质为800μm或更大。在某些实施方案中，本公开的组织基质呈片形式。
本公开的组织基质可来源于任何类型的组织。可用于构造本公开组织基质的组织的示例包括但不限于皮肤、皮肤的部分(例如真皮)、筋膜、肌肉(横纹肌、平滑肌、或心肌)、心包组织、硬脑膜、脐带组织、胎盘组织、心脏瓣膜组织、韧带组织、肌腱组织、血管组织诸如动脉和静脉组织、软骨、骨、神经结缔组织、膀胱组织、输尿管组织、以及肠组织。本文所述的方法可用于交联任何白纤维组织类型并且用于任何组织基质产品。例如，Badylak等人描述了多种生物支架材料，并且本公开的方法可用于交联本领域已知的那些或其它组织基质。Badylak等人，“Extracellular Matrix as a Biological Scaffold Material:Structureand Function,”Acta Biomaterialia(2008)，doi:10.1016/j.actbio.2008.09.013。
本公开的组织基质包括但不限于任何细胞化组织基质、脱细胞组织基质、部分去细胞化组织基质、已重新注入外源性细胞(例如干细胞)的去细胞化组织基质、或人造基质。在某些情况下，可用自体来源或其它来源的细胞接种去细胞产品以利于处理。如本文所用，术语“脱细胞组织基质”通常是指基本上不含细胞和/或细胞组分的任何组织基质。
本公开的组织基质可被选择成提供多种不同的生物和/或机械性能。例如，脱细胞组织基质可被选择成允许组织长入并重构，以助于通常发现于基质植入部位处的组织再生。又如，脱细胞组织基质在植入到筋膜或其它软组织之上或之中时，可被选择成允许筋膜或其它软组织再生而无过度纤维变性或瘢痕形成。在某些实施方案中，本公开的组织基质可选自或STRATTICETM(LIFECELL CORPORATION,Branchburg,NJ)，其分别为人和猪的非细胞皮肤基质。另选地，可使用其它合适的脱细胞组织基质，如下文进一步所述。
本公开的组织基质能够以多种方式被处理，以产生去细胞化(即脱细胞)或部分去细胞化组织基质。可将下述处理步骤与本文所述的方法一起(以及在其之前或之后)使用，从而产生本公开的交联组织基质。
一般来讲，涉及产生部分去细胞化或脱细胞组织基质的步骤包括从供体(例如人尸体或动物来源)获取组织，并且在保留生物和结构功能的条件下移除细胞。在某些实施方案中，该方法包括在细胞移除的同时或之前进行化学处理，以使组织稳定化并避免生物化学和结构降解。在各种实施方案中，稳定溶液抑制和防止渗透性、低氧、自溶、以及蛋白水解降解，防止微生物污染，并且降低在包含例如平滑肌组分(例如血管)的组织情况下可能发生的机械损伤。稳定溶液可包含适当的缓冲液、一种或多种抗氧化剂、一种或多种膨胀剂、一种或多种抗生素、一种或多种蛋白酶抑制剂和/或一种或多种肌肉松弛剂。
随后将组织置入去细胞溶液中，以从结构基质移除活细胞(例如上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞)而不损伤胶原蛋白基质的生物和结构完整性。去细胞溶液可包含适当的缓冲液、盐、抗生素、一种或多种洗涤剂、一种或多种防止交联的试剂、一种或多种蛋白酶抑制剂和/或一种或多种酶。
可对脱细胞组织基质以多种方式进行测试或评价，以确定它们是否基本上不含细胞和/或细胞组分。例如，可用光学显微镜检查经处理的组织，以确定细胞(活或死)和/或细胞组分是否留下。此外，某些测定可用于鉴定细胞或细胞组分的存在。例如，DNA或其它核酸测定可用于定量组织基质之内留下的细胞核物质。一般来讲，不存在剩余的DNA或其它核酸将指示完全去细胞化(即移除了细胞和/或细胞组分)。最终，鉴定细胞特异性组分(例如表面抗原)的其它测定可用于确定组织基质是否脱细胞。在去细胞化处理之后，将组织样品用盐水进行充分洗涤。
虽然脱细胞组织基质可由与脱细胞组织基质移植受体的相同物种中的一个或多个个体制得，但并非必须如此。因此，例如脱细胞组织基质可由猪组织制得并植入人类患者中。可充当脱细胞组织基质的受体和用于产生脱细胞组织基质的组织或器官的供体的物种包括但不限于哺乳动物，诸如人、非人灵长类(例如猴、狒狒、或黑猩猩)、猪、牛、马、山羊、绵羊、狗、猫、兔子、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠或小鼠。
从包含胶原蛋白的材料消除α-半乳糖表位可降低针对包含胶原蛋白的材料的免疫应答。α-半乳糖表位表达于非灵长类哺乳动物和新世界猴(南美洲猴)中，以及大分子诸如细胞外组分的蛋白聚糖上。U.Galili等人，J.Biol.Chem.,263:17755(1988)。然而，该表位不存在于旧世界灵长类(亚洲和非洲猴以及猿)和人中。Id抗gal抗体由于对胃肠细菌上α-半乳糖表位碳水化合物结构的免疫应答而产生于人和灵长类中。U.Galili等人，Infect.Immun.,56:1730(1988)；R.M.Hamadeh等人，J.Clin.Invest.,89:1223(1992)。
因此，在一些实施方案中，当产生α-半乳糖表位的动物用作组织源时，从包含胶原蛋白的材料的细胞和细胞外组分基本消除α-半乳糖表位，以及防止细胞α-半乳糖表位再表达可使针对与结合α-半乳糖表位的抗gal抗体相关联的包含胶原蛋白的材料的免疫应答下降。
为了移除α-半乳糖表位，可使组织样品经受一次或多次酶处理，以移除特定免疫原性抗原(如果存在于样品中)。在一些实施方案中，可用α-半乳糖苷酶处理组织样品来消除α-半乳糖表位(如果存在于组织中)。在一些实施方案中，可将组织样品用α-半乳糖苷酶以100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中所制备的300U/L的浓度进行处理。在其它实施方案中，使α-半乳糖苷酶的浓度增大至400U/L，以从收获的组织充分移除α-半乳糖表位。只要实现抗原的充分移除，可使用任何合适的酶浓度和缓冲液。
另选地，除用酶处理组织之外，还可选择经基因修饰成缺乏一个或多个抗原表位的动物作为组织源。例如，可选择经基因工程化成缺乏末端α-半乳糖部分的动物(例如猪)作为组织源。对于适当动物的描述，参见美国专利申请公开No.2005/0028228A1和美国专利No.6,166,288，其公开内容全文以引用方式并入本文中。此外，处理组织以产生脱细胞基质(无论是否α-1,3-半乳糖部分的量有所减少或缺乏)的特定示例性方法描述于Xu,Hui等人，“A Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold that Supports Soft TissueRegeneration:Removal of Terminal Galactose-α-(1,3)-Galactose and Retention ofMatrix Structure,”Tissue Engineering，第15卷，第1-13页(2009年)，其全文以引用方式并入。
在形成脱细胞组织基质之后，可将组织相容性活细胞任选地接种到脱细胞组织基质中，以产生可由宿主进一步重建的移植物。在一些实施方案中，可在移植之前通过标准体外细胞共培养技术，或者在移植之后通过体内重建，将组织相容性活细胞添加到基质中。体内重建可通过迁移到脱细胞组织基质中的受体的自身细胞，或者通过将获自受体的细胞或另一供体的组织相容性细胞原位输注或注射到脱细胞组织基质中进行。可使用各种细胞类型，包括胚胎干细胞、成体干细胞(例如间充质干细胞)和/或神经细胞。在各种实施方案中，可在移植之前或之后立即将细胞间接施加于脱细胞组织基质的内部部分。在某些实施方案中，可将细胞置入待移植的脱细胞组织基质之内，并在移植之前进行培养。
可将本公开的包含胶原蛋白的组织基质以任何方式脱水，以形成脱水的包含胶原蛋白的组织基质。此类脱水的合适模式的示例包括但不限于真空干燥、空气干燥、经惰性气体处理、经吸湿性盐干燥、以及浸入强吸湿性流体(诸如无水醇或甘油)中。可使包含胶原蛋白的组织基质经受脱水足以形成脱水的包含胶原蛋白的组织基质的任何时间段。此类时间段的长度将取决于诸如包含胶原蛋白的组织基质的尺寸和厚度、包含胶原蛋白的组织基质的含水量、以及实施脱水的温度之类的因素。脱水应当至少在低于胶原蛋白开始热变性的温度的温度下进行。此类时间段的示例包括但不限于15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时和24小时。在脱水期间，湿组织中前90％至95％的水含量必须在低于40℃的温度下移除。剩余5％水含量的移除可通过在高于40℃下适度加热较短的时间段来促进。
在某些实施方案中，本公开的包含胶原蛋白的组织基质可被脱水至其厚度的特定深度(即部分厚度脱水)，随后用UV光照射来使脱水的包含胶原蛋白的组织基质交联。具体地，脱水至组织厚度的特定深度可通过化学干燥来实现。相比于其可从片的另一(即湿)侧经由扩散所补充的，用化学干燥剂仅处理组织片的一侧更快地从片的经处理侧移除水分。这可例如通过将甘油仅施加至组织片的一侧来进行。暴露于甘油的一侧变得半透明和干燥，而暴露于水的一侧保持水化且不透明。该技术可用于控制或限制交联的有效深度，从而导致根据本公开的交联的包含胶原蛋白的组织基质具有跨越其厚度的功能梯度或者层状或片状结构。
如本文所用，术语“交联”和“交联的”是指在本公开的组织基质的细胞外基质蛋白之间形成键并指具有此类键的细胞外基质蛋白。这些键可为细胞外基质蛋白之间所形成的共价键、静电键(例如氢键)、或它们的组合。这些键也可为共价或静电地键合至两个或更多个细胞外基质蛋白的原子或原子团(例如交联剂)的结果。
本公开的脱水的包含胶原蛋白的组织基质可采用足以使脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联的任何波长的UV光进行照射。在某些实施方案中，脱水的包含胶原蛋白的组织基质可用任何波长的以下光进行照射：波长在320nm至400nm范围内的UV-A光，波长在290nm至320nm范围内的UV-B光，波长在100nm至290nm范围内的UV-C光，或它们的任何组合。可用于照射本公开的脱水的包含胶原蛋白的组织基质的UV-A光波长的示例包括但不限于365nm和370nm。可用于照射本公开的脱水的包含胶原蛋白的组织基质的UV-B光波长的示例包括但不限于250nm和265nm。
脱水的包含胶原蛋白的组织基质可用UV光照射，或者当用核黄素-5'-磷酸酯作为交联剂浸渍时，用电子束辐射照射足以使脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联的任何时间量。此类时间段的示例包括但不限于15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时和10小时。脱水的包含胶原蛋白的组织基质也可用足以使脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联的任何强度(例如1mW/cm2至100mW/cm2范围内的强度)的UV光进行照射。此类强度的示例包括但不限于1.0mW/cm2、1.5mW/cm2、2.0mW/cm2、2.5mW/cm2、3.0mW/cm2、3.5mW/cm2、4.0mW/cm2、4.5mW/cm2、5.0mW/cm2、5.5mW/cm2、6.0mW/cm2、6.5mW/cm2、7.0mW/cm2、7.5mW/cm2、8.0mW/cm2、8.5mW/cm2、9.0mW/cm2和10.0mW/cm2。脱水的包含胶原蛋白的组织基质也可用足以使脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联的任何剂量(例如12至22千戈瑞(kGy)范围内的剂量)的电子束辐射进行照射。
在某些实施方案中，UV照射在脱水的包含胶原蛋白的组织基质上连续地进行，直至实现期望的交联程度。在其它实施方案中，UV照射间歇地进行，直至实现期望的交联程度。在某些实施方案中，当脱水的包含胶原蛋白的组织基质呈片形式时，采用UV仅在片的一侧上照射组织基质片。在其它实施方案中，采用UV在片的两侧上照射组织基质片。
可产生足以使脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联的一定强度和波长的UV光的任何UV光源均可用于照射本公开的脱水的包含胶原蛋白的组织基质。此类来源的示例包括但不限于短波长UV灯、UV气体放电灯、UV发光二极管(LED)和UV激光器。可用于照射和交联本公开的脱水的包含胶原蛋白的组织基质的UV交联室的示例是Stratalinker 2400TM(Stratagene)。就脱水而言，UV照射期间的温度不应超过40℃。
整个脱水的包含胶原蛋白的组织基质可根据本公开的方法采用UV光进行照射，从而使脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联。已知交联可使组织基质对体内炎性细胞酶降解的抗性增加，并且此类增加的抗性可减慢植入后的弱化速率。然而，过度交联可对细胞浸润和组织基质内正常组织的再生有不利影响。因此，在一些实施方案中，可能期望通过仅照射脱水的包含胶原蛋白的组织基质的一个或多个选择区域而为脱水的包含胶原蛋白的组织基质提供局部交联，从而维持其移植后长时间抵抗酶降解的能力，与此同时提供足以支持组织基质的未交联区域内正常组织再生的组织基质质量。
出于多种其它原因，可使用组织基质的局部交联。例如，其可允许产生不同的强度或其它机械性能，将组织处理成天然上更强的。此外，产生具有局部柔韧性的组织基质可允许外科医师将组织置入较小开口中，包括使组织基质通过腹腔镜切口或套管针。此外，产生具有局部柔韧性的组织基质可有利于允许柔度与天然组织匹配，或匹配组织的各向异性机械性能。
可通过掩模照射组织基质来实现脱水的包含胶原蛋白的组织基质的局部交联，从而在组织基质中产生交联的线或点的阵列或图案。可通过用UV光仅照射本公开组织基质的一个或多个选择区域而获得的交联图案的示例包括但不限于蛇形图案、螺旋图案、线性图案、弯曲图案、线性或纵向排列的图案、圆形图案、幅材状图案、以及网格图案。
可用一种或多种光活化交联剂浸渍本公开的包含胶原蛋白的组织基质。在某些实施方案中，一种或多种光活化交联剂是非细胞毒性的并且/或者在包含胶原蛋白的组织基质降解时不释放细胞毒性残余物。此类非细胞毒性光活化交联剂的示例包括但不限于核黄素-5'-磷酸酯及其盐、玫瑰红、生物类黄酮、抗坏血酸及其盐、以及它们的任意组合。可用作非细胞毒性光活化交联剂的特定生物类黄酮的示例包括但不限于原花色素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、鞣酸以及它们的组合。除作为非细胞毒性光活化交联剂之外，抗坏血酸及其盐也可充当辐射防护剂(即经由自由基清除提供防止长期氧化降解)。因此，在某些实施方案中，本公开的包含胶原蛋白的组织基质可用核黄素与抗坏血酸的混合物来浸渍。
本公开的包含胶原蛋白的组织基质可用一种或多种光活化交联剂以多种方式进行浸渍。在某些实施方案中，通过使本公开的包含胶原蛋白的组织基质浸泡入一种或多种光活化交联剂的溶液中，用一种或多种光活化交联剂对其进行浸渍。一种或多种光活化交联剂溶液的溶剂可为任何合适的生物相容性溶剂。此类生物相容性溶剂的示例包括但不限于水。一种或多种光活化交联剂的溶液还可包含任何合适的药学或生理学可接受的稀释剂、载体、赋形剂和/或添加剂。因此，在某些实施方案中，可将一种或多种光活化交联剂在pH缓冲液(水性和非水性两者)中进行配制。此类pH缓冲液的示例包括但不限于磷酸缓冲盐水(PBS)，以及基于柠檬酸盐、乙酸盐和HEPES的水性缓冲体系。此外，因为胶原蛋白处于天然缓冲环境，在某些实施方案中，一种或多种光活化交联剂可在未缓冲的盐水溶液中进行配制。
本公开的包含胶原蛋白的组织基质可用其浸渍的一种或多种光活化交联剂溶液可具有任何合适的交联剂浓度。浓度可在0.01％至5.0％的范围内，或在0.1％至1.0％的范围内。特定浓度的示例包括但不限于0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％和5.0％。
本公开还提供由前述方法产生的交联组织基质。这些交联组织基质可用于产生治疗患者的组织产品。例如，各种组织产品可用于再生、修复、补充、加强和/或处理已因各种疾病和/或结构损伤(例如，来自于创伤、外科手术、萎缩和/或长期磨损和变性)而损伤或损失的人组织。此类产品可包括例如脱细胞组织基质、组织同种异体移植物或异种移植物、和/或重构组织(即至少部分去细胞化的组织，已经细胞接种以产生可行材料)。
由本公开的交联组织基质产生的组织产品可用于修复缺陷(例如疝)，支持周围组织或植入物(例如，用于乳房增大和/或重建)，或替换损伤或损失的组织(例如，在创伤或外科手术切除后)。例如，本公开的交联组织基质可用于构建疝修复网，其能够被用来修复腹壁疝。在某些实施方案中，组织产品是胶原蛋白海绵。在其它实施方案中，组织产品是可注射胶原蛋白制剂，诸如可注射脂肪组织基质。无论何种特定用途，组织产品应当足以耐受酶降解直至组织再生和/或修复发生。
本公开的组织产品也可包含脱细胞的包含胶原蛋白的组织基质，其中组织基质是厚度大于200μm，例如大于800μm或至少5,000μm(即5mm)的柔性片，其中组织基质交联至距组织基质表面大于200μm的深度，并且其中组织基质不含细胞毒性残余物，诸如使用某些化学交联剂产生的那些。在组织产品是胶原海绵的某些实施方案中，胶原海绵可具有至多50,000μm(即5cm)的厚度。组织基质可跨越其整个厚度交联。包含胶原蛋白的组织基质可来源于上述任何来源，并且可用上述任何光活化交联剂进行交联。可使整个包含胶原蛋白的组织基质或者仅其一个或多个选择区域(如上所述)发生交联。
本发明在以下实施例中进一步定义。应当理解这些实施例虽然指示出了本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出。从以上讨论和这些实施例中，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，并且可以对本发明作出各种变化和修改来使其适应于各种用途和条件，而不脱离本发明的精神和范围。
实施例
实施例1
在35℃和小于100毫托的绝对压力下，将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)片样品真空干燥12-24小时，得到厚度为约0.7mm的干燥半透明ADM。然后将经干燥半透明的ADM转移至UVP型CL-1000紫外线交联仪，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射2小时。然后，在不含Ca或Mg盐的Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBS缓冲液)(标准标称浓度为2.67mM KCl、1.47mM KH2PO4、138mM NaCl和8.06mM Na2HPO4·7H2O)中，使ADM再水化过夜。
比较例1
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)“湿”(即不真空干燥过夜)片样品置入UVP型CL-1000紫外线交联仪中，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射2小时。
实施例2
在35℃和小于100毫托的绝对压力下，将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)片样品真空干燥12-24小时，得到厚度为约0.7mm的干燥半透明ADM。然后将经干燥半透明的ADM转移至UVP型CL-1000紫外线交联仪，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射4小时。然后，在不含Ca或Mg盐的Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBS缓冲液)(标准标称浓度为2.67mM KCl、1.47mM KH2PO4、138mM NaCl和8.06mM Na2HPO4·7H2O)中，使ADM再水化过夜。
比较例2
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)“湿”(即不真空干燥过夜)片样品置入UVP型CL-1000紫外线交联仪中，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射4小时。
实施例3
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)片样品在0.1重量％核黄素-5'-磷酸酯的PBS缓冲溶液中浸泡至多20小时(图1a)。然后在35℃和小于100毫托的绝对压力下，将经核黄素处理的ADM真空干燥12-24小时，得到厚度为约0.7mm的干燥半透明ADM(图1b)。然后将经干燥半透明的ADM转移至UVP型CL-1000紫外线交联仪，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射2小时(图1c)。然后，在不含Ca或Mg盐的Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBS缓冲液)(标准标称浓度为2.67mM KCl、1.47mM KH2PO4、138mM NaCl和8.06mM Na2HPO4·7H2O)中，使ADM再水化过夜(图1d)。如从图1d可以看出，交联的再水化ADM的视觉外观呈浅黄色。这可能是存在的残余核黄素所致，该核黄素可利用附加洗涤除去。
比较例3
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)“湿”(即未真空干燥过夜)片样品在0.1重量％核黄素-5'-磷酸酯的PBS缓冲溶液中浸泡至多20小时。随后，将经核黄素处理的ADM置入UVP型CL-1000紫外线交联仪中，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射2小时。
实施例4
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)片样品在0.1重量％核黄素-5'-磷酸酯的PBS缓冲溶液中浸泡至多20小时。然后在35℃和小于100毫托的绝对压力下，将经核黄素处理的ADM真空干燥12-24小时，得到厚度为约0.7mm的干燥半透明ADM。然后将经干燥半透明的ADM转移至UVP型CL-1000紫外线交联仪，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射4小时。然后，在不含Ca或Mg盐的Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBS缓冲液)(标准标称浓度为2.67mM KCl、1.47mM KH2PO4、138mM NaCl和8.06mM Na2HPO4·7H2O)中，使ADM再水化过夜。
比较例4
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)“湿”(即未真空干燥过夜)片样品在0.1重量％核黄素-5'-磷酸酯的PBS缓冲溶液中浸泡至多20小时。随后，将经核黄素处理的ADM置入UVP型CL-1000紫外线交联仪中，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射4小时。
实施例5
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)片样品在1.0重量％核黄素-5'-磷酸酯的PBS缓冲溶液中浸泡至多20小时(图1a)。然后在35℃和小于100毫托的绝对压力下，将经核黄素处理的ADM真空干燥12-24小时，得到厚度为约0.7mm的干燥半透明ADM(图1b)。然后将经干燥半透明的ADM转移至UVP型CL-1000紫外线交联仪，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射2小时(图1c)。然后，在不含Ca或Mg盐的Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBS缓冲液)(标准标称浓度为2.67mM KCl、1.47mM KH2PO4、138mM NaCl和8.06mM Na2HPO4·7H2O)中，使ADM再水化过夜(图1d)。如从图1d可以看出，交联的再水化ADM的视觉外观呈浅黄色。这可能是存在的残余核黄素所致，该核黄素可利用附加洗涤除去。
比较例5
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)“湿”(即未真空干燥过夜)片样品在1.0重量％核黄素-5'-磷酸酯的PBS缓冲溶液中浸泡至多20小时。随后，将经核黄素处理的ADM置入UVP型CL-1000紫外线交联仪中，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射2小时。
实施例6
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)片样品在1.0重量％核黄素-5'-磷酸酯的PBS缓冲溶液中浸泡至多20小时。然后在35℃和小于100毫托的绝对压力下，将经核黄素处理的ADM真空干燥12-24小时，得到厚度为约0.7mm的干燥半透明ADM。然后将经干燥半透明的ADM转移至UVP型CL-1000紫外线交联仪，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射4小时。然后，在不含Ca或Mg盐的Dulbecco磷酸缓冲盐水(PBS缓冲液)(标准标称浓度为2.67mM KCl、1.47mM KH2PO4、138mM NaCl和8.06mM Na2HPO4·7H2O)中，使ADM再水化过夜。
比较例6
将来源于猪真皮且具有约1.3mm湿厚度的2cm×3cm脱细胞真皮基质(ADM)“湿”(即未真空干燥过夜)片样品在1.0重量％核黄素-5'-磷酸酯的PBS缓冲溶液中浸泡至多20小时。随后，将经核黄素处理的ADM置入UVP型CL-1000紫外线交联仪中，使用发射350nm-375nm范围内UV波长(目标365nm)的UVA灯，采用370nm波长UV-A光以5.5mW/cm2的强度照射4小时。
对照例
将未在核黄素-5'-磷酸酯溶液中浸泡或未用UV-A光照射的“湿”(即未真空干燥过夜)片ADM用作对照。
根据以下方案测试以上实施例产生的ADM而无需最终灭菌。
差示扫描量热测定(DSC)
将实施例1至6、比较例1至6和对照例各自用DSC进行分析，以确定UV照射之前干燥样品对ADM热变性的影响。相比于其相应的比较例1至6对应物，观察到实施例1至6(在UV照射之前干燥样品)胶原蛋白热变性的初始温度较高。相比于完全水化时被照射的样品，经干燥样品的较高热初始温度指示出没有变性。
体外胶原酶消化
使实施例1、3和5，比较例1、3和5，以及对照例各自经受体外胶原酶消化，以确定UV照射之前干燥对胶原酶随给定时间段推移消化ADM的胶原蛋白的程度的影响。相比于它们相应的对应比较例1、3和5中的每者，观察到实施例1、3和5的胶原酶抗性程度更高(如由干重保留％所测)。图3示出UVA处理之前干燥的ADM对体外胶原酶降解的抗性得到改善。

Claims (36)

1.一种用于产生交联组织基质的方法，包括：
(1)使包含胶原蛋白的组织基质脱水，以形成脱水的包含胶原蛋白的组织基质；以及
(2)用UV光照射所述脱水的包含胶原蛋白的组织基质，使得所述脱水的包含胶原蛋白的组织基质的至少一部分交联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含胶原蛋白的组织基质是脱细胞组织基质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述包含胶原蛋白的组织基质是皮肤组织基质。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述包含胶原蛋白的组织基质来源于选自以下的组织：筋膜、心包组织、硬脑膜、脐带组织、胎盘组织、心脏瓣膜组织、韧带组织、肌腱组织、动脉组织、静脉组织、神经结缔组织、膀胱组织、输尿管组织以及肠组织。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)之前，用光活化的交联剂浸渍所述包含胶原蛋白的组织基质。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述光活化的交联剂是核黄素-5'-磷酸酯。
7.根据权利要求1所述的方法，其中通过使所述包含胶原蛋白的组织基质浸泡在包含核黄素-5'-磷酸酯的水溶液中来用核黄素-5'-磷酸酯对其进行浸渍。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述水溶液包含0.1重量％至1.0重量％的核黄素-5'-磷酸酯。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述水溶液是磷酸盐缓冲盐水溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述UV光是UV-A光。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述UV-A光具有370nm的波长。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含胶原蛋白的组织基质具有大于200μm的厚度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述包含胶原蛋白的组织基质具有800μm或更大的厚度。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含胶原蛋白的组织基质经由真空干燥、空气干燥、或经惰性气体处理来脱水。
15.根据权利要求1所述的方法，还包括：
(3)使所述交联的包含胶原蛋白的组织基质再水化。
16.根据权利要求1所述的方法，其中将整个脱水的包含胶原蛋白的组织基质用UV光照射。
17.根据权利要求1所述的方法，其中将所述包含胶原蛋白的组织基质的一个或多个选择区域用UV光照射。
18.根据权利要求1所述的方法，其中通过掩模用UV光照射所述包含胶原蛋白的组织基质上的线和/或点的阵列。
19.根据权利要求1所述的方法，其中将所述包含胶原蛋白的组织基质用UV光照射，使得获得交联的包含胶原蛋白的组织基质的图案。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述图案选自蛇形图案、幅材状图案、圆形图案、网格图案、线性图案以及它们的组合。
21.一种通过根据权利要求15所述的方法产生的交联组织基质。
22.根据权利要求21所述的交联的组织基质，其中所述交联的组织基质呈片形式。
23.一种组织产品，包含根据权利要求21所述的交联的组织基质。
24.根据权利要求23所述的组织产品，其中所述组织产品是疝修复网。
25.一种组织产品，包含脱细胞的包含胶原蛋白的组织基质，其中所述组织基质是具有大于200μm的厚度的柔性片，其中所述组织基质交联至距所述组织基质的表面大于200μm的深度，并且其中所述组织基质不含细胞毒性残余物。
26.根据权利要求25所述的组织产品，其中组织基质在整个所述组织基质的厚度上交联。
27.根据权利要求25所述的组织产品，其中所述包含胶原蛋白的组织基质是皮肤组织基质。
28.根据权利要求25所述的组织产品，其中所述包含胶原蛋白的组织基质来源于选自以下的组织：筋膜、心包组织、硬脑膜、脐带组织、胎盘组织、心脏瓣膜组织、韧带组织、肌腱组织、动脉组织、静脉组织、神经结缔组织、膀胱组织、输尿管组织以及肠组织。
29.根据权利要求25所述的组织产品，其中采用光活化交联剂对所述包含胶原蛋白的组织基质进行交联。
30.根据权利要求29所述的组织产品，其中所述光活化交联剂是核黄素-5'-磷酸酯。
31.根据权利要求25所述的组织产品，其中所述包含胶原蛋白的组织基质具有800μm或更大的厚度。
32.根据权利要求25所述的组织产品，其中使所述整个包含胶原蛋白的组织基质交联。
33.根据权利要求25所述的组织产品，其中使所述包含胶原蛋白的组织基质的一个或多个选择区域交联。
34.根据权利要求25所述的组织产品，其中使所述包含胶原蛋白的组织基质上的线和/或点的阵列交联。
35.根据权利要求25所述的组织产品，其中使所述包含胶原蛋白的组织基质以一定图案交联。
36.根据权利要求35所述的组织产品，其中所述图案选自蛇形图案、幅材状图案、圆形图案、网格图案、线性图案以及它们的组合。
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