KR20210098266A - 하단유동을 포함하는 3차원 세포의 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포의 배양 방법 - Google Patents

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윤재승
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Abstract

본 발명은 3차원 세포 배양 시 세포의 안착, 증식 및 분화에 악영향을 주지 않으면서, 3차원 세포 배양 시 생성되는 노폐물을 효율적으로 제거하며 3차원 세포의 하단에 영양분을 원활하게 공급할 수 있는 3차원 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법을 제공하는 것으로, 상세하게는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및 상기 상부 챔버가 배치되며, 유체를 포함하여 다공성 마이크로웰의 하단 유동이 가능한 하부 챔버를 포함하는 3차원 세포 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 배양 방법을 제공한다.

Description

하단유동을 포함하는 3차원 세포의 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포의 배양 방법{Well plate and method for cell culture using the same}
본 발명은 3차원 세포 배양 시, 세포를 안정적으로 배양하고, 생성되는 노폐물을 효율적으로 제거하며 세포 배양에 원활한 영양분을 공급을 할 수 있는 세포 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 배양 방법을 제공한다.
최근에 약물 스크리닝이나 질병 연구에 있어 효율적이며 성숙한 3차원 세포의 형성 및 배양 방법이 요구되고 있으며, 다양한 마이크로엔지니어링적 접근이 시도 되고 있다. 그 중 마이크로웰 플랫폼이 대표적이다.
종래의 마이크로웰 플랫폼은 3차원 세포 집합체 배양 시 생기는 노폐물 배출과 영양분 공급을 수동적 확산에만 의존하고 있다. 하지만 이는 3차원 세포의 성장 시 증가하는 신진 대사 요구를 충족시키기에는 불충분 해지며, 결국 3차원 세포의 성장과 성숙을 제한한다는 문제점이 있다.
한편, 등록특허 제10-1403536호와 같이 유동을 이용하여 노폐물을 배출하고 영양분을 공급하는 방법이 연구되고 있기는 하나, 이는 세포가 배양되는 영역에서 직접적으로 배양액을 흡입하고 노폐물을 배출하게 되어 배양된 세포의 안착, 증식 및 분화에 악영향을 주거나, 노폐물 제거 시 해당 세포가 노폐물과 함께 흡입 배출될 위험이 있다. 또한 3차원 세포의 하부까지 노폐물 제거와 영양분 공급이 원활하지 않다는 한계가 있다.
나아가 공개특허 제10-2012-0011609호와 같이 미세유체 시스템이 결합된 마이크로웰 플랫폼이 제시되었으나, 상기 플랫폼 역시 세포 배양 챔버에서의 연속적인 유동 흐름을 이용하는 것으로, 세포가 배양되는 챔버 내부에 난류가 쉽게 생성될 수 있고, 나아가 불필요한 물리적 힘을 인가하여 3차원 세포의 성숙을 제한한다는 문제가 있고 3차원 세포의 하부까지 노폐물 제거와 영양분 공급이 원활하지 않다는 한계가 있다.
상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 안정적인 3차원 세포의 배양과 세포 배양 시 노폐물을 효율적으로 배출하고 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있도록, 다공성 마이크로웰의 하단부에 유동조절을 가능하게 하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 일 견지에 있어서, 본 발명은 개구부 및 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및 상기 상부 챔버가 배치되며, 다공성 마이크로웰의 하단에서 유체의 유동이 가능한 하부 챔버를 포함하는, 3차원 세포 배양 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 견지에 있어서, 본 발명은 본 발명의 3차원 세포 배양 장치를 이용하며, 다공성 마이크로웰에 세포 배양액 및 세포를 투입하여 3차원 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 3차원 세포 배양 장치는 3차원 세포 배양 시 세포의 안착, 증식 및 분화에 악영향을 주지 않으면서, 세포 배양 시 형성되는 노폐물을 효율적으로 제거하고 3차원 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있는 3차원 세포 배양 장치를 제공할 수 있다.
도 1(a)은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 배양 장치의 예시도를 나타내며, 도 1(b)는 본 발명의 3차원 세포 배양 장치의 상부 챔버에 있어서 다공성 마이크로웰의 인접한 부분에 관통부가 형성된 경우의 예시도를 나타내며, 도 1(c)는 본 발명의 3차원 세포 배양 장치의 실제 이미지를 나타낸다.
도 2(a)는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에서 측정된 알부민의 발현양을 비교한 것이며, 도 2(b)는 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에서 측정된 FITC-Dextran의 농도를 비교한 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따라, 시간에 따른 노폐물의 제거를 육안으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 하부 챔버에서 유체 흐름 및 다공성 마이크로웰에 의해 다공성 마이크로웰 상면의 노폐물이 제거되는 개략도를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 세포 배양 시 생성되는 노폐물을 용이하게 제거하고 3차원 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있는 3차원 세포 배양 장치를 제공한다.
상세하게, 본 발명은 개구부 및 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및 상기 상부 챔버가 배치되며, 다공성 마이크로웰의 하단에서 유체의 유동이 가능한 하부 챔버를 포함하는, 3차원 세포 배양 장치를 제공한다.
본 발명에서 상기 상부 챔버는 개구부 및 다공성 마이크로웰을 포함하는 웰형태의 챔버가 플레이트를 관통하여 끼워져 있는 형태를 의미할 수 있으며, 예를 들어, 도 1에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 상부 챔버는 개구부 및 다공성 마이크로웰을 포함하는 웰, 그리고 상기 웰이 관통되어 끼워진 플레이트를 포함할 수 있다.
나아가, 상기 다공성 마이크로웰의 하단은 다공성 마이크로웰의 하부 영역을 의미하는 것으로, 하부 챔버 내의 영역을 의미한다.
상기 상부 챔버에는 하부챔버의 유체가 외부와 접촉할 수 있도록 관통부가 형성될 수 있으며, 이때, 상기 관통부는 상부 챔버의 다공성 마이크로웰의 인접한 부분에 형성되거나, 상기 상부 챔버의 임의의 위치에 관통부가 형성될 수 있다. 상기와 같이 유체가 외부와 접촉되는 경우, 유체의 흐름에 의해 형성된 물리적인 힘에 의해 다공성 멤브레인이 형태가 변형되는 것을 방지할 수 있는 것이라면 상기 관통부의 위치는 특히 제한되는 것은 아니다.
상기 하부 챔버는 유체가 유동할 수 있는 유체 유입구 및 유체 배출구를 추가로 구비할 수 있으며, 이를 통해 상기 하부 챔버의 유체가 유동할 수 있다.
나아가, 상기 유체 유입구 및 유체 배출구는 유동을 일으킬 수 있는 장치가 추가로 연결될 수 있으며, 예를 들어 상기 하부 챔버는 유체가 다공성 마이크로웰의 수평 방향으로 흐르도록 하는 유체 흐름을 유도하는 장치와 연결될 수 있다. 이 때, 상기 유체 흐름을 유도하는 장치로 펌프 등을 사용할 수 있으나, 상기 유체의 유동을 일으킬 수 있는 것이라면, 제한되지 않는다.
한편, 상기 유체는 세포 배양액을 사용할 수 있으며, 상기 세포 배양액에는 FBS, 글루코스 및 성장인자 등이 포함될 수 있으나, 당업계에서 사용되는 세포 배양액이라면 제한되지 않는다.
나아가, 상기 다공성 마이크로웰은 복수개의 고분자 나노 섬유가 무작위로 얽혀짐으로써 이루어지거나, 고분자 합성 수지가 성형됨으로써 이루어질 수 있다. 상기 다공성 마이크로웰이 복수개의 고분자 나노 섬유로 이루어짐에 따라, 다공성 마이크로웰은 생체 내 기저막과 유사한 구조를 가질 수 있어, 생체 내 혈액 유동 환경과 유사한 환경을 제공할 수 있다.
한편, 상기 다공성 마이크로웰은 고분자 나노 섬유들의 사이 영역에 형성된 다수의 공극을 포함할 수 있는 것이다. 이때, 상기 공극은 수㎚ 내지 수㎛의 크기를 가질 수 있다. 즉, 상기 다공성 마이크로웰은 공극으로 인해, 단일 세포들은 투과시키기 않으면서 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있으며, 이에 따라 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 마이크로웰은 평균 직경 10㎚내지 8㎛의 기공 사이즈를 가질 수 있다.
이 때, 상기 고분자 나노 섬유 또는 고분자 합성 수지는 열가소성 수지, 열경화성 수지, 탄성 중합체 및 생체 고분자 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있으며, 예를 들어 고분자 나노 섬유 또는 고분자 합성 수지는 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐리덴 플로라이드 (Polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리스티렌(polystyrene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan) 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 다공성 마이크로웰은 하부 방향으로 오목하게 형성된 함몰 패턴이 형성된 몰드를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 고분자 나노섬유로 이루어진 편평한 다공성 멤브레인을 상기 몰드 상에 위치시키고 엠보싱 공정을 위해 별도의 몰드로 상기 다공성 멤브레인을 가압함으로써 제조할 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 마이크로웰의 상면은 세포 배양층으로 작용하는 영역으로, 함몰된 부분에 의해 상기 세포 배양층에 세포가 쉽게 안착하게 되며, 상기 다공성 마이크로웰 내에서 3차원 세포가 안정적으로 증식할 수 있게 된다.
또한, 통상적으로 편평한 형상의 세포 배양층을 구비하는 종래의 세포 배양 용기와 달리, 본 발명의 세포 배양 장치는 입체적인 3차원 형상의 세포 배양층을 제공할 수 있어, 생체 내와 같이 3차원 구조 환경에서 세포를 배양할 수 있으므로, 3차원 세포를 형성할 수 있는 환경을 제공할 수 있다.
나아가, 상기 3차원 세포 배양 장치는 상기 하부 챔버를 흐르는 유체가 다공성 마이크로웰의 하단에 흐르도록 하는 유체 흐름 유도 장치를 통해 상기 하부 챔버의 유체가 안정적으로 흐를 수 있도록 하며, 상기 다공성 마이크로웰의 공극의 투과성으로 인해, 상기와 같은 흐름을 가지는 유체가 3차원 세포 배양 시 형성되는 노폐물을 다공성 멤브레인의 상면에서 하부 챔버로 배출시킬 수 있으며 3차원 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있다. 나아가 하부 챔버에서 3차원 세포 배양 장치 외부로 노폐물을 배출시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 유체 흐름 유도 장치는 시린지 펌프(syringe pump), 튜브연동펌프(peristaltic pump) 또는 교반기 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 3차원 세포 배양 장치는 3차원 세포 배양 시 다공성 마이크로웰에 인가되는 압력을 분산시키고, 형성되는 노폐물과 영양분을 효율적으로 제거 및 공급할 수 있도록, 상기 상부 챔버는 하부 챔버의 유체의 표면이 외부와 접촉할 수 있도록 관통부가 형성될 수 있다.
상기 관통부는 하부 챔버의 유체의 표면이 외부와 접촉될 수 있는 구조를 제공하는 것으로, 상기와 같은 구조에 의해 유체 흐름 시 상부 챔버에 압력이 걸려 다공성 마이크로웰이 변형되고, 이로 인해 3차원 세포 배양 시 세포의 안착, 증식 및 분화에 악영향을 미치는 문제를 해결할 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 3차원 세포 배양 장치를 이용하여 다공성 마이크로웰에 세포 배양액 및 세포를 투입하여 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양 방법을 제공하며, 상기 세포는 근아세포(myoblasts), 태아 섬유아세포(embryo fibroblasts), 인간 제정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells), 인간 간암 세포(HepG2 세포) 또는 인간 표피 세포(human epidermal cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 본 발명의 3차원 세포 배양 장치는 3차원 스페로이드 또는 3차원 오가노이드를 배양할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
도 1(a)와 같은 형태의 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 3차원 세포 배양 장치에서, 다공성 마이크로웰에 HepG2 세포 및 DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media, FBS 10%) 배양액과 함께 주입한 후 이를 37℃에서 48시간 안정화하여 3차원 스페로이드를 형성하였다. 그 후 하부 챔버에 유동을 주어 9일동안 배양 하였다.
비교예 1
상기 실시예 1에서 하단 유동을 주지 않는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 3차원의 HepG2 스페로이드를 배양하였다.
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 상기 배양 기간 중, 6일차 및 9일차에서 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현량을 측정하였다. 측정된 알부민 발현양을 도 2(a)에 나타내었으며, 도 2(a)에 보이는 바와 같이 비교예 1에서 배양된 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현양은 6일차에 1182.64mg/ml, 9일차에 2966.505mg/ml인 반면, 실시예 1에서 배양된 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현양은 6일차에 4813.99mg/ml, 9일차에 6644.55mg/ml인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 하단 유동이 있는 3차원 세포 배양 장치에서 배양시킨 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현량이 큰 것을 알 수 있었으며, 이를 통해 하단 유동으로 인해 3차원 Hep G2 스페로이드의 기능성 향상을 확인할 수 있었다.
실시예 2
하단 유동에 의한 본 발명의 3차원 세포 배양 장치에서 노폐물이 효율적으로 제거될 수 있음을 확인하기 위해, 도 1(a)과 같은 형태의 3차원 세포 배양 장치의 다공성 마이크로웰에 FITC-Dextran 20kDa을 200ug/ml를 넣고, 하단 유동을 3시간 동안 수행한 후 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC Dextran의 농도를 측정하였다.
비교예 2
상기 실시예 2에서 하단 유동을 주지 않는 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일하게 FITC-Dextran을 넣고 3시간 후에 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도를 측정하였다.
실시예 2에서 노폐물이 축적된 정도를 육안으로 살펴본 결과를 도 3에 나타내었으며, 상기 실시예 2 및 비교예 2에서 측정된 FITC-Dextran의 농도를 도 2(b)에 나타내었다. 도 2(b)에 보이는 바와 같이, 하단 유동이 있는 실시예 2의 경우 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도는 55.6199±3.3429mg/ml인 반면, 비교예 2의 경우 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도는 131.435±7.80245mg/ml임을 확인할 수 있었다.
즉, 하단 유동이 있을 때, 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-dextran의 농도는 하단 유동이 없는 경우에 비해 현저히 낮은 것으로, 같은 양의 배양액으로도 하단 유동이 있을 때가 다공성 마이크로웰에 있는 세포의 노폐물을 효율적으로 제거할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 도 4와 같이 하부 챔버에서 유체 흐름 유도 장치 및 다공성 마이크로웰에 의해 다공성 마이크로웰 상면의 노폐물이 제거되는 것임을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (7)

  1. 개구부 및 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부 챔버; 및
    상기 상부 챔버가 배치되며, 상기 다공성 마이크로웰의 하단에서 유체의 유동이 가능한 하부 챔버를 포함하는, 3차원 세포 배양 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 상부 챔버에는 하부 챔버의 유체가 외부와 접촉할 수 있도록 관통부가 형성된, 3차원 세포 배양 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하부 챔버는 유체가 유동할 수 있는 유체 유입구 및 유체 배출구를 추가로 구비하는, 3차원 세포 배양 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하부 챔버는 유체가 다공성 마이크로웰의 하단에 흐르도록 하는 유체 흐름을 유도하는 장치와 연결된, 3차원 세포 배양 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유체는 세포 배양액인, 3차원 세포 배양 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 다공성 마이크로웰의 공극은 평균 직경 10㎚내지 8㎛의 기공 사이즈를 갖는 것인, 3차원 세포 배양 장치.
  7. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 3차원 세포 배양 장치를 이용하며, 다공성 마이크로웰에 세포 배양액 및 세포를 투입하여 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 3차원 세포 배양 방법.
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