JP6772422B2 - 脂質膜非透過性指示薬 - Google Patents
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Description
本発明は、脂質膜非透過性の指示薬、特に、脂質膜非透過性の発光性の指示薬に関する。
生体を構成している細胞は、細胞膜によって外界と内部が区別されている。細胞膜上に存在する膜タンパク質は、細胞の内側と外側の間で物質輸送を行うトランスポーターとして、あるいは、外界からの情報を細胞内部へ伝達するための受容体として、様々な重要な役割を果たしている。受容体やトランスポーターなどの膜タンパク質の機能的な欠陥は、種々の疾患の原因となる場合がある。そのため、これらの膜タンパク質は、創薬における疾患治療のための薬剤標的としても有用であり、薬剤スクリーニングをハイスループットで行うことができるようなシステムおよび装置の開発が盛んに行われている。
生体内において、膜タンパク質は、細胞膜に組み込まれた状態でその機能を発揮する。従って、in vitroの系において膜タンパク質の活性を測定する場合にも、生体膜（脂質二重膜）に膜タンパク質を組み込んだ状態で行う必要がある。すなわち、人工的に脂質二重膜を再構成させ、その中に膜タンパク質が活性を発揮し得るように組み込んだ測定系を構築する必要がある。
これまでに、本発明者らは、脂質二重膜で液封された微小チャンバーをアレイ化した高密度チャンバーアレイを開発し、チャンバー内に存在する生体分子の反応を、１分子レベルで、高感度で検出できることを報告している（特許文献１、非特許文献１および非特許文献２）。
発明者らが開発した高密度微小チャンバーアレイの脂質二重膜に、例えば、プロトン駆動力を用いてATPを合成するATP合成酵素を埋め込み、その酵素活性を測定する場合には、チャンバー内の水溶液中に蛍光pH指示薬を添加しておくことで、チャンバー内のpHの変化を指示薬の蛍光変化として検出することができる。
以上のように、発明者らによって開発された高密度微小チャンバーは、トランスポーターなどの膜タンパク質の活性を、迅速、かつ、ハイスループットに検出することを可能にするため、創薬の分野において、重要な役割を果たすことが期待されている。
これまでに、本発明者らは、脂質二重膜で液封された微小チャンバーをアレイ化した高密度チャンバーアレイを開発し、チャンバー内に存在する生体分子の反応を、１分子レベルで、高感度で検出できることを報告している（特許文献１、非特許文献１および非特許文献２）。
発明者らが開発した高密度微小チャンバーアレイの脂質二重膜に、例えば、プロトン駆動力を用いてATPを合成するATP合成酵素を埋め込み、その酵素活性を測定する場合には、チャンバー内の水溶液中に蛍光pH指示薬を添加しておくことで、チャンバー内のpHの変化を指示薬の蛍光変化として検出することができる。
以上のように、発明者らによって開発された高密度微小チャンバーは、トランスポーターなどの膜タンパク質の活性を、迅速、かつ、ハイスループットに検出することを可能にするため、創薬の分野において、重要な役割を果たすことが期待されている。
ところで、上述の微小チャンバーのような測定系においては、脂質二重膜で封じられた水溶液内のイオン濃度などの変化を検出するために、様々な指示薬が利用されている。これらの指示薬の中でも、特に、発光性（蛍光、燐光などを発する特性）の指示薬は、発光の変化（例えば、蛍光強度など）を検出することで簡単に対象物質の活性を測定することが可能であり、また、視覚的にもその変化を観察することができるため、非常に有用である。
ただ、現在利用可能な発光性の指示薬は、疎水的なものが多く、脂質膜を容易に透過してしまうため、その多くは、上述の高密度微小チャンバーアレイにおける活性測定に利用することが困難であった。
さらに、このような指示薬の多くが疎水的なものであるという問題は、発明者らの高密微小チャンバーアレイのみならず、リポソームなどの様々な人工生体膜を利用した計測系においても共通した技術的な課題であった（非特許文献３）。
ただ、現在利用可能な発光性の指示薬は、疎水的なものが多く、脂質膜を容易に透過してしまうため、その多くは、上述の高密度微小チャンバーアレイにおける活性測定に利用することが困難であった。
さらに、このような指示薬の多くが疎水的なものであるという問題は、発明者らの高密微小チャンバーアレイのみならず、リポソームなどの様々な人工生体膜を利用した計測系においても共通した技術的な課題であった（非特許文献３）。
Watanabeら, Nature communications 5: 4519 Doi: 10.1038/ncomms5519
Sogaら, Scientific reports 5: 11025 Doi: 10.1038/srep11025
Guoら, Lab Chip., 2012, 12, 2146-2155
上記事情に鑑み、本発明者らは、既存の指示薬（特に、蛍光指示薬などのような発光性の指示薬）の膜透過性を抑制することを解決課題とし、鋭意研究を進めた。
すなわち、本発明は、脂質膜透過性を顕著に減少させた指示薬、特に、発光性の指示薬の提供を目的とする。
さらに、本発明は、当該指示薬の製造方法の提供を目的とする。
すなわち、本発明は、脂質膜透過性を顕著に減少させた指示薬、特に、発光性の指示薬の提供を目的とする。
さらに、本発明は、当該指示薬の製造方法の提供を目的とする。
発明者らは、核酸などの電荷を帯びたポリマー（高分子電解質）を既存の指示薬に結合させると、指示薬の脂質膜透過性が著しく減少することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）である。
（１）指示薬に高分子電解質を結合させた脂質膜非透過性指示薬。
（２）前記指示薬が、Ca2+濃度用指示薬、Cl-濃度用指示薬、pH指示薬、K+濃度用指示薬、Na+濃度用指示薬、Cu2+、Cu+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+およびNi2+などの重金属濃度用指示薬から選択されるいずれかであることを特徴とする上記（１）に記載の脂質膜非透過性指示薬。
（３）前記指示薬が、発光分子を含んで成ることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の脂質膜非透過性指示薬。
（４）前記発光分子が、Coelenterazine（セレンテラジン）およびその誘導体、Fluo-3およびその誘導体、Fura-2およびその誘導体、Cal520（登録商標）およびその誘導体、Indo-1およびその誘導体、Rhod-2およびその誘導体、MQAE（1-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide）およびその誘導体、Fluorescein（フルオレセイン）およびその誘導体、PBFI（Bis(Acetyloxymethyl)4-[6-[16-[2-[2,4-bis(acetyloxymethoxycarbonyl)phenyl]-5-methoxy-1-benzofuran-6-yl]-1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadec-7-yl]-5-methoxy-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,3-dicarboxylate）およびその誘導体、SBFI（Bis(acetyloxymethyl)4-[6-[13-[2-[2,4-bis(acetyloxymethoxycarbonyl)phenyl]-5-methoxy-1-benzofuran-6-yl]-1,4,10-trioxa-7,13-diazacyclopentadec-7-yl]-5-methoxy-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,3-dicarboxylate）およびその誘導体、PhenanGreenおよびその誘導体から選択されるいずれかであることを特徴とする上記（３）に記載の脂質膜非透過性指示薬。
（５）前記高分子電解質が、核酸および核酸誘導体、ペプチドおよびペプチド誘導体、環状ペプチド、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸から選択されるいずれかであることを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の脂質膜非透過性指示薬。
（６）前記核酸が、DNAまたはRNAであることを特徴とする上記（５）に記載の脂質非透過性指示薬。
（７）前記ペプチド、DNAおよびRNAが、アプタマーであることを特徴とする上記（５）または（６）に記載の脂質膜非透過性指示薬。
（８）指示薬と高分子電解質を結合させる工程を含む、脂質膜非透過性指示薬の製造方法。
（１）指示薬に高分子電解質を結合させた脂質膜非透過性指示薬。
（２）前記指示薬が、Ca2+濃度用指示薬、Cl-濃度用指示薬、pH指示薬、K+濃度用指示薬、Na+濃度用指示薬、Cu2+、Cu+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+およびNi2+などの重金属濃度用指示薬から選択されるいずれかであることを特徴とする上記（１）に記載の脂質膜非透過性指示薬。
（３）前記指示薬が、発光分子を含んで成ることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の脂質膜非透過性指示薬。
（４）前記発光分子が、Coelenterazine（セレンテラジン）およびその誘導体、Fluo-3およびその誘導体、Fura-2およびその誘導体、Cal520（登録商標）およびその誘導体、Indo-1およびその誘導体、Rhod-2およびその誘導体、MQAE（1-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide）およびその誘導体、Fluorescein（フルオレセイン）およびその誘導体、PBFI（Bis(Acetyloxymethyl)4-[6-[16-[2-[2,4-bis(acetyloxymethoxycarbonyl)phenyl]-5-methoxy-1-benzofuran-6-yl]-1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadec-7-yl]-5-methoxy-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,3-dicarboxylate）およびその誘導体、SBFI（Bis(acetyloxymethyl)4-[6-[13-[2-[2,4-bis(acetyloxymethoxycarbonyl)phenyl]-5-methoxy-1-benzofuran-6-yl]-1,4,10-trioxa-7,13-diazacyclopentadec-7-yl]-5-methoxy-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,3-dicarboxylate）およびその誘導体、PhenanGreenおよびその誘導体から選択されるいずれかであることを特徴とする上記（３）に記載の脂質膜非透過性指示薬。
（５）前記高分子電解質が、核酸および核酸誘導体、ペプチドおよびペプチド誘導体、環状ペプチド、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸から選択されるいずれかであることを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の脂質膜非透過性指示薬。
（６）前記核酸が、DNAまたはRNAであることを特徴とする上記（５）に記載の脂質非透過性指示薬。
（７）前記ペプチド、DNAおよびRNAが、アプタマーであることを特徴とする上記（５）または（６）に記載の脂質膜非透過性指示薬。
（８）指示薬と高分子電解質を結合させる工程を含む、脂質膜非透過性指示薬の製造方法。
本発明の指示薬は、脂質膜によって液封された計測系からの逸失が非常に少ないため、効率的な計測が可能になる。
また、本発明に係る指示薬の製造方法によれば、既存の様々な指示薬、特に、蛍光指示薬であって、脂質膜透過性であったものを有効に利用することができるため、指示薬自体の骨格を修正する必要がなく、迅速、かつ、安価に、脂質膜非透過性の指示薬を製造することができる。
本発明の第１の実施形態は、指示薬に高分子電解質を結合させた脂質膜非透過性指示薬である。
本発明の実施形態の対象である「脂質膜非透過性指示薬」とは、脂質で形成される膜状の物質（一重膜、二重膜のいずれも含み、例えば、生体膜を形成している脂質二重膜など）を透過（または通過）しない指示薬のことである。
ここで、「指示薬」とは、測定対象である水溶液の組成または構成成分の変動を検出するために使用される物質、あるいは、試薬のことである。指示薬は、通常、その物理化学的状態が変化し、検出可能な信号を発する分子もしくは化合物、あるいは、これらの分子もしくは化合物をその一部に含む化合物から構成される。指示薬の検出対象は、特に限定はしないが、例えば、溶液のH+濃度、Ca2+濃度、Na+濃度、K+濃度、Cl-濃度、糖の濃度、タンパク質濃度、温度、密度、電位などを挙げることができる。本明細書のおける指示薬は、特に限定はしないが、例えば、光を発する発光（ルミネッセンス；蛍光および燐光など）分子からなる指示薬、ラマンスペクトルなどの特徴的なスペクトルを発するアルキンなどからなる指示薬などを挙げることができる。特に、発光分子からなる指示薬としては、例えば、Coelenterazine（セレンテラジン）およびその誘導体、Fluo-3およびその誘導体、Fura-2およびその誘導体、Cal520（登録商標）およびその誘導体、Indo-1およびその誘導体、Rhod-2およびその誘導体（以上、Ca2+濃度用指示薬）、MQAE（1-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide）およびその誘導体（Cl-濃度用指示薬）、Fluorescein（フルオレセイン）およびその誘導体（H+濃度用指示薬（pH指示薬））、PBFI（Bis(Acetyloxymethyl)4-[6-[16-[2-[2,4-bis(acetyloxymethoxycarbonyl)phenyl]-5-methoxy-1-benzofuran-6-yl]-1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadec-7-yl]-5-methoxy-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,3-dicarboxylate）およびその誘導体（K+濃度用指示薬）、SBFI（Bis(acetyloxymethyl)4-[6-[13-[2-[2,4-bis(acetyloxymethoxycarbonyl)phenyl]-5-methoxy-1-benzofuran-6-yl]-1,4,10-trioxa-7,13-diazacyclopentadec-7-yl]-5-methoxy-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,3-dicarboxylate）およびその誘導体（Na+濃度用指示薬）、PhenanGreenおよびその誘導体（Cu2+、Cu+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+およびNi2+などの重金属濃度用指示薬）などを挙げることができる。
また、特定の分子（例えば、タンパク質など）を標識することで、当該特定の分子の溶液中における濃度変化をモニターすることができる発光分子（蛍光色素など）なども、「指示薬」の中に含まれる
指示薬は、前掲のもの以外にも、多種多様なものが市販されているので、市販品を購入して、使用することが可能である。
本発明の実施形態の対象である「脂質膜非透過性指示薬」とは、脂質で形成される膜状の物質（一重膜、二重膜のいずれも含み、例えば、生体膜を形成している脂質二重膜など）を透過（または通過）しない指示薬のことである。
ここで、「指示薬」とは、測定対象である水溶液の組成または構成成分の変動を検出するために使用される物質、あるいは、試薬のことである。指示薬は、通常、その物理化学的状態が変化し、検出可能な信号を発する分子もしくは化合物、あるいは、これらの分子もしくは化合物をその一部に含む化合物から構成される。指示薬の検出対象は、特に限定はしないが、例えば、溶液のH+濃度、Ca2+濃度、Na+濃度、K+濃度、Cl-濃度、糖の濃度、タンパク質濃度、温度、密度、電位などを挙げることができる。本明細書のおける指示薬は、特に限定はしないが、例えば、光を発する発光（ルミネッセンス；蛍光および燐光など）分子からなる指示薬、ラマンスペクトルなどの特徴的なスペクトルを発するアルキンなどからなる指示薬などを挙げることができる。特に、発光分子からなる指示薬としては、例えば、Coelenterazine（セレンテラジン）およびその誘導体、Fluo-3およびその誘導体、Fura-2およびその誘導体、Cal520（登録商標）およびその誘導体、Indo-1およびその誘導体、Rhod-2およびその誘導体（以上、Ca2+濃度用指示薬）、MQAE（1-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide）およびその誘導体（Cl-濃度用指示薬）、Fluorescein（フルオレセイン）およびその誘導体（H+濃度用指示薬（pH指示薬））、PBFI（Bis(Acetyloxymethyl)4-[6-[16-[2-[2,4-bis(acetyloxymethoxycarbonyl)phenyl]-5-methoxy-1-benzofuran-6-yl]-1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadec-7-yl]-5-methoxy-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,3-dicarboxylate）およびその誘導体（K+濃度用指示薬）、SBFI（Bis(acetyloxymethyl)4-[6-[13-[2-[2,4-bis(acetyloxymethoxycarbonyl)phenyl]-5-methoxy-1-benzofuran-6-yl]-1,4,10-trioxa-7,13-diazacyclopentadec-7-yl]-5-methoxy-1-benzofuran-2-yl]benzene-1,3-dicarboxylate）およびその誘導体（Na+濃度用指示薬）、PhenanGreenおよびその誘導体（Cu2+、Cu+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+およびNi2+などの重金属濃度用指示薬）などを挙げることができる。
また、特定の分子（例えば、タンパク質など）を標識することで、当該特定の分子の溶液中における濃度変化をモニターすることができる発光分子（蛍光色素など）なども、「指示薬」の中に含まれる
指示薬は、前掲のもの以外にも、多種多様なものが市販されているので、市販品を購入して、使用することが可能である。
また、本明細書中、「高分子電解質」とは、荷電高分子と同義であり、水溶液中において正または負のいずれかに荷電している高分子のことである。ここで、限定はしないが、高分子電解質として、例えば、核酸および核酸誘導体、電荷を帯びたペプチド（例えば、ポリリジン、ポリアルギニンなど）およびペプチド誘導体、電荷を帯びた環状ペプチド、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸などを例示することができる。特に、特定のタンパク質に結合するアプタマー（例えば、RNAアプタマー、DNAアプタマー、ペプチドアプタマーなど）を高分子電解質として用いた場合には、例えば、疎水性蛍光分子などを指示薬としてアプタマーに結合させ、溶液中の蛍光強度の変化をモニターすることで、溶液中に含まれる当該タンパク質の濃度変化を検出することができる。
高分子電解質の長さ（あるいは、大きさ）は特に限定はされず、水溶液中に安定して溶解された状態を維持できるものであれば、いかなる長さであってもよい。高分子電解質として核酸を使用する場合、その長さは、例えば、１０塩基〜１５０塩基、好ましくは、１５塩基〜１００塩基、より好ましくは、２０塩基〜１００塩基程度である。核酸としてDNAを使用する場合、一本鎖であっても、二本鎖であっても、いずれも使用可能である。また、核酸以外の高分子電解質を使用する場合も、その形状は特に限定されない。
高分子電解質は、常法により調製してもよく、あるいは、市販品を購入してもよい。特に、高分子電解質として核酸やオリゴペプチドを用いる場合には、所望の長さの核酸またはオリゴペプチドの調製を専門業者等に委託して調製してもよい。
高分子電解質の長さ（あるいは、大きさ）は特に限定はされず、水溶液中に安定して溶解された状態を維持できるものであれば、いかなる長さであってもよい。高分子電解質として核酸を使用する場合、その長さは、例えば、１０塩基〜１５０塩基、好ましくは、１５塩基〜１００塩基、より好ましくは、２０塩基〜１００塩基程度である。核酸としてDNAを使用する場合、一本鎖であっても、二本鎖であっても、いずれも使用可能である。また、核酸以外の高分子電解質を使用する場合も、その形状は特に限定されない。
高分子電解質は、常法により調製してもよく、あるいは、市販品を購入してもよい。特に、高分子電解質として核酸やオリゴペプチドを用いる場合には、所望の長さの核酸またはオリゴペプチドの調製を専門業者等に委託して調製してもよい。
本発明の他の実施形態は、指示薬と高分子電解質を結合させる工程を含む、脂質膜非透過性指示薬の製造方法である。
指示薬と高分子電解質との結合は、当該技術分野において周知の方法に従って行うことができる。例えば、指示薬に含まれるNHS（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）とＤＮＡやペプチド等のアミノ基を反応させて、指示薬とＤＮＡを結合させる方法の他、指示薬に含まれるマレイミド基とＤＮＡやペプチド等のチオール基を反応させて、指示薬とＤＮＡを結合させる方法などを挙げることができる。なお、NHS基やマレイミド基は、指示薬を構成する分子中に、元々含まれていてもよく、あるいは、該分子に導入してもよい。
指示薬と高分子電解質を結合させるときの反応条件は、用いる指示薬および高分子電解質に含まれる反応基に適した条件を採用することができる。例えば、NHS基を含むFluoresceinとDNAを結合させる場合には、FluoresceinとDNAを混合し、室温等において、攪拌しながら、数時間反応させてもよい。指示薬と高分子電解質との結合物は、結合反応の終了後、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどにより、未結合の物質と結合物とを容易に分離することができる。
指示薬と高分子電解質との結合は、当該技術分野において周知の方法に従って行うことができる。例えば、指示薬に含まれるNHS（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）とＤＮＡやペプチド等のアミノ基を反応させて、指示薬とＤＮＡを結合させる方法の他、指示薬に含まれるマレイミド基とＤＮＡやペプチド等のチオール基を反応させて、指示薬とＤＮＡを結合させる方法などを挙げることができる。なお、NHS基やマレイミド基は、指示薬を構成する分子中に、元々含まれていてもよく、あるいは、該分子に導入してもよい。
指示薬と高分子電解質を結合させるときの反応条件は、用いる指示薬および高分子電解質に含まれる反応基に適した条件を採用することができる。例えば、NHS基を含むFluoresceinとDNAを結合させる場合には、FluoresceinとDNAを混合し、室温等において、攪拌しながら、数時間反応させてもよい。指示薬と高分子電解質との結合物は、結合反応の終了後、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどにより、未結合の物質と結合物とを容易に分離することができる。
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
以下の実施例においては、本発明者らによって開発された高密度微小チャンバーアレイを使用して測定を行った。高密度微小チャンバーアレイの作製方法については、前掲の特許文献１、非特許文献１および非特許文献２を参照のこと（特開2015-40754、Watanabeら, Nature communications 5: 4519 Doi: 10.1038/ncomms5519およびSogaら, Scientific reports 5: 11025 Doi: 10.1038/srep11025を参照のこと。これら３文献は、参照として本明細書に取り込む）。
１．FluoresceinにDNAを結合させた脂質膜非透過性指示薬
１−１．FluoresceinにDNAを結合させた脂質膜非透過性指示薬の調製
指示薬としてFluoresceinを、高分子電解質として一本鎖DNAを用いて、脂質膜非透過性指示薬を作製した。
一本鎖DNAはG（グアニン）が２０個結合しDNAの５’末端にアミノ基が修飾されたものを、常法に従い固相合成法により調製し、当該一本鎖DNAとNHS-Fluoresceinを用いて反応を行わせた（Hokkaido system science）。反応物を、200μMとなるように100 mM HEPES pH8に溶解し、一本鎖DNAとFluoresceinの結合物（Fluorescein-DNA指示薬）を調製した。
１−１．FluoresceinにDNAを結合させた脂質膜非透過性指示薬の調製
指示薬としてFluoresceinを、高分子電解質として一本鎖DNAを用いて、脂質膜非透過性指示薬を作製した。
一本鎖DNAはG（グアニン）が２０個結合しDNAの５’末端にアミノ基が修飾されたものを、常法に従い固相合成法により調製し、当該一本鎖DNAとNHS-Fluoresceinを用いて反応を行わせた（Hokkaido system science）。反応物を、200μMとなるように100 mM HEPES pH8に溶解し、一本鎖DNAとFluoresceinの結合物（Fluorescein-DNA指示薬）を調製した。
１−２．Fluorescein-DNA指示薬の膜透過性の検討
Fluorescein-DNA指示薬の膜透過性について検討した。
最終濃度10μMのFluorescein-DNA指示薬を含む50 mM HEPES pH7の水溶液を微小チャンバーに封入し、チャンバー内の蛍光強度を経時的に測定した(図１Ａ)。
その結果、DNAを結合させていないFluoresceinのみを使用した場合、その蛍光強度はすぐに低下したのに対し、Fluorescein-DNAを使用した場合は、時間経過による蛍光強度の低下はほとんど見られなかった（図１Ｂ）。
従って、Fluorescein-DNA指示薬は、脂質膜を透過せずにチャンバー内に留まり、チャンバー内のｐＨ変化を有効に検出することが可能である。
Fluorescein-DNA指示薬の膜透過性について検討した。
最終濃度10μMのFluorescein-DNA指示薬を含む50 mM HEPES pH7の水溶液を微小チャンバーに封入し、チャンバー内の蛍光強度を経時的に測定した(図１Ａ)。
その結果、DNAを結合させていないFluoresceinのみを使用した場合、その蛍光強度はすぐに低下したのに対し、Fluorescein-DNAを使用した場合は、時間経過による蛍光強度の低下はほとんど見られなかった（図１Ｂ）。
従って、Fluorescein-DNA指示薬は、脂質膜を透過せずにチャンバー内に留まり、チャンバー内のｐＨ変化を有効に検出することが可能である。
１−３．FluoresceinにDNAを結合させた脂質膜非透過性指示薬の検量線
１−１で調製したFluorescein-DNA指示薬はｐＨ指示薬として使用できる。そこで、Fluorescein-DNA指示薬の検量線を作成した。
脂質二重膜で封じられた微小チャンバー内には、pHにより、以下の異なる組成の水溶液を封入した。
・pH9.0；50 mM Tricine, 1 M sucrose, 1 mM CaCl2
・pH8.0 ; 50 mM Tricine, 1 M sucrose, 1 mM CaCl2
・pH7.0；50 mM HEPES, 1 M sucrose, 1 mM CaCl2
・pH6.0；50 mM MES, 1 M sucrose, 1 mM CaCl2
上記各組成の水溶液にFluorescein-DNA指示薬を、最終濃度10μMとなるように添加した。
各pH条件下の微小チャンバーから得られる蛍光を、共焦点顕微鏡（Nikon, A1R+）により検出し、検量線を作成した（図２）。
１−１で調製したFluorescein-DNA指示薬はｐＨ指示薬として使用できる。そこで、Fluorescein-DNA指示薬の検量線を作成した。
脂質二重膜で封じられた微小チャンバー内には、pHにより、以下の異なる組成の水溶液を封入した。
・pH9.0；50 mM Tricine, 1 M sucrose, 1 mM CaCl2
・pH8.0 ; 50 mM Tricine, 1 M sucrose, 1 mM CaCl2
・pH7.0；50 mM HEPES, 1 M sucrose, 1 mM CaCl2
・pH6.0；50 mM MES, 1 M sucrose, 1 mM CaCl2
上記各組成の水溶液にFluorescein-DNA指示薬を、最終濃度10μMとなるように添加した。
各pH条件下の微小チャンバーから得られる蛍光を、共焦点顕微鏡（Nikon, A1R+）により検出し、検量線を作成した（図２）。
１−４．Fluorescein-DNA指示薬によるPOTの活性測定
Fluorescein-DNA指示薬を用いて、プロトン共役型のオリゴペプチド輸送体（POT; proton-coupled oligopeptide transporter）の活性を以下のようにして測定した。
高密度微小チャンバーアレイ（特許文献１、非特許文献１および２）を用いて脂質二重膜を再構成した後、その中にPOTを埋め込んだ。微小チャンバー内には最終濃度10μMのFluorescein-DNA指示薬を含む50 mM HEPES pH8、100 mM sucroseの水溶液を封入しておいた。その後、外部の溶液を50 mM HEPES pH7、100 mM sucroseの水溶液へ溶液交換する事で脂質二重膜を介したH+濃度差を形成し、測定を開始した。
その結果、POTを組み込ませた場合、その蛍光強度は時間経過に伴い減少したのに対し、POTを組み込ませなかった場合は、時間経過による蛍光強度の低下はほとんどみられなかった（図３Ｂ）。各pH条件下で作成したFluorescein-DNA指示薬の検量線（図２）に基づいた解析により、微小チャンバー内のH+濃度がPOT のH+輸送により上昇する事が検出できた（図３Ｃ）。
以上の結果から、Fluorescein-DNA指示薬は、脂質膜を透過せずにチャンバー内に留まり、有効にH+輸送を高感度に検出できることが分かった。
Fluorescein-DNA指示薬を用いて、プロトン共役型のオリゴペプチド輸送体（POT; proton-coupled oligopeptide transporter）の活性を以下のようにして測定した。
高密度微小チャンバーアレイ（特許文献１、非特許文献１および２）を用いて脂質二重膜を再構成した後、その中にPOTを埋め込んだ。微小チャンバー内には最終濃度10μMのFluorescein-DNA指示薬を含む50 mM HEPES pH8、100 mM sucroseの水溶液を封入しておいた。その後、外部の溶液を50 mM HEPES pH7、100 mM sucroseの水溶液へ溶液交換する事で脂質二重膜を介したH+濃度差を形成し、測定を開始した。
その結果、POTを組み込ませた場合、その蛍光強度は時間経過に伴い減少したのに対し、POTを組み込ませなかった場合は、時間経過による蛍光強度の低下はほとんどみられなかった（図３Ｂ）。各pH条件下で作成したFluorescein-DNA指示薬の検量線（図２）に基づいた解析により、微小チャンバー内のH+濃度がPOT のH+輸送により上昇する事が検出できた（図３Ｃ）。
以上の結果から、Fluorescein-DNA指示薬は、脂質膜を透過せずにチャンバー内に留まり、有効にH+輸送を高感度に検出できることが分かった。
２．Cal520（登録商標）にDNAを結合させた脂質膜非透過性指示薬
２−１．Cal520にDNAを結合させた脂質膜非透過性指示薬の調製
指示薬としてCal520を、高分子電解質として一本鎖DNAを用いて、脂質膜非透過性指示薬を作製した。
一本鎖DNAは上記１の実施例で使用したものを用いた。Cal520は、AAT Bioquestから購入した。
100 mM HEPES pH8 に溶解させたCal520溶液と、超純水に溶解させた一本鎖DNA溶液を、各々、最終濃度200μMとなるようにエッペンドルフチューブに添加し、回転撹拌機で撹拌しながら、室温で７時間放置して反応を行わせた。その後、反応液をゲル濾過カラム（GE healthcare, NAP-10）に通して、未結合のCal520とDNAを除去し、一本鎖DNAとCal520の結合物（Cal520-DNA指示薬）を精製した。
２−１．Cal520にDNAを結合させた脂質膜非透過性指示薬の調製
指示薬としてCal520を、高分子電解質として一本鎖DNAを用いて、脂質膜非透過性指示薬を作製した。
一本鎖DNAは上記１の実施例で使用したものを用いた。Cal520は、AAT Bioquestから購入した。
100 mM HEPES pH8 に溶解させたCal520溶液と、超純水に溶解させた一本鎖DNA溶液を、各々、最終濃度200μMとなるようにエッペンドルフチューブに添加し、回転撹拌機で撹拌しながら、室温で７時間放置して反応を行わせた。その後、反応液をゲル濾過カラム（GE healthcare, NAP-10）に通して、未結合のCal520とDNAを除去し、一本鎖DNAとCal520の結合物（Cal520-DNA指示薬）を精製した。
２−２．Cal520-DNA指示薬の膜透過性の検討
Cal520-DNA指示薬の膜透過性について検討した。
最終濃度1.6 mMのCal520-DNA指示薬を含む50 mM MES pH6.5、100 mM sucroseの水溶液を微小チャンバーに封入し、チャンバー内の蛍光強度を経時的に測定した。
その結果、DNAを結合させていないCal520のナトリウム塩を使用した場合、その蛍光強度はすぐに低下したのに対し、Cal520-DNAを使用した場合は、時間経過による蛍光強度の低下はほとんど見られなかった（図４Ａ）。
従って、Cal520-DNA指示薬は、脂質膜を透過せずにチャンバー内に留まり、チャンバー内のCa2+濃度変化を有効に検出することが可能である。
Cal520-DNA指示薬の膜透過性について検討した。
最終濃度1.6 mMのCal520-DNA指示薬を含む50 mM MES pH6.5、100 mM sucroseの水溶液を微小チャンバーに封入し、チャンバー内の蛍光強度を経時的に測定した。
その結果、DNAを結合させていないCal520のナトリウム塩を使用した場合、その蛍光強度はすぐに低下したのに対し、Cal520-DNAを使用した場合は、時間経過による蛍光強度の低下はほとんど見られなかった（図４Ａ）。
従って、Cal520-DNA指示薬は、脂質膜を透過せずにチャンバー内に留まり、チャンバー内のCa2+濃度変化を有効に検出することが可能である。
２−３．Cal520にDNAを結合させた脂質膜非透過性指示薬の検量線
２−１で調製したCal520−DNA指示薬は、Ca2+濃度用指示薬として使用できる。そこで、Cal520−DNA指示薬の検量線を作成した。
脂質二重膜で封じられた微小チャンバー内には、Ca2+濃度により、以下の組成の水溶液を封入した。
・50 mM Tricine pH8, 100 mM sucrose, 100 mM CaCl2
・50 mM Tricine pH8, 100 mM sucrose, 10 mM CaCl2
・50 mM Tricine pH8, 100 mM sucrose, 1 mM CaCl2
・50 mM Tricine pH8, 100 mM sucrose, 100 nM CaCl2
上記各組成の水溶液にCal520−DNA指示薬を、最終濃度1.6 mMとなるように添加した。
微小チャンバーからの蛍光を上記１−３と同様に検出し、検量線を作成した（図４Ｂ）。
２−１で調製したCal520−DNA指示薬は、Ca2+濃度用指示薬として使用できる。そこで、Cal520−DNA指示薬の検量線を作成した。
脂質二重膜で封じられた微小チャンバー内には、Ca2+濃度により、以下の組成の水溶液を封入した。
・50 mM Tricine pH8, 100 mM sucrose, 100 mM CaCl2
・50 mM Tricine pH8, 100 mM sucrose, 10 mM CaCl2
・50 mM Tricine pH8, 100 mM sucrose, 1 mM CaCl2
・50 mM Tricine pH8, 100 mM sucrose, 100 nM CaCl2
上記各組成の水溶液にCal520−DNA指示薬を、最終濃度1.6 mMとなるように添加した。
微小チャンバーからの蛍光を上記１−３と同様に検出し、検量線を作成した（図４Ｂ）。
本発明は、脂質膜非透過性の指示薬を提供する。本発明の脂質膜非透過性指示薬は、既存の指示薬に高分子電解質を結合することで、容易に作成することが可能であるため、膜タンパク質の機能解析などの分野において、その活性を測定する上で、非常に有用な技術として利用が期待される。
Claims (6)
- 発光分子を含んで成る指示薬（ただし、アルカリ金属イオン用指示薬を除く）に、核酸または核酸誘導体を結合させた脂質膜非透過性指示薬。
- 前記発光分子を含んで成る指示薬が、Ca2+濃度用指示薬、Cl-濃度用指示薬、pH指示薬、Cu 2+ 濃度用指示薬、Cu + 濃度用指示薬、Fe 2+ 濃度用指示薬、Hg 2+ 濃度用指示薬、Pb 2+ 濃度用指示薬、Cd 2+ 濃度用指示薬、Zn 2+ 濃度用指示薬およびNi 2+ 濃度用指示薬から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の脂質膜非透過性指示薬。
- 前記発光分子が、Coelenterazine（セレンテラジン）およびその誘導体、Fluo-3およびその誘導体、Fura-2およびその誘導体、Cal520（登録商標）およびその誘導体、Indo-1およびその誘導体、Rhod-2およびその誘導体、MQAE（1-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide）およびその誘導体、Fluorescein（フルオレセイン）およびその誘導体、PhenanGreenおよびその誘導体から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１または２に記載の脂質膜非透過性指示薬。
- 前記核酸が、DNAまたはRNAであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の脂質非透過性指示薬。
- 前記DNAおよびRNAがアプタマーであることを特徴とする請求項４に記載の脂質膜非透過性指示薬。
- 発光分子を含んで成る指示薬（ただし、アルカリ金属イオン用指示薬を除く）と核酸または核酸誘導体を結合させる工程を含む、脂質膜非透過性指示薬の製造方法。
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