KR101041764B1 - 마이크로파 조사에 의한 생체 조직의 처리 방법 - Google Patents

Abstract

동물 유래의 생체 조직으로부터 도너 세포를 제거 또는 고정화하는 처리를 효과적으로 달성하는 방법은 처리액 속에 침지된 동물 유래의 생체 조직에 대하여, 0℃∼40℃ 의 온도를 유지하면서 마이크로파를 조사하는 것을 포함한다.

마이크로파, 생체 조직, 도너 세포.

Description

마이크로파 조사에 의한 생체 조직의 처리 방법 {METHOD OF TREATING BIOLOGICAL TISSUE BY MICROWAVE-IRRADIATION}

본 발명은 재생 의료, 즉 정상적으로 기능하지 않는 환자 자신의 기관이나 조직을 대체하여 이식하여, 정상적인 기능을 회복시키는 의료 기술의 분야에 관한 것이다. 상세하게는 동물 유래의 생체 조직으로부터 세포 성분을 제거하거나, 또는 전형적으로는 글루타르알데히드인 고정제를 사용하여 조직을 고정함으로써 이식용 조직편을 제작하는 방법에 관한 것이다.

생체 조직을 글루타르알데히드와 같은 고정제에 의해서 화학 처리함으로써, 또는 생체 조직으로부터 세포 성분을 제거함으로써 이식용 조직편이 제작되어, 널리 임상 응용되고 있다. 예를 들어 심장 밸브 치환술에 있어서, 이종 생체밸브는 돼지 심장 밸브 또는 소 심막을 면역원성의 저하를 위하여 글루타르알데히드로 고정화한 것이다. 이 이종 생체 밸브는 항응고성이 우수하기는 하나, 약년자에서는 5∼10년 정도의 내구성밖에 없어, 통상은 60세 이상의 고령자에게 적용하게 된다. 유럽과 미국에서는 1985년 경부터, 일본에서도 최근, 동결 보존에 의한 조직 은행이 정비됨으로써, 사체로부터 제공된 동결 보존 동종 밸브가 임상에서 사용되고 있다. 이 동종 밸브는 기계 밸브에 비하여 항혈전성 면에서, 이종 생체 밸브에 비하여 내구성 면에서, 그리고 항감염성 면에서 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나, 제공되는 개수가 절대적으로 부족하다는 것이 큰 문제이다. 또한, 약년자에서는 비교적 조기에 기능 부전을 가져오는 증례도 보고되고 있어, 면역 반응의 관여가 강하게 시사되고 있다. 약년자에게 유효한 것으로 알려진 Ross 수술에서는 자기 폐동맥 밸브를 대동맥 밸브 위치에 치환 이식하여, 결손된 폐동맥 밸브를 동결 보존 동종 밸브에 의해서 재건하는데, 대동맥 밸브 위치에 이식된 자기 폐동맥 밸브는 환자의 성장과 함께 증대된다는 특징이 있다. 이에 비하여, 기계 밸브나 이종 생체 밸브는 물론, 동결 보존 동종 밸브에서도 성장성을 갖지 않기 때문에, 소아 환자의 경우에는 재이식해야 하는 경우가 적지 않다. 최근, 이들 문제를 해결하기 위해서, 동종 밸브로부터 도너 유래 세포를 제거하여 항원성의 감약에 의해서 면역 반응의 관여를 저하시킴으로써, 내구성 및 자기화를 향상시키는 연구 보고가 이루어져 왔다. 미국 Cryo Life 사는 SynerGraft 라고 불리는 약액 처리에 의한 세포 제거 방법을 발표하였는데, 이식 후 수개월 사이에 자기 세포가 조직 내에 침윤하여 자기 조직화된다고 보고하고 있다. 또한, 독일 하노버 의과 대학의 Haverich 등의 그룹은 계면 활성제인 Triton X-100 이나 단백 분해 효소인 트립신 용액을 세포 제거에 사용하고 있다. 그러나, 종래의 계면 활성제 또는 약액만 이용하는 세정 공정만으로는, 조직편 내부의 세포 성분 및 세균이나 바이러스의 제거는 약액 표면으로부터의 확산 및 침투를 이용하기 때문에, 충분하지 않다. 또한, 이러한 제약 때문에, 대형 조직편의 처리에 관해서는 완전한 세포 제거나 세균, 바이러스 제거가 곤란하였다. 또한, 화학 처리에 의한 경우에서는 충분한 효과를 얻기 위해서는 처리의 정도를 높일 필요가 있고, 이 때문에 이식 후 석회화 (post-graft calcification)나 처리 시약의 제거 등과 같은 문제가 생긴다. 또한, 경막 이식에 있어서의 BSE 및 CJD 의 감염을 통해 밝혀진 바와 같이, 이식 조직의 안전성 확보는 매우 중요하지만, 현재의 화학 약액 처리에 있어서는 조직 내의 바이러스를 완전히 비활성화시킬 수 있다는 보증이 얻어져 있지 않다. 또한, 처리 과정에서의 오염으로 인해서, 이식용 조직을 통해 감염된 사고도 종종 발생하고 있다.

또한, 세포 성분을 제거한 이종 또는 동종의 이식용 조직편은, 이것에 환자 자신의 세포를 파종하고, 세포편 내에서 자가 세포를 증식시켜, 하이브리드 재생 조직으로서 이식하기 위해서도 이용된다.

발명의 개시

본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 개선하는 데에 있다. 즉, 우선 첫째, 약액 처리에서는 달성할 수 없는 대형 조직 내부의 세포 성분 및 세포나 바이러스의 제거를 달성하는 것, 둘째, 처리 조직의 생체 역학 특성을 손상시키지 않고 처리하는 것, 셋째, 간편하게 또한 단시간에 처리하는 것이다.

본 발명은 처리액 속에 침지된 동물 유래의 생체 조직에 대하여, 0℃∼40℃ 의 온도를 유지하면서 마이크로파를 조사하는 것을 특징으로 하는 생체 조직의 처리 방법을 제공한다.

도 1 은 본 발명을 실시하기 위한 장치의 일례를 나타내는 개략도이다.

도 2 는 돼지 심장 밸브 조직의 조직 단면 사진이다. 좌측이 종래법에 의한 처리, 우측이 마이크로파 조사를 병용한 본 발명에 의한 처리를 나타낸다. 종래의 처리에서는 조직 심부 (사진의 좌측 아래) 내에서는 세포핵의 잔존이 관찰된다.

도 3 은 트리톤 X-100 으로 세포 제거한 돼지 심장 밸브로부터의 트리톤 X-100 의 제거 효율을 나타내는 그래프이다. 마이크로파 조사에 의한 본 발명 방법에서는 종래법의 약 10분의 1의 시간으로 트리톤 X-100 을 제거할 수 있었다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 방법은 생체 조직으로부터 세포 성분을 제거하여 이식용 조직편을 제작하는 처리에 적용할 수 있다. 이 경우에는 처리액으로서 물, 고장액, 저장액, 계면 활성제 용액, 효소액, 액체배지, 또는 적은 비율의 유기 용매를 함유하고 있는 이들의 액체가 사용된다.

본 발명의 방법을 조직을 고정하여, 이식용 조직편을 제작하는 처리에 적용하는 경우에는 글루타르알데히드와 같은 화학적 고정제의 용액을 사용한다.

어느 처리나, 마이크로파를 조사하지 않는 종래의 방법에서는, 처리액은 시료 표면으로부터의 확산 및 침투에 의해서 전체적으로 고루 퍼지기 때문에, 장시간의 처리가 필요하고, 그 사이에 시료의 오염 등의 위험도 있었다. 마이크로파의 조사는 처리액이 조직 심부까지 침투에 요하는 시간을 기존의 약 10분의 1로 단 축할 수 있으므로, 처리 효율을 대폭 향상시킬 수 있고, 그 사이의 시료의 오염 등을 방지할 수 있다. 또한, 조직으로부터 세포를 제거하여 이식편을 제작하는 경우, 기존의 방법에서는 불가능 내지 곤란하였던 조직 심부로부터의 세포핵의 제거를 단시간에 달성할 수 있게 된다.

마이크로파 처리는 병리 조직학 분야에서, 조직의 고정, 뼈의 탈회, 탈지, 면역 조직 화학 등에 응용되고 있다. 그러나, 마이크로파 조사를 이식용 조직편의 제작에 적용한 사례는 없다. 본 발명의 새로운 생물 유래 조직의 처리법에서는 마이크로파를 투과하는 유리 또는 플라스틱제의 시료 용기 내에 처리 시료를 넣고, 세포 제거 처리에 있어서는 계면 활성제나 저조액, 고조액 등의 처리액을, 세포 고정 처리에 있어서는 글루타르알데히드 등의 화학 고정액을, 시료가 완전히 잠기도록 붓는다. 처리 시료의 온도를 0∼40℃ 내로 컨트롤하면서 마이크로파를 조사하는데, 일반적으로 마이크로파를 조사하면 시료 온도가 상승하기 때문에, 장시간 마이크로파를 조사하기 위해서는 시료를 냉각시켜야 한다. 이를 위해서는 예를 들어 시판 중인 마이크로 웨이브 신속 시료 처리 장치의 사용이 유효하다. 이 장치를, 마이크로파를 조사하기 위한 전자 레인지 오븐 내의 시료 용기 주위에, 전자 레인지 외부의 냉각 장치에 의해서 냉각된 부동액을 순환시키도록 개조하여 사용한다. 시료 용기 내에 온도 센서를 설치하고, 냉각 장치 및 마이크로파 조사 시간을 간헐적으로 제어함으로써, 마이크로파 조사시의 시료 온도를 0∼40℃ 로 컨트롤할 수 있다. 병리 조직학 분야와 달리, 이식용 생체 조직의 경우에는 생체 역학 특성을 변화시키지 않기 위해서, 구성 매트릭스의 변성을 막을 필요가 있어, 마이크로파 조사시에 있어서 온도가 빙점 이하나 40℃ 이상이 되는 것을 피해야 한다.

도 1 은 본 발명을 실시하기 위한 장치의 일례를 나타내는 개략도이다. 장치는 마그네트론 (12) 을 구비한 전자 레인지 오븐 (1) 으로 이루어진다. 오븐 내부에는 냉각용 부동액 (21) 을 수용한 냉각조 (2) 가 설치되어 있고, 냉각조 (2) 의 거의 중앙에 시료 용기 (3) 가 놓여진다. 시료 용기 (3) 는 처리액으로 채워지고, 그 속에 시료 즉 처리하고자 하는 생체 조직 (4) 이 침지된다. 냉각조 (2) 및 시료 용기 (3) 는 유리나 플라스틱 예를 들어 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등의 마이크로파를 투과하는 재질로 만들어진다. 앞서 기술한 것처럼 마이크로파의 조사는 처리액 (31) 따라서 시료 (4) 를 가열하여 시료의 구성 매트릭스를 불가역적으로 열변성시키므로, 냉각조 (2) 내의 냉각액 (31) 을 오븐 (1) 밖에 설치한 냉각 장치 (7) 와 냉각조 (2) 의 사이를 도관 (5, 6) 을 통해 순환시킬 필요가 있다. 그래서 냉각조 (21) 에서 데워진 냉각액 (21) 은 도관 (6) 을 통해 냉각 장치의 열교환기 (72) 로 반환되고, 다시 냉각된 후 도관 (5) 을 통해 냉각조 (21) 로 펌프 (71) 에 의해서 되돌려진다. 조 (21) 내의 냉각액의 온도를 센서 (11) 에 의해서 감지하고, 그 온도가 0℃∼40℃ 의 범위 내의 일정 온도 예를 들어 20℃ 로 유지되도록, 컨트롤러 (13) 에 의해서 마그네트론 (12) 의 작동 시간을 간헐적으로 또한 자동적으로 제어한다. 마이크로파를 균등하게 조사하기 위해서 교반 팬이나 그 밖의 수단을 설치할 수도 있다.

본 발명의 방법은 조직으로부터 세포 성분을 제거하기 위한 기지의 방법과 조합하여 사용할 수도 있다. 예를 들어 계면 활성제나 효소를 사용하여 조직 내의 세포를 제거하는 전처리를 실시한 후, 조직편에 남아 있는 약액을 제거하는 세정을 마이크로파 조사 하에 행할 수 있다.

본 발명 방법의 이용 분야 또는 용도는

1) 이식용 동물 유래 연조직

예: 뇌사 또는 심장사 도너로부터의 이식용 연조직 처리, 또는 돼지, 소 등의 이종 동물로부터의 이식용 연조직 처리로부터 세포 성분을 제거하는 세정 처리 공정의 효율을 비약적으로 향상시킬 수 있다. 또한, 항원성 원인 물질의 대폭적인 감소를 달성할 수 있다.

2) 이식용 동물 유래 경조직

예: 상기와 동일하게, 뼈·연골·치아 등의 경조직 처리를 실시할 수 있다.

3) 의료용 생물 조직의 처리

예: 동물 및 식물 유래 조직 중, 세포를 포함한 것에 대한 세포 파괴 처리에 사용할 수 있다.

1. 식용 돼지 번식장에서 돼지 심장을 구입하여 4℃ 로 반송하였다. 심장 적출시에 있어서의 온허혈 시간 (warm ischemic time) 은 20분 이내로 하였다. 폐동맥 밸브, 혈관을 적출하여 행크액으로 세정하였다. 계면 활성제인 트리톤 X-100 의 1% 수용액에 시료를 침지하고, 도 1 에 개략도로 나타낸 장치를 이용하여 20℃ 에서 마이크로파를 48시간 간헐적으로 조사하여 도너 세포를 제거하였다. 처리 후, 인산 완충 생리 식염수로 세정 제거하였다. 처리 표본의 조직 단면을 HE 염색에 의해 광현미경 관찰함으로써, 조직학적으로 평가하였다. 그 결과, 돼지 폐동맥 밸브 리플릿 조직에서는 도 2 에 나타내는 바와 같이 마이크로파 조사를 병용하면, 병용하지 않는 경우에 비하여 더욱 조직 심부까지 세포를 제거할 수 있었다.

2. 마찬가지로 식용 돼지 번식장에서 구입한 돼지 심장 밸브를, 계면 활성제인 트리톤 X-100 의 1% 수용액 속에 24시간 침지함으로써 세포 제거하였다. 그 후, 인산 완충 생리 식염수에 침지하고, 10℃ 하에서 마이크로파 처리를 간헐적으로 48시간 조사하였다. 그 결과, 도 3 에 나타내는 바와 같이, 마이크로파를 조사하지 않는 종래법에서는 세포 독성을 나타내는 트리톤 X-100 용액을 제거하기 위해서 3주간 정도 필요하던 것이, 마이크로파를 조사함으로써 수일간으로 대폭적인 처리 시간의 단축이 가능하였다.

Claims (9)

1. 계면 활성제를 함유하고 있는 처리액에 침지된 동물 유래의 생체 조직에 대하여, 0℃∼40℃ 의 온도를 유지하면서 마이크로파를 조사함으로써 생체 조직으로부터 세포 성분을 제거하는 것을 특징으로 하는 생체 조직의 처리 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로파 조사는 주파수 2450 MHz 에서 순수 조사 시간으로서 1 시간 내지 1 주간 행해지는 방법.
5. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 처리되는 생체 조직은 혈관, 심장 밸브막, 심막, 각막, 양막, 및 경막을 포함하는 연조직인 방법.
6. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 처리되는 생체 조직은 뼈, 연골, 및 치아를 포함하는 경조직인 방법.
7. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 처리되는 생체 조직은 심장, 신장, 간장, 췌장, 및 뇌를 포함하는 장기 또는 그 일부인 방법.
8. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 마이크로파 조사 후, 신선한 세정액을 사용하여 파괴된 생체 조직 세포를 조직으로부터 세정 제거하는 공정을 포함하는 방법.
9. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 처리되는 생체 조직은 생체 조직 세포의 제거를 용이하게 하는 전 처리를 받는 방법.

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