WO2022231310A1 - 3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법 - Google Patents

3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2022231310A1
WO2022231310A1 PCT/KR2022/006037 KR2022006037W WO2022231310A1 WO 2022231310 A1 WO2022231310 A1 WO 2022231310A1 KR 2022006037 W KR2022006037 W KR 2022006037W WO 2022231310 A1 WO2022231310 A1 WO 2022231310A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell culture
cells
lower chamber
porous
fluid
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/006037
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김동성
이성진
김형우
김도희
엄성수
윤재승
Original Assignee
셀로이드 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 셀로이드 주식회사 filed Critical 셀로이드 주식회사
Priority to EP22796142.2A priority Critical patent/EP4328298A1/en
Priority to JP2023566416A priority patent/JP2024516408A/ja
Publication of WO2022231310A1 publication Critical patent/WO2022231310A1/ko
Priority to US18/496,292 priority patent/US20240101942A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a culture apparatus and a culturing method for culturing a three-dimensional cell aggregate, and more specifically, to a culture apparatus including a porous microwell and a membrane, and other additional components to effectively cultivate the three-dimensional cell aggregate It's all about cultivating technology.
  • the cells in the actual body are three-dimensional, and these cells interact with the microenvironment of the cells in three dimensions.
  • the similarity to cells in the body in terms of morphology is greatly lacking, and in the case of three-dimensional culture
  • a phenomenon more similar to the actual in vivo phenomenon can be confirmed.
  • microwells have limitations in forming 3D cell aggregation because they do not have a porous structure or use plastics, etc., and even if 3D cell aggregates are formed, the process of detachment from the microwell platform is not easy.
  • the culture environment that has been previously proposed has a problem of limiting the growth and maturation of three-dimensional cell aggregates because they depend only on passive diffusion for the discharge of waste products and the supply of nutrients generated during culture.
  • the present invention has been proposed in view of the above limitations and problems, and relates to a culture apparatus capable of culturing three-dimensional cell aggregates more effectively than before and a culture method using the same.
  • the present invention was invented to provide additional technical elements that cannot be easily invented by a person skilled in the art in addition to solving the above technical problems.
  • An object of the present invention is to provide an environment capable of forming a three-dimensional cell aggregate, more precisely, a three-dimensional cell spheroid.
  • Another object of the present invention is to induce the formation of three-dimensional cell aggregates at the cell culture temperature and maintain the characteristics of easy culture, but at room temperature, a large amount of three-dimensional cell aggregates can be simultaneously detached from the microwell plate.
  • Another object of the present invention is to enable the flow control at the lower end of the porous microwell so as to efficiently discharge wastes during stable three-dimensional cell culture and cell culture and smoothly supply nutrients to the lower part of the cells.
  • the present invention minimizes the loss of cells and three-dimensional cell aggregates caused by pipetting on the cell culture surface, which is the upper surface of the microwell, for repeated cell culture replacement, which is widely used in the past, and at the same time continuously uniform cells. It aims to provide an environment that can provide an agglomerate surrounding environment.
  • the three-dimensional cell culture apparatus includes: an upper chamber including an opening, a porous thin film, and a porous microwell having a cell culture space accommodating a culture medium; and a lower chamber having a space in which the upper chamber is disposed, wherein the fluid flowing into the upper chamber passes through the porous microwell in the upper chamber and flows into the lower chamber, and the fluid in the lower chamber is discharged and may be characterized in that the fluid flows.
  • the three-dimensional cell aggregate culture method using the three-dimensional cell culture apparatus, inoculating the cells on the porous membrane of the upper chamber; introducing the cell culture solution into the upper chamber; and discharging the cell culture solution introduced into the lower chamber through the porous microwell in the upper chamber from the lower chamber.
  • cells settled in a certain region can more smoothly three-dimensionally proliferate and differentiate.
  • microwell plate having a surface structure having a surface roughness that is easy for cell culture and harvesting through temperature change, thereby enabling mass production and harvesting of three-dimensional cell aggregates.
  • the height of the culture medium reservoir may be set to correspond to the level of the culture medium in the lower chamber, thereby maintaining a constant height of the culture medium during the culturing process.
  • FIG. 1 shows a cell culture vessel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of one side of a cell culture vessel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 3 shows a plate 30 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is an enlarged view of the periphery of one opening 31 in FIG. 2 .
  • FIG 5 shows a state in which cells proliferate in a cell culture vessel according to another embodiment of the present invention.
  • FIG 6 shows the body 10 and the fastening portion 40 of the cell culture vessel according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 shows a sequence of a method for manufacturing a cell culture vessel according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 shows an example of S10 or S100 of a method for manufacturing a cell culture vessel according to another embodiment of the present invention.
  • FIG 9 shows an example of S20 or S200 of the method for manufacturing a cell culture vessel according to another embodiment of the present invention.
  • FIG 10 shows a photograph of the membrane 20 formed by the method of manufacturing a cell culture vessel according to an embodiment of the present invention.
  • 11 shows an image observed from above of the upper chamber of the cell culture vessel manufactured according to another embodiment of the present invention.
  • 11B is an enlarged view of one of the plurality of porous microwells of FIG. 11A.
  • 12 is a graph showing the change in surface roughness of the cell culture layer according to temperature and time.
  • FIG. 13A is an enlarged view of the porous microwell, and FIG. 13B shows that a cell culture layer including polyisopropyl acrylamide is formed on the upper surface of the porous microwell.
  • 14A shows an image taken in the process of culturing a three-dimensional cell aggregate.
  • 14B shows cell aggregates detached from the well plate.
  • 14C shows a photograph of a well plate after cell aggregates are detached.
  • Figure 15 (a) is an exemplary view of a three-dimensional cell culture apparatus according to an embodiment of the present invention
  • Figure 15 (b) is a portion adjacent to the porous microwell in the upper chamber of the three-dimensional cell culture apparatus of the present invention. It is an exemplary view when a penetration part is formed
  • FIG. 15( c ) shows an actual image of the three-dimensional cell culture apparatus.
  • Figure 16 (a) is a comparison of the expression level of albumin measured in ⁇ Example 2> and ⁇ Comparative Example 2> of the present invention
  • Figure 16 (b) is ⁇ Example 3> and ⁇ Comparative Example> of the present invention
  • the concentration of FITC-Dextran measured in 4> is compared.
  • FIG. 18 is a schematic diagram illustrating that wastes on an upper surface of a porous microwell are removed by fluid flow and a porous microwell in the lower chamber of the present invention, and a schematic diagram in which a culture solution is diffused into the porous microwell.
  • Figure 19 shows a cell culture apparatus according to another embodiment of the present invention
  • Figure 19 (a) shows the overall shape of the cell culture apparatus
  • Figure 19 (b) is a combination of one upper chamber and lower chamber It is an enlarged view
  • FIG. 19( c ) is a cross-sectional view of a cell culture apparatus including a culture medium reservoir connected to an outlet.
  • FIG. 21 shows a photomicrograph of a porous microwell in which the porous membrane has a concave portion.
  • Fig. 21 (a) is an enlarged image at a magnification of 4 times
  • Fig. 21 (b) is a magnification of 220 times.
  • Figure 21 (c) shows a photograph of another type of porous microwell in which the porous membrane has a concave portion
  • Figure 21 (c) a) is a DSLR camera
  • Figures 21 (c) b) and (c) c) are microscope images magnified at 4x and 20x magnifications, respectively.
  • 22 shows the structure and property changes of the nanofiber network of the porous membrane according to the electrospinning time.
  • Transwellinsert Corning, USA
  • 22 (a) is a microscopic image of a commercial membrane and each nanofiber network structure according to a change in electrospinning time at a magnification of 20 times.
  • 22(b), (c) and (d) show the porosity (FIG. 22(b)), the hydraulic conductivity of each nanofiber network structure according to the commercial membrane and the electrospinning time (FIG. 22( c)), and the induced pressure.
  • Figure 24 is a numerical simulation of the nutrient concentration around the cell aggregate when using the cell culture apparatus according to the present invention and the nutrient concentration around the cell aggregate when the cells are cultured through the cell culture medium replacement method by conventional pipetting. shows the results of comparison.
  • 25 is a diagram illustrating a state in which the fluid existing in the cell culture apparatus is smoothly replaced with the newly injected fluid, and the level of the culture medium in the lower chamber is maintained constant in this process.
  • 26 shows a method for fabricating a porous microwell.
  • FIG. 27 shows a lower chamber (a) used in the cell culture apparatus according to the present invention and an upper chamber (b) inserted into the lower chamber.
  • a cell culture vessel which is a basic configuration of the cell culture apparatus according to the present invention, and a method for manufacturing the same will be described.
  • FIG. 1 shows a cell culture vessel according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 shows a cross-sectional view of one side.
  • FIG. 2 shows a cross-section taken along lines A and A' in FIG. 1 .
  • 3 shows a plate 30 according to an embodiment of the present invention.
  • the cell culture vessel may include a body 10 and a membrane 20 as shown in FIGS. 1 and 2 , and may further include a plate 30 in addition.
  • the plate 30 will be first described, and then the body 10 and the membrane 20 will be described in turn.
  • the plate 30 is provided with one or more openings 31 having an opening shape, and the body 10 may be inserted and mounted in the upper opening 31 .
  • the opening 31 may be of an open type with the lower part closed and the upper part open as shown in FIG.
  • the cell culture vessel may have a receiving space with an open top, and the receiving space may further include a cover vessel for mounting the plate 30 .
  • each of the openings 31 may be arranged to be spaced apart from each other, and thus, the influence between samples of each opening 31 may be blocked during cell culture. As a result, a plurality of independent experimental data can be derived using one plate 30 .
  • the body 10 includes a spacer SP, an inlet 11 formed at the other end, and a penetrating portion penetrating the spacer and the inlet 11 , respectively.
  • the spacer refers to a portion corresponding to the side or sidewall of the body 10, and is denoted by the reference numeral SP in the drawing.
  • the outer surface of the spacer faces the inner surface of the opening 31, and it can be seen that a predetermined interval or space exists between the spacer and the inner surface of the opening.
  • the spacer SP of the body 10 may be inserted into the opening 31 of the plate 30 .
  • the body 10 may include one insertion part or a plurality of insertion parts. That is, when including one insertion part, the body 10 may be inserted into the corresponding insertion part into one opening 31 .
  • the body 10 when including a plurality of inserts, the body 10 may be inserted into each insert corresponding to the plurality of openings (31).
  • the body 10 when including a plurality of inserts, has a structure in which each insert is connected to each other, and each insert can be inserted corresponding to each opening 31 .
  • 1 to 6 show the body 10 including one insertion part, but the present invention is not limited thereto. Of course it can be applied.
  • the spacer of the body 10 When the spacer of the body 10 is inserted into the opening 31 , the spacer of the body 10 is located at the lower part, and the inlet part 11 of the body 10 is located at the upper part.
  • the spacer of the body 10 may have a vertical shape having a constant width from one end to the other end, a funnel shape gradually increasing in width from one end to the other end, or a combination of a vertical shape and a funnel shape.
  • the penetrating portion of the body 10 may be formed in various shapes, such as circular, polygonal, and the like in cross section, and may be formed in various sizes.
  • the inlet of the body 10 is positioned to be spaced apart from the bottom surface of the cell culture vessel by a predetermined distance, the inlet of the body 10
  • the portion 11, as shown in FIG. 4, preferably has a cross section wider than the inlet of the spacer and the opening 31 of the body 10. Accordingly, in the space between the spacer of the body 10 and the bottom surface of the cell culture vessel, a passage of a fluid having nutrients for supplying the cells may be formed.
  • the bottom surface of the cell culture vessel may be the bottom surface of the open portion in the case of an open plate, and may be the bottom surface of the cover vessel in the case of a through-type plate.
  • the membrane 20 is a layer that provides a cell culture surface in which cells are cultured, and is employed in the penetrating portion of the spacer side of the body 10 .
  • the membrane 20 may be formed through an electrospinning method to cover one end of the spacer of the body 10 .
  • the membrane 20 may be formed by randomly intertwining a plurality of polymer nanofibers or by molding a polymer synthetic resin.
  • each polymer nanofiber may have a diameter of 1 nm or more to less than 1000 nm.
  • the membrane 20 has a structure similar to the basement membrane in vivo, thereby providing an in vivo blood flow environment.
  • the polymer nanofibers or the synthetic polymer resin may include at least one of a thermoplastic resin, a thermosetting resin, an elastomer, and a biopolymer.
  • polymer nanofibers or polymer synthetic resins are polycaprolactone, polyurethane, polyvinylidene fluoride (PVDF), polystyrene, collagen, gelatin. ), may include at least one or more of chitosan (chitosan).
  • the membrane 20 may include a porous microwell 21 , a connection part 22 , and a fixing part 23 .
  • the microwell 21 , the connection part 22 , and the fixing part 23 have a structure connected to each other by entanglement of a plurality of polymer nanofibers.
  • the microwell 21 is a region serving as a cell culture surface and is concave in the downward direction. Due to this concave shape, cells are easily seated in the microwell 21 , and can stably proliferate in the microwell 21 irrespective of the movement of the fluid. At this time, at least one of the microwells 21 is located in a region formed by the penetrating portion of the body 10 . That is, when viewed from the top or bottom, the microwell 21 is smaller in size than the penetration portion of the body 10 and is included in the region formed by the penetration portion.
  • the membrane 20 allows the cells to be more intensively and stably attached to the cell culture surface and increases the area of the cell culture surface, can improve the adhesion efficiency of
  • the body 10 of the cell culture vessel according to the present invention is provided with a cell culture surface of a three-dimensional shape, through which the in vivo Cells can be cultured in a three-dimensional structural environment, such as a three-dimensional cell spheroid.
  • the spacer of the body 10 has a plurality of cell culture surfaces to further improve cell adhesion efficiency.
  • connection part 22 is a region formed around an arbitrary microwell 21 to connect between the microwells 21 and may have a flat shape.
  • the connecting portion 22 may have a thickness greater than that of the microwell 21 . This corresponds to a region in which the microwell 21 extends in a lower concave shape among the membrane 20 and becomes thinner than the original by an embossing process to be described later, whereas the connection part 22 corresponds to an area in which the original thickness is not increased. because it keeps
  • the fixing part 23 is a region fixed to the edge of one end of the spacer of the body 10 .
  • the fixing part 23 may have a thinner thickness and a lower density than the connection part 22 .
  • the membrane 20 can be formed through an electrospinning method using an electrolyte solution. That is, since the microwell 21 and the connection part 22 correspond to a region generated at a position containing the electrolyte solution during electrospinning, a greater number of polymer nanofibers than the fixing part 23 are formed to form the fixing part 23 ) and may be formed to have a higher density and a thicker thickness.
  • 5 shows a state in which cells proliferate in the cell culture vessel according to the present invention.
  • 5(a), 5(b), and 5(c) sequentially show cell proliferation over time under the fluid concentration phenomenon.
  • the membrane 20 includes a plurality of holes formed in the region between the polymer nanofibers.
  • the pores may have a size of several ⁇ m to several tens of ⁇ m. Due to the pores, the membrane 20 may act as a selective permeation membrane that does not permeate single cells but selectively permeates other materials, thus serving as a material transfer barrier and passage.
  • the first porosity formed by the first voids formed in the microwell 21 and the second porosity formed by the second voids formed in the connection part 22 may be different from each other.
  • the porosity may be a ratio of the pore area existing in the unit area.
  • the first porosity may be greater than the second porosity. This is because the region corresponding to the microwell 21 in the membrane 20 is stretched into a lower concave shape by the embossing process, and a plurality of parts blocked by the entangled polymer nanofibers are opened or already opened in the corresponding region.
  • the present invention is not limited to having only these two porosity. That is, the present invention may have various porosity in addition to the first porosity and the second porosity.
  • cell proliferation in the microwell 21 may be more actively performed while a fluid concentration phenomenon occurs in the area around the microwell 21 . This is because the higher the porosity region, the higher the material permeability according to Darcy's equation.
  • the opening 31 of the plate 30 is filled with a fluid (eg, a cell culture solution, a mixture of distilled water, PBS solution, etc.), and this fluid is periodically replaced using a dropper or the like. have to do it
  • the fluid may be replaced, for example, by a method in which a new fluid is supplied to the inside of the body 10 while the fluid is sucked out from the outside of the body 10 . This is because, when the fluid is sucked and discharged from the inside of the body 10 , there is a risk of adversely affecting cells that are seated in the microwell 21 and proliferating and differentiated or that the cells are discharged together.
  • the fluid filled in the accommodating space accommodating the microwell 21 passes from the upper side to the lower side of the microwell 21 and the connection part 22 .
  • the microwell 21 has a greater porosity than the connection part 22 , as shown in FIG. 5 , more fluid permeates than the connection part 22 . Accordingly, a phenomenon in which the fluid moves more intensively in the periphery of the microwell 21 than in the periphery of the connection part 22 , that is, a fluid concentration phenomenon occurs.
  • the cell culture vessel according to the present invention uses a single plate 30 for a plurality of independent experimental data tested in a three-dimensional structure environment such as in vivo. can be derived by
  • FIG 6 shows the body 10 and the fastening portion 40 of the cell culture vessel according to another embodiment of the present invention.
  • the cell culture vessel according to another embodiment of the present invention may further include a fastening part 40 having one end and the other end penetrated therethrough and fastened to one end of the spacer of the body 10 as shown in FIG. 6 . .
  • the fastening part 40 may include one through-portion or a plurality of through-portions. That is, when including one through-portion, the fastening part 40 may be fastened to each spacer of the body 10 and may be formed in a ring shape. In addition, when including a plurality of through portions, the fastening portion 40 may be fastened with each through portion corresponding to each spacer of the body 10 . 6 illustrates a case in which the fastening part 40 includes one through-portion, but the present invention is not limited thereto. Of course it can be applied.
  • the membrane 20 is not provided at one end of the spacer of the body 10 but the membrane 20 is provided at one end of the fastening unit 40 , or the spacer end of the body 10 is provided with the membrane 20 . And the membrane 20 may be provided together at one end of the fastening part 40 .
  • the fastening part 40 is fastened to the spacer of the body 10 , the through part of the fastening part 40 and the through part of the body 10 are connected to each other.
  • the fastening part 40 may be provided in a form that is detachable (mounted and separated) from one end of the spacer of the body 10 .
  • a screw thread is formed inside or outside the fastening part 40
  • a thread corresponding to the screw thread of the fastening part 40 may be formed on the outside or inside of one end of the body.
  • the fastening portion 40 as shown in Fig. 6 (b), is fitted to the inner circumferential surface of the penetrating portion of one end of the spacer of the body 10, or, as shown in Fig. 6 (c), the body 10 ) can be fitted to the outer circumferential surface of one end of the spacer.
  • the membrane 20 provided at one end of the fastening unit 40 is the same except for replacing the spacer of the body 10 with the fastening unit 40 in the membrane 20 provided at one end of the spacer of the body 10 described above. do. That is, the position of the membrane 20 provided at one end of the fastening part 40 is changed from one end of the spacer of the body 10 to one end of the fastening part 40 . Therefore, the detailed description of the membrane 20 provided at one end of the fastening part 40 will be omitted below and will be replaced with the description of the membrane 20 provided at one end of the spacer of the body 10 described above.
  • a method for manufacturing such a cell culture vessel includes a method of manufacturing the microwell 21 or the membrane 20 .
  • FIG. 7 shows a sequence of a method for manufacturing a cell culture vessel according to the present invention.
  • the method of manufacturing a cell culture vessel according to an embodiment of the present invention includes preparation steps (S10, S100) and forming steps (S20, S200).
  • S10 and S20 are methods of manufacturing the above-described body 10 and membrane 20
  • S100 and S200 are methods of manufacturing the above-described body 10 , membrane 20 and fastening part 40 .
  • S10 is a step of preparing the body 10 and the membrane 20 .
  • S100 is a step of preparing the body 10 , the membrane 20 and the fastening part 40 .
  • the membrane 20 may be formed through an electrospinning method using an electrolyte solution, and the electrospinning method using an electrolyte solution will be described below.
  • FIG. 8 shows an example of S10 or S100 of a method for manufacturing a cell culture vessel according to another embodiment of the present invention.
  • the electrospinning method using an electrolyte solution forms the membrane 20 to cover one end of the spacer or the fastening part 40 of the body 10, and may be performed inside the chamber.
  • the chamber is a space in which work is performed, and when the membrane 20 is formed, external leakage of the polymer solution can be prevented.
  • an electrospinning method using an electrolyte solution for forming the membrane 20 on one end of the spacer of the body 10 is referred to as a “first electrospinning method”, and an electrolyte for forming the membrane 20 at one end of the fastening part 40 .
  • the electrospinning method using a solution is referred to as a “second electrospinning method”. First, the first electrospinning method will be described.
  • the first electrospinning method may sequentially include an electrolyte filling step, a voltage application step, and a membrane formation step.
  • the electrolyte filling step is a step of filling the electrolyte solution 50 in the spacer of the body 10 formed so that one end and the other end pass through, as shown in FIG. 8( a ).
  • the body 10 is disposed so that one end of the spacer faces upward and the other end is blocked.
  • the electrolyte solution 50 is filled with one end of the spacer of the body 10 .
  • a stopper is provided to block the inlet 11 of the body 10 , and an electrode for applying a voltage to the electrolyte solution 50 may be provided in the stopper. That is, the electrode is formed to pass through the stopper and may be connected to the electrolyte solution 50 filled in the spacer of the body 10 .
  • the spacer of the body 10 is disposed in the electrolyte container 60 filled with the electrolyte solution 50, but one end of the spacer of the body 10 is upper It is also possible to fill the electrolyte solution 50 in the penetrating portion of the body 10 by disposing to face.
  • the spacer of the body 10 is disposed as the receiving space of the electrolyte container 60
  • the spacer of the body 10 comes into contact with the surface of the electrolyte solution 50 and a pressure is generated to press the surface of the electrolyte solution 50 , and the The electrolyte solution 50 is filled with the spacer of the body 10 by the pressure.
  • the receiving space of the electrolyte container 60 may be formed to match the spacer shape of the body 10 so that the pressure on the surface of the electrolyte solution 50 can be better generated.
  • the electrolyte solution 50 Since the electrolyte solution 50 has conductivity, when a voltage is applied in the voltage application step, it takes on a (-) charge and attracts particles having a (+) charge by electrical attraction, and thus, particles having a (+) charge may be integrated on top of the electrolyte.
  • the electrolyte solution 50 is classified into a strong electrolyte and a weak electrolyte according to the degree of dissociation. The degree of dissociation depends on the solvent.
  • the electrolyte solution 50 a solution in which potassium chloride and distilled water are mixed in a 3% mol ratio may be used.
  • any material and concentration having an electrical conductivity higher than 1 mS/cm dissolved in water or an organic solvent (ethanol, methanol) may be used as the electrolyte solution 50 .
  • any material and concentration having a relative permittivity higher than 80 F/m dissolved in water may be used as the electrolyte solution 50 .
  • the voltage application step is a step of applying a voltage between the electrolyte solution 50 and the metal needle 71 of the electrospinning machine 70, as shown in FIG. 8(c). At this time, the voltage is supplied through the power supply, and the structure of the membrane 20 formed in the membrane forming step may be changed according to the change in the intensity of the applied voltage.
  • An electric field is formed between the electrolyte solution 50 and the metal needle 71 of the electrospinning machine 70, and when the strength of the electric field formed at this time is too low, the polymer solution is not continuously discharged and a polymer having a uniform thickness It may be difficult to manufacture the nanofibers, and it may be difficult for the prepared polymer nanofibers to be smoothly focused on the electrolyte solution 50 . Conversely, when the strength of the electric field is too high, it may be difficult to have a normal shape because the polymer fibers are not accurately seated on the upper surface of the electrolyte solution 50 . In consideration of this content, the strength of the voltage applied to the electrolyte solution 50 and the metal needle 71 of the electrospinning machine 70 may be 5 kV to 30 kV.
  • a negative (-) voltage may be applied to the electrolyte solution 50
  • a positive (+) voltage may be applied to the metal needle 71 . Accordingly, the electrolyte solution 50 has a negative (-) charge, and the polymer solution radiated in the membrane formation step has a positive (+) charge.
  • the membrane forming step is a step of forming the membrane 20 by radiating a polymer solution to the spacer of the body 10 through the electrospinning machine 70 in a state in which a voltage is applied, as shown in FIG. 8(c). .
  • the membrane 20 is formed in a network shape in which a plurality of polymer nanofibers are randomly entangled due to the high degree of freedom of the electrolyte solution 50 .
  • the electrospinning machine 70 is a device for supplying a polymer solution. That is, the electrospinning machine 70 may discharge the polymer solution through the metal needle 71 after storing the polymer solution to have an appropriate viscosity for electrospinning. At this time, the discharged polymer solution may be cured simultaneously with scattering to form polymer nanofibers.
  • the metal needle 71 is configured to discharge the polymer solution. As it is made of a metal material, the metal needle 71 is easy to connect to the power supply, and the charge charging efficiency of the polymer solution discharged when a voltage is applied from the power supply can be improved. In particular, the metal needle 71 is located in the upper portion spaced apart from the spacer of the body 10, but the discharge end is disposed to face the spacer of the body 10 can radiate the polymer solution.
  • the electrospinning machine 70 may be composed of a syringe, a syringe pump, and a metal needle 71 . That is, the polymer solution can be put into the syringe and the polymer solution can be discharged into the air with the metal needle 71 through the power of the syringe pump. At this time, the metal needle 71 may use a 23 gauge needle, but the size may vary depending on the polymer solution.
  • the polymer solution may be spun at a discharge rate of 0.01 ml/h to 3 ml/h so that the polymer fibers can be placed on the surface of the electrolyte solution 50 while maintaining the surface shape of the electrolyte solution 50 .
  • the polymer nanofibers may have a diameter of 10 nm to 900 nm.
  • polymer solution a solution having a concentration of 5% to 25% in which chloroform and methanol are mixed in a mass ratio of 1: 1 and polycaprolactone can be used.
  • a solution of 25% to 30% concentration in which polyvinylidenefluoride (PVDF) is mixed is used as a polymer solution.
  • PVDF polyvinylidenefluoride
  • a polymer solution may be prepared using polystyrene, polycarbonate, collagen/polycarbonate blending solution, gelatin, or the like.
  • the electrical attraction generated between the through-portion on the spacer side of the body 10 filled with the electrolyte solution 50 and the polymer solution is constant, but between the edge of the spacer of the body 10 and the polymer solution. It may be larger than the generated electrical attraction. Accordingly, the region of the membrane 20 (hereinafter referred to as “through-portion region”) that is integrated into the through-portion on the spacer side of the body 10 filled with the electrolyte solution 50 has a constant but relatively large density and thickness. .
  • the magnitude of the electrical attraction generated between the edge of the spacer of the body 10 and the polymer solution is small compared to the magnitude of the electrical attraction generated between the penetrating portion of the spacer of the body 10 and the polymer solution, and the body ( 10), it becomes smaller as it goes away from the penetrating part of the spacer. Accordingly, the fixing part 23 , which is the membrane 20 integrated on the rim of the spacer of the body 10 , is not constant but has a relatively small density and thickness.
  • the membrane forming step may further include adjusting any one or more of the thickness, porosity, and transparency of the membrane 20 formed on one end of the spacer of the body 10 by adjusting the radiation time of the electrospinning machine 70 . That is, as the spinning time of the electrospinning machine 70 increases, the amount of polymer nanofibers to be integrated increases. Accordingly, as the thickness of the membrane 20 formed on one end of the spacer of the body 10 increases, the porosity and transparency thereof decrease.
  • the membrane forming step may further include adjusting the diameter of the polymer nanofibers of the membrane 20 formed by adjusting the concentration of the polymer solution. That is, as the concentration of the polymer solution increases, the viscosity increases, so that the diameter of the polymer nanofibers of the membrane 20 formed at one end of the spacer of the body 10 increases.
  • the second electrospinning method includes an electrolyte filling step, a voltage application step, and a membrane forming step in the same manner as the first electrospinning method, and may further include a fastening part fastening step.
  • the electrolyte filling step, the voltage application step, and the membrane forming step are the same except for replacing the spacer of the body 10 with the fastening part 40 in the first electrospinning method described above. Therefore, detailed descriptions of the electrolyte filling step, voltage application step, and membrane formation step of the second electrospinning method are omitted below and the description of the electrolyte filling step, voltage application step and membrane formation step of the first electrolyte electrospinning method described above will be replaced. let it do
  • the membrane 20 may be formed on one end of the fastening part 40 through the electrolyte filling step, the voltage application step, and the membrane forming step.
  • the fastening step is a step of fastening the fastening part 40 in which the membrane 20 is formed to one end of the spacer of the body 10 formed so that one end and the other end pass therethrough.
  • the fastening step of the fastening part may be performed by a transfer device that transports the spacer or the fastening part 40 of the body 10 to fasten the spacer and the fastening part 40 of the body 10 .
  • the first electrospinning method and the second electrospinning method may further include cutting the membrane 20 formed according to the shape of the spacer or the fastening part 40 of the body 10 after forming the membrane 20 .
  • FIG 9 shows an example of S20 or S200 of the method for manufacturing a cell culture vessel according to another embodiment of the present invention.
  • S20 is a step of performing an embossing process on the membrane 20 formed on the spacer of the body 10 .
  • S200 is a step of performing an embossing process on the membrane 20 formed on the fastening part 40 .
  • an embossing process is performed on the membrane 20 prepared in S10 or S100 using the mold M in which the pattern of the microwell 21 is formed.
  • the embossing process is a process of forming a pattern on the membrane 20 corresponding to the pattern of the mold M by pressing the membrane 20 with the mold M. That is, as a result of the embossing process, the microwell 21 and the connection part 22 may be formed in the membrane 20 .
  • the embossing process may be a hot embossing process of pressing the membrane 20 with the heated mold M, but is not limited thereto. In the case of using the hot embossing process, the result of S20 can be derived more quickly.
  • the mold M may include a first mold M1 having a lower portion protruding according to the pattern of the microwell 21 and a second mold M2 having a concave upper portion according to the pattern of the microwell 21 . That is, the membrane 20 is placed between the first mold M1 and the second mold M2, and the first mold M1 and the second mold M2 are pressed to combine and separate to form the membrane 20. A microwell 21 and a connection part 22 may be formed. When combined, the protruding portion of the first mold M1 is in contact with one surface of the membrane 20 , and the concave portion of the second mold M2 is in contact with the other surface of the membrane 20 .
  • either one of the first mold M1 and the second mold M2 may be heated, or both the first mold M1 and the second mold M2 may be heated before merging.
  • the protruding shape of the first mold M1 has a greater influence on the formation of the microwell 21 , it may be preferable to heat and use only the first mold M1 .
  • the temperature of the heated first mold M1 or the second mold M2 is lower than the melting point of the polymer nanofibers constituting the membrane 20 .
  • FIG. 10 shows a photograph of the membrane 20 formed by the method of manufacturing a cell culture vessel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10(c) shows a plan view of the membrane 20
  • FIG. 10(d) shows a plan view of the microwell 21 and the connection part 22, which are enlarged views of FIG. 10(c).
  • FIG. 10(a) shows an enlarged photograph of the microwell 21, and
  • FIG. 10(b) shows the first void formed in the microwell 21 of FIG. 10(a).
  • FIG. 10(e) shows an enlarged photograph of the connection part 22, and
  • FIG. 10(f) shows the second void formed in the connection part 22 of FIG. 10(e).
  • the membrane 20 formed by the method for manufacturing a cell culture vessel according to an embodiment of the present invention as shown in FIGS. it can be confirmed that
  • the first pores formed in the microwell 21 in the membrane 20 formed by the method for manufacturing a cell culture vessel according to an embodiment of the present invention, the first pores formed in the microwell 21 . It can be seen that the number of the second voids formed in the silver connection part 22 is larger than that of the second voids. At this time, it can be seen that the first porosity is increased by about 10 times or more compared to the second porosity.
  • a cell culture vessel and a manufacturing method thereof were examined with reference to FIGS. 1 to 10 .
  • some conditions were mentioned about what condition the porosity of parts constituting the membrane, such as a microwell or a connection part, should have, but the cell culture vessel according to the present invention is a fluid Alternatively, it is sufficient if only enough pores are formed through which the material can pass, and the porosity may have any numerical value without any restrictions. That is, in all the examples mentioned in the present detailed description, the existence of pores is naturally recognized, but it is understood that the difference in porosity is not an essential limitation in implementing a cell culture vessel.
  • FIGS. 11 to 14 Another embodiment of the microwell and plate will be described with reference to FIGS. 11 to 14 .
  • porous microwell 21 and the plate 30 were described.
  • a coating composition having a surface structure change according to temperature is coated on the porous microwell 21 to , it is possible to implement a cell culture vessel including a cell culture layer whose surface structure changes according to temperature.
  • the cell culture layer having a surface structure change according to temperature has a surface structure suitable for culturing cells due to high adhesion to cells at a temperature of more than 32° C. to 40° C. or less on the upper surface of the porous microwell 21, and is 0° C. or higher At a temperature of less than 32° C., it has a surface structure suitable for detachment of cells and may be formed in a form suitable for recovering cells.
  • the cell culture layer may include poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAAm), and the surface roughness may be 4 to 37 nm, preferably 20 to 32 nm, at more than 32 ° C. to 40 ° C. or less. and a surface roughness of 4 ⁇ m or more at 0° C. or higher to less than 32° C. may have a surface roughness change characteristic according to temperature.
  • the surface roughness was measured with a non-contact atomic force microscope (Park Systems, Korea) using a PPP-NCHR cantilever using a frequency of 300 kHz or a BL-AC40TS cantilever using a frequency of 25 kHz. it means.
  • the cell culture layer may include 1 to 5% by weight of the crosslinking agent based on the total weight of the cell culture layer, preferably more than 1% to less than 3% by weight. If the content of the crosslinking agent is less than 1% by weight, there may be a problem that cells do not adhere well to the cell culture layer, and if it exceeds 5% by weight, the temperature below the LCST (lower critical solution temperature) There may be a problem that the detachment of cell spheroids does not occur well.
  • the LCST lower critical solution temperature
  • the porous microwell 21 has permeability to the fluid, portions other than the porous microwell 21 have no permeability to the fluid.
  • the pores of the porous microwell 21 may have a pore size of 100 nm to 20 ⁇ m in average diameter, and preferably, a pore size of 100 nm to 5 ⁇ m. Due to such a pore size, the porous microwell can act as a selective permeation membrane that selectively permeates other materials while not permeating single cells, thereby serving as a material transfer barrier and passage.
  • a fluid concentration phenomenon may occur in the porous microwell 21 as described above. have.
  • oxygen and nutrients contained in the fluid can be smoothly supplied to cells that are proliferating and differentiated in the porous microwell, thereby further promoting cell proliferation and differentiation.
  • a phenomenon in which cells are gathered into the porous microwell due to such a fluid concentration phenomenon also occurs, thereby facilitating the formation of cell aggregates or spheroids.
  • the cell culture vessel of the present invention may include an upper chamber 100 and a lower chamber 200 as shown in FIG. 1 .
  • the lower chamber 200 may be a chamber in which the upper chamber 100 is disposed or mounted so that a cell culture solution or the like can flow.
  • the present invention can use a lower chamber in which a plurality of upper chambers can be disposed so that several cells can be simultaneously cultured, and the number of the upper chambers can be used without limitation as long as it is a number commonly used in the art. .
  • the method includes an N-isopropylacrylamide monomer, a crosslinking agent and the remainder of water, and the crosslinking agent is 1 part by weight or more to 5 parts by weight based on 100 parts by weight of a mixture of N-isopropylacrylamide monomer and water providing an aqueous coating solution that is less than; forming a coating layer using the aqueous coating solution on the upper surface of the porous microwell of a well plate chamber including the porous microwell at the lower portion; and irradiating UV to the coating layer to form a cell culture layer.
  • the rate of cell detachment can be adjusted according to the temperature change of the support for cell culture, and as described above, the cross-linking agent is based on 100 parts by weight of a mixture of N-isopropyl acrylamide monomer and water. As 1 part by weight or more to less than 5 parts by weight, preferably more than 1 part by weight to less than 3 parts by weight may be.
  • the content of the crosslinking agent is less than 1 part by weight based on 100 parts by weight of the mixture of N-isopropylacrylamide monomer and water, there may be a problem that cells do not adhere well to the cell culture support, and if it is 5 parts by weight or more, LCST At a temperature lower than the temperature, there may be a problem that the detachment of cells does not occur well.
  • the crosslinking agent serves to polymerize the N-isopropyl acrylamide monomer into polyisopropyl acrylamide, and a conventional method used for preparing polyisopropyl acrylamide, that is, homopolymerization, copolymerization And if it is a crosslinking agent that can be used for terpolymerization, cross-linked polymerization, etc., it can be used without limitation, preferably N,N'-methylenebisacrylamide (N,N-Methylenebisacrylamide; MBAAm) and tetra Methylethylenediamine (tetramethylethylenediamine, TEMED) or a mixture thereof may be used as the crosslinking agent.
  • N,N'-methylenebisacrylamide N,N-Methylenebisacrylamide; MBAAm
  • tetra Methylethylenediamine tetramethylethylenediamine
  • the aqueous coating solution may further include a photoinitiator so that the monomers in the coating aqueous solution can cross-link by UV.
  • the photoinitiator may be 0.01 to 0.1 parts by weight, preferably 0.01 to 0.05 parts by weight, based on 100 parts by weight of the mixture of N-isopropyl acrylamide monomer and water. If the content of the photoinitiator is less than 0.01 parts by weight, there may be a problem that cross-linking by UV is not performed. Death can be a problem.
  • the photoinitiator may be used without limitation as long as it can initiate crosslinking through UV, for example, 2-hydroxy-1-1[4-(hydroxyethoxy)phenyl]-2-methyl-1 Propanone may be used.
  • the step of forming the coating layer is not limited as long as the coating layer by the aqueous coating solution is formed to the extent that the fluid permeates into the porous microwell, for example, the step of forming the coating layer may include spin coating or bar coating. can form. Furthermore, since the cell culture layer formed by the coating layer is formed in the same form as a hydrogel, the solution moves smoothly, so that the fluid can flow through the porous microwell and the hydrogel.
  • the step of forming a cell culture layer by irradiating UV to the coating layer is a step of polymerizing monomers, and if irradiating UV is performed so as to form a polymer of N-isopropyl acrylamide (polyisopropyl acrylamide).
  • irradiating UV is performed so as to form a polymer of N-isopropyl acrylamide (polyisopropyl acrylamide).
  • it may be performed by irradiating UV with 1800w for 10 minutes.
  • the three-dimensional cell aggregate culture method is cultured by attaching the three-dimensional cell aggregate to the cell culture layer at a temperature of more than 32 ° C. to less than 40 ° C., and a temperature of 0 ° C. or more to less than 32 ° C. may include detaching the three-dimensional cell aggregate from the cell culture layer, wherein the cells are myoblasts, fetal fibroblasts, human umbilical vein endothelial cells, or It may be human epidermal cells, but is not limited thereto.
  • Example 1 an upper chamber including a porous microwell at the bottom was prepared. Specifically, a porous microwell was prepared by drilling a hole of a certain size in poly methyl methacrylate (PMMA) and bonding polymer nanofibers with the hole-perforated PMMA together with an adhesive.
  • PMMA poly methyl methacrylate
  • an aqueous solution of N-isopropyl acrylamide having a high content ratio and an aqueous solution of N-isopropyl acrylamide having a low content ratio were prepared by using the phase separation phenomenon that occurs in a solution containing a high concentration of N-isopropyl acrylamide monomer. .
  • cells are attached to the upper surface of the porous microwell at a temperature of more than 32°C to less than 40°C, and at 0°C to less than 32°C, the cells are A cell culture vessel in which a detachable cell culture layer was formed was prepared.
  • the N-isopropyl acrylamide monomer and distilled water were mixed in a 1:1 mass ratio, and the mixture was stirred for 5 minutes so that the N-isopropyl acrylamide monomer was sufficiently dissolved in the distilled water.
  • the low concentration of N-isopropyl acrylamide aqueous solution and the high concentration of N-isopropyl acrylamide aqueous solution were stably divided, and finally, when the N-isopropyl acrylamide aqueous solution was stably separated, pi
  • Each solution was transferred to a vial using a pet, to obtain 5 ml of an aqueous solution of N-isopropylacrylamide having a high content ratio of N-isopropylacrylamide:water with a mass ratio of 87:13.
  • N,N'-methylenebisacrylamide a crosslinking agent to make it react to UV when UV irradiation treatment
  • N-isopropyl acrylamide monomer and water 100 weight 0.005 g of 2-hydroxy-1-1[4-(hydroxyethoxy)phenyl]-2-methyl-1-propanone as a photoinitiator a mixture of N-isopropylacrylamide monomer and water 0.01 parts by weight relative to 100 parts by weight
  • a composition prepared by adding a crosslinking agent and a photoinitiator to an aqueous solution of N-isopropylacrylamide is applied thinly on the polymer nanofibers using a bar coating, and then irradiated with a UV light source for 10 minutes to irradiate the upper surface of the porous microwell at 32°C to 40°C
  • a cell culture vessel was prepared in which a cell culture layer to which cells are attached and from which cells are detached at 0° C. or higher to less than 32° C. is formed.
  • 11A and 11B show a cell culture vessel in which a cell culture layer is formed on the top surface of the prepared porous microwell, in which cells are attached at a temperature of more than 32° C. to 40° C. or less, and from which cells are detached at a temperature of 0° C. or more to less than 32° C.
  • FIG. 13A shows a composition containing N-isopropyl acrylamide before coating the polymer nanofibers
  • FIG. 13B shows a cell culture layer after the composition containing N-isopropyl acrylamide is coated on the polymer nanofibers.
  • the cell culture layer is a combination of polymer nanofibers and hydrogel.
  • the human liver cancer cell line (HepG2) was seeded in the cell culture vessel of ⁇ Example 1> at 36° C., and three-dimensional cell aggregates were cultured after 3 days.
  • the upper chamber containing the three-dimensional human liver cancer cell line aggregate was moved to an environment of 20°C.
  • FIG. 14A is an image of a cell culture vessel in which cells are being cultured
  • FIG. 14B shows an image of the cultured cells
  • 14C shows an image of a cell culture vessel in which cultured cells are detached. As shown in Figure 5C, it was confirmed that the cells cultured in the cell culture vessel of the present invention are easily detached.
  • a cell culture apparatus according to an embodiment of the present invention, more precisely, a cell culture apparatus for enhancing the cell culture effect using bottom flow, and a cell culture method using the same. do it with
  • This embodiment relates to a three-dimensional cell culture apparatus capable of easily removing waste products generated during cell culture and smoothly supplying nutrients to the lower part of the three-dimensional cell.
  • the present invention provides an upper chamber 100 including an opening and a porous microwell; and a lower chamber 200 in which the upper chamber is disposed and a fluid can flow at the lower end of the porous microwell.
  • the upper chamber 100 may refer to a shape in which a well-shaped chamber including an opening 11 and a porous microwell 21 is inserted through a plate. Furthermore, the lower end of the porous microwell 21 refers to a lower region of the porous microwell, and refers to a region within the lower chamber 200 .
  • a through portion may be formed in the upper chamber 100 so that the fluid of the lower chamber 200 can contact the outside, and in this case, the through portion is formed in an adjacent portion of the porous microwell 21 of the upper chamber 100 .
  • a through portion may be formed at any position of the upper chamber 100 .
  • the position of the penetrating portion is not particularly limited as long as the shape of the porous membrane can be prevented from being deformed by the physical force formed by the flow of the fluid.
  • the lower chamber 200 may further include a fluid inlet 310 and a fluid outlet 330 through which a fluid may flow, through which the fluid of the lower chamber 200 may flow.
  • the fluid inlet 310 and the fluid outlet 330 may be additionally connected to a device capable of causing a flow, for example, the lower chamber 200 may be configured to allow the fluid to flow in the horizontal direction of the porous microwell 21 . It may be connected to a device for directing a flow of fluid that causes it to flow. In this case, a pump or the like may be used as a device for inducing the flow of the fluid, but is not limited as long as it can cause the flow of the fluid.
  • the fluid in the lower chamber 200 can flow stably through a fluid flow inducing device that allows the fluid flowing through the lower chamber 200 to flow at the bottom of the porous microwell 21. and, due to the permeability of the pores of the porous microwell 21, the fluid having the flow as described above can discharge waste products formed during 3D cell culture from the upper surface of the porous membrane to the lower chamber 200 3 Nutrients can be smoothly supplied to the lower part of the dimensional cells. Furthermore, wastes may be discharged from the lower chamber 200 to the outside of the three-dimensional cell culture apparatus.
  • the fluid flow inducing device may use a syringe pump, a peristaltic pump, or an agitator.
  • the 3D cell culture apparatus distributes the pressure applied to the porous microwell during 3D cell culture and efficiently removes and supplies the formed wastes and nutrients, the upper chamber 100 and the lower chamber 200 ), the penetrating portion 400 may be formed so that the surface of the fluid is in contact with the outside.
  • the penetrating portion 400 provides a structure in which the surface of the fluid of the lower chamber 200 can be in contact with the outside. Due to the structure as described above, pressure is applied to the upper chamber 100 when the fluid flows through the porous microwell. (21) is modified, thereby solving the problem of adversely affecting the seating, proliferation and differentiation of cells in three-dimensional cell culture.
  • the present invention provides a three-dimensional cell culture method comprising the step of culturing cells by introducing a cell culture medium and cells into a porous microwell using the three-dimensional cell culture apparatus of the present invention, wherein the cells are myoblasts ( myoblasts), fetal fibroblasts, human umbilical vein endothelial cells, human liver cancer cells (HepG2 cells) or human epidermal cells, but is not limited thereto.
  • myoblasts myoblasts
  • fetal fibroblasts human umbilical vein endothelial cells
  • HepG2 cells human liver cancer cells
  • epidermal cells but is not limited thereto.
  • a three-dimensional cell culture apparatus including an upper chamber 100 and a lower chamber 200 including a porous microwell having the form as shown in FIG. 15(a)
  • HepG2 cells and DMEM Dulbeco's Modified
  • FBS 10% Eagle's Media
  • a three-dimensional HepG2 spheroid was cultured in the same manner as in ⁇ Example 2>, except that the flow at the bottom was not given in ⁇ Example 2>.
  • albumin expression levels of Hep G2 spheroids were measured on the 6th and 9th days during the culture period.
  • the measured albumin expression level is shown in FIG. 16(a), and as shown in FIG. 16(a), the albumin expression level of Hep G2 spheroids cultured in ⁇ Comparative Example 2> was 1182.64mg/ml on the 6th day, the 9th day
  • the albumin expression amount of Hep G2 spheroids cultured in ⁇ Example 2> was 4813.99 mg/ml on the 6th day and 6644.55 mg/ml on the 9th day.
  • FITC-Dextran 20kDa was added to the porous microwell of the three-dimensional cell culture apparatus of the form as shown in Fig. 15(a). 200ug/ml was added, and the concentration of FITC Dextran remaining in the porous microwell was measured after the bottom flow was performed for 3 hours.
  • FITC-Dextran was added in the same manner as in ⁇ Example 3>, and the concentration of FITC-Dextran remaining in the porous microwell was measured after 3 hours.
  • FIG. 17 The result of visually examining the degree of waste accumulation in ⁇ Example 3> is shown in FIG. 17, and the concentration of FITC-Dextran measured in ⁇ Example 3> and ⁇ Comparative Example 3> is shown in FIG. 16(b). indicated.
  • FIG. 16(b) in the case of ⁇ Example 4> with bottom flow, the concentration of FITC-Dextran remaining in the porous microwell was 55.6199 ⁇ 3.3429 mg/ml, whereas in the case of ⁇ Comparative Example 3>, the porosity It was confirmed that the concentration of FITC-Dextran remaining in the microwell was 131.435 ⁇ 7.80245 mg/ml.
  • FIG. 18(a) is a view showing that wastes existing in the porous microwell are removed through the pores when there is a bottom flow of the culture medium, that is, the wastes are removed from the inside of the microwell as they pass through the pores along the flow of the fluid will show On the other hand, FIG.
  • FIGS. 19 to 29 a cell culture apparatus and a cell culture method according to another embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 19 to 29 .
  • the culture medium flow by pipetting It can solve the problem that the loss of cells and cell aggregates may occur.
  • the present invention it is possible to minimize the loss of cells as described above during the culturing process, and at the same time, it continuously induces a uniform microenvironment around cell aggregates, which exhibits a phenomenon more similar to the in vivo phenomenon compared to the two-dimensional culture. It becomes possible to culture dimensional cell aggregates.
  • the cell culture apparatus includes an upper chamber 110 including an opening, a porous membrane, and a porous microwell 21 having a cell culture space accommodating a culture solution.
  • the upper chamber 110 includes a lower chamber 210 having a space disposed therein, the fluid flowing into the upper chamber 110 is a porous microwell ( 21) and is introduced into the lower chamber 210, and the fluid in the lower chamber 210 is discharged so that the fluid flows.
  • the three-dimensional cell aggregate culture method the cell culture solution flows by the cell culture solution discharged from the lower chamber 210, further comprising the step of introducing the cell culture solution into the lower chamber 210; may be
  • the fluid introduced into the upper chamber 110 passes through the porous microwell 21 in the upper chamber 110 and flows into the lower chamber 210 . Further, the fluid in the lower chamber 210 is discharged to allow the fluid to flow, and in this case, the fluid in the lower chamber 210 is discharged through a fluid outlet provided in the lower chamber 210 or the upper chamber 110 ) and the lower chamber 210 may be discharged through a gap region, for example, may be discharged through an upper portion of the gap region.
  • the fluid outlet may be formed at any position of the lower chamber 210, for example, may be provided at the lower end of the lower chamber 210 as shown in FIG. 1(c), but is not limited thereto.
  • the fluid is discharged through the gap region between the upper chamber 110 and the lower chamber 210 as shown in FIGS. 29 (a) to (c). It is possible to form a flow of fluid as possible.
  • the size of each chamber can be adjusted so that a gap exists between the walls of each side of the upper chamber 110 and the lower chamber 210 in order to have a gap region between the upper chamber 110 and the lower chamber 210. And it is possible to discharge the fluid from the upper portion of the interface in contact with the air in the gap region between them.
  • the three-dimensional cell culture apparatus may have a discharge structure to discharge the fluid from the lower chamber 210 , and the discharge structure includes a fluid outlet 331 in the lower chamber 210 .
  • a structure for flowing a fluid through a structure, or a structure for flowing a fluid by discharging it through a gap region between the upper chamber 110 and the lower chamber 210 , that is, a gap existing between the upper chamber 110 and the lower chamber 210 . can be made with
  • the porous membrane is made of a nanofiber network, and may be a porous membrane having a porosity of 20% to 60%, for example, a porous membrane having a porosity of 30% to 50%.
  • the porosity is less than 20%, the permeability coefficient is lowered, and accordingly, the water pressure applied to the porous membrane increases, thereby causing a problem in that the viability of the cell aggregates being cultured on the porous membrane is reduced.
  • the porous membrane may have an average pore size of 10 nm to 10 ⁇ m. That is, since the porous membrane includes the average pore size in the above range, it can act as a selective permeation membrane that selectively permeates other substances such as nutrients and growth factors in the cell culture medium without permeating single cells. This induces the aggregation of single cells on the porous membrane to enable the formation of three-dimensional aggregates, and after the formation of aggregates, it can serve as a material transfer barrier and passage.
  • the porous membrane may have characteristics of high permeability within the porosity and average pore size range of the present invention.
  • the porous membrane may have a hydraulic conductivity of 1 to 20 ⁇ m s ⁇ 1 .
  • the permeability coefficient is less than 1 ⁇ m s -1 , high water pressure is caused in the porous membrane, and when a water pressure of 1000 Pa or more is applied to the porous membrane and the cell aggregate in culture, there may be adverse effects such as lowering the viability of cells. .
  • the porous membrane is a nanofiber network for cell culture, and its manufacturing method is not particularly limited, but may be made of, for example, polymer nanofibers formed by electrospinning.
  • the method for preparing the nanofiber network may include, for example, electrospinning a solution in which polycaprolactone is dissolved in a solvent of a chloroform/methanol (3/1 vol/vol) mixture to a concentration of 4 to 10 wt %. .
  • the electrospinning is preferably performed at a discharge rate of a polymer solution of 0.1 to 2.0 ml hr -1 under a voltage of 10 to 30 kV, and when the voltage is less than the above range, there is a problem in uniform nanofiber production, If it exceeds, there may be a problem in the manufacture of stable nanofibers such as non-uniform stacking of nanofibers.
  • the porous microwell may be a porous membrane in which all or a part of the depression formed concave in the downward direction is preferably a porous microwell, that is, when the opening of the upper chamber is disposed to face upward, the surface forming the bottom is porous formed into a membrane.
  • the porous membrane constituting the lower surface of the upper chamber 110 of the present invention may be formed to have a protrusion and/or a concave portion.
  • a concave portion may be formed by using a porous membrane as shown in FIG. 28, or a concave portion may be formed by additionally adding a sidewall or protrusion capable of forming a compartment corresponding to the concave portion on the porous membrane as shown in FIG.
  • the material of the side wall or the protrusion is not particularly limited to that which may or may not be porous.
  • the underside of the recess is a porous membrane, and the sidewall or protrusion may or may not be porous.
  • FIG. 21 (a) and 21 (b) are examples showing the shape when the sidewall of the concave portion is not a porous material by laminating an additional layer in which a through hole is formed
  • FIG. 21 (c) is the porous membrane itself This is a case in which the concave portion is formed in the , and the concave portion and the non-concave portion are made of a porous material as a whole.
  • the porous microwell may be prepared, for example, by combining a porous membrane fabricated by electrospinning with an arrangement of through-holes as shown in FIG. 26, but is not limited thereto.
  • the formation of the concave part and the protrusion part of the porous material may be performed using a compression process using a mold as shown in FIG. 28 , for example.
  • the upper surface of the porous membrane of the porous microwell is a region acting as a cell culture layer.
  • the porous membrane has protrusions and concave portions, cells are more easily seated in the formed concave portion, and the porous microwell By inducing aggregation of single cells in the well, three-dimensional cell aggregates can be stably formed and then cultured.
  • a more preferred porous membrane of the present invention has protrusions and recesses, and all surfaces are made of the porous membrane.
  • the lower chamber 210 has a space in which the upper chamber 110 is disposed, and when a fluid outlet is provided in the lower chamber 210, a fluid outlet 331 through which the fluid can be discharged as described above is provided.
  • the culture solution may flow while the fluid of the lower chamber 210 containing the culture solution is discharged to the outside of the lower chamber in a state in which it is disposed therein.
  • a device capable of generating a flow may be additionally connected to the upper and/or lower chamber 210 , and for example, a device for injecting a cell culture solution into the upper chamber 110 at a constant flow rate may be added.
  • the lower chamber 210 allows the fluid introduced into the upper chamber 110 to pass through the porous membrane of the upper chamber 110 and flow into the lower chamber 210 and discharged at a constant flow rate. It can be connected to a device that controls the At this time, as long as it can cause the flow of the fluid, the device for inducing the flow of fluid is not limited, for example, the device for inducing the flow of fluid is a syringe pump, a peristaltic pump, or an agitator. can be used
  • the three-dimensional cell culture apparatus is disposed on the same plane as the lower chamber 210, and in fluid communication with the lower chamber 210, may further include a culture solution reservoir 65, the culture solution reservoir (65) The height of the culture solution may be set to correspond to the level of the culture solution in the lower chamber (210).
  • the water level of the culture medium in the lower chamber 210 may be a height of 1 to 20 mm in the upper direction based on the porous membrane at the bottom of the upper chamber 110, for example, 1 to 19 mm, preferably 1 to 18 mm, for example 1 to 8 mm. If the water level of the culture medium is less than the preferred range, it may be impossible to supply nutrients to the cell aggregates in culture, and if it exceeds the preferred range, overflow and overuse of the culture may occur.
  • the distance between the porous membrane at the bottom of the upper chamber 110 and the bottom of the lower chamber 210 may be 0.1 to 8 mm, for example, 0.2 to 7 mm, preferably 1 to 5 mm. .
  • the interval is less than the above preferred range, the flow of the cell culture medium is restricted, and discharge through the outlet may be impossible. In addition, when it exceeds the above preferred range, it may lead to overuse of the culture medium.
  • the fluid that is, the cell culture solution may flow while maintaining a constant speed.
  • the inflow and discharge of the fluid may be controlled at a constant speed.
  • the fluid may flow at a rate of 0.0001 to 1 ml hr -1 , for example, 0.001 to 1 ml hr -1 , preferably at a rate of 0.01 to 1 ml hr -1 .
  • the flow rate of the fluid is less than 0.0001 ml hr -1 , there may be a problem in that the required amount of cell culture solution for the cell aggregates is not supplied . Stress can act and adversely affect cell aggregates.
  • a shear stress that does not adversely affect cells for example, a shear stress of 0.001 to 10 dyne cm -2 may have a positive effect on cell differentiation and proliferation.
  • the cell culture medium is preferably applied to the porous membrane at a water pressure of less than 1000 Pa, more preferably as the pressure is less, for example, may be 1 Pa to 100 Pa. On the other hand, when it exceeds 1000 Pa, there is a problem that the cell viability is reduced.
  • cell lines such as Myoblasts, Embryo fibroblasts, Umbilical vein endothelial cells ), liver cancer cells (HepG2 cells), epidermal cells, or a mixture of at least one or more thereof.
  • cell lines such as Myoblasts, Embryo fibroblasts, Umbilical vein endothelial cells ), liver cancer cells (HepG2 cells), epidermal cells, or a mixture of at least one or more thereof.
  • primary cells such as liver, pancreas, and small intestine may be used.
  • stem cells for example, induced pluripotent stem cells (Induced pluripotent stem cells), mesenchymal-derived stem cells (Mesenchymal stem cells) or cells such as a mixture of at least one or more thereof may be cultured, but is limited thereto No, it is possible to culture spheroids or organoids, which are three-dimensional cell aggregates.
  • induced pluripotent stem cells Induced pluripotent stem cells
  • mesenchymal-derived stem cells mesenchymal stem cells
  • organoids which are three-dimensional cell aggregates.
  • the three-dimensional cell aggregate culture method using the three-dimensional cell culture apparatus of the present invention, the steps of inoculating the cells on the porous membrane of the upper chamber (110); and introducing the cell culture solution to the upper part of the upper chamber 110 through the inlet 311 or the opening.
  • the cells may be inoculated and cultured on the porous membrane, and the inoculation may be performed by inoculating cells to be cultured on the porous membrane prior to introducing a fluid into the upper chamber 110 .
  • the cells may be applied to the above three-dimensional cell culture apparatus, and the method of inoculating the cells may be performed by a method used in the art, for example, may be inoculated using a micropipette.
  • Cells seeded with this method form three-dimensional cell aggregates within hours to days. After the formation of cell aggregates, the flow of the cell culture solution can be applied by the developed device.
  • PCL Polycaprolactone
  • Mn 80,000 g mol -1
  • chloroform and methanol purchased from Sigma-Aldrich (USA).
  • a PCL solution for electrospinning was prepared by dissolving PCL in a mixture of chloroform/methanol (3/1 vol/vol) at a concentration of 7.5 wt%. Put the prepared PCL solution into a 5 ml precision syringe (Gastight syringe; Hamilton) and use a commercial electrospinning machine (ES-robot, NanoNC) through a 23 gauge metal needle placed at a distance of 10 cm on an annular electrode with a diameter of 5 cm. It was discharged at a flow rate of 1ml h -1 .
  • ES-robot, NanoNC commercial electrospinning machine
  • Electrospinning was performed by applying a high voltage of 15 kV between the metal needle and the annular electrode using the commercial electrospinning machine. As-electrospun PCL nanofibers were deposited between annular electrodes to create gas- and mass-permeable nanofiber membranes. Electrospinning was performed at a relative humidity of 50 to 60% and a temperature of 20 to 25 °C. The photomicrograph according to the spinning time when manufacturing the nanofiber network is shown in FIG. 22, and it was confirmed that the nanofiber diameter was about 800-1000 nm, and as the spinning time increased, the average pore size and porosity (Porositiy) decreased. Conversely, the average thickness increased.
  • FIG. 22(a) Structural change (Fig. 22(a)), porosity change (Fig. 22(b)) of the nanofiber network according to the spinning time during the manufacture of the nanofiber network, and the hydraulic conductivity of the porous membrane (Fig. 22(c)) , and induced pressure (FIG. 22(d)) are shown in FIG. 22, respectively.
  • the calculation method of the porosity was to convert the enlarged microscope image into a binary image, and then use Image J software (NIH, USA) to calculate the area fraction of the pores generated by the nanofiber network compared to the area of the nanofiber network. calculated and shown.
  • FIG. 26 A series of processes were performed to prepare an upper chamber including the porous membrane obtained in 1. above and a porous microwell having a cell culture space for accommodating the culture solution, and this is shown in FIG. 26 .
  • the porous membrane area at the bottom of the upper chamber is coated with an adhesive on a 500 ⁇ m thick polymethyl methacrylate plate (PMMA, Acryl Choika, South Korea) and then a laser cutter (ML-7050A, Machineshop, South Korea) is used.
  • An array of through-holes was drilled in the PMMA plate coated with an adhesive, and the through-hole and the porous membrane were combined using the applied adhesive to finally form a concave part with a porous membrane as shown in FIG. 21 .
  • FIG. 28 A series of processes for fabricating the porous membrane area at the bottom of the upper chamber of another type is shown in FIG. 28 . More specifically, the flat porous membrane obtained in step 1. was subjected to a compression process using a protruding mold and a concave mold to complete the lower end of the upper chamber having a porous membrane with protrusions and concavities formed on all surfaces of the porous membrane. .
  • the concave mold was manufactured by drilling on a 10 mm thick polymethyl methacrylate plate (PMMA, Acryl Choika, South Korea) using a machining facility (EGX-350, Roland, USA), and polydimethylsiloxane (Polydimethylsiloxane) was used. ; PDMS), a mixture of PDMS and curing agent (Sylgard 184, Dow Corning, USA) in a weight ratio of 10:1 was poured into a depression mold and cured at 55° C. for 12 hours to complete.
  • PMMA polymethyl meth
  • the remaining side parts having an opening shape were manufactured using an injection molding machine (SE50D, Sumitomo, Japan).
  • SE50D injection molding machine
  • the side portion thus obtained and the lower end of the upper chamber obtained above were combined using an adhesive to complete the upper chamber including the porous microwell.
  • a lower chamber composed of polydimethylsiloxane (PDMS) and its cover a mixture of PDMS and curing agent (Sylgard 184, Dow Corning, USA) in a weight ratio of 10:1 was poured into a mold and cured at 55°C for 12 hours. did.
  • the mold of the lower chamber and cover was manufactured using a 20 mm thick PMMA plate using machining equipment (EGX-350, Roland, USA).
  • the lower chamber was manufactured to have a size of 30 mm ⁇ 30 mm ⁇ 30 mm, and at this time, a 2 mm deep groove was designed on the upper surface (Fig. 27(a)) of the porous microwell manufactured in 2.
  • the distance interval to the porous membrane was set to 8 mm (Fig. 27(b)).
  • a biopsy punch (Miltex, USA) was used to form a hole in the bottom of the lower chamber and the center of the cover by drilling a hole in the size of 1 mm.
  • a tube (Biokonvision, South Korea) was connected through the perforation of the opening cover, and a syringe pump (KDS200, KD Scientific, USA) was injected with the cell culture medium at a flow rate of 0.062 ml h -1 through the tube.
  • the perforation on the bottom surface of the lower chamber was also connected to the tube so that the cell culture solution could be transferred to the culture solution reservoir.
  • the height of the reservoir is set to correspond to the level of the culture solution in the lower chamber, and the culture solution is continuously introduced from the syringe pump during the culture process. It was designed to maintain a constant level of the chamber culture medium.
  • a three-dimensional cell culture apparatus including an upper chamber and a lower chamber including the porous microwell prepared in 1 above and a culture medium reservoir capable of storing the discharged culture medium was prepared as shown in FIG. 19 .
  • the height of the culture medium reservoir was set to correspond to the water level of the lower chamber by 12 mm from the bottom of the lower chamber.
  • HepG2 liver cells
  • DMEM Dulbeco's Modified Eagle's Media, FBS 10%
  • Cell culture medium replacement using pipetting was performed without using an impermeable microwell composed of the bottom surface of an impermeable PMMA plate rather than a porous membrane and a device that applies the flow of the cell culture medium, such as a syringe pump or a culture medium reservoir.
  • HepG2 spheroids were cultured in the same manner as in Example 4, except that.
  • the flow velocity in the three-dimensional cell culture apparatus of Example 4 through COMSOL Multiphysics software (Version 5.0, USA) ( Surface velocity: 0 ms -1 ⁇ 8.11 e -6 ms -1 ), flow direction (black cone shape), and streamline (white line) were analyzed and calculated.
  • Example 4 the degree of loss of liver cell spheroids was compared at 2-day intervals, and the results are shown in FIG. 23 .
  • Example 23 there was no loss of liver cell spheroids in Example 4, but in Comparative Example 4, spheroids were continuously lost, and on the 8th day, about 15% of HepG2 cell spheroids were lost. could be seen to occur.
  • Example 4 In Example 4 and Comparative Example 4, COMSOL Multiphysics software (Version 5.0, USA) was used to measure and analyze the concentration of nutrients (glucose) around the HepG2 spheroids over time. The numerical values used in this process are shown in Table 1 below.
  • K is the permeability coefficient of the porous membrane
  • L is the thickness of the porous membrane
  • t is the time from h i to h f
  • hi and h f of 100 mm and 10 mm were utilized in this experiment, respectively.
  • the permeability of the porous membrane was calculated using the following formula.
  • k is the current permeability of the porous membrane
  • ⁇ is the viscosity of the cell culture
  • ⁇ is the density of the cell culture
  • g is the acceleration of gravity
  • the water pressure applied to the porous membrane was calculated using the following equation (Kozeny-Carman equation) based on the cell culture medium that permeates the porous membrane at a flow rate of 0.062 ml hr -1 , the measured permeability coefficient, and the calculated permeability.
  • the current flow rate k of the fluid passing through the porous membrane is the current permeability of the porous membrane
  • ⁇ is the viscosity of the cell culture medium
  • L is the thickness of the porous membrane
  • p is the water pressure applied to the porous membrane.
  • the hydraulic pressure applied to the porous membrane is lower as the network of nanofibers constituting the porous membrane is coarse, that is, the electrospinning time is short, that is, the porosity and permeability coefficient are high. Confirmed. When this was compared with a commercial porous membrane, not the porous membrane of the present invention, it was confirmed that a much lower hydraulic repulsion force was applied to the porous membrane of the present invention, and the porous membrane composed of a nanofiber network is more suitable for the device of the present invention was able to confirm

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 배양장치 및 배양방법에 관한 것으로, 구체적으로는 다공성 마이크로웰 및 멤브레인, 그리고 그 외에 부가적인 구성요소들을 포함하는 배양장치를 활용하여 3차원 세포 응집체를 효과적으로 배양하는 기술 전반에 관한 것이다.

Description

3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법
본 발명은 3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 배양장치 및 배양방법에 관한 것으로, 구체적으로는 다공성 마이크로웰 및 멤브레인, 그리고 그 외에 부가적인 구성요소들을 포함하는 배양장치를 활용하여 3차원 세포 응집체를 효과적으로 배양하는 기술 전반에 관한 것이다.
실제 몸 속의 세포는 3차원의 형상이며, 이러한 세포는 세포의 미세환경과도 3차원적으로 상호작용 한다. 한편, 세포 배양 시 종래의 기술과 같이 체외에서 세포를 3차원 구조가 아닌 2차원의 단일 층(Monolayer)으로 배양할 경우 체내의 세포와 형태적인 측면에서 유사성이 크게 결여 되며, 3차원 배양하는 경우 약물 스크리닝(Drug screening) 및 세포 치료제(Cell therapy)로 활용 시 실제 생체 내 현상과 보다 유사한 현상을 확인할 수 있다.
이와 같이, 상기와 같은 2차원 단일 층 세포배양의 한계를 극복하기 위해, 3차원 세포 응집체(3D cell aggregation) 배양 및 분화가 가능한 마이크로웰 플랫폼에 대한 요구가 전 세계적으로 증가하고 있다.
한편, 종래 마이크로웰은 다공성 구조를 가지지 않거나 플라스틱 등을 이용하였기 때문에 3D cell aggregation 형성에 한계가 있었으며, 3차원 세포 응집체가 형성되었다 하더라도 마이크로웰 플랫폼으로부터 탈착시키는 과정이 쉽지가 않은 문제점도 있었고, 또한 종래 제안되어 왔던 배양 환경은 배양 시 발생되는 노폐물 배출과 영양분 공급을 수동적 확산에만 의존하고 있어 3차원 세포 응집체의 성장 및 성숙을 제한하는 문제가 있었다.
본 발명은 위와 같은 한계 및 문제점에 착안하여 제안된 것으로, 3차원 세포 응집체를 종전에 비해 효과적으로 배양할 수 있는 배양장치 및 이를 이용한 배양방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 위의 기술적 문제점을 해소시키는 것 외에도 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 발명할 수 없는 추가적인 기술요소들을 제공하기 위해 발명되었다.
본 발명은 3차원 세포 응집체, 더 정확하게는 3차원 세포 스페로이드(spheroid) 형성이 가능한 환경을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 세포 배양 온도에서는 3차원 세포 응집체의 형성을 유도하고 배양에 용이한 특성을 그대로 유지하지만, 실온에서는 대량의 3차원 세포 응집체가 동시에 마이크로웰 플레이트로부터 탈착 가능하도록 하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 안정적인 3차원 세포의 배양과 세포 배양 시 노폐물을 효율적으로 배출하고 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있도록, 다공성 마이크로웰의 하단부에 유동조절을 가능하게 하는데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 기존에 널리 사용되고 있는 반복적인 세포 배양액 교체를 위해 마이크로웰의 상면인 세포 배양면에 대한 파이펫팅에 의해 발생되는 세포 및 3차원 세포 응집체 유실 등을 최소화하며 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변환경을 제공 할 수 있는 환경을 제공하는 것을 목적으로 한다.
위와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 장치는, 개구부, 다공성 박막 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공 성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버; 및 상기 상부챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부챔버를 포함하며, 상기 상부챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부챔버로 유입되고, 하부챔버의 유체는 배출되어 유체가 유동되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 3차원 세포 응집체 배양 방법은, 상기 3차원 세포 배양 장치를 이용하여, 상부챔버의 다공성 멤브레인 상에 세포를 접종하는 단계; 세포 배양액을 상부챔버로 투입하는 단계; 및 상부챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 하부챔버로 유입된 세포 배양액을 하부챔버로부터 배출하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면 3차원 세포 응집체, 또는 세포 스페로이드(spheroid)가 효과적으로 형성될 수 있는 환경이 제공됨으로써 일정 영역 안에 안착한 세포가 보다 원활하게 3차원적으로 증식 및 분화 가능할 수 있다.
또한 본 발명에 따르면 온도변화를 통해 세포의 배양 및 수확에 각각 용이한 표면 거칠기를 가지는 표면구조의 마이크로웰 플레이트를 구현할 수 있으며, 이를 통해 3차원 세포 응집체의 대량 생산 및 수확이 가능해지는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면 세포 배양 시 세포의 안착, 증식 및 분화에 악영향을 주지 않으면서, 세포 배양 시 형성되는 노폐물을 효율적으로 제거하고 3차원 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있는 배양 환경을 구현할 수 있게 된다.
또한 본 발명에 따르면 세포를 배양하는 과정 중 세포 및 세포 응집체의 유실 가능성을 현저히 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변미세환경을 제공 할 수 있는 효과가 있다. 나아가 배양액 저장소의 높이는 하부챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정하여 배양 과정에서 배양액의 높이를 일정하게 유지할 수 있다.
또한, 투수계수(Hydraulic conductivity)가 매우 우수한 다공성 마이크로웰을 사용하여 다공성 마이크로웰 및 그 내부에서 배양중인 3차원 세포 응집체에 인가되는 수압을 최소화 하여 유동의 흐름 외의 불필요한 자극을 최소화 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 일측 단면도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이트(30)를 나타낸다.
도 4는 도 2에서 하나의 개구부(31) 주변을 확대한 도면을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기에서 세포가 증식하는 모습을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 몸체(10) 및 체결부(40)를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 순서를 나타낸다.
도 8은 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 S10 또는 S100에 대한 일 예를 나타낸다.
도 9는 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 S20 또는 S200에 대한 일 예를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법으로 형성한 멤브레인(20)의 사진을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 제조된 세포 배양 용기의 상부챔버를 위에서 관찰한 이미지를 나타낸다. 도 11B 는 도 11A의 다수의 다공성 마이크로웰 중 하나를 확대한 도면이다.
도 12는 세포 배양층의 표면 거칠기 변화를 온도 및 시간에 따라 나타낸 것이다.
도 13A는 다공성 마이크로웰을 확대한 도면이며 도 13B는 상기 다공성 마이크로웰 상면에 폴리이소프로필아크릴아마이드를 포함하는 세포배양층이 형성된 것을 도시한 것이다.
도 14A는 3차원 세포 응집체를 배양하는 과정에서 촬영한 이미지를 나타낸다. 도 14B는 웰 플레이트로부터 탈착된 세포 응집체를 나타낸다. 도 14C는 세포 응집체가 탈착된 후의 웰플레이트가 촬영된 도면을 나타낸다.
도 15(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 장치의 예시도이며, 도 15(b)는 본 발명의 3차원 세포 배양 장치의 상부챔버에 있어서 다공성 마이크로웰의 인접한 부분에 관통부가 형성된 경우의 예시도이고, 도 15(c)는 3차원 세포 배양 장치의 실제 이미지를 나타낸다.
도 16(a)는 본 발명의 <실시예 2> 및 <비교예 2>에서 측정된 알부민의 발현양을 비교한 것이며, 도 16(b)는 본 발명의 <실시예 3> 및 <비교예 4>에서 측정된 FITC-Dextran의 농도를 비교한 것이다.
도 17은 본 발명의 <실시예 3>에 따라, 시간에 따라 노폐물이 제거되는 모습을 육안으로 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 18은 본 발명의 하부챔버에서 유체 흐름 및 다공성 마이크로웰에 의해 다공성 마이크로웰 상면의 노폐물이 제거되는 개략도, 및 배양액이 다공성 마이크로웰 내측으로 확산되는 개략도를 나타낸다.
도 19는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 배양 장치를 나타낸 것으로, 도 19(a)는 세포 배양 장치의 전체적인 형태를 나타내며, 도 19(b)는 하나의 상부챔버 및 하부챔버의 조합을 확대하여 나타낸 것이고, 도 19(c)는 배출구와 연결된 배양액 저장소를 포함하는 세포 배양 장치의 단면도를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명에 따른 세포 배양 장치에서 다공성 멤브레인을 통해 투과되는 배양액의 흐름을 시뮬레이션 한 결과를 나타낸다.
도 21은 다공성 멤브레인이 오목부를 구비하는 형태로 구성된 다공성 마이크로웰의 현미경 사진을 나타낸다. 도 21(a)는 4배, 도 21(b)는 220배의 배율로 확대한 이미지이다. 도 21(c)는 다공성 멤브레인이 오목부를 구비하는 또 다른 형태의 다공성 마이크로웰의 사진을 나타내는 것으로, 도 21 (c) a)는 DSLR 카메라, 도 21(c) b) 와 (c) c)는 각각 4배와 20배의 배율로 확대한 현미경 이미지이다.
도 22는 전기 방사 시간에 따른 다공성 멤브레인의 나노섬유 네트워크의 구조 및 특성 변화를 나타낸다. 보편적인 상용 다공성 멤브레인인 8 μm 공극 사이즈의 Transwellinsert (Corning, USA) 제품의 멤브레인을 참조를 위해 함께 첨부 하였다(가장 좌측, TW). 도 22(a)는 상용 멤브레인, 전기방사 시간 변화에 따른 각 나노섬유 네트워크 구조를 20배의 배율로 확대한 현미경 이미지이다. 도 22(b), (c) 및 (d)는 상용 멤브레인과 전기방사 시간에 따른 각 나노섬유 네트워크 구조의 공극률(Porosity)(도 22(b)), 투수계수(Hydraulic conductivity)(도 22(c)), 및 수압(Induced pressure)을 나타낸다.
도 23은 본 발명에 따른 세포 배양 장치를 사용할 경우의 세포 응집체 유실 정도와 종래 파이펫팅에 의한 세포 배양액 교체 방법을 통해 세포를 배양할 경우의 세포 응집체 유실 정도를 비교한 실험 결과를 나타낸다.
도 24는 본 발명에 따른 세포 배양 장치를 사용할 경우의 세포 응집체 주변 영양분 농도(Glucose concentration)와 종래 파이펫팅에 의한 세포 배양액 교체방법을 통해 세포를 배양할 경우의 세포 응집체 주변 영양분 농도를 수치 시뮬레이션을 통해 비교한 결과를 나타낸다.
도 25는 세포 배양 장치에 존재하던 유체가 새롭게 주입되는 유체로 원활하게 교체되고, 이 과정에서 하부챔버 내 배양액의 수위가 일정하게 유지 되는 모습을 도시한 것이다.
도 26은 다공성 마이크로웰을 제조하는 방법을 나타낸다.
도 27은 본 발명에 따른 세포 배양 장치에 사용되는 하부챔버(a)와 하부챔버 내부에 삽입된 상부챔버(b)를 나타낸다.
도 28은 압축공정을 이용하여 다공성 마이크로웰을 제조하는 방법을 도시한 것이다.
도 29는 상부챔버와 하부챔버 사이의 간극 영역을 통해 유체가 배출되도록 하여 유체의 흐름을 형성하는 과정을 나타낸 것으로, (a)는 사진, (b)는 도식화 한 이미지, 그리고 (c)는 이 경우 형성되는 유체의 유속을 나타낸 것이다.
먼저 도 1 내지 도 10을 참고하여 본 발명에 따른 세포 배양 장치를 구성하는 기본 구성인 세포 배양 용기 및 이의 제조 방법에 대해 살펴보기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기를 나타내며, 도 2는 일측 단면도를 나타낸다. 도 2는 도 1에서 A와 A'를 잘라낸 일측 단면을 나타낸다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이트(30)를 도시한 것이다.
세포 배양 용기는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 몸체(10) 및 멤브레인(20)을 포함할 수 있으며, 추가적으로 플레이트(30)를 더 포함할 수 있다. 이하에서는 설명의 편의를 위해, 플레이트(30)에 대해 먼저 설명한 후, 몸체(10) 및 멤브레인(20)에 대해서 차례로 설명하도록 한다.
플레이트(30)는 개구 형상인 하나 이상의 개구부(31)를 구비한 것으로서, 위 개구부(31)에는 몸체(10)가 삽입 장착될 수 있다. 개구부(31)는, 도 3(a)에 도시된 바와 같이 하부가 닫히고 상부가 개방된 개방형태이거나, 도 3(b)에 도시된 바와 같이 플레이트(30)를 관통하는 관통형태일 수 있다. 개구부(31)가 관통형태인 경우, 세포 배양 용기는 상부가 개방된 수용 공간을 가질 수 있으며, 수용 공간은 플레이트(30)를 장착하는 커버 용기를 더 포함할 수 있다.
플레이트(30)에 복수개의 개구부(31)가 구비된 경우 각 개구부(31)들이 서로 이격 배열될 수 있으며, 이에 따라 세포 배양 시에는 각 개구부(31)들의 샘플 간 영향을 차단될 수 있고, 결과적으로 복수의 독립적인 실험 데이터를 하나의 플레이트(30)를 이용하여 도출할 수 있다.
몸체(10)는, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 스페이서(SP)와, 타단에 형성된 입구부(11)와, 스페이서와 입구부(11)를 관통하는 관통부를 각각 포함한다. 참고로 스페이서는 몸체(10)의 측면 내지 측벽에 해당하는 부분을 가리키는 것으로, 도면 상에서는 도면부호 SP로 표시하였다. 도면에서도 볼 수 있는 것과 같이 스페이서의 바깥면은 개구부(31)의 내측면과 마주보되, 스페이서와 개구부 내측면 사이에는 소정의 간격 내지 공간이 존재하는 것을 확인할 수 있다.
몸체(10)의 스페이서(SP)는 플레이트(30)의 개구부(31)에 삽입될 수 있다. 이때, 몸체(10)는 하나의 삽입부를 포함하거나, 복수개의 삽입부를 포함할 수 있다. 즉, 하나의 삽입부를 포함하는 경우, 몸체(10)는 해당 삽입부가 하나의 개구부(31)에 삽입될 수 있다. 또한, 복수의 삽입부를 포함하는 경우, 몸체(10)는 각 삽입부가 다수의 개구부(31)에 대응하여 삽입될 수 있다. 이때, 복수개의 삽입부를 포함할 경우, 몸체(10)는 각 삽입부가 서로 연결된 구조를 가지며, 각 삽입부가 각 개구부(31)에 대응하여 삽입될 수 있다.
도 1 내지 도 6은 하나의 삽입부를 포함한 몸체(10)에 대해서 도시하고 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 내용은 몸체(10)가 복수개의 스페이서 및 관통부를 포함하는 경우에도 당연히 적용될 수 있다.
몸체(10)의 스페이서가 개구부(31)에 삽입될 때, 몸체(10)의 스페이서는 하부에 위치하며, 몸체(10)의 입구부(11)는 상부에 위치한다. 몸체(10)의 스페이서는, 일단에서부터 타단까지 폭이 일정한 수직 형태이거나, 일단에서부터 타단까지 폭이 점차 확대되는 깔때기 형태이거나, 수직 형태와 깔때기 형태가 복합된 형태일 수 있다. 몸체(10)의 관통부는 그 단면이 원형, 다각형 등 다양한 형상으로 형성될 수 있으며, 그 크기도 다양하게 형성될 수 있다.
도 4는 하나의 개구부(31) 주변을 확대한 도면을 나타낸다. 특히, 몸체(10)의 스페이서가 플레이트(30)의 개구부(31)에 장착될 때, 몸체(10)의 스페이서 일단이 세포 배양 용기의 바닥면으로부터 일정 간격 떨어지게 위치하도록, 몸체(10)의 입구부(11)는, 도 4에 도시된 바와 같이, 몸체(10)의 스페이서 및 개구부(31)의 입구 보다 넓은 단면을 가지는 것이 바람직하다. 이에 따라, 몸체(10)의 스페이서와 세포 배양 용기의 바닥면 사이의 공간에는 세포에 공급하기 위한 영양분을 가지는 유체의 통로가 형성될 수 있다. 이때, 세포 배양 용기의 바닥면은 개방형태 플레이트의 경우엔 그 개방부의 바닥면일 수 있으며, 관통형태 플레이트의 경우엔 커버 용기의 바닥면일 수 있다.
멤브레인(20)은 세포가 배양되는 세포 배양면을 제공하는 층으로서, 몸체(10)의 스페이서 측의 관통부에 채용된다. 예를 들어, 멤브레인(20)은 전기방사법를 통해 형성되어 몸체(10)의 스페이서 일단을 덮는 형태로 형성될 수 있다. 이때, 멤브레인(20)은 복수개의 고분자 나노 섬유가 무작위로 얽혀짐으로써 이루어지거나, 고분자 합성 수지가 성형됨으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 각 고분자 나노 섬유는 1㎚ 이상 내지 1000㎚ 미만의 직경을 가질 수 있다. 복수개의 고분자 나노 섬유로 이루어짐에 따라, 멤브레인(20)은 생체 내 기저막과 유사한 구조를 가짐에 따라 생체 내 혈액 유동 환경을 제공할 수 있다.
예를 들어, 고분자 나노 섬유 또는 고분자 합성 수지는 열가소성 수지, 열경화성 수지, 탄성 중합체 및 생체 고분자 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고분자 나노 섬유 또는 고분자 합성 수지는 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐리덴 플로라이드 (Polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리스티렌(polystyrene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan) 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
멤브레인(20)은 다공성의 마이크로웰(microwell)(21), 연결부(22) 및 고정부(23)를 포함할 수 있다. 이때, 마이크로웰(21), 연결부(22) 및 고정부(23)는 복수개의 고분자 나노 섬유가 얽혀짐으로써 서로 연결된 구조를 갖는다.
마이크로웰(21)은 세포 배양면으로 작용하는 영역으로서, 하부 방향으로 오목하게 형성된다. 이러한 오목 형상에 의해 세포는 마이크로웰(21) 내에 쉽게 안착하게 되며, 유체의 이동과 관계 없이 마이크로웰(21) 내에서 안정적으로 증식할 수 있게 된다. 이때, 마이크로웰(21)은 적어도 하나가 몸체(10)의 관통부가 이루는 영역 내에 위치한다. 즉, 상부 또는 하부에서 바라볼 때, 마이크로웰(21)은 몸체(10)의 관통부 보다 크기가 작으며 관통부가 이루는 영역 내에 포함된다.
세포 배양면인 마이크로웰(21)이 오목 형상으로 형성됨에 따라, 멤브레인(20)은 세포가 세포 배양면에 더 집중적으로 안정하게 부착될 수 있게 하고 세포 배양면의 면적을 증가시킬 수 있어, 세포의 부착 효율을 향상시킬 수 있다. 또한, 통상적으로 평평한 형상의 세포 배양면을 구비하는 종래의 세포 배양 용기와 달리, 본 발명에 따른 세포 배양 용기의 몸체(10)는 입체적인 3차원 형상의 세포 배양면을 구비하는데, 이를 통해 생체 내와 같이 3차원 구조 환경에서 세포를 배양할 수 있어 3차원 세포 스페로이드(spheroid)를 형성할 수 있다. 다수 개의 마이크로웰(21)이 몸체(10)의 관통부가 이루는 영역 내에 위치할 경우, 몸체(10)의 스페이서가 다수의 세포 배양면을 가져 세포 부착 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
연결부(22)는 임의의 마이크로웰(21)과 그 주변에 형성되어 마이크로웰(21) 사이를 연결하는 영역으로서, 평평한 형태를 가질 수 있다. 또한, 연결부(22)는 마이크로웰(21) 보다 그 두께가 더 두꺼울 수 있다. 이는 후술할 엠보싱(embossing) 공정에 의해 마이크로웰(21)이 멤브레인(20) 중에서 하부 오목 형상으로 늘어나는 영역에 해당하여 원래 보다 얇아지는 반면, 연결부(22)는 늘어나지 않는 영역에 해당하여 원래 두께를 유지하기 때문이다.
고정부(23)는 몸체(10)의 스페이서 일단의 테두리에 고정된 영역이다. 또한, 고정부(23)는 연결부(22) 보다 두께가 얇고 밀도가 낮을 수 있다. 이는 멤브레인(20)이 전해질 용액을 이용한 전기방사법을 통해 형성될 수 있기 때문이다. 즉, 마이크로웰(21) 및 연결부(22)는 전기방사 시에 전해질 용액이 담긴 위치에서 생성되는 영역에 해당하므로, 고정부(23) 보다 더 많은 수의 고분자 나노 섬유가 형성되어 고정부(23)에 비해 밀도가 크고 두께가 두껍게 형성될 수 있다.
도 5는 본 발명에 따른 세포 배양 용기에서 세포가 증식하는 모습을 나타낸다. 도 5(a), 도 5(b) 및 도 5(c)는 유체 집중 현상 하에서 시간에 따라 세포가 증식하는 모습을 차례로 나타낸다.
한편, 멤브레인(20)은 고분자 나노 섬유들의 사이 영역에 형성된 다수의 공극(hole)을 포함한다. 이때, 공극은 수 ㎛ 내지 수십 ㎛의 크기를 가질 수 있다. 멤브레인(20)은 공극으로 인해, 단일 세포들은 투과시키지 않되 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있으며, 이에 따라 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 할 수 있다.
마이크로웰(21)에 형성된 제1 공극들이 이루는 제1 공극률과, 연결부(22)에 형성된 제2 공극들이 이루는 제2 공극률은 서로 다를 수 있다. 이때, 공극률은 단위 면적 내에 존재하는 공극 면적의 비율일 수 있다. 특히, 제1 공극률이 제2 공극률 보다 클 수 있다. 이는 멤브레인(20) 중에서 마이크로웰(21)에 해당하는 영역이 엠보싱 공정에 의해 하부 오목 형상으로 늘어나면서, 해당 영역 중에서 얽혀진 고분자 나노 섬유들에 의해 막혀 있던 다수의 부분이 개구되거나 이미 개구된 부분의 면적이 넓어지는 현상이 발생하기 때문이다. 다만, 제1 공극률과 제2 공극률의 차이가 있음을 위해 이들 2가지 공극률에 대해서 설명하고 있으나, 본 발명이 이들 2가지 공극률만 가지는 것으로 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명은 제1 공극률 및 제2 공극률 외에 다양한 공극률을 가질 수도 있다.
이러한 공극률의 차이에 따라, 도 5에 도시된 바와 같이, 마이크로웰(21) 주변 영역에서 유체 집중 현상이 발생하면서 마이크로웰(21)에서의 세포 증식이 더 활발하게 이루어질 수 있다. 이는 공극률이 높은 영역일수록 다르시의 방정식(Darcy's equation)에 따라 물질 투과성이 더 높기 때문이다.
세포 배양을 위해, 플레이트(30)의 개구부(31)에는 유체(예를 들어, 세포 배양액. 증류수, PBS 용액 등의 혼합물)가 채워지는데, 이러한 유체는 스포이트(spuit) 등을 이용하여 주기적으로 교체해줘야 한다. 이 때 유체의 교체는, 예를 들어 몸체(10)의 외측에서 유체가 흡입 배출(suction)되면서 동시에 몸체(10)의 내측으로 새로운 유체가 공급되는 방법으로 이루어질 수 있다. 이는 몸체(10)의 내측에서 유체의 흡입 배출이 이루어지는 경우, 마이크로웰(21)에 안착하여 증식 및 분화 중인 세포에 악영향을 주거나 해당 세포가 함께 배출될 위험이 있기 때문이다.
상술한 유체 교체 과정에서, 마이크로웰(21)을 수용하는 수용 공간에 채워지는 유체는 마이크로웰(21) 및 연결부(22)의 상측에서 하측으로 통과하게 된다. 이때, 마이크로웰(21)은 연결부(22) 보다 공극률이 더 크므로, 도 5에 도시된 바와 같이, 연결부(22) 보다 더 많은 유체를 투과시킨다. 이에 따라, 마이크로웰(21)의 주변에서는 연결부(22)의 주변 보다 유체가 더 집중적으로 이동하는 현상, 즉 유체 집중 현상이 발생한다.
이러한 유체 집중 현상이 발생하는 경우, 마이크로웰(21) 내에서 증식 및 분화 중인 세포에게로 유체에 포함된 산소 및 영양소를 더 원활하게 공급할 수 있으며, 이에 따라 세포 증식 및 분화가 더 촉진될 수 있다. 또한, 이러한 유체 집중 현상에 의해, 마이크로웰(21) 내부로 세포들이 모이게 되는 현상도 발생한다. 즉, 공극률 차이를 갖는 다수의 영역을 구비하되 해당 영역 중 세포 배양면인 마이크로웰(21)이 연결부(22) 보다 더 높은 공극률을 갖도록 형성됨에 따라, 멤브레인(20)은 마이크로웰(21)에서의 세포의 증식 및 분화 효율을 증가시킬 수 있다.
플레이트(30)에 복수개의 개구부(31)가 구비된 경우, 본 발명에 따른 세포 배양 용기는 생체 내와 같이 3차원 구조 환경에서 실험한 복수의 독립적인 실험 데이터를 하나의 플레이트(30)를 이용하여 도출할 수 있다.
도 6은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 몸체(10) 및 체결부(40)를 나타낸다.
한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기는, 도 6에 도시된 바와 같이 일단과 타단이 관통하며 몸체(10)의 스페이서 일단에 체결되는 체결부(40)를 더 포함할 수 있다.
이 때 체결부(40)는 하나의 관통부를 포함하거나, 복수개의 관통부를 포함할 수 있다. 즉, 하나의 관통부를 포함하는 경우, 체결부(40)는 몸체(10)의 각 스페이서에 체결될 수 있으며, 링 형상으로 형성될 수 있다. 또한, 복수개의 관통부를 포함할 경우, 체결부(40)는 각 관통부가 몸체(10)의 각 스페이서에 대응하여 체결될 수 있다. 도 6은 체결부(40)가 하나의 관통부를 포함하는 경우에 대해서 도시하고 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 내용은 체결부(40)가 복수개의 관통부를 포함하는 경우에도 당연히 적용될 수 있다.
체결부(40)가 더 포함되는 경우, 몸체(10)의 스페이서 일단에 멤브레인(20)이 구비되지 않고 체결부(40)의 일단에 멤브레인(20)이 구비되거나, 몸체(10)의 스페이서 일단 및 체결부(40)의 일단에 함께 멤브레인(20)이 구비될 수 있다. 몸체(10)의 스페이서에 체결부(40)가 체결되면 체결부(40)의 관통부와 몸체(10)의 관통부는 서로 연결된다.
체결부(40)는 몸체(10)의 스페이서 일단에 착탈(장착 및 분리)되는 형태로 구비될 수 있다. 예를 들어, 체결부(40)의 내부 또는 외부에 나사산이 형성되며, 몸체 일단의 외부 또는 내부에 체결부(40)의 나사산에 대응하는 나사산이 형성될 수 있다. 또한, 체결부(40)는, 도 6(b)에 도시된 바와 같이, 몸체(10)의 스페이서 일단의 관통부의 내주면에 끼움 결합되거나, 도 6(c)에 도시된 바와 같이, 몸체(10)의 스페이서 일단의 외주면에 끼움 결합될 수 있다.
체결부(40)의 일단에 구비되는 멤브레인(20)은 상술한 몸체(10)의 스페이서 일단에 구비되는 멤브레인(20)에서 몸체(10)의 스페이서를 체결부(40)로 대체하는 것 외에는 동일하다. 즉, 체결부(40)의 일단에 구비되는 멤브레인(20)은 그 위치가 몸체(10)의 스페이서 일단에서 체결부(40)의 일단으로 달라졌을 뿐이다. 따라서, 체결부(40)의 일단에 구비되는 멤브레인(20)에 대한 상세한 설명은 이하 생략하고 상술한 몸체(10)의 스페이서 일단에 구비되는 멤브레인(20)에 대한 설명으로 갈음하도록 한다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법에 대하여 설명하도록 한다. 이러한 세포 배양 용기의 제조 방법은 마이크로웰(21) 또는 멤브레인(20)의 제조 방법을 포함한다.
도 7은 본 발명에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 순서를 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법은, 도 7에 도시된 바와 같이, 준비 단계(S10, S100) 및 형성 단계(S20, S200)를 포함한다. 이때, S10 및 S20은 상술한 몸체(10) 및 멤브레인(20)의 제조 방법이며, S100 및 S200은 상술한 몸체(10), 멤브레인(20) 및 체결부(40)의 제조 방법이다.
S10은 몸체(10)와 멤브레인(20)을 준비하는 단계이다. 또한, S100은 몸체(10), 멤브레인(20) 및 체결부(40)를 준비하는 단계이다. 이때, 몸체(10), 멤브레인(20) 및 체결부(40)는 도 1 내지 도 6에 따라 상술한 내용과 동일하므로, 이들에 대한 설명은 이하 생략하도록 한다. 다만, 멤브레인(20)은 전해질 용액을 이용한 전기방사법을 통해 형성될 수 있으며, 이하 전해질 용액을 이용한 전기방사법에 대해서 설명하도록 한다.
도 8은 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 S10 또는 S100에 대한 일 예를 나타낸다.
전해질 용액을 이용한 전기방사법은 몸체(10)의 스페이서 또는 체결부(40)의 일단을 덮도록 멤브레인(20)을 형성하는 것으로서, 챔버 내부에서 이루어질 수 있다. 챔버는 작업이 이루어지는 공간으로서, 멤브레인(20)이 형성될 때 고분자 용액의 외부 누출을 방지할 수 있다. 이하, 몸체(10)의 스페이서 일단에 멤브레인(20)을 형성하는 전해질 용액을 이용한 전기방사법을 “제1 전기방사법”이라 지칭하며, 체결부(40)의 일단에 멤브레인(20)을 형성하는 전해질 용액을 이용한 전기방사법을 “제2 전기방사법”이라 지칭한다. 먼저, 제1 전기방사법에 대해서 설명하도록 한다.
제1 전기방사법은 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계를 차례로 포함할 수 있다.
전해질 채움 단계는, 도 8(a)에 도시된 바와 같이, 일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체(10)의 스페이서에 전해질 용액(50)을 채우는 단계이다. 이때, 몸체(10)는 스페이서 일단이 상부를 향하도록 배치되고 타단이 차단된다. 이후, 몸체(10)의 스페이서 일단으로 전해질 용액(50)이 채워진다. 이때, 몸체(10)의 입구부(11)를 막도록 마개가 구비되는데, 해당 마개에는 전해질 용액(50)에 전압을 인가하기 위한 전극이 구비될 수 있다. 즉, 전극은 마개를 관통하도록 형성되어, 몸체(10)의 스페이서에 채워지는 전해질 용액(50)과 연결될 수 있다.
또는, 전해질 채우는 단계에서는, 도 8(b)에 도시된 바와 같이, 전해질 용액(50)이 채워진 전해질 용기(60)에 몸체(10)의 스페이서를 배치하되, 몸체(10)의 스페이서 일단이 상부를 향하도록 배치함으로써 몸체(10)의 관통부에 전해질 용액(50)을 채울 수도 있다. 몸체(10)의 스페이서가 전해질 용기(60)의 수용 공간으로 배치되면, 전해질 용액(50)의 표면에 몸체(10)의 스페이서가 닿으면서 전해질 용액(50)의 표면을 누르는 압력이 생기고, 그 압력에 의해 몸체(10)의 스페이서로 전해질 용액(50)이 채워지게 된다. 이때, 전해질 용액(50) 표면의 압력이 보다 잘 생성될 수 있도록, 전해질 용기(60)의 수용 공간은 몸체(10)의 스페이서 형상에 일치하도록 형성될 수 있다.
전해질 용액(50)은 전도성을 가지므로, 전압 인가 단계에서 전압이 인가되면 (-) 전하를 띠게 되어 (+) 전하를 갖는 입자를 전기적 인력으로 끌어당기고, 이에 따라, (+) 전하를 갖는 입자는 전해질 상부에 집적될 수 있다. 전해질 용액(50)은 해리의 정도에 따라 강전해질, 약전해질로 분류된다. 해리의 정도는 용매에 따라서 다르다.
예를 들어, 전해질 용액(50)으로는 염화칼륨과 증류수의 3%mol 비율로 혼합한 용액을 사용할 수 있다. 또한, 물 또는 유기용매(에탄올, 메탄올)에 녹아 1 mS/cm보다 높은 전기 전도도를 띠는 물질 및 농도 일체를 전해질 용액(50)으로 사용할 수 있다. 또한, 물에 녹아 상대 유전율이 80 F/m보다 높은 값을 가지는 물질 및 농도 일체를 전해질 용액(50)으로 사용할 수 있다.
전압 인가 단계는 도 8(c)에 도시된 바와 같이, 전해질 용액(50)과 전기방사기(70)의 금속 니들(needle)(71) 사이에 전압을 인가하는 단계이다. 이때, 전압은 전원 공급기를 통해서 공급되는데, 인가 전압의 세기 변화에 따라 형성되는 멤브레인 형성 단계에서 형성되는 멤브레인(20)의 구조에 변화가 생길 수 있다.
전해질 용액(50)과 전기방사기(70)의 금속 니들(71)의 사이에는 전기장이 형성되며, 이때 형성되는 전기장의 세기가 지나치게 낮을 경우, 고분자 용액물이 연속적으로 토출되지 않아 균일한 두께의 고분자 나노 섬유를 제조하기 어려울 뿐만 아니라, 제조된 고분자 나노 섬유가 전해질 용액(50) 위에 원활하게 집속되기 어려울 수 있다. 반대로, 전기장의 세기가 지나치게 높을 경우, 고분자 섬유가 전해질 용액(50)의 상부 표면에 정확하게 안착되지 않기 때문에 정상적인 형태를 갖기 어려울 수 있다. 이런 내용을 고려할 때, 전해질 용액(50)과 전기방사기(70)의 금속 니들(71)에 인가되는 전압의 세기는 5kV 내지 30kV일 수 있다.
전해질 용액(50)에는 음(-)의 전압을 인가할 수 있으며, 금속 니들(71)에는 양(+)의 전압을 인가할 수 있다. 이에 따라, 전해질 용액(50)은 음(-)의 전하를 띠게 되고, 멤브레인 형성 단계에서 방사되는 고분자 용액은 양(+)의 전하를 띠게 된다.
멤브레인 형성 단계는, 도 8(c)에 도시된 바와 같이, 전압이 인가된 상태에서 전기방사기(70)를 통해 몸체(10)의 스페이서로 고분자 용액을 방사하여 멤브레인(20)을 형성하는 단계이다. 이때, 멤브레인(20)은 전해질 용액(50)의 높은 자유도로 인해 복수개의 고분자 나노 섬유가 무작위로 얽힌 망형으로 형성된다.
한편, 전기방사기(70)는 고분자 용액을 공급하는 장치이다. 즉, 전기방사기(70)는 고분자 용액을 전기 방사가 가능한 적절한 점도를 갖도록 저장한 후, 금속 니들(71)을 통해 고분자 용액을 토출할 수 있다. 이때, 토출된 고분자 용액은 비산과 동시에 경화되어 고분자 나노 섬유를 형성할 수 있다.
금속 니들(71)은 고분자 용액을 토출하는 구성이다. 금속 재질로 이루어짐에 따라, 금속 니들(71)은 전원 공급기와 연결하기 용이하며, 전원 공급기로부터 전압이 인가될 때 토출되는 고분자 용액의 전하 대전 효율을 향상시킬 수 있다. 특히, 금속 니들(71)은 몸체(10)의 스페이서와 이격된 상부에 위치하되 그 토출 단부가 몸체(10)의 스페이서를 향하도록 배치된 상태에서 고분자 용액을 방사할 수 있다.
예를 들어, 전기방사기(70)는 주사기, 주사기 펌프 및 금속 니들(71)로 구성될 수 있다. 즉, 고분자 용액을 주사기에 넣고 주사기 펌프의 동력을 통해서 금속 니들(71)로 고분자 용액을 공기 중에 토출할 수 있다. 이때, 금속 니들(71)은 23 Gauge needle를 사용할 수 있지만 고분자 용액에 따라 그 크기가 달라질 수 있다. 특히, 전해질 용액(50)의 표면 형상을 유지하면서 전해질 용액(50) 표면에 고분자 섬유가 얹혀질 수 있도록, 고분자 용액은 0.01 ml/h 내지 3 ml/h의 토출 속도로 방사될 수 있다.
상술한 전압 인가 범위(5kV 내지 30kV) 및 토출 속도 범위(0.01 ml/h 내지 3 ml/h)에서 고분자 용액을 방사하면, 고분자 나노 섬유는 그 직경이 10㎚ 내지 900㎚으로 형성될 수 있다.
고분자 용액으로는 클로로폼(chloroform)과 메탄올(methanol)을 1: 1의 질량비로 혼합한 용액에 폴리카프로락톤(Polycarprolactone)을 혼합한 5% 내지 25% 농도의 용액을 사용할 수 있다. 또한, 아세톤(acetone)과 디메틸포름아미드(Dimethylformamide)를 3: 7의 부피비로 혼합한 후, 폴리비닐이딘 플루오라이드(Polyvinylidenefluoride, PVDF)을 혼합한 25% 내지 30% 농도의 용액을 고분자 용액으로 사용할 수 있다. 그 외에도 폴리스틸렌(Polystrene), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 콜라겐과 폴리카보네이트 혼합 용액(collagen/Polycarbonate blending solution), 젤라틴 등을 이용하여 고분자 용액을 제조할 수 있다.
멤브레인 형성 단계에서, 전해질 용액(50)이 채워진 몸체(10)의 스페이서 측의 관통부와 고분자 용액의 사이에서 발생되는 전기적 인력은 일정하되, 몸체(10)의 스페이서의 테두리와 고분자 용액의 사이에서 발생되는 전기적 인력에 비해 더 클 수 있다. 이에 따라, 전해질 용액(50)이 채워진 몸체(10)의 스페이서 측의 관통부에 집적되는 멤브레인(20)의 영역(이하, “관통부 영역”이라 지칭함)은 일정하되 비교적 큰 밀도 및 두께를 갖는다.
이에 반하여, 몸체(10)의 스페이서의 테두리와 고분자 용액 사이에서 발생되는 전기적 인력의 크기는 몸체(10)의 스페이서의 관통부와 고분자 용액 사이에 발생되는 전기적 인력의 크기에 비해 작으며, 몸체(10)의 스페이서의 관통부에서 멀어질수록 점점 작아지게 된다. 이에 따라, 몸체(10)의 스페이서의 테두리에 집적되는 멤브레인(20)인 고정부(23)는 일정하지 않되 비교적 작은 밀도 및 두께를 갖는다.
멤브레인 형성 단계는 전기방사기(70)의 방사 시간을 조절하여 몸체(10)의 스페이서 일단에 형성되는 멤브레인(20)의 두께, 공극률 및 투명도 중 어느 하나 이상을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 전기방사기(70)의 방사 시간이 길어질수록 집적되는 고분자 나노 섬유의 양이 많아진다. 이에 따라, 몸체(10)의 스페이서 일단에 형성되는 멤브레인(20)은 그 두께가 두꺼워지면서, 그 공극률 및 투명도가 작아지게 된다.
또한, 멤브레인 형성 단계는 고분자 용액의 농도를 조절하여 형성되는 멤브레인(20)의 고분자 나노 섬유의 직경을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 고분자 용액의 농도가 높아지면 그 점성도가 커지므로, 몸체(10)의 스페이서 일단에 형성되는 멤브레인(20)의 고분자 나노 섬유의 직경은 커지게 된다.
다음으로, 제2 전기방사법에 대해서 설명하도록 한다.
제2 전기방사법은 제1 전기방사법과 동일하게 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계를 포함하며, 추가적으로 체결부 체결 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계는 상술한 제1 전기방사법에서 몸체(10)의 스페이서를 체결부(40)로 대체하는 것 외에는 동일하다. 따라서, 제2 전기방사법의 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계에 대한 상세한 설명은 이하 생략하고 상술한 제1 전해질 전기방사법의 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계에 대한 설명으로 갈음하도록 한다.
제2 전기방사법에서는 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계를 통해 체결부(40)의 일단에 멤브레인(20)을 형성할 수 있다. 이후, 체결부 체결 단계는 일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체(10)의 스페이서 일단에 멤브레인(20)이 형성된 체결부(40)를 체결하는 단계이다. 예를 들어, 체결부 체결 단계는 몸체(10)의 스페이서 또는 체결부(40)를 이송하여 몸체(10)의 스페이서와 체결부(40)를 체결하는 이송 장치에 의해 수행될 수 있다.
다만, 제1 전기방사법 및 제2 전기방사법은 멤브레인(20)을 형성한 후, 몸체(10)의 스페이서 또는 체결부(40)의 모양에 맞춰 형성된 멤브레인(20)을 절삭하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 9는 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 S20 또는 S200에 대한 일 예를 나타낸다.
S20은 몸체(10)의 스페이서에 형성된 멤브레인(20)에 엠보싱 공정을 수행하는 단계이다. 또한, S200은 체결부(40)에 형성된 멤브레인(20)에 엠보싱 공정을 수행하는 단계이다.
즉, S20 또는 S200에서는, 도 9에 도시된 바와 같이, 마이크로웰(21)의 패턴이 형성된 몰드(M)를 이용하여 S10 또는 S100에서 준비된 멤브레인(20)에 엠보싱 공정을 수행한다. 이때, 엠보싱 공정은 몰드(M)로 멤브레인(20)을 가압하여, 몰드(M)의 패턴에 대응하는 패턴을 멤브레인(20)에 형성하는 공정이다. 즉, 엠보싱 공정 결과, 멤브레인(20)에는 마이크로웰(21) 및 연결부(22)가 형성될 수 있다.
엠보싱 공정은 가열된 몰드(M)로 멤브레인(20)을 가압하는 핫 엠보싱(hot embossing) 공정일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 핫 엠보싱 공정을 사용하는 경우에 보다 빠르게 S20의 결과를 도출할 수 있다.
몰드(M)는 마이크로웰(21)의 패턴에 따라 하부가 돌출된 제1 몰드(M1)와, 마이크로웰(21)의 패턴에 따라 상부가 오목한 제2 몰드(M2)를 포함할 수 있다. 즉, 제1 몰드(M1)와 제2 몰드(M2) 사이에 멤브레인(20)을 두고, 제1 몰드(M1)와 제2 몰드(M2)를 가압하여 합체한 후 분리함으로써 멤브레인(20)에 마이크로웰(21) 및 연결부(22)가 형성될 수 있다. 합체 시, 제1 몰드(M1)의 돌출된 부분이 멤브레인(20)의 일면에 접촉하고, 제2 몰드(M2)의 오목한 부분이 멤브레인(20)의 타면에 접촉한다.
핫 엠보싱 공정의 경우 합체 전에, 제1 몰드(M1) 및 제2 몰드(M2) 중 어느 하나가 가열되거나, 제1 몰드(M1) 및 제2 몰드(M2)가 모두 가열될 수 있다. 다만, 제1 몰드(M1)의 돌출된 형상이 마이크로웰(21) 형성에 더 많은 영향을 미치므로, 제1 몰드(M1)만 가열하여 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 가열된 제1 몰드(M1) 또는 제2 몰드(M2)의 온도는 멤브레인(20)을 이루는 고분자 나노 섬유의 녹는점 보다 낮은 것이 바람직할 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법으로 형성한 멤브레인(20)의 사진을 나타낸다. 이때, 도 10(c)는 멤브레인(20)의 평면 사진을 나타내고, 도 10(d)는 도 10(c)을 확대하여 도시한 마이크로웰(21) 및 연결부(22)의 평면도를 나타낸다. 또한, 도 10(a)는 마이크로웰(21)의 확대 사진을 나타내고, 도 10(b)는 도 10(a)의 마이크로웰(21)에 형성된 제1 공극을 나타낸다. 또한, 도 10(e)는 연결부(22)의 확대 사진을 나타내고, 도 10(f)는 도 10(e)의 연결부(22)에 형성된 제2 공극을 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법으로 형성한 멤브레인(20)은, 도 10(a) 및 도 10(e)에 도시된 바와 같이, 복수개의 고분자 나도 섬유가 얽힌 망형으로 형성되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 10(b) 및 도 10(f)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법으로 형성한 멤브레인(20)에서, 마이크로웰(21)에 형성된 제1 공극은 연결부(22)에 형성된 제2 공극 보다 개수가 더 많은 것을 확인할 수 있다. 이때, 제1 공극률은 제2 공극률에 비해 약 10배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다.
도 1 내지 도 10을 참고하여 세포 배양 용기 및 이의 제조 방법에 대해 살펴 봤다. 참고로, 위 도 1 내지 도 10을 참고한 실시예에서는 마이크로웰, 또는 연결부 등과 같이 멤브레인을 구성하는 일부분들의 공극률이 어떤 조건을 가져야 하는지에 대해서도 일부 언급하였으나, 본 발명에 따른 세포 배양 용기는 유체 또는 물질이 통과할 수 있을 정도의 공극만 형성되어 있으면 족하며, 공극률은 어떠한 제약 조건 없이 임의의 수치를 가질 수 있다. 즉, 본 상세한 설명에서 언급되는 모든 실시예에 있어서 공극의 존재는 당연히 인정되나, 공극률 차이는 세포 배양 용기를 구현하는 데 있어 필수적인 한정 사항은 아님을 이해한다.
이하에서는 도 11 내지 도 14를 참고하여 마이크로웰 및 플레이트의 또 다른 실시예에 대해 알아보기로 한다.
앞서 도 1에 대한 설명에서는 다공성 마이크로웰(21) 및 플레이트(30)에 대해 설명하였는데, 또 다른 실시예에서는 상기 다공성 마이크로웰(21) 상에 온도에 따른 표면 구조 변화를 갖는 코팅 조성물을 코팅하여, 온도에 따른 표면 구조가 변하는 세포 배양층이 포함된 세포 배양 용기를 구현할 수 있다.
온도에 따른 표면 구조 변화를 갖는 세포 배양층은, 상기 다공성 마이크로웰(21)의 상면에 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포에 대한 부착력이 높아 세포의 배양에 적합한 표면 구조를 가지고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포의 탈착에 적합한 표면 구조를 가져 세포를 회수하는데 적합한 형태로 형성될 수 있다.
상기 세포 배양층은 폴리이소프로필아크릴아마이드(Poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAAm)를 포함할 수 있으며, 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서 표면 거칠기가 4 내지 37nm이고, 바람직하게는 20 내지 32nm일 수 있고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서 표면 거칠기가 4㎛ 이상인 온도에 따른 표면 조도 변화 특성을 가질 수 있다. 이 때 상기 표면 거칠기는 300kHz의 진동수를 사용하는 PPP-NCHR 캔틸레버 또는 25kHz의 진동수를 사용하는 BL-AC40TS 캔틸레버를 이용한 비접촉 방식의 원자간력 현미경(atomic force microscope, Park Systems, Korea)으로 측정된 것을 의미한다.
상기 세포 배양층은 세포 배양층 총 중량을 기준으로 1 내지 5중량%의 가교제를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1중량% 초과 내지 3중량% 미만을 포함할 수 있다. 상기 가교제의 함량이 1중량% 미만인 경우에는 세포 배양층에 세포가 잘 부착되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 5중량%를 초과하는 경우에는 LCST(하한 임계 용액 온도, lower critical solution temperature) 미만의 온도에서 세포 스페로이드의 탈착이 잘 일어나지 않는 문제가 생길 수 있다.
나아가 상기 다공성 마이크로웰(21)은 유체에 대한 투과성을 갖는 반면 이를 제외한 부분은 유체에 대한 투과성을 갖지 않는다. 이 때, 상기 다공성 마이크로웰(21)의 공극은 평균 직경 100nm 내지 20㎛의 기공 사이즈를 가질 수 있으며, 바람직하게는 100nm 내지 5㎛의 기공 사이즈를 가질 수 있다. 이와 같은 기공 사이즈로 인해 상기 다공성 마이크로웰은 단일 세포들은 투과시키기 않으면서 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있으며, 이에 따라 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다.
또한, 상기와 같이 다공성 마이크로웰(21)과 그 주변부의 투과율의 차이에 의해 상기 다공성 마이크로웰(21)과 세포배양층을 통과하여 유체가 흐르는 경우 상기 다공성 마이크로웰에서 유체 집중 현상이 발생 할 수 있다. 이러한 유체 집중 현상이 발생하는 경우, 다공성 마이크로웰에서 증식 및 분화 중인 세포에게로 유체에 포함된 산소 및 영양소를 원활하게 공급할 수 있으며, 이에 따라 세포 증식 및 분화가 더 촉진될 수 있다. 또한, 이러한 유체 집중 현상에 의해 다공성 마이크로웰 내로 세포들이 모이게 되는 현상도 발생하여 세포 응집체, 또는 스페로이드의 형성이 용이하다.
또한 본 발명의 세포 배양 용기는 도 1에 도시되어 있는 것과 같이 상부챔버(100) 및 하부챔버(200)를 포함할 수 있다. 상기 하부챔버(200)는 상부챔버(100)가 배치 또는 장착되어 세포 배양액 등이 흐를 수 있는 챔버일 수 있다. 나아가, 본 발명은 여러 세포를 동시에 배양할 수 있도록, 복수개의 상부챔버가 배치될 수 있는 하부챔버를 사용할 수 있으며, 상기 상부챔버의 수는 당업계에서 통상적으로 사용되는 개수라면 제한 없이 사용 가능하다.
이하에서는 3차원 세포 배양 용기를 제조하는 방법을 설명한다. 구체적으로, 상기 방법은, N-이소프로필아크릴아마이드 단량체, 가교제 및 잔부의 물을 포함하며, 상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100 중량부를 기준으로 1중량부 이상 내지 5중량부 미만인 코팅 수용액을 제공하는 단계; 하부에 다공성 마이크로웰을 포함하는 웰 플레이트 챔버의 다공성 마이크로웰 상면에 상기 코팅 수용액을 이용하여 코팅층을 형성하는 단계; 및 상기 코팅층에 UV를 조사하여 세포 배양층을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 실시예는 상기 가교제의 함량을 조절함으로써 세포 배양용 지지체의 온도 변화에 따른 세포의 탈부착률을 조절할 수 있으며, 전술한 바와 같이 상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100 중량부를 기준으로 1중량부 이상 내지 5중량부 미만, 바람직하게는 1중량부 초과 내지 3중량부 미만일 수 있다. 상기 가교제의 함량이 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100 중량부를 기준으로 1중량부 미만인 경우에는 세포 배양용 지지체에 세포가 잘 부착되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 5중량부 이상인 경우에는 LCST 미만의 온도에서 세포의 탈착이 잘 일어나지 않는 문제가 생길 수 있다.
한편, 상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체를 폴리이소프로필아크릴아마이드로 중합시키는 역할을 하는 것으로, 폴리이소프로필아크릴아마이드 제조에 사용되는 통상의 방법, 즉 단일중합(homopolymerization), 공중합(copolymerization) 및 3원공중합(terpolymerization), 가교중합(cross-linkedpolymerization) 등에 사용될 수 있는 가교제라면 제한 없이 사용 가능하며, 바람직하게는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide;MBAAm) 및 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine, TEMED) 또는 이들의 혼합이 가교제로서 사용될 수 있다.
상기 코팅 수용액에서 단량체가 UV에 의해 가교결합을 수행할 수 있도록, 상기 코팅 수용액은 광개시제를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 광개시제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부를 기준으로 0.01 내지 0.1중량부일 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 0.05중량부일 수 있다. 상기 광개시제의 함량이 0.01중량부 미만인 경우에는 UV에 의한 가교결합이 수행되지 않는 문제가 생길 수 있고, 0.05중량부를 초과하는 경우에는 가교결합제 자체의 독성으로 인해 추후 세포 배양에서 세포가 상기 독성에 의해 죽는 문제가 생길 수 있다.
한편, 상기 광개시제는 UV를 통해 가교결합을 개시할 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 2-히드록시-1-1[4-(히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1프로파논을 사용할 수 있다.
상기 코팅층을 형성하는 단계는 상기 코팅 수용액에 의한 코팅층이 상기 다공성 마이크로웰로 유체가 투과될 정도로 형성되는 것이라면 제한 없으며, 예를 들어 상기 코팅층을 형성하는 단계는 스핀 코팅 또는 바 코팅을 사용하여 상기 코팅층을 형성할 수 있다. 나아가, 상기 코팅층에 의해 형성된 세포 배양층은 하이드로젤과 같은 형태로 형성되므로 용액의 이동이 원활한 바, 다공성 마이크로웰과 하이드로젤을 통과하여 유체가 흐를 수 있다.
상기 코팅층에 UV를 조사하여 세포 배양층을 형성하는 단계는 단량체를 중합하는 단계로, N-이소프로필아크릴아마이드의 중합체 (폴리이소프로필아크릴아마이드)가 형성될 수 있을 정도로 수행되도록 UV를 조사하는 것이라면 제한 없으며, 예를 들어 UV를 1800w로 10분 간 조사하여 수행될 수 있다.
한편, 배양되는 세포의 탈부착을 위해, 3차원 세포 응집체 배양 방법은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 3차원 세포 응집체를 세포 배양층에 부착시켜 배양시키고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만의 온도에서 3차원 세포 응집체를 세포 배양층으로부터 탈착시키는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 세포는 근아세포(myoblasts), 태아 섬유아세포(embryo fibroblasts), 인간 제정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells), 또는 인간 표피 세포(human epidermal cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1>
실시예 1에서는 하부에 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버를 제조 하였다. 구체적으로 poly methyl methacrylate(PMMA)에 일정 크기의 구멍을 뚫고 접착제와 함께 고분자 나노섬유를 구멍이 뚫린 PMMA와 결합 하여, 다공성 마이크로웰을 제조하였다.
다음으로, 고농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체를 포함하는 용액 내에서 나타나는 상분리 현상을 이용하여 높은 함량 비율의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액과 낮은 함량 비율의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액을 제조하였다. 제조된 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버의 다공성 마이크로웰 상면에 상기 코팅 수용액을 이용하여 다공성 마이크로웰 상면에 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는 세포 배양층이 형성된, 세포 배양 용기를 제조하였다.
구체적으로, N-이소프로필아크릴아마이드 단량체와 증류수를 1:1 질량비로 혼합하고, N-이소프로필아크릴아마이드 단량체가 증류수에 충분히 녹을 수 있도록 5분 동안 교반하였다. 시간이 지남에 따라서, 낮은 농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액과 높은 농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액은 안정적으로 나뉘게 되었고, 최종적으로 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액이 안정적으로 분리되었을 때, 파이펫을 이용하여 각각의 용액을 바이알에 옮겨 N-이소프로필아크릴아마이드:물의 질량비가 87:13인 높은 함량 비율의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액 5ml을 수득하였다.
다음으로, 자외선 조사처리를 할 때 자외선에 반응하게 만들기 위한 가교제인 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide; MBAAm) 0.05g (N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부 대비 1중량부) 와 광개시제인 2-히드록시-1-1[4-(히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 0.005g (N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부 대비 0.01중량부)를 수득한 각각의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액에 첨가하였다.
N-이소프로필아크릴아마이드 수용액에 가교제 및 광개시제를 첨가하여 제조된 조성물을 바 코팅을 이용해서 상기 고분자 나노섬유 위에 얇게 도포 한 후 UV 광원을 10분간 조사하여 다공성 마이크로웰 상면에 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는 세포 배양층이 형성된, 세포 배양 용기를 제조하였다.
도면 11A및 11B는 제조된 다공성 마이크로웰 상면에 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착 되는 세포 배양층이 형성된, 세포 배양 용기를 나타낸다.
<실험예 1>
표면 거칠기의 변화를 측정하기 위해 <실시예 1>의 세포 배양층의 온도 및 시간에 따른 표면 거칠기 변화를 원자간력 현미경(atomic force microscope, Park Systems, Korea)으로 측정한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 보이는 바와 같이, LSCT를 초과하는 온도인 37℃에서는 <실시예 1>의 세포 배양층의 표면 거칠기 변화가 거의 없는 반면, LSCT 미만의 온도인 20℃에서는 <실시예 1>의 세포 배양층의 표면 거칠기의 변화가 급격하게 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2>
<실시예 1>에서 제조된 세포 배양 용기에 있어서, 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는 세포 배양층의 형태적 차이를 확인하기 위해서 주사 전자 현미경을 활용해서 표면 형상을 비교 했다.
도면 13A는 N-이소프로필아크릴아마이드를 포함하는 조성물을 고분자 나노섬유에 코팅하기 전을 나타내며 도면 13B는 N-이소프로필아크릴아마이드를 포함하는 조성물이 고분자 나노섬유에 코팅된 후의 세포배양층을 나타낸다. 상기 세포배양층은 고분자 나노섬유와 하이드로젤이 결합된 형태이다.
<실험예 3>
36℃에서 <실시예 1>의 세포 배양 용기에 인간 간암 세포주(HepG2)를 파종(seeding)하여 3일 후 3차원 세포 응집체를 배양하였다. 배양된 3차원 인간 간암 세포주 응집체를 수확하기 위해서 3차원 인간 간암 세포주 응집체를 포함한 상부챔버를 20℃의 환경으로 이동하였다.
도면 14A는 세포를 배양 중인 세포 배양 용기를 촬영한 이미지이며, 도 14B는 배양된 세포를 촬영한 이미지를 나타낸다. 또한, 도 14C는 배양된 세포를 탈착한 세포 배양 용기를 촬영한 이미지를 나타낸다. 도 5C에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 세포 배양 용기에서 배양된 세포는 쉽게 탈착되는 것을 확인할 수 있었다.
이하에서는 도 15 내지 도 18을 참고하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치, 더 정확하게는 하단유동을 이용하여 세포 배양 효과를 제고시키는 세포 배양 장치, 그리고 이를 이용한 세포 배양 방법을 알아보기로 한다.
본 실시예는 세포 배양 시 생성되는 노폐물을 용이하게 제거하고 3차원 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있는 3차원 세포 배양 장치에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 개구부 및 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버(100); 및 상기 상부챔버가 배치되며, 다공성 마이크로웰의 하단에서 유체의 유동이 가능한 하부챔버(200)를 포함하는 3차원 세포 배양 장치에 관한 것이다.
도 15를 참고할 때, 상기 상부챔버(100)는 개구부(11) 및 다공성 마이크로웰(21)을 포함하는 웰 형태의 챔버가 플레이트를 관통하여 끼워져 있는 형태를 의미할 수 있다. 나아가, 상기 다공성 마이크로웰(21)의 하단은 다공성 마이크로웰의 하부 영역을 의미하는 것으로, 하부챔버(200) 내의 영역을 의미한다.
상기 상부챔버(100)에는 하부챔버(200)의 유체가 외부와 접촉할 수 있도록 관통부가 형성될 수 있으며, 이때, 상기 관통부는 상부챔버(100)의 다공성 마이크로웰(21)의 인접한 부분에 형성되거나, 상기 상부챔버(100)의 임의의 위치에 관통부가 형성될 수 있다. 상기와 같이 유체가 외부와 접촉되는 경우, 유체의 흐름에 의해 형성된 물리적인 힘에 의해 다공성 멤브레인이 형태가 변형되는 것을 방지할 수 있는 것이라면 상기 관통부의 위치는 특히 제한되는 것은 아니다.
상기 하부챔버(200)는 유체가 유동할 수 있는 유체 유입구(310) 및 유체 배출구(330)를 추가로 구비할 수 있으며, 이를 통해 상기 하부챔버(200)의 유체가 유동할 수 있다. 나아가, 상기 유체 유입구(310) 및 유체 배출구(330)는 유동을 일으킬 수 있는 장치가 추가로 연결될 수 있으며, 예를 들어 상기 하부챔버(200)는 유체가 다공성 마이크로웰(21)의 수평 방향으로 흐르도록 하는 유체 흐름을 유도하는 장치와 연결될 수 있다. 이 때, 상기 유체 흐름을 유도하는 장치로 펌프 등을 사용할 수 있으나, 상기 유체의 유동을 일으킬 수 있는 것이라면, 제한되지 않는다.
이처럼, 상기 3차원 세포 배양 장치는 상기 하부챔버(200)를 흐르는 유체가 다공성 마이크로웰(21)의 하단에 흐르도록 하는 유체 흐름 유도 장치를 통해 상기 하부챔버(200)의 유체가 안정적으로 흐를 수 있도록 하며, 상기 다공성 마이크로웰(21)의 공극의 투과성으로 인해, 상기와 같은 흐름을 가지는 유체가 3차원세포 배양 시 형성되는 노폐물을 다공성 멤브레인의 상면에서 하부챔버(200)로 배출시킬 수 있으며 3차원 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있다. 나아가 하부챔버(200)에서 3차원세포 배양 장치 외부로 노폐물을 배출시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 유체 흐름 유도 장치는 시린지 펌프(syringe pump), 튜브연동펌프(peristaltic pump) 또는 교반기 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 3차원 세포 배양 장치는 3차원세포 배양 시 다공성 마이크로웰에 인가되는 압력을 분산시키고, 형성되는 노폐물과 영양분을 효율적으로 제거 및 공급할 수 있도록, 상기 상부챔버(100)는 하부챔버(200)의 유체의 표면이 외부와 접촉할 수 있도록 관통부(400)가 형성될 수 있다.
상기 관통부(400)는 하부챔버(200)의 유체의 표면이 외부와 접촉될 수 있는 구조를 제공하는 것으로, 상기와 같은 구조에 의해 유체 흐름 시 상부챔버(100)에 압력이 걸려 다공성 마이크로웰(21)이 변형되고, 이로 인해 3차원 세포 배양 시 세포의 안착, 증식 및 분화에 악영향을 미치는 문제를 해결할 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 3차원 세포 배양 장치를 이용하여 다공성 마이크로웰에 세포 배양액 및 세포를 투입하여 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원세포 배양 방법을 제공하며, 상기 세포는 근아세포(myoblasts), 태아 섬유아세포(embryo fibroblasts), 인간 제정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells), 인간 간암 세포(HepG2 세포) 또는 인간 표피 세포(human epidermal cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 2>
도 15(a)와 같은 형태의 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버(100) 및 하부챔버(200)를 포함하는 3차원 세포 배양 장치에서, 다공성 마이크로웰(21)에 HepG2 세포 및 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media, FBS 10%) 배양액과 함께 주입한 후 이를 37℃에서 48시간 안정화하여 3차원 스페로이드를 형성하였다. 그 후 하부챔버에 유동을 주어 9일동안 배양 하였다.
<비교예 2>
상기 <실시예 2>에서 하단 유동을 주지 않는 것을 제외하고는, <실시예 2>와 동일하게 3차원의 HepG2 스페로이드를 배양하였다.
상기 <실시예 2> 및 <비교예 2>에서 상기 배양 기간 중, 6일차 및 9일차에서 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현량을 측정하였다. 측정된 알부민 발현양을 도 16(a)에 나타내었으며, 도 16(a)에 보이는 바와 같이 <비교예 2>에서 배양된 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현양은 6일차에 1182.64mg/ml, 9일차에 2966.505mg/ml인 반면, <실시예 2>에서 배양된 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현양은 6일차에 4813.99mg/ml, 9일차에 6644.55mg/ml인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 하단 유동이 있는 3차원 세포 배양 장치에서 배양시킨 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현량이 큰 것을 알 수 있었으며, 이를 통해 하단 유동으로 인해 3차원 Hep G2 스페로이드의 기능성 향상을 확인할 수 있었다.
<실시예 3>
하단 유동에 의한 본 발명의 3차원 세포 배양 장치에서 노폐물이 효율적으로 제거될 수 있음을 확인하기 위해, 도 15(a)과 같은 형태의 3차원 세포 배양 장치의 다공성 마이크로웰에 FITC-Dextran 20kDa을 200ug/ml를 넣고, 하단 유동을 3시간 동안 수행한 후 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC Dextran의 농도를 측정하였다.
<비교예 3>
상기 <실시예 3>에서 하단 유동을 주지 않는 것을 제외하고는, <실시예 3>과 동일하게 FITC-Dextran을 넣고 3시간 후에 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도를 측정하였다.
<실시예 3>에서 노폐물이 축적된 정도를 육안으로 살펴본 결과를 도 17에 나타내었으며, 상기 <실시예 3> 및 <비교예 3>에서 측정된 FITC-Dextran의 농도를 도 16(b)에 나타내었다. 도 16(b)에 보이는 바와 같이, 하단 유동이 있는 <실시예 4>의 경우 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도는 55.6199±3.3429mg/ml인 반면, <비교예 3>의 경우 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도는 131.435±7.80245mg/ml임을 확인할 수 있었다.
즉, 하단 유동이 있을 때, 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-dextran의 농도는 하단 유동이 없는 경우에 비해 현저히 낮은 것으로, 같은 양의 배양액으로도 하단 유동이 있을 때가 다공성 마이크로웰에 있는 세포의 노폐물을 효율적으로 제거할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 도 18(a)와 같이 하부챔버에서 유체 흐름 유도 장치 및 다공성 마이크로웰에 의해 다공성 마이크로웰 상면의 노폐물이 제거되는 것임을 확인할 수 있었다. 도 18(a)는 배양액의 하단 유동이 있을 때 다공성 마이크로웰 내 존재하던 노폐물들이 공극을 통과하여 제거되는 모습, 다시 말해 노폐물들이 유체의 흐름을 따라 공극을 통과하게 됨으로써 마이크로웰 내부로부터 제거되는 모습을 도시한 것이다. 한편, 도 18(b)는 배양액이 하부챔버 내에서 하단 유동이 될 때에 배양액이 자연스럽게 마이크로웰 내부로 확산되는 현상을 도시한 것으로, 배양액의 하단 유동이 있을 시 멤브레인의 공극을 통해서는 노폐물이 제거될 수 있을 뿐만 아니라 배양액의 확산도 동시에 일어날 수 있음을 설명하기 위한 도면이다. 도 18의 (a) 및 (b)를 참고할 때, 당연히 노폐물이 공극을 통과하는 방향과 배양액이 공극을 통과하는 방향은 서로 반대의 방향이 될 것이다.
이하에서는 도 19 내지 도 29를 참고하여, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 배양 장치 및 세포 배양 방법에 대해 살펴보기로 한다.
본 실시예에 의하면, 세포를 배양하는 과정에서 마이크로웰 상부에서 파이펫팅을 통해 사용된 세포 배양액을 제거하고 새로운 세포 배양액을 주입하는 기존 세포 배양액 교체법을 사용하는 경우 파이펫팅에 의한 배양액 유동에 의해 세포 및 세포 응집체의 유실이 발생할 수 있는 문제를 해결할 수 있다. 또한 지속적으로 다공성 마이크로웰을 투과하여 유도되는 세포 응집체 주변의 유동에 의해 영양분과 같은 균일한 세포 미세 환경의 구현이 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면 배양 과정에서 상기와 같은 세포의 유실을 최소화할 수 있으며 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세 환경을 유도하여, 2차원 배양에 비하여 생체 내 현상과 더욱 유사한 현상을 나타내는 3차원의 세포 응집체를 배양할 수 있게 된다.
도 19를 참고할 때, 본 실시예에 따른 세포 배양 장치는 개구부와 다공성 멤브레인 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰(21)을 포함하는 상부챔버(110)를 포함한다. 또한, 상기 상부챔버(110)가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부챔버(210)를 포함하며, 상기 상부챔버(110)의 상부로 유입된 유체는 상기 상부챔버(110)에서 다공성 마이크로웰(21)을 투과해 상기 하부챔버(210)로 유입되고, 하부챔버(210)의 유체는 배출되어 유체가 유동되도록 구현된다.
또한, 본 상세한 설명에서는 도 19의 세포 배양 장치를 이용하여, 상부챔버(110)의 다공성 멤브레인 상에 세포를 접종하는 단계; 세포 배양액을 상부챔버(110)의 상부로 유입구(311) 또는 개구부를 통해 투입하는 단계; 및 상부챔버(110)에서 다공성 마이크로웰을 투과해 하부챔버(210)로 유입된 세포 배양액을 하부챔버(210)로부터 배출하는 단계;를 포함하는 3차원 세포 응집체 배양 방법에 대해서도 언급하기로 한다. 또한, 상기 3차원 세포 응집체 배양 방법은, 하부챔버(210)로부터 배출되는 세포 배양액에 의해 세포 배양액이 유동하게 되며, 나아가 상기 세포 배양액을 하부챔버(210)로 투입하는 단계;를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 장치는 상부챔버(110)의 상부로 유입된 유체가 상기 상부챔버(110)에서 다공성 마이크로웰(21)을 투과해 상기 하부챔버(210)로 유입되고, 나아가 하부챔버(210)의 유체는 배출되어 유체가 유동되도록 하는 것으로, 이때 상기 하부챔버(210)의 유체는, 하부챔버(210)에 구비된 유체 배출구를 통해 배출되거나 또는 상부챔버(110)와 하부챔버(210)의 사이의 간극 영역을 통해 배출되는 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 간극 영역의 상부를 통해 배출되는 것일 수 있다.
상기 유체 배출구는 하부챔버(210)의 어떠한 위치에서도 형성될 수 있으며, 예를 들어 도 1(c)와 같이 하부챔버(210) 하단에 구비될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 하부챔버(210)에 이와 같은 유체 배출구가 구비되지 않는 경우 도 29의 (a) 내지 (c)와 같이 상부챔버(110)와 하부챔버(210)의 사이의 간극 영역을 통해 유체가 배출되도록 하여 유체의 흐름을 형성할 수 있다. 이때 상부챔버(110)와 하부챔버(210)의 사이의 간극 영역이 존재하기 위해 상부챔버(110)와 하부챔버(210)의 각 측면의 벽 사이에 간극이 존재하도록 각 챔버의 사이즈를 조절할 수 있으며, 이들 사이의 간극 영역에서 공기와 접하는 계면의 상부로부터 유체가 배출되도록 할 수 있다.
정리하면, 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 장치는 하부챔버(210)로부터 유체를 배출할 수 있도록 배출 구조를 구비할 수 있으며, 이 때 배출 구조는 하부챔버(210)에 유체 배출구(331)를 통하여 유체를 유동 시키는 구조, 또는 상부챔버(110)와 하부챔버(210) 사이 간극 영역, 다시 말해 상부챔버(110)와 하부챔버(210) 사이에 존재하는 틈을 통해 배출 시킴으로써 유체를 유동 시키는 구조로 이루어질 수 있다.
한편, 본 상세한 설명에서 구체적으로 언급이 되지 않은 여타의 배출 구조가 존재할 수 있는데, 세포 배양액을 포함한 유체의 흐름이 상부챔버(110)로부터 하부챔버(210)로 이어지는 하방 흐름을 유지할 수 있는 한, 배출 구조의 구체적인 세부적인 조건들에는 제한이 없다 할 것이다.
참고로, 본 실시예에 있어서 상기 다공성 멤브레인은 나노섬유 네트워크로 이루어진 것으로, 공극률이 20 % 내지 60 %의 다공성 멤브레인인 것이며, 예를 들어 공극률이 30 % 내지 50 % 의 다공성 멤브레인일 수 있다. 상기 공극률이 20% 미만인 경우에는 투수계수가 낮아지고, 이에 따라 다공성 멤브레인에 가해지는 수압이 증가함으로써 다공성 멤브레인상에 배양 중인 세포 응집체의 생존률이 저하되는 문제를 발생시킬 수 있다.
또한, 상기 다공성 멤브레인은 10 nm 내지 10 μm의 평균 공극의 입경 크기를 가질 수 있다. 즉, 상기 다공성 멤브레인은 상기와 같은 범위의 평균 공극의 크기를 포함하므로, 단일 세포들은 투과시키지 않으면서 세포 배양액 내 영양분, 성장인자 등의 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있다. 이로 인해 다공성 멤브레인 상에서 단일 세포의 응집을 유도하여 3차원 응집체 형성을 가능하게 하며, 응집체 형성 후에는 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다.
다공성 멤브레인은 상술한 본 발명의 공극률 및 평균 공극의 입경 크기 범위 내에서 높은 투수계수의 특성을 보유 할 수 있다. 또한 상기 다공성 멤브레인은 1 내지 20 μm s-1의 투수계수(Hydraulic conductivity)를 가질 수 있다. 상기 투수 계수가 1 μm s-1 미만인 경우에는 다공성 멤브레인에 높은 수압이 야기되며, 1000Pa 이상의 수압이 다공성 멤브레인 및 배양 중인 세포 응집체에 인가되면 세포의 생존률을 저하시 키는 등의 악영향이 있을 수 있다.
상기 다공성 멤브레인은 세포 배양용 나노섬유 네트워크인 것으로, 이의 제조 방법은 특히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 전기 방사에 의해 형성되는 고분자 나노섬유로 이루어진 것일 수 있다.
상기 나노섬유 네트워크의 제조 방법은 예를 들어 폴리카프로락톤을 4 내지 10 wt % 농도가 되도록 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol) 혼합물의 용매에 용해한 용액을 전기방사하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 전기 방사는 10 내지 30 kV 전압 하에서 0.1 내지 2.0 ml hr-1의 고분자 용액의 토출 속도로 수행되는 것이 바람직하며, 전압이 상기 범위 미만인 경우에는 균일한 나노섬유 제조에 문제가 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 에는 나노섬유의 적층이 불균일해 지는 등 안정적인 나노섬유 제조에 문제가 있을 수 있다.
상기 다공성 마이크로웰은 하부 방향으로 오목하게 형성된 함몰부의 전체 또는 일부분이 다공성 멤브레인일 수 있으며, 바람직하게는 다공성 마이크로웰, 즉 상부챔버의 개구부가 위를 향하도록 배치하는 경우 바닥을 형성하는 면이 다공성 멤브레인으로 형성된다.
한편, 상기 본 발명의 상부챔버(110)의 하면을 이루는 다공성 멤브레인은 돌 출부 및/또는 오목부를 구비하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 도 28과 같이 다공성 멤브레인을 이용하여 오목부를 형성하거나, 또는 도 26과 같이 다공성 멤브레인 상에 오목부에 상응하는 구획을 형성할 수 있는 측벽 또는 돌출부를 추가로 부가하여 오목 부를 형성할 수 있으며, 이때 측벽 또는 돌출부의 재질은 다공성이거나 또는 다공성이 아닐 수 있는 것으로 특히 제한되지 않는다. 바람직하게는 오목부의 하면은 다공성 멤브레인인 것이며, 측벽 또는 돌출부는 다공성이거나 또는 다공성이 아닐 수 있다. 예를 들어 도 21(a) 및 도 21(b)는 관통 구멍이 형성된 추가의 층을 적층함으로써 오목부의 측벽이 다공성 재질이 아닌 경우의 형태를 나타낸 예시이며, 도 21(c)는 다공성 멤브레인 자체에 오목부가 형성된 것으로 오목부 및 오목부가 아닌 부분이 전체적으로 모두 다공성인 재질인 경우이다.
다공성 마이크로웰은 예를 들어 도 26에 나타낸 바와 같이 전기 방사로 제작된 다공성 멤브레인을 쓰루홀 (Thru-hole)의 배열과 결합하여 제조 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 도 21(c)와 같이 다공성 재질의 오목부 및 돌출부 형성은 예를 들어 도 28과 같이 몰드를 활용한 압축 공정을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 다공성 마이크로웰의 다공성 멤브레인의 상면은 세포 배양층으로 작용하는 영역으로, 상술한 바와 같이 다공성 멤브레인이 돌출부 및 오목부를 구비하는 경우에는 형성된 오목부에 세포가 더욱 용이하게 안착하게 되며, 상기 다공성 마이크로웰 내에서 단일 세포의 응집을 유도하여 3차원 세포 응집체가 안정적으로 형성된 후 배양 될 수 있게 된다. 보다 바람직한 본 발명의 다공성 멤브레인은 돌출부 및 오목부를 구비하며, 모든 면이 다공성 멤브레인으로 이루어진 것이다.
한편, 상기 하부챔버(210)는 상부챔버(110)가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하부챔버(210)에 유체 배출구가 구비되는 경우 이와 같이 유체가 배출될 수 있는 유체 배출구(331)를 통해 상기 상부챔버(110)가 내부에 배치된 상태로 배양액을 담고 있는 하부챔버(210)의 유체가 하부챔버 외부로 배출되면서 배양액이 유동할 수 있다. 이를 위해, 상기 상부 및/또는 하부챔버(210)에는 유동을 일으킬 수 있는 장치가 추가로 연결될 수 있으며, 예를 들어 상기 상부챔버(110)에 세포 배양액을 일정한 유속으로 주입하는 장치가 추가될 수 있고, 상기 하부챔버(210)는 상기 상부챔버(110)에 유입된 유체가 상기 상부챔버(110)의 다공성 멤브레인을 투과해 상기 하부챔버(210)로 흐르면서 일정한 유속으로 배출되도록 하는, 유체의 흐름을 제어하는 장치와 연결 될 수 있으며, 이는 예를 들어 배양액 저장소일 수 있다. 이때, 상기 유체의 유동을 일으킬 수 있는 것이라면, 유체 흐름을 유도하는 장치는 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 유체 흐름 유도 장치는 시린지 펌프(Syringe pump), 튜브연동펌프(Peristaltic pump) 또는 교반기 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 3차원 세포 배양 장치는 상기 하부챔버(210)와 동일한 평면 상에 배치되며, 하부챔버(210)와 유체 연통된, 배양액 저장소(65)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 배양액 저장소(65) 내 배양액의 높이는 하부챔버(210) 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정될 수 있다.
상기 하부챔버(210) 내 배양액의 수위는 상부챔버(110) 하단의 다공성 멤브레인을 기준으로 상부 방향으로 1 내지 20 mm 의 높이인 것일 수 있으며, 예를 들 어 1 내지 19 mm, 바람직하게는 1 내지 18 mm, 예를 들어 1 내지 8mm일 수 있다. 배양액의 수위가 상기 바람직한 범위 미만인 경우 배양중인 세포 응집체에 원활한 영양분 공급이 불가해 질 수 있으며, 상기 바람직한 범위를 초과 할 경우 배양액 의 범람 및 과용을 초래 할 수 있다.
또한, 상기 상부챔버(110) 하단의 다공성 멤브레인과 하부챔버(210) 바닥의 간격은 0.1 내지 8 mm인 것일 수 있으며, 예를 들어 0.2 내지 7 mm, 바람직하게는 1 내 지 5 mm일 수 있다. 간격이 상기 바람직한 범위 미만인 경우 세포 배양액의 유동이 제한되어 배출구를 통한 배출이 불가능 할 수 있다. 또한, 상기 바람직한 범위를 초과할 경우 배양액의 과용을 초래 할 수 있다.
이때, 상기 유체, 즉 세포 배양액은 일정한 속도를 유지하면서 유동 할 수 있다. 이를 위해 상기 유체의 유입과 배출을 일정한 속도로 조절할 수 있다. 이때, 예를 들어, 상기 유체는 0.0001 내지 1 ml hr-1, 예를 들어, 0.001 내지 1 ml hr-1의 속도로, 바람직하게는 0.01 내지 1 ml hr-1의 속도로 유동할 수 있다. 상기 유체의 유동 속도가 0.0001 ml hr-1 미만인 경우에는 세포 응집체가 필요한 양의 세포 배양액이 공급되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 1 ml hr-1를 초과하는 경우에는 세포 응집체에 유동에 의한 과도한 전단응력이 작용해 세포 응집체에 악영향이 미칠 수 있다. 세포에 악영향을 미치지 않는 전단응력, 예를 들어 0.001 내지 10 dyne cm-2의 전단응력은 세포에 분화 및 증식에 긍정적인 영향을 끼칠 수 있다.
한편, 상기 세포 배양액은 1000 Pa 미만의 수압으로 상기 다공성 멤브레인에 인가하는 것이 바람직하며, 압력이 적을수록 보다 바람직하고, 예를 들어 1 Pa 내지 100 Pa일 수 있다. 한편, 1000 Pa 초과인 경우 세포 생존률이 저하되는 문제가 있다.
본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 상기 장치를 이용한 3차 원 세포 응집체 배양 방법에서는 세포주 예를 들면 근아세포(Myoblasts), 태아 섬 유아세포(Embryo fibroblasts), 제정맥 내피세포(Umbilical vein endothelial cells), 간암 세포(HepG2 세포), 표피 세포(Epidermal cells) 또는 이 중 적어도 일종 이상의 혼합 등을 사용 할 수 있다. 또한, 세포주뿐만 아니라 간, 췌장, 소장 등의 1차 세포 또한 사용 될 수 있다. 마지막으로, 줄기세포 예를 들면, 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell), 중간엽유래 줄기세포(Mesenchymal stem cell) 또는 이 중 적어도 일종 이상의 혼합 등의 세포를 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 3차원 세포 응집체인 스페로이드 또는 오가노이드를 배양 할 수 있다.
한편, 본 실시예에 따른 3차원 세포 응집체 배양 방법은 상기 본 발명의 3 차원 세포 배양 장치를 이용하여, 상부챔버(110)의 다공성 멤브레인 상에 세포를 접종하는 단계; 및 세포 배양액을 상부챔버(110)의 상부로 유입구(311) 또는 개구부를 통해 투입하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포는 상기 다공성 멤브레인 상에 접종되어 배양될 수 있으며, 상기 접종은, 상기 상부챔버(110)에 유체를 유입하는 단계에 선행하여 배양할 세포를 상기 다공성 멤브레인 상에 접종함으로써 수행될 수 있다. 이에 의해 세포는 위 3차원 세포 배양 장치에 적용될 수 있고, 상기 세포를 접종하는 방법은 당업계에서 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 마이크로파이펫을 이용하여 접종할 수 있다.
상기 방법으로 접종된 세포는 수 시간에서 수 일 내에 3차원 세포 응집체를 형성한다. 세포 응집체 형성 후에 개발된 장치에 의한 세포 배양액의 유동이 인가 될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 다공성 멤브레인의 제조
폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL; Mn = 80,000 g mol-1), 클로로포름 및 메탄올은 Sigma-Aldrich (미국)에서 구입하였다. 전기 방사를 위한 PCL 용액은 7.5 wt% 농도의 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol)의 혼합물에 PCL을 용해하여 준비하였다. 준비된 PCL 용액을 5 ml 정밀 주사기(Gastight syringe; Hamilton)에 넣고 상업용 전기 방사 기계(ES-robot, NanoNC)를 사용하여 직경 5 cm 의 고리 모양 전극 위에 10cm 거리를 두고 배치된 23 게이지 금속 바늘을 통하여 1ml h-1 의 유속으로 토출하였다. 금속 바늘과 고리 모양의 전극 사이에 상기 상업용 전기방사 기계를 활용하여 15kV의 고전압을 가하여 전기 방사를 수행하였다. 전기 방사된 PCL 나노섬유(As-electrospun PCL nanofiber)는 고리 모양 전극 사이에 증착되어 기체 및 질량 투과성 나노섬유 멤브레인을 생성하였다. 전기 방사는 상대 습도 50 ~ 60 %, 온도 20 ~ 25 ℃에서 실시하였다. 나노섬유 네트워크 제조 시 방사 시간에 따른 현미경 사진을 도 22에 나타내었으며, 나노섬유 직경은 약 800- 1000 nm인 것을 확인 하였으며, 방사시간이 증가함에 따라 평균 공극의 크기 및 공극률(Porositiy)은 감소하며 반대로 평균 두께는 증가하였다.
상기 나노섬유 네트워크 제조 시 방사 시간에 따른 나노섬유 네트워크의 구조 변화(도 22(a)), 공극률 변화(도 22(b)), 다공성 멤브레인의 투수 계수 (Hydraulic conductivity)(도 22(c)), 및 수압(Induced pressure)(도 22(d))을 각각 도 22에 나타내었다.
이때, 공극률의 계산 방법은 확대 된 현미경 이미지를 이진 이미지로 (Binary image) 변환 한 다음 Image J 소프트웨어 (NIH, USA)를 사용하여 나노 섬유 네트워크 면적 대비 나노섬유 네트워크에 의해 생성된 공극의 면적 분율을 계산하여 나타낸 것이다.
2. 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버 제조
상기 1.에서 획득된 다공성 멤브레인 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버를 제조하기 위해서 일련의 공정을 수행했으며 이를 도 26에 나타내었다. 상세하게, 상부챔버 하단의 다공성 멤브레인 영역은 500μm 두께의 폴리 메틸메타크릴레이트 플레이트 (PMMA, Acryl Choika, South Korea)에 접착제를 도포한 후 레이저 절단기 (ML-7050A, Machineshop, South Korea)를 사용하여 접착제가 도포된 PMMA 플레이트에 쓰루홀의 배열을 천공하였으며 도포된 접착제를 활용하여 쓰루홀과 다공성 멤브레인을 결합함으로써 최종적으로 도 21과 같이 바닥면이 다공성 멤브레인으로 이루어진 오목부를 형성하여 완성하였다.
또 다른 형태의 상부챔버 하단의 다공성 멤브레인 영역을 제작하기 위 한 일련의 공정을 도 28에 나타내었다. 보다 상세하게는, 상기 1.에서 획득된 평평한 다공성 멤브레인을 돌출 몰드 및 오목 몰드를 활용한 압축 공정을 통해 모든 면이 다공성 멤브레인으로 이루어진 돌출부 및 오목부가 형성된 다공성 멤브레인을 구비하는 상부챔버 하단을 완성하였다. 이때 오목 몰드는 10mm 두께의 폴리 메틸메타크릴레이 트 플레이트 (PMMA, Acryl Choika, South Korea)에 기계가공장비(EGX-350, Roland, USA)를 활용하여 드릴링을 통해 제작 하였으며, 폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 돌출 몰드를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물(Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 함몰 몰드에 붓고 55℃에서 12 시간 동안 경화하여 완성했다.
상부챔버 중 개구부 형태를 갖는 나머지 측면 부분은 사출성형기 (SE50D, Sumitomo, Japan)를 활용해 제작하였다. 이렇게 획득된 상기 측면 부분과 상기에서 획득된 상부챔버 하단을 접착제를 활용하여 결합하여 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버를 완성하였다.
3. 3차원 세포 응집체 배양 장치 제조
폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 하부챔버와 이의 덮개를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물(Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 몰드에 붓고 55℃에서 12 시간 동안 경화했다. 하부챔버와 덮개의 몰드는 20 mm 두께의 PMMA 플레이트를 기계가공 장비 (EGX-350, Roland, USA)를 활용하여 제작하였다. 하부챔버는 30 mm × 30 mm × 30 mm 의 크기로 제작 되었으며, 이때 윗면에 2 mm 깊이의 홈을 설계하여 (도 27(a)) 하부챔버 바닥 면으로부터 상기 2.에서 제작된 다공성 마이크로웰의 다공성 멤브레인까지의 거리 간격은 8 mm 로 설정하였다(도 27(b)). 하부챔버 바닥 면과 덮개의 정중앙에 Biopsy punch (Miltex, USA)를 활용하여 1 mm 크기로 천공하여 배출구를 형성하였다.
개구부 덮개의 천공을 통해 튜브(Biokonvision, South Korea)가 연결되었으며 syringe pump (KDS200, KD Scientific, USA)는 상기 튜브를 통해 0.062 ml h-1의 유속(flow rate)으로 세포배양액을 주입하였다. 하부챔버 바닥 면의 천공 또한 튜브와 연결되어 세포 배양액이 배양액 저장소로 이송될 수 있도록 하였다. 또한, 상기 배양액 저장소 하부에 Z-스테이지(stage)를(Sciencetown, South Korea) 구비해 저장소의 높이는 하부챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정하여, 배양 과정에서 시린지 펌프로부터 지속적으로 배양액이 유입됨에도 하부챔버 배양액의 수위를 일정하게 유지할 수 있도록 설계되었다.
4. 응집체 배양 장치를 이용한 세포 배양
<실시예 4>
상기 1에서 제조된 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버 및 하부챔버에 더하여 배출된 배양액을 저장할 수 있는 배양액 저장소를 포함하는 3차원 세포 배양 장치를 도 19와 같이 마련하였다. 이때 배양액 저장소의 높이는 하부챔버 바닥면으로부터 하부챔버의 수위가 12 mm에 상응 하도록 설정하였다. 이렇게 획득된 세포 배양 장치와 관련하여서는 '본 발명의 세포 배양 장치' 및 '실시예 4의 세포 배양 장치'를 상호 호환적으로 지칭하기로 한다.
상기 3차원 세포 배양 장치에서, 다공성 마이크로웰에 간 세포(HepG2) 및 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media, FBS 10%) 배양액과 함께 주입한 후 이를 37℃에서 48 시간 동안 유동을 인가하지 않고 정적인 환경에서 3차원 HepG2 응집체 즉 HepG2 스페로이드를 형성하였다. 그 후 시린지 펌프를 이용하여 일정한 유속인 0.062 ml hr-1으로 상부챔버에 세포 배양액을 지속적으로 주입하였다. 그 후 상기 주입된 유량만큼 유체를 배출하기 위해 하부 방향으로 유체 배출구(331)가 형성된 하부챔버를 통해 배양액 저장소로 배출 되도록 하여 8일 동안 HepG2 스페로이드를 배양 하였다.
<비교예 4>
다공성 멤브레인이 아닌 불투과성 PMMA 플레이트의 바닥면으로 구성된 불투과성 마이크로웰을 사용한 것과 시린지 펌프, 배양액 저장소 등의 세포 배양액의 유동을 인가하는 장치를 사용하지 않고 파이펫팅을 이용한 세포 배양액 교체를 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일하게 HepG2 스페로이드를 배양하였다.
실험예
(1) 시간의 흐름에 따른 3차원 세포 배양 장치 내의 유체 교환 확인
실시예 4의 3차원 세포 배양 장치에서, 상부챔버로 새롭게 유체가 0.062ml hr-1의 유속으로 주입될 때 3차원 세포 배양 장치 내의 유동 변화(유체 교환 확인)를 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
도 25에 보이는 바와 같이, 세포 배양 응집체 내부에 기존에 존재하던 푸른 용액이 새롭게 주입되는 투명한 색의 용액으로 점진적으로 교환되는 것을 확인할 수 있었다. (흑백의 도면에서는 도 25의 좌측으로부터 우측으로 시간이 경과할수록 어두운 색깔의 용액이 점차 밝은 색깔로 변화해 가는 것을 확인할 수 있다) 또한, 이 과정에서 하부챔버의 수위는 일정하게 유지 되는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 실시예 4에서 세포 배양액의 흐름 해석
본 발명의 3차원 세포 배양 장치에서 세포 배양액의 흐름을 측정하기 위한 전산유체해석 방법을 적용하기 위해 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)을 통해서 실시예 4의 3차원 세포 배양 장치에서 내 의 유속(Surface velocity: 0 m s-1 ~ 8.11 e-6 m s-1), 유동방향(검정색 콘 모양), 유선(흰색 선)에 해당하는 내용을 해석 및 계산하였다.
그 결과, 도 20에 보이는 바와 같이, 본 발명의 3차원 세포 배양 장치에서, 세포 배양액은 상부챔버에서 하부챔버로 원활하게 흐르는 것을 확인할 수 있었다.
(3) 세포 배양 시 세포가 유실되는 정도의 비교
실시예 4 및 비교예 4에서 2일 간격으로 간 세포 스페로이드의 유실 정도를 비교하였으며, 그 결과를 도 23에 나타냈다.
도 23에 보이는 바와 같이, 실시예 4에서는 간 세포 스페로이드의 유실이 전혀 없었으나, 비교예 4에서는 지속적으로 스페로이드가 유실되고, 8일 째에는 약 15 % 가량의 HepG2 세포 스페로이드의 유실이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
(4) 시간의 흐름에 따른 3차원 세포 응집체 주변 영양분 농도 비교
실시예 4 및 비교예 4에서 시간에 흐름에 따른 HepG2 스페로이드 주변의 영양분(Glucose) 농도를 측정하여 비교 분석하기 위하여 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)을 활용 하였다. 이 과정에서 활용된 수치는 하기 표 1에 나타내었다.
분자
(Molecules)		 MW
[kDA]		 확산 계수
[μm2s-1]		 배양액 내 초기 농도
[mol m-3]		 소비율
[mol m-3s-1]
글루코스 0.18 580 11.1 5.2E-3
도 24에 보이는 바와 같이, 실시예 4의 세포 배양 장치에서는 36시간 이후 균일한 영양분 농도가 HepG2 세포 응집체 주변에 유도되는 것이 수치 예측되었으나, 비교예 4에서는 파이펫팅 간격 전후로 영양분 농도의 변화가 심하며 세포 응집체 주변에 불균일한 영양분 농도가 유도되는 것이 수치 예측 되었다.
(5) 실시예 4의 3차원 세포 배양 장치에서 다공성 멤브레인의 투수 계수 및 수압 측정
상부챔버로 새롭게 유체가 0.062 ml hr-1의 유속으로 주입될 때 3차원 세포 배양 장치 내의 다공성 멤브레인에 인가되는 수압(Applied pressure on membrane)을 확인하기 위한 실험을 진행 하였다. 이를 확인하기 위해서, 사전에 투수 계수의 측정은 발명된 장치 외부에서 하기와 같이 Falling-head method를 활용 하여 진행하였다.
구체적으로, 초기 수두(Initial pressure head, hi) 를 갖는 물이 다공성 멤브레인을 투과하여 최종 수두(Final pressure head, hf)에 도달하기 까지의 시간을 확인하여 Darcy 's law를 기반하는 공식을 통해 투수 계수를 측정 하였다.
Figure PCTKR2022006037-appb-I000001
(식 1)
여기서 K는 다공성 멤브레인의 투수 계수, L은 다공성 멤브레인의 두께, t는 hi 에서 hf 까지 도달하는 시간이며 본 실험에서는 각 각 100mm 와 10mm의 hi 및 hf 를 활용 하였다. 계산된 투수 계수를 기초로 다공성 멤브레인의 투과도(Permeability) 를 다음과 같은 수식을 활용하여 계산 하였다.
Figure PCTKR2022006037-appb-I000002
(식 2)
여기서 k는 현재 다공성 멤브레인의 투과도, μ는 세포 배양액의 점도, ρ는 세포 배양액의 밀도, g는 중력 가속도이다.
0.062 ml hr-1의 유속으로 다공성 멤브레인을 투과하는 세포 배양액, 측정된 투수계수와 계산된 투과도를 기반하여 다음과 같은 수식(Kozeny-Carman equation)을 활용하여 다공성 멤브레인에 인가되는 수압을 계산 하였다.
Figure PCTKR2022006037-appb-I000003
(식 3)
여기서는 현재 다공성 멤브레인을 투과하는 유체의 유속 k는 현재 다공성 멤브레인의 투과성, μ는 세포 배양액의 점도, L는 다공성 멤브레인의 두께이며 p는 다공성 멤브레인에 인가되는 수압이다.
도 22에 보이는 바와 같이, 다공성 멤브레인에 인가되는 수압 즉, 수력 반발력은 다공성 멤브레인을 구성하는 나노섬유의 네트워크가 성길수록 즉, 전기 방사 수행 시간이 짧을수록, 즉 공극률 및 투수 계수가 높을수록 낮은 것을 확인 하였다. 이를 본 발명의 다공성 멤브레인이 아닌 상용 다공성 멤브레인과 비교 분석 하였을 때, 본 발명의 다공성 멤브레인에 훨씬 낮은 수력 반발력이 인가 되는 것을 확인할 수 있었으며 나노섬유 네트워크로 구성된 다공성 멤브레인이 본 발명의 장치에 더 적합함을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 개구부, 다공성 멤브레인 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버; 및
    상기 상부챔버가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부챔버를 포함하며,
    상기 상부챔버의 상부로 유입된 유체는 상기 상부챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 상기 하부챔버로 유입되고,
    하부챔버의 유체는 배출되어 유체가 유동되는,
    3차원 세포 배양 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하부챔버의 유체는, 하부챔버에 구비된 유체 배출구를 통해 배출되거나 또는 상부챔버와 하부챔버의 사이의 간극 영역을 통해 배출되는,
    3차원 세포 배양 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 하부챔버와 동일한 평면 상에 배치되며, 하부챔버의 배출구와 유체 연통된, 배양액 저장소를 추가로 포함하며, 상기 배양액 저장소 내 배양액의 수위는 하부챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정되는,
    3차원 세포 배양 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 3차원 세포 배양 장치를 이용하여,
    상부챔버의 다공성 멤브레인 상에 세포를 접종하는 단계;
    세포 배양액을 상부챔버의 상부로 개구부를 통해 투입하는 단계; 및
    상부챔버에서 다공성 마이크로웰을 투과해 하부챔버로 유입된 세포 배양액을 하부챔버로부터 배출하는 단계를 포함하는,
    3차원 세포 응집체 배양 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 세포는 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell) 및 중간엽유래 줄기세포(Mesenchymal stem cell)를 포함하는 줄기세포; 근아세포(Myoblasts), 태아 섬유아세포(Embryo fibroblasts), 제정맥 내피세포(Umbilical vein endothelial cells), 간암 세포(HepG2 세포), 및 표피 세포(Epidermal cells)를 포함하는 세포주; 및 간, 췌장 또는 소장으로부터 획득된 1차 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나 이상인,
    3차원 세포 응집체 배양 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 세포 배양액을 하부챔버로 투입하는 단계를 추가로 포함하는,
    3차원 세포 응집체 배양 방법.
PCT/KR2022/006037 2021-04-27 2022-04-27 3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법 WO2022231310A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22796142.2A EP4328298A1 (en) 2021-04-27 2022-04-27 Cell culture device for culturing 3d cell aggregation and cell culture method using same
JP2023566416A JP2024516408A (ja) 2021-04-27 2022-04-27 ３次元細胞凝集体を培養するための細胞培養装置及びこれを用いた細胞培養方法
US18/496,292 US20240101942A1 (en) 2021-04-27 2023-10-27 Cell culture device for culturing 3d cell aggregation and cell culture method using same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20210054529 2021-04-27
KR10-2021-0054529 2021-04-27

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US18/496,292 Continuation US20240101942A1 (en) 2021-04-27 2023-10-27 Cell culture device for culturing 3d cell aggregation and cell culture method using same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022231310A1 true WO2022231310A1 (ko) 2022-11-03

Family

ID=83847077

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/010026 WO2022231068A1 (ko) 2021-04-27 2021-08-02 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법
PCT/KR2022/006037 WO2022231310A1 (ko) 2021-04-27 2022-04-27 3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/010026 WO2022231068A1 (ko) 2021-04-27 2021-08-02 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 응집체 배양 방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240101942A1 (ko)
EP (1) EP4328298A1 (ko)
JP (1) JP2024516408A (ko)
KR (1) KR20220147522A (ko)
WO (2) WO2022231068A1 (ko)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180091763A (ko) * 2017-02-06 2018-08-16 포항공과대학교 산학협력단 세포 배양 인서트와 세포 배양 용기 및 그 제조 방법
KR20190115604A (ko) * 2018-04-03 2019-10-14 한국생산기술연구원 다공성 필름과 미세인공혈관 채널이 구비된 세포배양 플레이트, 이를 포함하는 세포배양 장치 및 세포배양 장치를 이용한 세포배양방법
KR20190121544A (ko) * 2018-04-18 2019-10-28 주식회사 포스코 세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치
KR20200071966A (ko) * 2018-12-12 2020-06-22 주식회사 티앤알바이오팹 이중 구조를 갖는 기능성 세포배양체
KR20200081853A (ko) * 2018-12-28 2020-07-08 포항공과대학교 산학협력단 다공성 마이크로웰 및 이를 구비한 멤브레인과 그 제조 방법
KR20210098266A (ko) * 2020-01-31 2021-08-10 포항공과대학교 산학협력단 하단유동을 포함하는 3차원 세포의 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포의 배양 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4601746B2 (ja) * 1999-10-25 2010-12-22 エイブル株式会社 三次元動物細胞培養装置及び培養方法
KR101131303B1 (ko) * 2009-06-08 2012-03-30 한국과학기술원 세포 배양 장치 및 시스템과 이를 이용한 세포 배양 방법
KR101075032B1 (ko) * 2010-02-26 2011-10-21 한국과학기술원 세포 배양기 및 이를 포함하는 세포 배양장치
KR101403536B1 (ko) * 2011-12-23 2014-06-03 주식회사 넥스비보 세포 배양기, 이를 갖는 세포 배양 시스템 및 이를 이용한 세포 배양 방법
JP6326827B2 (ja) * 2014-01-22 2018-05-23 株式会社Ihi 細胞培養装置および細胞培養方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180091763A (ko) * 2017-02-06 2018-08-16 포항공과대학교 산학협력단 세포 배양 인서트와 세포 배양 용기 및 그 제조 방법
KR20190115604A (ko) * 2018-04-03 2019-10-14 한국생산기술연구원 다공성 필름과 미세인공혈관 채널이 구비된 세포배양 플레이트, 이를 포함하는 세포배양 장치 및 세포배양 장치를 이용한 세포배양방법
KR20190121544A (ko) * 2018-04-18 2019-10-28 주식회사 포스코 세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치
KR20200071966A (ko) * 2018-12-12 2020-06-22 주식회사 티앤알바이오팹 이중 구조를 갖는 기능성 세포배양체
KR20200081853A (ko) * 2018-12-28 2020-07-08 포항공과대학교 산학협력단 다공성 마이크로웰 및 이를 구비한 멤브레인과 그 제조 방법
KR20210098266A (ko) * 2020-01-31 2021-08-10 포항공과대학교 산학협력단 하단유동을 포함하는 3차원 세포의 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포의 배양 방법

Also Published As

Publication number Publication date
EP4328298A1 (en) 2024-02-28
KR20220147522A (ko) 2022-11-03
JP2024516408A (ja) 2024-04-15
WO2022231068A1 (ko) 2022-11-03
US20240101942A1 (en) 2024-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kajtez et al. 3D‐Printed soft lithography for complex compartmentalized microfluidic neural devices
WO2018088856A2 (ko) 마이크로유체칩, 삼차원 채널 구조물, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 이를 이용한 생리활성 물질의 활성평가 방법
Lv et al. Micro/nanofabrication of brittle hydrogels using 3D printed soft ultrafine fiber molds for damage-free demolding
WO2021101313A1 (ko) 심근주막 수준 생체모방 심장칩 및 이의 용도
WO2016143956A1 (ko) 하이드로젤 기반의 세포 공동-배양용 미세유체칩
Cho et al. Development of a novel hanging drop platform for engineering controllable 3D microenvironments
WO2020204230A1 (ko) 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체 및 이를 포함하는 조직 재생용 스캐폴드
Gallego-Perez et al. High throughput assembly of spatially controlled 3D cell clusters on a micro/nanoplatform
WO2022231310A1 (ko) 3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 세포 배양 장치 및 이를 이용한 세포 배양 방법
WO2020022870A1 (ko) 말뼈 나노세라믹 및 pcl을 포함하는 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법
WO2021034107A1 (ko) 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
WO2013154381A1 (ko) 근적외선에 의한 세포의 선택적 탈착, 패턴 및 수확 방법
WO2021132809A1 (ko) 균일한 크기의 스페로이드의 제작 방법
WO2020138581A1 (ko) 다공성 마이크로웰 및 이를 구비한 멤브레인과 그 제조 방법
WO2017005927A1 (en) Cell culture device
KR20170122231A (ko) 의료 기구, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머, 불소 함유 환상 올레핀 폴리머 조성물, 및 세포 배양 방법
EP3922431A1 (en) Method of manufacturing microdevices for lab-on-chip applications
WO2021040169A1 (ko) 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법
WO2016052769A1 (ko) 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법
Zhang et al. Recent progresses in novel in vitro models of primary neurons: A biomaterial perspective
WO2022255841A1 (ko) 줄기세포 유래 스페로이드형 초자연골세포 분화방법 및 이의 용도
JP2016170090A (ja) 生体観察用プレートおよびその製造方法
Wang et al. Fabrication of spaced monolayers of electrospun nanofibers for three-dimensional cell infiltration and proliferation
WO2016108529A1 (en) Modified cell prepared by putting material into the cell without using delivery vehicle
US20130280747A1 (en) Cell culture apparatus

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22796142

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023566416

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022796142

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022796142

Country of ref document: EP

Effective date: 20231124