CN113237807B - 生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术 - Google Patents

生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术，通过检测生物体蛋白值含量或蛋白纳米颗粒的大小和数量，结合各种离子和小分子化合物含量，并采用基于荧光共振能量转移原理的中间纤维荧光张力检测技术，获得生物跨膜渗透压值，评价生物体离子、小分子化合物和蛋白纳米颗粒协同调控人体混合液跨膜渗透压变化的经验数量关系。建立生物体内液跨膜渗透势能与蛋白纳米颗粒、各种小分子化合物和离子含量的量值对应关系，以及相互间的协同和拮抗作用，解析生物体内液真实渗透势能，据此用于临床评价人体内液间水流动的方向以及水肿发生的潜在几率，或筛选和鉴定与生物跨膜渗透势能相关的各种疾病治疗药物。

Description

生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析 技术
技术领域
本发明涉及一种生物体离子、小分子化合物和蛋白纳米颗粒混合溶液生物跨膜渗透压的量化分析方法，具体是在生物体蛋白纳米颗粒相关的生物大分子光学检测和各种离子和小分子化合物含量测定基础上，应用细胞荧光张力技术检测获取生物跨膜渗透压经验值，通过绘制生物渗透压与离子、小分子化合物和蛋白颗粒的二维、或多维曲线，分析生物体内液的细胞跨膜渗透压量值变化及其在相关疾病药物筛选的评价方法。
背景技术
当前流行观点认为：渗透压的高低取决于溶液中溶质颗粒(分子或离子)数目的多少，而与溶质的种类和颗粒大小无关。人体血浆渗透压(包括细胞渗透压)接近300mOsm/L，相当于5790mmHg，其中，血浆蛋白形成的渗透压(又称胶体渗透压)为25mmHg，相当于1.3mOsm/kg，据此胶体渗透压在血液中的作用微乎其微。但是，国内临床治疗认为：胶体渗透压不能等同于离子渗透压，两者对血浆渗透压调节并不分享相似的机制！同时，按照范特霍夫渗透压公式(第一届诺贝尔化学奖得主)，0.9％NaCl溶液和1.9％尿素溶液渗透压均为300mOsm/L。而当前生理实验发现：0.85％(283mOsm/L，低于理论值)的NaCl溶液，能保持红细胞形态稳定，为机体等渗液；1.9％尿素溶液，却导致红细胞立即发生溶血。因而，在人体内，其理论合理性令人质疑。
应该明确指出：渗透压是基于半透明膜提出的物理学特征值，但是细胞的质膜与半透明膜有本质差异。由类脂双分子层组成的细胞质膜，其离子和水进出受离子通道、转运体和水通道的有序调节，这种特异性调节机制导致机体血浆、组织间隙液和细胞内液的离子组成和数值有显著差异(血浆和组织间隙液以Na+为主，细胞内液以K+为主)，并形成机体细胞内负外正的“静息电位”[6]，与物理渗透压的形成有明显区别。研究发现：等渗环境下，血浆白蛋白含量增加(细胞外渗透压)能显著诱导细胞内渗透势能(离子和蛋白颗粒)的上调。提示：人体渗透势能的改变受细胞外和细胞内渗透压变化的协同调节，是细胞两侧“跨膜渗透压”差，是人体动态变化过程(细胞能自主调节细胞内渗透势能)，与物理概念中的离子或颗粒自由交换显著不同(一边增加一边减少)。因而，采用传统的渗透压仪只检测细胞内或细胞外渗透压的单侧渗透压变化，来评价人体细胞“跨膜渗透势能”的变化既不科学也不准确。
等渗环境下，细胞外蛋白或血浆白蛋白含量变化为什么能导致细胞内渗透势能的改变？唐南(Donnan)效应或唐南平衡对此提供一个合理解释。该理论认为：在生理pH环境中，蛋白纳米颗粒能携带大量负电荷，形成固定的负电荷层(FCD)。它可以强烈吸附颗粒附近的阳离子，从而导致溶液游离阳离子浓度的降低，及胞膜间离子渗透压的不平衡，也刺激了电压门控离子通道的激活及细胞外阳离子的内流。而胞内阳离子积累又会形成膜间电荷梯度，即膜电位差，吸附阴离子流入，阴阳离子协同诱导细胞内总渗透压的升高。
作为“蛋白纳米颗粒”，生物体内液蛋白不仅能导致溶液中离子数量的变化，也能调控游离阳离子数量降低及膜电位的改变(或电驱动力)，参与细胞“去极化”或“超极化”的调节。电压门控离子通道是调控细胞膜电位恢复及电势能平衡的主要途径。按照离子的选择通透性，电压门控离子通道可分为：钙、镁、钾、钠和氯等多种类型。因而，血浆中各种离子和小分子化合物的含量变化可能通过改变蛋白纳米颗粒阳离子吸附能力以及细胞内电势能改变调控电压门控离子通道的开放程度，诱导离子内外流动，参与了细胞跨膜渗透压及水流动的调节，是生物跨膜渗透压改变的重要调控因素。
因此，有必要建立生物体内液各组分改变调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析体系。
发明内容
本发明为解决现有技术中识别人体细胞外液和活细胞胞内蛋白纳米颗粒和离子混合渗透压的不足，提供一种与光学检测结合的生物跨膜渗透压分析方法。
本发明的目的是针对现有技术识别生物体内液蛋白颗粒和离子混合液渗透压的缺陷，提供一种与细胞内离子、小分子化合物和蛋白纳米颗粒混合液跨膜渗透压相关的检测方法。本发明的另一目的是可据本发明人体内液跨膜渗透势能的检测，构建相关药物筛选细胞平台，筛选与人体蛋白纳米颗粒和离子混合溶液跨膜渗透压调节相关的药物。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术，其特征在于：检测生物体内液蛋白质的总量以及生物体内液中各种离子及小分子化合物的含量；依据各种离子和小分子化合物的含量以及蛋白质的总量，采用以荧光共振能量转移为原理的中间纤维张力检测技术测定生物体内液跨膜渗透势能的数值变化，其方法包括以下步骤：
步骤一：获取生物体内液样本，以建立中间纤维张力检测技术测定生物体内液跨膜渗透势能的关系；
步骤二：利用具有足够分辨率的成像光对生物体内液样本进行光强度检测，确定其中蛋白质纳米颗粒数量和大小；采用全自动生化光学检测仪，检测溶液中蛋白质、各种离子和小分子化合物含量；
步骤三：依据荧光共振能量转移原理，建立中间纤维荧光张力检测探针技术，采用荧光共振能量转移效率的倒数1/E，评价细胞容积的变化，分析生物体内液的生物跨膜渗透势能变化；
步骤四：绘制出蛋白质的总量与至少一种离子或小分子化合物的含量的因素变化与生物跨膜渗透势能的量值的对应关系；
步骤五：将所得的对应关系用于检测待测生物体内液，先检测生物体内液中的蛋白质的总量，依据步骤四所得的对应关系推测出待测生物体内液相应的跨膜渗透压数值。
进一步的，所述的蛋白质的总量为由生物体内液中蛋白纳米颗粒、蛋白颗粒聚合体的大小和数量计算得到的总和。
进一步的，所述的生物体内液是指含蛋白纳米颗粒的血浆、细胞间隙液、细胞质或细胞核提取液。
进一步的，所述的生物体内液的跨膜渗透势能是指生物体内液中的细胞内外渗透压差，是细胞受到细胞外渗透压刺激后的细胞渗透势能动态变化过程。
进一步的，所述的蛋白质的总量与至少一种离子或小分子化合物的含量的因素变化与生物跨膜渗透势能的量值的对应关系包括单因素变化对应关系、双因素变化对应关系、多因素变化对应关系。
进一步的，所述的对应关系为所述的对应关系为二维或多维曲线关系。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
细胞渗透势能是细胞内力学活动的重要组成，依据细胞张力是以骨架结构牵拉为特征的力学活动(又名细胞结构张力)，本发明采用“荧光共振能量转移”原理，开创性的构建了“角度荧光张力生物探针”，将其克隆整合到中间纤维丝亚基之间，悬挂在细胞骨架结构外侧(减少对骨架整体结构的影响)。通过观察荧光共振能量转移效率的变化，有效识别“活细胞”胞膜向外膨胀的骨架结构牵拉张力大小和时间变化，评价生物体内液跨膜渗透势能及其对生物体的影响，纠正目前渗透压仪只能单一检测细胞内或外渗透势能数值的误差，成为揭示活细胞内外渗透势能差变化的重要实验技术和方法，揭示众多与水代谢相关的疾病发病和治疗机制。
本发明中与人体内蛋白纳米颗粒和离子混合液相关的光学检测结合的分析方法，能分析人体跨膜渗透压的改变，突破现有渗透压检测方法仅能对“离子或蛋白纳米颗粒溶液”或“细胞内或细胞外”分别检测的限制，实现了活细胞跨膜渗透势能变化转换为“可见”光学信号。重新认识晶体渗透压和胶体渗透压与人体内液渗透压变化的联系和区别，对揭示其与人体生理和病理变化的调控具有重要的研究意义。可据此构建其相关药物筛选细胞平台，筛选与人体跨膜渗透压调节相关的药物。
以血浆白蛋白调控血浆跨膜渗透压改变及机体水进出为实例。改变血浆中白蛋白、各种离子和小分子化合物含量，通过检测中间纤维荧光张力探针荧光共振能量转移效率，发现其FRET转移效率的倒数(1/E)与血浆胞外渗透压或组成成分改变有显著的线性关系，表明：细胞跨膜渗透压的改变与胞外人体内液成分变化有密切相关性。研究结果概述如下：
1.胞外不同组成诱导蛋白纳米颗粒渗透压变化对生物跨膜渗透势能的量化关系：
a)氯化钠
Y＝-0.007829XNaCl+2.109 R2＝0.9512 X是NaCl浓度值(98-175mM)
b)甘露醇(mannitol)
Y＝-0.0011X+1.002 R2＝0.9942 X是甘露醇浓度值(0-210mM)
2.胞外离子单因素调控生物跨膜渗透势能变化的量化关系：
a)血浆白蛋白(albumin)
Y＝0.003359XAlb+0.8619 R2＝0.9499 X是白蛋白浓度(10-100mg/ml)
b)钙离子
Y＝0.0134XCa 2-0.1354XCa+1.2618 R2＝0.9627 X是Ca2+浓度(0≤X≤10mM)
Y＝-0.1329XCa+1.3155 R2＝0.978 X是Ca2+浓度(1.25≤X≤2.5mM)
Y＝-0.0362XCa+1.0834 R2＝0.999 X是Ca2+浓度(2.5≤X≤5mM)
c)镁离子
Y＝0.0496XMg 2-0.1579XMg+1.1292 R2＝0.9829 X是Mg2+浓度(0-2.2mM)
Y＝-0.1073XMg+1.126 R2＝0.999 X是Mg2+浓度(0-1.1mM)
d)钾离子
Y＝0.03009XK+0.8571 R2＝0.9737 X是K+浓度(0-10mM)
3.小分子化合物单因素调控生物跨膜渗透势能变化的量化关系：
a)胆红素
Y＝-0.002616XBili+0.9883 R2＝0.9238 X是Bilirubin浓度(0-90uM)
b)尿素
Y＝0.01731XUrea+0.9579 R2＝0.9629 X是Urea浓度(0-20mM)
c)尿酸
Y＝0.0004XUA+0.9467 R2＝0.9629 X是Uric acid浓度(0-1000μM)
4.双因素协同调控生物渗透势能平衡(跨膜渗透势能差为零或内外等渗，即Y值为零)的量化关系：
a)白蛋白和钙离子
Y＝XALB-21.14XCa-2.44当1.25≤XCa2+≤2.5时
Y＝XALB-5.75XCa-39.12当2.5≤XCa2+≤5时
b)白蛋白和钾离子
Y＝XALB+5.95XK-80.6
c)白蛋白和尿素
Y＝XALB+1.996XUrea-59.96
d)白蛋白和胆红素
Y＝XALB-1.003XBilirubin-40.071
e)钾离子和钙离子
Y＝XK+3.55XCa-13.14当1.25≤XCa2+≤2.5时
Y＝XK+0.97XCa-6.97当2.5≤XCa2+≤5时
f)尿素和胆红素
Y＝1.731XUrea-XBilirubin+6.79
5.钙钾协同调控白蛋白相关生物渗透压的量化关系：
Y＝XALB-10.57XCa+2.98XK-41.52当1.25≤XCa2+≤2.5时
Y＝XALB-2.88XCa+2.98XK-59.86当2.5≤XCa2+≤5时
区间范围低渗9以上，正常范围有-6—9，中度高渗-6—-18，高度高渗-18以下，
6.钙镁钾协同调控白蛋白相关生物渗透压的量化关系：
Y＝XALB-10.54(XCa+XMg)+2.98XK-29.88当1.25≤XCa2+≤2.5时
Y＝XALB-2.87(XCa+XMg)+2.98XK-56.71当2.5≤XCa2+≤5时
区间范围低渗9以上，正常范围有-6—9，中度高渗-6—-17，高度高渗-17以下，
7.尿素协同调控胆红素相关生物渗透压的量化关系：
Y＝1.731XUrea-XBilirubin+6.79
区间范围，高度高渗-27以下，中度高渗-9—-27，正常范围有-9—18，中度低渗18-40，高度低渗40以上
上述三个血浆多成分综合评价指标(5-7)能作为人体内液跨膜渗透压的合理评价指标，分析血浆组成对人体跨膜渗透压的动态作用，为低蛋白血症、高尿素和高胆红素血症等血浆组成相关疾病提供合理的诊断参考。
附图说明
图1-2：人体血浆溶液(或高钙Hanks液)中，NaCl和甘露醇不同浓度诱导冰点OP值与神经胶质细胞中间纤维张力(胞内渗透势能)的数值量化关系。细胞外液渗透压可诱导细胞中间纤维的变化并呈线性相关。
A、B和F：将表达GFAP探针的U87细胞用NaCl调节的高渗透压梯度溶液(A)、NaCl调节的低渗透压梯度溶液(B)和甘露醇调节的高渗透压梯度溶液(F)分别处理15min。使用Image J的16色图处理CFP(青色)和FRET(黄色)荧光图像。将校准栏设置为0.10至1.5。比例尺：20μm。
C、D和G：在NaCl/甘露醇调节的渗透压梯度溶液的刺激下，与GFAP张力对应的CFP/FRET信号VS.时间的归一化，Mean±SEM。
E和H：刺激U87细胞15min后，用NaCl和甘露醇调节的溶液渗透压与CFP/FRET信号的相关性曲线。
图3-图9为人体血浆溶液(或高钙Hanks液)中，白蛋白、Ca2+、Mg2+、K+、胆红素、尿素和尿酸的单因素生理剂量改变对神经胶质细胞中间纤维张力(胞内渗透势能)的二维曲线关系：
图3：细胞外液中蛋白质浓度改变可诱导细胞中间纤维的变化并呈线性相关。
A：将表达GFAP探针的U87细胞用不同ALB浓度的细胞外液分别处理15min。使用Image J的16色图处理CFP(青色)和FRET(黄色)荧光图像。将校准栏设置为0.10至1.5。比例尺：20μm。
B：在不同蛋白浓度细胞外液刺激下，与GFAP张力对应的CFP/FRET信号VS.时间的归一化，Mean±SEM。
C：刺激U87细胞15min后，不同蛋白浓度细胞外液与CFP/FRET信号的相关性曲线。图4-图6：细胞外液中离子浓度改变可诱导细胞中间纤维的变化及其相关性分析。
A、D和G：将表达GFAP探针的U87细胞用不同Ca2+(A)、Mg2+(D)、K+(G)浓度的细胞外液分别处理15min。使用Image J的16色图处理CFP(青色)和FRET(黄色)荧光图像。将校准栏设置为0.10至1.5。比例尺：20μm。
B、E和H：在不同离子浓度细胞外液刺激下，与GFAP张力对应的CFP/FRET信号VS.时间的归一化，Mean±SEM。
C、F和I：刺激U87细胞15min后，不同离子浓度细胞外液与CFP/FRET信号的相关性曲线。图7-图9：细胞外液中胆红素、尿素和尿酸浓度改变可诱导细胞中间纤维的变化并呈线性相关。
A和D：将表达GFAP探针的U87细胞用不同胆红素(A)、尿素(D)和尿酸(G)浓度的细胞外液分别处理15min。使用Image J的16色图处理CFP(青色)和FRET(黄色)荧光图像。将校准栏设置为0.10至1.5。比例尺：20μm。
B、E和H：在不同胆红素、尿素和尿酸浓度细胞外液刺激下，与GFAP张力对应的CFP/FRET信号VS.时间的归一化，Mean±SEM。
C、F和I：刺激U87细胞15min后，不同胆红素、尿素和尿酸浓度细胞外液与CFP/FRET信号的相关性曲线。
图10-图11为人体血浆溶液(或高钙Hanks液)中，白蛋白和Ca2+、白蛋白和K+的双因素生理剂量改变对神经胶质细胞中间纤维张力(胞内渗透势能)的渗透平衡关系。
图10：细胞外液中蛋白质和钙离子浓度同时改变可诱导细胞中间纤维的变化。
A：将表达GFAP探针的U87细胞用两组细胞外液分别处理15min。使用Image J的16色图处理CFP(青色)和FRET(黄色)荧光图像。将校准栏设置为0.10至1.5。比例尺：20μm。
B和C：在正常蛋白浓度(B)和低蛋白浓度(C)细胞外液刺激下，与GFAP张力对应的CFP/FRET信号VS.时间的归一化，Mean±SEM。
D：刺激U87细胞15min后，测得的标准化的CFP/FRET比值(Mean±SD；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
图11：细胞外液中白蛋白和钾离子浓度同时改变可诱导细胞中间纤维的变化。
A：将表达GFAP探针的U87细胞用两组细胞外液分别处理15min。使用Image J的16色图处理CFP(青色)和FRET(黄色)荧光图像。将校准栏设置为0.10至1.5。比例尺：20μm。B和C：在白蛋白和钾离子细胞外液刺激下，与GFAP张力对应的CFP/FRET信号VS.时间的归一化，Mean±SEM。
D：刺激U87细胞15min后，测得的标准化的CFP/FRET比值(Mean±SD，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
图12：细胞外液中白蛋白和钙、钾离子浓度同时改变诱导细胞中间纤维的变化。
A：将表达GFAP探针的U87细胞用两组细胞外液分别处理15min。使用Image J的16色图处理CFP(青色)和FRET(黄色)荧光图像。将校准栏设置为0.10至1.5。比例尺：20μm。
B和C：在白蛋白和钙、钾离子浓度同时改变细胞外液刺激下，与GFAP张力对应的CFP/FRET信号VS.时间的归一化，Mean±SEM。
图13：细胞外液中胆红素和尿素浓度同时改变可诱导细胞中间纤维的变化。
A：将表达GFAP探针的U87细胞用两组细胞外液分别处理15min。使用Image J的16色图处理CFP(青色)和FRET(黄色)荧光图像。将校准栏设置为0.10至1.5。比例尺：20μm。
B：在胆红素和尿素细胞外液刺激下，与GFAP张力对应的CFP/FRET信号VS.时间的归一化，Mean±SEM。
具体实施方式
本发明的各种实施方案和方面会在下文中详细阐述。
下文的描述和图示解释了本发明但并不解释为对本发明的限制。所描述的大量特定详细资料为本发明的各种实施方案提供了全面理解。然而，某些情况下，为了对本发明的实施方案提供简明地论述，并未描述一些众所周知或常规的详细资料。
本文使用的术语“包括/包含”被解释为包括在内且是开放式的，并不排外。特别是用在本说明书包括权利要求书中，“包括/包含”及其变体表示特定特征、步骤或成分被包括在其中。这些术语不能解释为排除其他特征、步骤或成分的存在。
本文使用的术语“示例的”意为“可作为例子、实例或例证”，不应当解释为比本文公开的其他配置优选或有利。
本文使用的术语“约/大约”和“大概”，当与粒子尺寸范围、混合物成分或其他物理性质和特征连用时，意为涵盖尺寸范围内上下限中可能存在的微小变化，以不排除平均大部分尺寸满足但在统计学上可存在该范围之外的尺寸的实施方案。本申请不打算排除诸如这些的实施方案。
本发明应用细胞荧光张力检测技术评价细胞内外渗透势能变化诱导中间纤维牵拉张力变化，并绘制跨膜渗透压改变与细胞中间纤维牵拉诱导的荧光共振能量转移效率的标准曲线关系，建立细胞跨膜渗透势能变化的光学评价曲线。评价细胞内中间纤维牵拉张力的光学变化与跨膜渗透势能改变的量化曲线关系。
本发明利用蛋白质胶体的光学性质，通过检测细胞内含量丰富的蛋白质颗粒及其聚合体含量及分布，测定胞内蛋白纳米颗粒(或胶体)数量及分布变化。
本发明也可结合呈色反应或全自动生化检测仪，采用光学检测技术测定人体内液小分子化合物和离子含量以及蛋白质含量变化变化。
本发明依据细胞内外渗透压差改变而绘制的标准力学变化曲线，来分析人体蛋白纳米颗粒和离子混合内液的生物跨膜渗透压：
1、绘制蛋白纳米颗粒改变诱导细胞跨膜渗透势能变化的二维曲线关系。
在其他离子保持相对稳定前提下，绘制蛋白纳米颗粒含量变化与细胞跨膜渗透压变化的量化关系。
2、绘制离子组成，离子浓度改变诱导细胞跨膜渗透势能变化的相关线性关系。
4、绘制蛋白纳米颗粒和其中一种离子改变诱导细胞跨膜渗透势能变化的相关线性关系。
5、依次类推，绘制蛋白纳米颗粒和两种以上离子组成，其浓度改变诱导细胞跨膜势能变化的多维曲线关系。
6、依据上述建立的人体蛋白纳米颗粒和离子组成变化的经验数量曲线关系，通过检测人体内液的蛋白纳米颗粒、离子和小分子化合物的组成变化，推测生物体内液的跨膜渗透势能变化。
实施方法
1.细胞培养
以人神经胶质细胞系U87为例，每100ml培养基由含11.1mM葡萄糖的DMEM培养基加10％的灭活胎牛血清(V:V)，100U/ml青霉素和100mg/l链霉素配制而成。培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。待细胞生长融合度达到70％-80％时，进行传代。
2.中间纤维张力探针构建(GFAP或vimentin)及其张力检测原理
中间纤维张力探针采用角度荧光共振能量转移原理(FRET)构建，即将一对基于eCFP和eYFP荧光蛋白对基因采用7个氨基酸(7aa)基因连接，两侧各连接一个中间纤维单体(如GFAP或vimentin)基因，得到中间纤维张力探针基因克隆：pCMV-GFAP-eCFP-7aa-eYFP-GFAP(GcpG)或pCMV-vimentin-eCFP-7aa-eYFP-vimentin(VcpV)。将该基因克隆转染细胞，当其在细胞内表达后，能整合到中间纤维骨架中。经G418筛选获得阳性克隆探针，并使用流式分选仪分选转染含GFAP或vimentin张力探针的单克隆细胞系。用于细胞内中间纤维骨架张力变化检测。
在张力探针中，荧光蛋白eCFP(青色)和eYFP(黄色)分别是FRET的供体和受体。其中，eCFP吸收波长433nm和发射波长476nm；eYFP吸收波长514nm和发射波长527nm。静息状态下，eCFP与eYFP平行；433nm荧光激发eCFP，eCFP发射476nm荧光能作为eYFP激发光，诱导eYFP发射527nm荧光。检测eYFP(FRET)/eCFP发射光比值来计算FRET的效率(E)，用其倒数(1/E)表示张力大小变化。
3.质粒转化、扩增及提取
3.1质粒转化
在1.5ml无菌无酶的Eppendorf管中加入50μl感受态细胞(DH5α)和2μl质粒(GFAP)，轻轻混匀，置于冰上溶解25分钟，备用；然后转移至42℃恒温水浴锅中热激90s，避免剧烈摇晃；取出后转移至冰上吸附2min，加入1ml高压灭菌锅的不含抗生素的新鲜液体LB培养基；随后置于37℃，180rpm/min摇床内，震荡孵育1h；取出后6000rpm/min，室温离心5min，去除上清，重悬剩下的培养基，涂在含有与质粒抗性相同的卡那霉素或者氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃倒置过夜。
3.2质粒扩增与提取
将过夜后的LB培养板取出，在超净台中挑选单克隆菌落，置于含有35ml与质粒抗性相同的LB液体培养基的50ml离心管中，37℃震荡培养12-16h，使用Endo-Free PlasmidMini Kits试剂盒制备用于转染的质粒，按照试剂盒的说明书进行具体操作。提取后的质粒浓度使用微量核酸仪进行检测，单位为μg/μl。
4.质粒转染
细胞在6孔板中生长直至细胞融合度达到70％左右时准备转染，转染前6h将培养基换成无血清培养基；转染前按照质粒：转染试剂＝1.5μg/3μl的比例制备转染混合液，加入适量OPTI-MEM，轻弹混匀；室温静置20min，同时将实验细胞孔进行换液，20min后将转染混合液缓慢滴入实验细胞孔中；将6孔板置于37℃，5％CO2培养箱，孵育过夜12-16h。
5.cpstFRET测定与处理
细胞转染后，置于共聚焦皿内，使用TCS SP5(Leica)激光共聚焦显微镜在63×油镜下拍摄。设置实验条件为：供体CFP通道采用475nm激发，505nm发射；受体YFP通道采用538nm激发，601nm发射；FRET通道采用的激发波长最小为为475nm，最大为505nm，速度按照1024×1024，400赫兹设置，以取得最好的拍摄效果。以FRET和R作为能量传递指数的测定指标，使用等式1/R＝ICerulean donor/IVenus acceptor计算CFP/FRET比值。
6.离子溶液渗透压的测定和蛋白质纳米颗粒的计数
(1)改良HBSS平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution)的配制：
Figure GDA0003861669980000101
Figure GDA0003861669980000111
计算可得HBSS平衡盐溶液中各离子浓度如下：
Figure GDA0003861669980000112
实验中通过改变HBSS溶液中CaCl2、MgCl2、KCl的浓度来配制不同浓度的离子溶液；通过加入ALB(白蛋白)来改变溶液中蛋白质浓度。
(2)渗透压的测定：吸取上清液(约50μL)放入0.5mL试管中。在使用前，将Osmomat3000 Freezing Point Osmometer and 050Membrane Osmometer校准三次，记录细胞质OP。
(3)蛋白质纳米颗粒的计数：并使用Nanosight NS300检测细胞质蛋白纳米颗粒(kilocycles peeconr sd，Kcps)的计数。
7.统计学分析
使用Image J图像分析软件计算CFP/FRET比率，并对免疫印迹、离子成像等结果进行半定量分析。采用Origin 2017、GraphPad Prism 8等软件进行统计学处理，数据以均数±标准差(Means±SD)的形式表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显着差异检验确定统计学显着性，P<0.05被认为是显著的。每个实验至少重复三遍，>10个细胞成像，并分析每种情况。
实施例1
一、人体血浆溶液或高钙Hanks液中，NaCl和甘露醇不同浓度诱导冰点OP值与神经胶质细胞中间纤维张力(胞内渗透势能)的数值量化关系
以HBSS平衡盐溶液为基础，加入NaCl溶液，调节浓度使得终溶液冰点渗透压值分别为300、330、360、390、420和450mOsmol/kg；减少HBSS溶液中NaCl浓度，调节浓度使得终溶液冰点渗透压值分别为300、270、240、210、180和150mOsmol/kg；同理，加入甘露醇溶液，调节浓度使得终溶液冰点渗透压值分别为300、330、360、390、420和450mOsmol/kg。在U87细胞中转入GFAP探针，观察不同渗透压值对细胞张力的影响并分析两者之间的相关性。
实施例2
二、人体血浆溶液或高钙Hanks液中，白蛋白、Ca2+、Mg2+、K+、胆红素、尿素和尿酸的单因素生理剂量改变对神经胶质细胞中间纤维张力(胞内渗透势能)的二维曲线关系
2.1细胞外液中蛋白质浓度的改变诱导GFAP张力的变化
由于HBSS平衡盐溶液中钙离子低于血浆中钙离子浓度(2.5mM)，因此，我们用CaCl2调节使得HBSS平衡盐溶液中钙离子终浓度为2.5mM，然后加入白蛋白粉末(ALB)来改变细胞外液中蛋白质浓度。在U87细胞中转入GFAP探针，观察不同ALB浓度对细胞张力的影响并分析两者之间的相关性。
2.2细胞外液中阳离子(Ca2+、Mg2+、K+)浓度的改变诱导GFAP张力的变化
以ALB浓度50mg/ml为基础，增加或减少HBSS平衡盐溶液中CaCl2、MgCl2、KCl的含量，配制含不同浓度阳离子的细胞外液。在U87细胞中转入GFAP探针，观察不同离子浓度细胞外液对细胞张力的影响并分析两者之间的相关性。
2.3细胞外液中胆红素、尿素和尿酸浓度的改变诱导GFAP张力的变化
用CaCl2调节使得HBSS平衡盐溶液中钙离子终浓度为2.5mM，以ALB浓度50mg/ml为基础，配制含不同浓度胆红素、尿素和尿酸的细胞外液。在U87细胞中转入GFAP探针，观察不同离子浓度细胞外液对细胞张力的影响并分析两者之间的相关性。
实施例3
三、人体血浆溶液或高钙Hanks液中，白蛋白和Ca2+、白蛋白和K+的双因素人体剂量改变对神经胶质细胞中间纤维张力(胞内渗透势能)的三维曲线关系
3.1细胞外液中ALB、Ca2+浓度同时改变诱导GFAP张力的变化
依据血浆中各离子及蛋白含量，配制不同浓度ALB的细胞外液，分为正常蛋白浓度组(50mg/ml)以及低蛋白浓度组(30mg/ml)。由于血浆中Ca2+浓度为2.5mM，我们在两组细胞外液中用CaCl2调节溶液中Ca2+浓度，使得终浓度为1.25mM、2.5mM和5mM。在U87细胞中转入GFAP探针，观察在两组不同蛋白质浓度的细胞外液中改变Ca2+浓度对细胞张力的影响并分析两组之间的显著性差异。
3.2细胞外液中ALB、K+浓度同时改变诱导GFAP张力的变化
依据血浆中各离子及蛋白含量，配制不同浓度ALB的细胞外液，分为正常蛋白浓度组(50mg/ml)以及低蛋白浓度组(30mg/ml)。由于血浆中K+浓度为4.3mM，我们在两组细胞外液中用KCl调节溶液中K+浓度，使得终浓度为2.15mM、4.3mM和8.6mM。在U87细胞中转入GFAP探针，观察在两组不同蛋白质浓度的细胞外液中改变K+浓度对细胞张力的影响并分析两组之间的显著性差异。
实施例4
人体血清白蛋白、钙和钾三者同时改变与神经胶质细胞中间纤维张力或跨膜渗透势能的量化关系。
设置两种蛋白质浓度血清模拟液，分别为30mg/ml(低于正常生理水平)和50mg/ml(正常生理水平)，改变Ca2+和K+在血浆中的平衡浓度(Ca2+为2.5mM，K+为4.3mM)。将这三种条件依次组合配制成混合细胞外液，作用于U87细胞，观察15min内细胞中IF张力的变化。实验结果表明，当细胞外液中Alb、Ca2+以及K+三者浓度同时改变时，依旧出现了两个“平衡点”。第一个“平衡点”时Alb浓度为50mg/ml、Ca2+浓度为1.25mM且K+浓度为2.15mM，第二个“平衡点”时Alb浓度为50mg/ml、Ca2+浓度为5mM且K+浓度为8.6mM，当溶液处于这两种组成状态时，细胞内IF张力保持不变，即细胞跨膜渗透势能为零。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，如应用其他中间纤维张力探针、冰点渗透压仪检测细胞内外渗透压和细胞容积检测方法检测细胞内外跨膜渗透压变化等相应变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术，其特征在于：检测生物体内液蛋白质的总量以及生物体内液中各种离子及小分子化合物的含量；依据各种离子和小分子化合物的含量以及蛋白纳米颗粒的数量，采用以荧光共振能量转移为原理的中间纤维荧光张力检测技术测定生物体内液跨膜渗透势能的数值变化，其方法包括以下步骤：
步骤一：获取生物体内液样本，以建立中间纤维荧光张力检测技术测定生物体细胞内外渗透势能差值变化的方法；
步骤二：利用具有足够分辨率的成像光对生物体内液样本进行光强度检测，确定其中蛋白质纳米颗粒数量；采用全自动生化光学检测仪，检测溶液中蛋白质、各种离子和小分子化合物含量；
步骤三：依据荧光共振能量转移原理，建立中间纤维荧光张力检测探针技术，采用荧光共振能量转移效率的倒数1 /E，评价细胞容积的变化，分析生物体内液的生物跨膜渗透势能变化；
步骤四：绘制蛋白纳米颗粒和至少一种离子或小分子化合物的组成，其浓度改变诱导细胞跨膜势能变化的多维曲线关系；
步骤五：依据上述建立的多维曲线关系，通过检测人体内液的蛋白纳米颗粒、离子和小分子化合物的组成变化，推测生物体内液的跨膜渗透势能变化；
其中，生物体内液是指含蛋白纳米颗粒的血浆、细胞间隙液、细胞质或细胞核提取液而并非代指所有的体内液；
蛋白质总量是指由生物体内液中蛋白纳米颗粒、蛋白颗粒聚合体的大小和数量计算得到的总和也并非所有蛋白质的总量；
中间纤维荧光张力检测技术是应用细胞荧光张力检测技术评价细胞内外渗透势能变化诱导中间纤维牵拉张力变化，并绘制跨膜渗透压改变与细胞中间纤维牵拉诱导的荧光共振能量转移效率的标准曲线关系，建立细胞跨膜渗透势能变化的光学评价曲线，评价细胞内中间纤维牵拉张力的光学变化与跨膜渗透势能改变的量化曲线关系。
2.根据权利要求1所述的生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术，其特征在于：所述的生物体内液的跨膜渗透势能是指生物体内液中的细胞内外渗透压差，是细胞受到细胞外渗透压刺激后的细胞渗透势能动态变化过程。
3.根据权利要求1所述的生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术，其特征在于：所述的多维曲线关系包括单因素变化对应关系、双因素变化对应关系、多因素变化对应关系。
4.根据权利要求1所述的生物体内液各组分调控蛋白纳米颗粒跨膜渗透压的量化分析技术，其特征在于：所述的多维曲线关系为二维曲线关系。
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