WO2022255841A1

WO2022255841A1 - 줄기세포 유래 스페로이드형 초자연골세포 분화방법 및 이의 용도

Info

Publication number: WO2022255841A1
Application number: PCT/KR2022/007936
Authority: WO
Inventors: 김동성; 주지현; 남유준; 임예리; 이성진; 김도희
Original assignee: 셀로이드 주식회사
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2022-06-03
Publication date: 2022-12-08
Also published as: US20240200032A1; KR20220164111A

Abstract

본 발명은 3차원 세포 응집체를 배양하기 위한 배양방법, 그리고 이를 위한 배양장치에 관한 것으로, 그 중에서도 특히 줄기세포응집체로 응집한 줄기세포를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법, 장치, 그리고 분화된 초자연골세포응집체를 활용할 수 있는 용도에 관한 것이다.

Description

줄기세포 유래 스페로이드형 초자연골세포 분화방법 및 이의 용도

실제 몸 속의 세포는 3차원의 형상이며, 이러한 세포는 세포의 미세환경과도 3차원적으로 상호작용 한다. 한편, 세포 배양 시 종래의 기술과 같이 체외에서 세포를 3차원 구조가 아닌 2차원의 단일 층(Monolayer)으로 배양할 경우 체내의 세포와 형태적인 측면에서 유사성이 크게 결여 되며, 3차원 배양하는 경우 약물 스크리닝(Drug screening) 및 세포 치료제(Cell therapy)로 활용 시 실제 생체 내 현상과 보다 유사한 현상을 확인할 수 있다.

이와 같이, 상기와 같은 2차원 단일 층 세포배양의 한계를 극복하기 위해, 3차원 세포 응집체(3D cell aggregation) 배양 및 분화가 가능한 마이크로웰 플랫폼에 대한 요구가 전 세계적으로 증가하고 있다.

한편, 종래 마이크로웰은 다공성 구조를 가지지 않거나 플라스틱 등을 이용하였기 때문에 3D cell aggregation 형성에 한계가 있었으며, 3차원 세포 응집체가 형성되었다 하더라도 마이크로웰 플랫폼으로부터 탈착시키는 과정이 쉽지가 않은 문제점도 있었고, 또한 종래 제안되어 왔던 배양 환경은 배양 시 발생되는 노폐물 배출과 영양분 공급을 수동적 확산에만 의존하고 있어 3차원 세포 응집체의 성장 및 성숙을 제한하는 문제가 있었다.

또 다른 한편, 줄기세포를 배양하는 방법에 있어서는, 종래 2차원 단일층 세포배양법의 한계를 극복하기 위해 3차원 세포 응집체(3D cell aggregation) 즉, 스페로이드 (Spheroid) 배양 방법이 최근에 널리 활용 되고 있다. 스페로이드형의 줄기세포를 타겟 세포로 분화하는 과정에서 높은 분화 수율을 보장하기 위해서는 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 스페로이드 주변에 균일한 세포미세환경(Cellular microenvironment)를 유도하는 것이 중요한데, 이는 스페로이드 주변 환경이 공간적으로 균일하지 않다면 스페로이드의 일부분은 타겟 세포로 분화가 유도되는 반면 나머지 일부분은 타겟 세포로 분화되지 못하고 비 타겟 세포로 분화가 진행되기 때문이다.

본 발명은 위와 같은 한계 및 문제점에 착안하여 제안된 것으로, 3차원 세포 응집체를 종전에 비해 효과적으로 배양할 수 있는 배양장치 및 이를 이용한 배양방법에 관한 것이며, 더 구체적으로는 줄기세포응집체 주변의 세포미세환경을 균일하게 유도하여 줄기세포로부터 분화된 세포응집체형 연골세포 치료제를 만들어낼 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 3차원 세포 응집체, 더 정확하게는 3차원 세포 스페로이드(spheroid) 형성이 가능한 환경을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 본 발명에서는 줄기세포를 스페로이드형으로 제조한 뒤 불투과성 튜브 또는 마이크로웰 상에서 저산소 환경하에서 배양한 후, 상기 스페로이드형 줄기세포를 산소 및 분화 인자를 포함한 배지의 투과 및 이동은 허용하되 세포의 이동은 허용하지 않는 나노섬유로 된 투과성 튜브 또는 마이크로웰에서 배양함으로써 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따라 줄기세포를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법은 a) 줄기세포를 응집하여 줄기세포응집체를 제조하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 제조된 줄기세포응집체를 산소 수준이 0.001 내지 0.15 mol/m³ 인 저산소 조건에서 1일 내지 10일 동안 배양하는 단계; c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포응집체를 투과성 웰 또는 투과성 튜브 상에서 초자연골세포응집체로 분화시키는 단계; 를 포함한다.

또한, 상기 방법에 있어서 상기 줄기세포응집체는 직경 50 ㎛ 내지 2000 ㎛ 일 수 있다.

또한, 상기 방법에 있어서 단계 b) 의 배양은 불투과성 웰 또는 불투과성 튜브에서 배양하는 것일 수 있다.

또한, 상기 방법에 있어서 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 산소, 연골 분화 유도 인자 및 성장인자는 이동 가능하지만 세포는 이동할 수 없는 것일 수 있다.

또한, 상기 방법에 있어서 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 10 nm 내지 1000 nm 직경의 나노섬유로 구성된 것일 수 있다.

또한, 상기 방법에 있어서 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 공극률(Porosity)은 0.05 내지 0.5 인 것일 수 있다.

또한, 상기 방법에 있어서 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 확산에 의한 물질 투과성은 1.0Х10^-5 cm/s 내지 1.0Х10^-4 cm/s일 수 있다.

또한, 상기 방법에 있어서 상기 줄기세포는 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액 유래 줄기세포일 수 있다.

또한, 상기 방법에 있어서 상기 연골 분화 유도 인자는 TGF-β 및 BMP-2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 방법에 따라 제조된 초자연골세포응집체가 포함된 연골 질환 치료용 세포 치료제가 제공될 수 있다. 이 때, 상기 연골 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 방법에 의해 제조된 초자연골세포응집체가 포함된 연골 재생용 세포 치료제가 제공될 수 있다.

본 발명에 따르면 3차원 세포 응집체, 또는 세포 스페로이드(spheroid)가 효과적으로 형성될 수 있는 환경이 제공됨으로써 일정 영역 안에 안착한 세포가 보다 원활하게 3차원적으로 증식 및 분화 가능해 지는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따르면 기존의 지속적으로 불투과성 웰에서만 배양 및 분화를 수행하는 방법과 비교하여 스페로이드형 줄기세포로부터 초자연골로의 분화 효율이 높아지는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따르면 초자연골 함유량이 높은 줄기세포 유래 세포응집체형 연골 치료제의 생산이 가능하며, 체내에 이식한 경우 유의적으로 증가된 치료 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 일측 단면도를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이트(30)를 나타낸다.

도 4는 도 2에서 하나의 개구부(31) 주변을 확대한 도면을 나타낸다.

도 5는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기에서 세포가 증식하는 모습을 나타낸다.

도 6은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 몸체(10) 및 체결부(40)를 나타낸다.

도 7은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 순서를 나타낸다.

도 8은 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 S10 또는 S100에 대한 일 예를 나타낸다.

도 9는 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 S20 또는 S200에 대한 일 예를 나타낸다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법으로 형성한 멤브레인(20)의 사진을 나타낸다.

도 11은 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 제조된 세포 배양 용기의 상부챔버를 위에서 관찰한 이미지를 나타낸다. 도 11B 는 도 11A의 다수의 다공성 마이크로웰 중 하나를 확대한 도면이다.

도 12는 세포 배양층의 표면 거칠기 변화를 온도 및 시간에 따라 나타낸 것이다.

도 13A는 다공성 마이크로웰을 확대한 도면이며 도 13B는 상기 다공성 마이크로웰 상면에 폴리이소프로필아크릴아마이드를 포함하는 세포배양층이 형성된 것을 도시한 것이다.

도 14A는 3차원 세포 응집체를 배양하는 과정에서 촬영한 이미지를 나타낸다. 도 14B는 웰 플레이트로부터 탈착된 세포 응집체를 나타낸다. 도 14C는 세포 응집체가 탈착된 후의 웰플레이트가 촬영된 도면을 나타낸다.

도 15(a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 장치의 예시도이며, 도 15(b)는 본 발명의 3차원 세포 배양 장치의 상부챔버에 있어서 다공성 마이크로웰의 인접한 부분에 관통부가 형성된 경우의 예시도이고, 도 15(c)는 3차원 세포 배양 장치의 실제 이미지를 나타낸다.

도 16(a)는 본 발명의 <실시예 2> 및 <비교예 2>에서 측정된 알부민의 발현양을 비교한 것이며, 도 16(b)는 본 발명의 <실시예 3> 및 <비교예 4>에서 측정된 FITC-Dextran의 농도를 비교한 것이다.

도 17은 본 발명의 <실시예 3>에 따라, 시간에 따라 노폐물이 제거되는 모습을 육안으로 관찰한 결과를 도시한 것이다.

도 18은 본 발명의 하부챔버에서 유체 흐름 및 다공성 마이크로웰에 의해 다공성 마이크로웰 상면의 노폐물이 제거되는 개략도, 및 배양액이 다공성 마이크로웰 내측으로 확산되는 개략도를 나타낸다.

도 19는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 배양 장치를 나타낸 것으로, 도 19(a)는 세포 배양 장치의 전체적인 형태를 나타내며, 도 19(b)는 하나의 상부챔버 및 하부챔버의 조합을 확대하여 나타낸 것이고, 도 19(c)는 배출구와 연결된 배양액 저장소를 포함하는 세포 배양 장치의 단면도를 나타낸 것이다.

도 20은 본 발명에 따른 세포 배양 장치에서 다공성 멤브레인을 통해 투과되는 배양액의 흐름을 시뮬레이션 한 결과를 나타낸다.

도 21은 다공성 멤브레인이 오목부를 구비하는 형태로 구성된 다공성 마이크로웰의 현미경 사진을 나타낸다. 도 21(a)는 4배, 도 21(b)는 220배의 배율로 확대한 이미지이다. 도 21(c)는 다공성 멤브레인이 오목부를 구비하는 또 다른 형태의 다공성 마이크로웰의 사진을 나타내는 것으로, 도 21 (c) a)는 DSLR 카메라, 도 21(c) b) 와 (c) c)는 각각 4배와 20배의 배율로 확대한 현미경 이미지이다.

도 22는 전기 방사 시간에 따른 다공성 멤브레인의 나노섬유 네트워크의 구조 및 특성 변화를 나타낸다. 보편적인 상용 다공성 멤브레인인 8 μm 공극 사이즈의 Transwellinsert (Corning, USA) 제품의 멤브레인을 참조를 위해 함께 첨부 하였다(가장 좌측, TW). 도 22(a)는 상용 멤브레인, 전기방사 시간 변화에 따른 각 나노섬유 네트워크 구조를 20배의 배율로 확대한 현미경 이미지이다. 도 22(b), (c) 및 (d)는 상용 멤브레인과 전기방사 시간에 따른 각 나노섬유 네트워크 구조의 공극률(Porosity)(도 22(b)), 투수계수(Hydraulic conductivity)(도 22(c)), 및 수압(Induced pressure)을 나타낸다.

도 23은 본 발명에 따른 세포 배양 장치를 사용할 경우의 세포 응집체 유실 정도와 종래 파이펫팅에 의한 세포 배양액 교체 방법을 통해 세포를 배양할 경우의 세포 응집체 유실 정도를 비교한 실험 결과를 나타낸다.

도 24는 본 발명에 따른 세포 배양 장치를 사용할 경우의 세포 응집체 주변 영양분 농도(Glucose concentration)와 종래 파이펫팅에 의한 세포 배양액 교체방법을 통해 세포를 배양할 경우의 세포 응집체 주변 영양분 농도를 수치 시뮬레이션을 통해 비교한 결과를 나타낸다.

도 25는 세포 배양 장치에 존재하던 유체가 새롭게 주입되는 유체로 원활하게 교체되고, 이 과정에서 하부챔버 내 배양액의 수위가 일정하게 유지 되는 모습을 도시한 것이다.

도 26은 다공성 마이크로웰을 제조하는 방법을 나타낸다.

도 27은 본 발명에 따른 세포 배양 장치에 사용되는 하부챔버(a)와 하부챔버 내부에 삽입된 상부챔버(b)를 나타낸다.

도 28은 압축공정을 이용하여 다공성 마이크로웰을 제조하는 방법을 도시한 것이다.

도 29는 상부챔버와 하부챔버 사이의 간극 영역을 통해 유체가 배출되도록 하여 유체의 흐름을 형성하는 과정을 나타낸 것으로, (a)는 사진, (b)는 도식화 한 이미지, 그리고 (c)는 이 경우 형성되는 유체의 유속을 나타낸 것이다.

도 30은 스페로이드형 줄기세포를 연골세포로 분화 하는 기존 방법과 본 발명에 따른 방법을 개략적으로 나타내는 도면이다.

도 31은 본 발명에서 활용되는 투과성 튜브 또는 마이크로웰을 딥 드로잉 공정을 활용하여 제작하는 방법을 도시한 것으로, 이의 실제 사진 (전경뷰, 측면뷰), 벽면 두께(Wall thickness), 나노섬유의 현미경 사진을 나타낸다.

도 32는 기존 방법과 본 발명에서 각각 배양되는 스페로이드형 줄기세포 주변의 세포미세환경 (산소 및 TGF-β3)을 각각 나타내는 시뮬레이션과 이의 분석 데이터 관련 도면이다.

도 33은 본 발명에 따라 제조된 세포치료제와 기존 방법으로 배양된 세포치료제의 잠재적 치료효과를 비교분석결과 관련 도면이다.

도 34는 본 발명에 따라 제조된 세포치료제와 기존 방법으로 배양된 세포치료제를 동물 모델에 이식 후 치료효과를 비교분석결과 관련 도면이다.

먼저 도 1 내지 도 10을 참고하여 세포 배양 장치를 구성하는 기본 구성인 세포 배양 용기 및 이의 제조 방법에 대해 살펴보기로 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기를 나타내며, 도 2는 일측 단면도를 나타낸다. 도 2는 도 1에서 A와 A'를 잘라낸 일측 단면을 나타낸다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 플레이트(30)를 도시한 것이다.

세포 배양 용기는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 몸체(10) 및 멤브레인(20)을 포함할 수 있으며, 추가적으로 플레이트(30)를 더 포함할 수 있다. 이하에서는 설명의 편의를 위해, 플레이트(30)에 대해 먼저 설명한 후, 몸체(10) 및 멤브레인(20)에 대해서 차례로 설명하도록 한다.

플레이트(30)는 개구 형상인 하나 이상의 개구부(31)를 구비한 것으로서, 위 개구부(31)에는 몸체(10)가 삽입 장착될 수 있다. 개구부(31)는, 도 3(a)에 도시된 바와 같이 하부가 닫히고 상부가 개방된 개방형태이거나, 도 3(b)에 도시된 바와 같이 플레이트(30)를 관통하는 관통형태일 수 있다. 개구부(31)가 관통형태인 경우, 세포 배양 용기는 상부가 개방된 수용 공간을 가질 수 있으며, 수용 공간은 플레이트(30)를 장착하는 커버 용기를 더 포함할 수 있다.

플레이트(30)에 복수개의 개구부(31)가 구비된 경우 각 개구부(31)들이 서로 이격 배열될 수 있으며, 이에 따라 세포 배양 시에는 각 개구부(31)들의 샘플 간 영향을 차단될 수 있고, 결과적으로 복수의 독립적인 실험 데이터를 하나의 플레이트(30)를 이용하여 도출할 수 있다.

몸체(10)는, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 스페이서(SP)와, 타단에 형성된 입구부(11)와, 스페이서와 입구부(11)를 관통하는 관통부를 각각 포함한다. 참고로 스페이서는 몸체(10)의 측면 내지 측벽에 해당하는 부분을 가리키는 것으로, 도면 상에서는 도면부호 SP로 표시하였다. 도면에서도 볼 수 있는 것과 같이 스페이서의 바깥면은 개구부(31)의 내측면과 마주보되, 스페이서와 개구부 내측면 사이에는 소정의 간격 내지 공간이 존재하는 것을 확인할 수 있다.

몸체(10)의 스페이서(SP)는 플레이트(30)의 개구부(31)에 삽입될 수 있다. 이때, 몸체(10)는 하나의 삽입부를 포함하거나, 복수개의 삽입부를 포함할 수 있다. 즉, 하나의 삽입부를 포함하는 경우, 몸체(10)는 해당 삽입부가 하나의 개구부(31)에 삽입될 수 있다. 또한, 복수의 삽입부를 포함하는 경우, 몸체(10)는 각 삽입부가 다수의 개구부(31)에 대응하여 삽입될 수 있다. 이때, 복수개의 삽입부를 포함할 경우, 몸체(10)는 각 삽입부가 서로 연결된 구조를 가지며, 각 삽입부가 각 개구부(31)에 대응하여 삽입될 수 있다.

도 1 내지 도 6은 하나의 삽입부를 포함한 몸체(10)에 대해서 도시하고 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 내용은 몸체(10)가 복수개의 스페이서 및 관통부를 포함하는 경우에도 당연히 적용될 수 있다.

몸체(10)의 스페이서가 개구부(31)에 삽입될 때, 몸체(10)의 스페이서는 하부에 위치하며, 몸체(10)의 입구부(11)는 상부에 위치한다. 몸체(10)의 스페이서는, 일단에서부터 타단까지 폭이 일정한 수직 형태이거나, 일단에서부터 타단까지 폭이 점차 확대되는 깔때기 형태이거나, 수직 형태와 깔때기 형태가 복합된 형태일 수 있다. 몸체(10)의 관통부는 그 단면이 원형, 다각형 등 다양한 형상으로 형성될 수 있으며, 그 크기도 다양하게 형성될 수 있다.

도 4는 하나의 개구부(31) 주변을 확대한 도면을 나타낸다. 특히, 몸체(10)의 스페이서가 플레이트(30)의 개구부(31)에 장착될 때, 몸체(10)의 스페이서 일단이 세포 배양 용기의 바닥면으로부터 일정 간격 떨어지게 위치하도록, 몸체(10)의 입구부(11)는, 도 4에 도시된 바와 같이, 몸체(10)의 스페이서 및 개구부(31)의 입구 보다 넓은 단면을 가지는 것이 바람직하다. 이에 따라, 몸체(10)의 스페이서와 세포 배양 용기의 바닥면 사이의 공간에는 세포에 공급하기 위한 영양분을 가지는 유체의 통로가 형성될 수 있다. 이때, 세포 배양 용기의 바닥면은 개방형태 플레이트의 경우엔 그 개방부의 바닥면일 수 있으며, 관통형태 플레이트의 경우엔 커버 용기의 바닥면일 수 있다.

멤브레인(20)은 세포가 배양되는 세포 배양면을 제공하는 층으로서, 몸체(10)의 스페이서 측의 관통부에 채용된다. 예를 들어, 멤브레인(20)은 전기방사법를 통해 형성되어 몸체(10)의 스페이서 일단을 덮는 형태로 형성될 수 있다. 이때, 멤브레인(20)은 복수개의 고분자 나노 섬유가 무작위로 얽혀짐으로써 이루어지거나, 고분자 합성 수지가 성형됨으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 각 고분자 나노 섬유는 1㎚ 이상 내지 1000㎚ 미만의 직경을 가질 수 있다. 복수개의 고분자 나노 섬유로 이루어짐에 따라, 멤브레인(20)은 생체 내 기저막과 유사한 구조를 가짐에 따라 생체 내 혈액 유동 환경을 제공할 수 있다.

예를 들어, 고분자 나노 섬유 또는 고분자 합성 수지는 열가소성 수지, 열경화성 수지, 탄성 중합체 및 생체 고분자 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고분자 나노 섬유 또는 고분자 합성 수지는 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리비닐리덴 플로라이드 (Polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리스티렌(polystyrene), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan) 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.

멤브레인(20)은 다공성의 마이크로웰(microwell)(21), 연결부(22) 및 고정부(23)를 포함할 수 있다. 이때, 마이크로웰(21), 연결부(22) 및 고정부(23)는 복수개의 고분자 나노 섬유가 얽혀짐으로써 서로 연결된 구조를 갖는다.

마이크로웰(21)은 세포 배양면으로 작용하는 영역으로서, 하부 방향으로 오목하게 형성된다. 이러한 오목 형상에 의해 세포는 마이크로웰(21) 내에 쉽게 안착하게 되며, 유체의 이동과 관계 없이 마이크로웰(21) 내에서 안정적으로 증식할 수 있게 된다. 이때, 마이크로웰(21)은 적어도 하나가 몸체(10)의 관통부가 이루는 영역 내에 위치한다. 즉, 상부 또는 하부에서 바라볼 때, 마이크로웰(21)은 몸체(10)의 관통부 보다 크기가 작으며 관통부가 이루는 영역 내에 포함된다.

세포 배양면인 마이크로웰(21)이 오목 형상으로 형성됨에 따라, 멤브레인(20)은 세포가 세포 배양면에 더 집중적으로 안정하게 부착될 수 있게 하고 세포 배양면의 면적을 증가시킬 수 있어, 세포의 부착 효율을 향상시킬 수 있다. 또한, 통상적으로 평평한 형상의 세포 배양면을 구비하는 종래의 세포 배양 용기와 달리, 본 발명에 따른 세포 배양 용기의 몸체(10)는 입체적인 3차원 형상의 세포 배양면을 구비하는데, 이를 통해 생체 내와 같이 3차원 구조 환경에서 세포를 배양할 수 있어 3차원 세포 스페로이드(spheroid)를 형성할 수 있다. 다수 개의 마이크로웰(21)이 몸체(10)의 관통부가 이루는 영역 내에 위치할 경우, 몸체(10)의 스페이서가 다수의 세포 배양면을 가져 세포 부착 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.

연결부(22)는 임의의 마이크로웰(21)과 그 주변에 형성되어 마이크로웰(21) 사이를 연결하는 영역으로서, 평평한 형태를 가질 수 있다. 또한, 연결부(22)는 마이크로웰(21) 보다 그 두께가 더 두꺼울 수 있다. 이는 후술할 엠보싱(embossing) 공정에 의해 마이크로웰(21)이 멤브레인(20) 중에서 하부 오목 형상으로 늘어나는 영역에 해당하여 원래 보다 얇아지는 반면, 연결부(22)는 늘어나지 않는 영역에 해당하여 원래 두께를 유지하기 때문이다.

고정부(23)는 몸체(10)의 스페이서 일단의 테두리에 고정된 영역이다. 또한, 고정부(23)는 연결부(22) 보다 두께가 얇고 밀도가 낮을 수 있다. 이는 멤브레인(20)이 전해질 용액을 이용한 전기방사법을 통해 형성될 수 있기 때문이다. 즉, 마이크로웰(21) 및 연결부(22)는 전기방사 시에 전해질 용액이 담긴 위치에서 생성되는 영역에 해당하므로, 고정부(23) 보다 더 많은 수의 고분자 나노 섬유가 형성되어 고정부(23)에 비해 밀도가 크고 두께가 두껍게 형성될 수 있다.

도 5는 본 발명에 따른 세포 배양 용기에서 세포가 증식하는 모습을 나타낸다. 도 5(a), 도 5(b) 및 도 5(c)는 유체 집중 현상 하에서 시간에 따라 세포가 증식하는 모습을 차례로 나타낸다.

한편, 멤브레인(20)은 고분자 나노 섬유들의 사이 영역에 형성된 다수의 공극(hole)을 포함한다. 이때, 공극은 수 ㎛ 내지 수십 ㎛의 크기를 가질 수 있다. 멤브레인(20)은 공극으로 인해, 단일 세포들은 투과시키지 않되 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있으며, 이에 따라 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 할 수 있다.

마이크로웰(21)에 형성된 제1 공극들이 이루는 제1 공극률과, 연결부(22)에 형성된 제2 공극들이 이루는 제2 공극률은 서로 다를 수 있다. 이때, 공극률은 단위 면적 내에 존재하는 공극 면적의 비율일 수 있다. 특히, 제1 공극률이 제2 공극률 보다 클 수 있다. 이는 멤브레인(20) 중에서 마이크로웰(21)에 해당하는 영역이 엠보싱 공정에 의해 하부 오목 형상으로 늘어나면서, 해당 영역 중에서 얽혀진 고분자 나노 섬유들에 의해 막혀 있던 다수의 부분이 개구되거나 이미 개구된 부분의 면적이 넓어지는 현상이 발생하기 때문이다. 다만, 제1 공극률과 제2 공극률의 차이가 있음을 위해 이들 2가지 공극률에 대해서 설명하고 있으나, 본 발명이 이들 2가지 공극률만 가지는 것으로 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명은 제1 공극률 및 제2 공극률 외에 다양한 공극률을 가질 수도 있다.

이러한 공극률의 차이에 따라, 도 5에 도시된 바와 같이, 마이크로웰(21) 주변 영역에서 유체 집중 현상이 발생하면서 마이크로웰(21)에서의 세포 증식이 더 활발하게 이루어질 수 있다. 이는 공극률이 높은 영역일수록 다르시의 방정식(Darcy's equation)에 따라 물질 투과성이 더 높기 때문이다.

세포 배양을 위해, 플레이트(30)의 개구부(31)에는 유체(예를 들어, 세포 배양액. 증류수, PBS 용액 등의 혼합물)가 채워지는데, 이러한 유체는 스포이트(spuit) 등을 이용하여 주기적으로 교체해줘야 한다. 이 때 유체의 교체는, 예를 들어 몸체(10)의 외측에서 유체가 흡입 배출(suction)되면서 동시에 몸체(10)의 내측으로 새로운 유체가 공급되는 방법으로 이루어질 수 있다. 이는 몸체(10)의 내측에서 유체의 흡입 배출이 이루어지는 경우, 마이크로웰(21)에 안착하여 증식 및 분화 중인 세포에 악영향을 주거나 해당 세포가 함께 배출될 위험이 있기 때문이다.

상술한 유체 교체 과정에서, 마이크로웰(21)을 수용하는 수용 공간에 채워지는 유체는 마이크로웰(21) 및 연결부(22)의 상측에서 하측으로 통과하게 된다. 이때, 마이크로웰(21)은 연결부(22) 보다 공극률이 더 크므로, 도 5에 도시된 바와 같이, 연결부(22) 보다 더 많은 유체를 투과시킨다. 이에 따라, 마이크로웰(21)의 주변에서는 연결부(22)의 주변 보다 유체가 더 집중적으로 이동하는 현상, 즉 유체 집중 현상이 발생한다.

이러한 유체 집중 현상이 발생하는 경우, 마이크로웰(21) 내에서 증식 및 분화 중인 세포에게로 유체에 포함된 산소 및 영양소를 더 원활하게 공급할 수 있으며, 이에 따라 세포 증식 및 분화가 더 촉진될 수 있다. 또한, 이러한 유체 집중 현상에 의해, 마이크로웰(21) 내부로 세포들이 모이게 되는 현상도 발생한다. 즉, 공극률 차이를 갖는 다수의 영역을 구비하되 해당 영역 중 세포 배양면인 마이크로웰(21)이 연결부(22) 보다 더 높은 공극률을 갖도록 형성됨에 따라, 멤브레인(20)은 마이크로웰(21)에서의 세포의 증식 및 분화 효율을 증가시킬 수 있다.

플레이트(30)에 복수개의 개구부(31)가 구비된 경우, 본 발명에 따른 세포 배양 용기는 생체 내와 같이 3차원 구조 환경에서 실험한 복수의 독립적인 실험 데이터를 하나의 플레이트(30)를 이용하여 도출할 수 있다.

한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 세포 배양 용기는, 도 6에 도시된 바와 같이 일단과 타단이 관통하며 몸체(10)의 스페이서 일단에 체결되는 체결부(40)를 더 포함할 수 있다.

이 때 체결부(40)는 하나의 관통부를 포함하거나, 복수개의 관통부를 포함할 수 있다. 즉, 하나의 관통부를 포함하는 경우, 체결부(40)는 몸체(10)의 각 스페이서에 체결될 수 있으며, 링 형상으로 형성될 수 있다. 또한, 복수개의 관통부를 포함할 경우, 체결부(40)는 각 관통부가 몸체(10)의 각 스페이서에 대응하여 체결될 수 있다. 도 6은 체결부(40)가 하나의 관통부를 포함하는 경우에 대해서 도시하고 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 내용은 체결부(40)가 복수개의 관통부를 포함하는 경우에도 당연히 적용될 수 있다.

체결부(40)가 더 포함되는 경우, 몸체(10)의 스페이서 일단에 멤브레인(20)이 구비되지 않고 체결부(40)의 일단에 멤브레인(20)이 구비되거나, 몸체(10)의 스페이서 일단 및 체결부(40)의 일단에 함께 멤브레인(20)이 구비될 수 있다. 몸체(10)의 스페이서에 체결부(40)가 체결되면 체결부(40)의 관통부와 몸체(10)의 관통부는 서로 연결된다.

체결부(40)는 몸체(10)의 스페이서 일단에 착탈(장착 및 분리)되는 형태로 구비될 수 있다. 예를 들어, 체결부(40)의 내부 또는 외부에 나사산이 형성되며, 몸체 일단의 외부 또는 내부에 체결부(40)의 나사산에 대응하는 나사산이 형성될 수 있다. 또한, 체결부(40)는, 도 6(b)에 도시된 바와 같이, 몸체(10)의 스페이서 일단의 관통부의 내주면에 끼움 결합되거나, 도 6(c)에 도시된 바와 같이, 몸체(10)의 스페이서 일단의 외주면에 끼움 결합될 수 있다.

체결부(40)의 일단에 구비되는 멤브레인(20)은 상술한 몸체(10)의 스페이서 일단에 구비되는 멤브레인(20)에서 몸체(10)의 스페이서를 체결부(40)로 대체하는 것 외에는 동일하다. 즉, 체결부(40)의 일단에 구비되는 멤브레인(20)은 그 위치가 몸체(10)의 스페이서 일단에서 체결부(40)의 일단으로 달라졌을 뿐이다. 따라서, 체결부(40)의 일단에 구비되는 멤브레인(20)에 대한 상세한 설명은 이하 생략하고 상술한 몸체(10)의 스페이서 일단에 구비되는 멤브레인(20)에 대한 설명으로 갈음하도록 한다.

이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법에 대하여 설명하도록 한다. 이러한 세포 배양 용기의 제조 방법은 마이크로웰(21) 또는 멤브레인(20)의 제조 방법을 포함한다.

도 7은 본 발명에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법의 순서를 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법은, 도 7에 도시된 바와 같이, 준비 단계(S10, S100) 및 형성 단계(S20, S200)를 포함한다. 이때, S10 및 S20은 상술한 몸체(10) 및 멤브레인(20)의 제조 방법이며, S100 및 S200은 상술한 몸체(10), 멤브레인(20) 및 체결부(40)의 제조 방법이다.

S10은 몸체(10)와 멤브레인(20)을 준비하는 단계이다. 또한, S100은 몸체(10), 멤브레인(20) 및 체결부(40)를 준비하는 단계이다. 이때, 몸체(10), 멤브레인(20) 및 체결부(40)는 도 1 내지 도 6에 따라 상술한 내용과 동일하므로, 이들에 대한 설명은 이하 생략하도록 한다. 다만, 멤브레인(20)은 전해질 용액을 이용한 전기방사법을 통해 형성될 수 있으며, 이하 전해질 용액을 이용한 전기방사법에 대해서 설명하도록 한다.

전해질 용액을 이용한 전기방사법은 몸체(10)의 스페이서 또는 체결부(40)의 일단을 덮도록 멤브레인(20)을 형성하는 것으로서, 챔버 내부에서 이루어질 수 있다. 챔버는 작업이 이루어지는 공간으로서, 멤브레인(20)이 형성될 때 고분자 용액의 외부 누출을 방지할 수 있다. 이하, 몸체(10)의 스페이서 일단에 멤브레인(20)을 형성하는 전해질 용액을 이용한 전기방사법을 “제1 전기방사법”이라 지칭하며, 체결부(40)의 일단에 멤브레인(20)을 형성하는 전해질 용액을 이용한 전기방사법을 “제2 전기방사법”이라 지칭한다. 먼저, 제1 전기방사법에 대해서 설명하도록 한다.

제1 전기방사법은 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계를 차례로 포함할 수 있다.

전해질 채움 단계는, 도 8(a)에 도시된 바와 같이, 일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체(10)의 스페이서에 전해질 용액(50)을 채우는 단계이다. 이때, 몸체(10)는 스페이서 일단이 상부를 향하도록 배치되고 타단이 차단된다. 이후, 몸체(10)의 스페이서 일단으로 전해질 용액(50)이 채워진다. 이때, 몸체(10)의 입구부(11)를 막도록 마개가 구비되는데, 해당 마개에는 전해질 용액(50)에 전압을 인가하기 위한 전극이 구비될 수 있다. 즉, 전극은 마개를 관통하도록 형성되어, 몸체(10)의 스페이서에 채워지는 전해질 용액(50)과 연결될 수 있다.

또는, 전해질 채우는 단계에서는, 도 8(b)에 도시된 바와 같이, 전해질 용액(50)이 채워진 전해질 용기(60)에 몸체(10)의 스페이서를 배치하되, 몸체(10)의 스페이서 일단이 상부를 향하도록 배치함으로써 몸체(10)의 관통부에 전해질 용액(50)을 채울 수도 있다. 몸체(10)의 스페이서가 전해질 용기(60)의 수용 공간으로 배치되면, 전해질 용액(50)의 표면에 몸체(10)의 스페이서가 닿으면서 전해질 용액(50)의 표면을 누르는 압력이 생기고, 그 압력에 의해 몸체(10)의 스페이서로 전해질 용액(50)이 채워지게 된다. 이때, 전해질 용액(50) 표면의 압력이 보다 잘 생성될 수 있도록, 전해질 용기(60)의 수용 공간은 몸체(10)의 스페이서 형상에 일치하도록 형성될 수 있다.

전해질 용액(50)은 전도성을 가지므로, 전압 인가 단계에서 전압이 인가되면 (-) 전하를 띠게 되어 (+) 전하를 갖는 입자를 전기적 인력으로 끌어당기고, 이에 따라, (+) 전하를 갖는 입자는 전해질 상부에 집적될 수 있다. 전해질 용액(50)은 해리의 정도에 따라 강전해질, 약전해질로 분류된다. 해리의 정도는 용매에 따라서 다르다.

예를 들어, 전해질 용액(50)으로는 염화칼륨과 증류수의 3%mol 비율로 혼합한 용액을 사용할 수 있다. 또한, 물 또는 유기용매(에탄올, 메탄올)에 녹아 1 mS/cm보다 높은 전기 전도도를 띠는 물질 및 농도 일체를 전해질 용액(50)으로 사용할 수 있다. 또한, 물에 녹아 상대 유전율이 80 F/m보다 높은 값을 가지는 물질 및 농도 일체를 전해질 용액(50)으로 사용할 수 있다.

전압 인가 단계는 도 8(c)에 도시된 바와 같이, 전해질 용액(50)과 전기방사기(70)의 금속 니들(needle)(71) 사이에 전압을 인가하는 단계이다. 이때, 전압은 전원 공급기를 통해서 공급되는데, 인가 전압의 세기 변화에 따라 형성되는 멤브레인 형성 단계에서 형성되는 멤브레인(20)의 구조에 변화가 생길 수 있다.

전해질 용액(50)과 전기방사기(70)의 금속 니들(71)의 사이에는 전기장이 형성되며, 이때 형성되는 전기장의 세기가 지나치게 낮을 경우, 고분자 용액물이 연속적으로 토출되지 않아 균일한 두께의 고분자 나노 섬유를 제조하기 어려울 뿐만 아니라, 제조된 고분자 나노 섬유가 전해질 용액(50) 위에 원활하게 집속되기 어려울 수 있다. 반대로, 전기장의 세기가 지나치게 높을 경우, 고분자 섬유가 전해질 용액(50)의 상부 표면에 정확하게 안착되지 않기 때문에 정상적인 형태를 갖기 어려울 수 있다. 이런 내용을 고려할 때, 전해질 용액(50)과 전기방사기(70)의 금속 니들(71)에 인가되는 전압의 세기는 5kV 내지 30kV일 수 있다.

전해질 용액(50)에는 음(-)의 전압을 인가할 수 있으며, 금속 니들(71)에는 양(+)의 전압을 인가할 수 있다. 이에 따라, 전해질 용액(50)은 음(-)의 전하를 띠게 되고, 멤브레인 형성 단계에서 방사되는 고분자 용액은 양(+)의 전하를 띠게 된다.

멤브레인 형성 단계는, 도 8(c)에 도시된 바와 같이, 전압이 인가된 상태에서 전기방사기(70)를 통해 몸체(10)의 스페이서로 고분자 용액을 방사하여 멤브레인(20)을 형성하는 단계이다. 이때, 멤브레인(20)은 전해질 용액(50)의 높은 자유도로 인해 복수개의 고분자 나노 섬유가 무작위로 얽힌 망형으로 형성된다.

한편, 전기방사기(70)는 고분자 용액을 공급하는 장치이다. 즉, 전기방사기(70)는 고분자 용액을 전기 방사가 가능한 적절한 점도를 갖도록 저장한 후, 금속 니들(71)을 통해 고분자 용액을 토출할 수 있다. 이때, 토출된 고분자 용액은 비산과 동시에 경화되어 고분자 나노 섬유를 형성할 수 있다.

금속 니들(71)은 고분자 용액을 토출하는 구성이다. 금속 재질로 이루어짐에 따라, 금속 니들(71)은 전원 공급기와 연결하기 용이하며, 전원 공급기로부터 전압이 인가될 때 토출되는 고분자 용액의 전하 대전 효율을 향상시킬 수 있다. 특히, 금속 니들(71)은 몸체(10)의 스페이서와 이격된 상부에 위치하되 그 토출 단부가 몸체(10)의 스페이서를 향하도록 배치된 상태에서 고분자 용액을 방사할 수 있다.

예를 들어, 전기방사기(70)는 주사기, 주사기 펌프 및 금속 니들(71)로 구성될 수 있다. 즉, 고분자 용액을 주사기에 넣고 주사기 펌프의 동력을 통해서 금속 니들(71)로 고분자 용액을 공기 중에 토출할 수 있다. 이때, 금속 니들(71)은 23 Gauge needle를 사용할 수 있지만 고분자 용액에 따라 그 크기가 달라질 수 있다. 특히, 전해질 용액(50)의 표면 형상을 유지하면서 전해질 용액(50) 표면에 고분자 섬유가 얹혀질 수 있도록, 고분자 용액은 0.01 ml/h 내지 3 ml/h의 토출 속도로 방사될 수 있다.

상술한 전압 인가 범위(5kV 내지 30kV) 및 토출 속도 범위(0.01 ml/h 내지 3 ml/h)에서 고분자 용액을 방사하면, 고분자 나노 섬유는 그 직경이 10㎚ 내지 900㎚으로 형성될 수 있다.

고분자 용액으로는 클로로폼(chloroform)과 메탄올(methanol)을 1: 1의 질량비로 혼합한 용액에 폴리카프로락톤(Polycarprolactone)을 혼합한 5% 내지 25% 농도의 용액을 사용할 수 있다. 또한, 아세톤(acetone)과 디메틸포름아미드(Dimethylformamide)를 3: 7의 부피비로 혼합한 후, 폴리비닐이딘 플루오라이드(Polyvinylidenefluoride, PVDF)을 혼합한 25% 내지 30% 농도의 용액을 고분자 용액으로 사용할 수 있다. 그 외에도 폴리스틸렌(Polystrene), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 콜라겐과 폴리카보네이트 혼합 용액(collagen/Polycarbonate blending solution), 젤라틴 등을 이용하여 고분자 용액을 제조할 수 있다.

멤브레인 형성 단계에서, 전해질 용액(50)이 채워진 몸체(10)의 스페이서 측의 관통부와 고분자 용액의 사이에서 발생되는 전기적 인력은 일정하되, 몸체(10)의 스페이서의 테두리와 고분자 용액의 사이에서 발생되는 전기적 인력에 비해 더 클 수 있다. 이에 따라, 전해질 용액(50)이 채워진 몸체(10)의 스페이서 측의 관통부에 집적되는 멤브레인(20)의 영역(이하, “관통부 영역”이라 지칭함)은 일정하되 비교적 큰 밀도 및 두께를 갖는다.

이에 반하여, 몸체(10)의 스페이서의 테두리와 고분자 용액 사이에서 발생되는 전기적 인력의 크기는 몸체(10)의 스페이서의 관통부와 고분자 용액 사이에 발생되는 전기적 인력의 크기에 비해 작으며, 몸체(10)의 스페이서의 관통부에서 멀어질수록 점점 작아지게 된다. 이에 따라, 몸체(10)의 스페이서의 테두리에 집적되는 멤브레인(20)인 고정부(23)는 일정하지 않되 비교적 작은 밀도 및 두께를 갖는다.

멤브레인 형성 단계는 전기방사기(70)의 방사 시간을 조절하여 몸체(10)의 스페이서 일단에 형성되는 멤브레인(20)의 두께, 공극률 및 투명도 중 어느 하나 이상을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 전기방사기(70)의 방사 시간이 길어질수록 집적되는 고분자 나노 섬유의 양이 많아진다. 이에 따라, 몸체(10)의 스페이서 일단에 형성되는 멤브레인(20)은 그 두께가 두꺼워지면서, 그 공극률 및 투명도가 작아지게 된다.

또한, 멤브레인 형성 단계는 고분자 용액의 농도를 조절하여 형성되는 멤브레인(20)의 고분자 나노 섬유의 직경을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 고분자 용액의 농도가 높아지면 그 점성도가 커지므로, 몸체(10)의 스페이서 일단에 형성되는 멤브레인(20)의 고분자 나노 섬유의 직경은 커지게 된다.

다음으로, 제2 전기방사법에 대해서 설명하도록 한다.

제2 전기방사법은 제1 전기방사법과 동일하게 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계를 포함하며, 추가적으로 체결부 체결 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계는 상술한 제1 전기방사법에서 몸체(10)의 스페이서를 체결부(40)로 대체하는 것 외에는 동일하다. 따라서, 제2 전기방사법의 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계에 대한 상세한 설명은 이하 생략하고 상술한 제1 전해질 전기방사법의 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계에 대한 설명으로 갈음하도록 한다.

제2 전기방사법에서는 전해질 채움 단계, 전압 인가 단계 및 멤브레인 형성 단계를 통해 체결부(40)의 일단에 멤브레인(20)을 형성할 수 있다. 이후, 체결부 체결 단계는 일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체(10)의 스페이서 일단에 멤브레인(20)이 형성된 체결부(40)를 체결하는 단계이다. 예를 들어, 체결부 체결 단계는 몸체(10)의 스페이서 또는 체결부(40)를 이송하여 몸체(10)의 스페이서와 체결부(40)를 체결하는 이송 장치에 의해 수행될 수 있다.

다만, 제1 전기방사법 및 제2 전기방사법은 멤브레인(20)을 형성한 후, 몸체(10)의 스페이서 또는 체결부(40)의 모양에 맞춰 형성된 멤브레인(20)을 절삭하는 단계를 더 포함할 수 있다.

S20은 몸체(10)의 스페이서에 형성된 멤브레인(20)에 엠보싱 공정을 수행하는 단계이다. 또한, S200은 체결부(40)에 형성된 멤브레인(20)에 엠보싱 공정을 수행하는 단계이다.

즉, S20 또는 S200에서는, 도 9에 도시된 바와 같이, 마이크로웰(21)의 패턴이 형성된 몰드(M)를 이용하여 S10 또는 S100에서 준비된 멤브레인(20)에 엠보싱 공정을 수행한다. 이때, 엠보싱 공정은 몰드(M)로 멤브레인(20)을 가압하여, 몰드(M)의 패턴에 대응하는 패턴을 멤브레인(20)에 형성하는 공정이다. 즉, 엠보싱 공정 결과, 멤브레인(20)에는 마이크로웰(21) 및 연결부(22)가 형성될 수 있다.

엠보싱 공정은 가열된 몰드(M)로 멤브레인(20)을 가압하는 핫 엠보싱(hot embossing) 공정일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 핫 엠보싱 공정을 사용하는 경우에 보다 빠르게 S20의 결과를 도출할 수 있다.

몰드(M)는 마이크로웰(21)의 패턴에 따라 하부가 돌출된 제1 몰드(M1)와, 마이크로웰(21)의 패턴에 따라 상부가 오목한 제2 몰드(M2)를 포함할 수 있다. 즉, 제1 몰드(M1)와 제2 몰드(M2) 사이에 멤브레인(20)을 두고, 제1 몰드(M1)와 제2 몰드(M2)를 가압하여 합체한 후 분리함으로써 멤브레인(20)에 마이크로웰(21) 및 연결부(22)가 형성될 수 있다. 합체 시, 제1 몰드(M1)의 돌출된 부분이 멤브레인(20)의 일면에 접촉하고, 제2 몰드(M2)의 오목한 부분이 멤브레인(20)의 타면에 접촉한다.

핫 엠보싱 공정의 경우 합체 전에, 제1 몰드(M1) 및 제2 몰드(M2) 중 어느 하나가 가열되거나, 제1 몰드(M1) 및 제2 몰드(M2)가 모두 가열될 수 있다. 다만, 제1 몰드(M1)의 돌출된 형상이 마이크로웰(21) 형성에 더 많은 영향을 미치므로, 제1 몰드(M1)만 가열하여 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 가열된 제1 몰드(M1) 또는 제2 몰드(M2)의 온도는 멤브레인(20)을 이루는 고분자 나노 섬유의 녹는점 보다 낮은 것이 바람직할 수 있다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법으로 형성한 멤브레인(20)의 사진을 나타낸다. 이때, 도 10(c)는 멤브레인(20)의 평면 사진을 나타내고, 도 10(d)는 도 10(c)을 확대하여 도시한 마이크로웰(21) 및 연결부(22)의 평면도를 나타낸다. 또한, 도 10(a)는 마이크로웰(21)의 확대 사진을 나타내고, 도 10(b)는 도 10(a)의 마이크로웰(21)에 형성된 제1 공극을 나타낸다. 또한, 도 10(e)는 연결부(22)의 확대 사진을 나타내고, 도 10(f)는 도 10(e)의 연결부(22)에 형성된 제2 공극을 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법으로 형성한 멤브레인(20)은, 도 10(a) 및 도 10(e)에 도시된 바와 같이, 복수개의 고분자 나도 섬유가 얽힌 망형으로 형성되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 10(b) 및 도 10(f)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 용기의 제조 방법으로 형성한 멤브레인(20)에서, 마이크로웰(21)에 형성된 제1 공극은 연결부(22)에 형성된 제2 공극 보다 개수가 더 많은 것을 확인할 수 있다. 이때, 제1 공극률은 제2 공극률에 비해 약 10배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다.

도 1 내지 도 10을 참고하여 세포 배양 용기 및 이의 제조 방법에 대해 살펴 봤다. 참고로, 위 도 1 내지 도 10을 참고한 실시예에서는 마이크로웰, 또는 연결부 등과 같이 멤브레인을 구성하는 일부분들의 공극률이 어떤 조건을 가져야 하는지에 대해서도 일부 언급하였으나, 본 발명에 따른 세포 배양 용기는 유체 또는 물질이 통과할 수 있을 정도의 공극만 형성되어 있으면 족하며, 공극률은 어떠한 제약 조건 없이 임의의 수치를 가질 수 있다. 즉, 본 상세한 설명에서 언급되는 모든 실시예에 있어서 공극의 존재는 당연히 인정되나, 공극률 차이는 세포 배양 용기를 구현하는 데 있어 필수적인 한정 사항은 아님을 이해한다.

이하에서는 도 11 내지 도 14를 참고하여 마이크로웰 및 플레이트의 또 다른 실시예에 대해 알아보기로 한다.

앞서 도 1에 대한 설명에서는 다공성 마이크로웰(21) 및 플레이트(30)에 대해 설명하였는데, 또 다른 실시예에서는 상기 다공성 마이크로웰(21) 상에 온도에 따른 표면 구조 변화를 갖는 코팅 조성물을 코팅하여, 온도에 따른 표면 구조가 변하는 세포 배양층이 포함된 세포 배양 용기를 구현할 수 있다.

온도에 따른 표면 구조 변화를 갖는 세포 배양층은, 상기 다공성 마이크로웰(21)의 상면에 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포에 대한 부착력이 높아 세포의 배양에 적합한 표면 구조를 가지고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포의 탈착에 적합한 표면 구조를 가져 세포를 회수하는데 적합한 형태로 형성될 수 있다.

상기 세포 배양층은 폴리이소프로필아크릴아마이드(Poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAAm)를 포함할 수 있으며, 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서 표면 거칠기가 4 내지 37nm이고, 바람직하게는 20 내지 32nm일 수 있고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서 표면 거칠기가 4㎛ 이상인 온도에 따른 표면 조도 변화 특성을 가질 수 있다. 이 때 상기 표면 거칠기는 300kHz의 진동수를 사용하는 PPP-NCHR 캔틸레버 또는 25kHz의 진동수를 사용하는 BL-AC40TS 캔틸레버를 이용한 비접촉 방식의 원자간력 현미경(atomic force microscope, Park Systems, Korea)으로 측정된 것을 의미한다.

상기 세포 배양층은 세포 배양층 총 중량을 기준으로 1 내지 5중량%의 가교제를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1중량% 초과 내지 3중량% 미만을 포함할 수 있다. 상기 가교제의 함량이 1중량% 미만인 경우에는 세포 배양층에 세포가 잘 부착되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 5중량%를 초과하는 경우에는 LCST(하한 임계 용액 온도, lower critical solution temperature) 미만의 온도에서 세포 스페로이드의 탈착이 잘 일어나지 않는 문제가 생길 수 있다.

나아가 상기 다공성 마이크로웰(21)은 유체에 대한 투과성을 갖는 반면 이를 제외한 부분은 유체에 대한 투과성을 갖지 않는다. 이 때, 상기 다공성 마이크로웰(21)의 공극은 평균 직경 100nm 내지 20㎛의 기공 사이즈를 가질 수 있으며, 바람직하게는 100nm 내지 5㎛의 기공 사이즈를 가질 수 있다. 이와 같은 기공 사이즈로 인해 상기 다공성 마이크로웰은 단일 세포들은 투과시키기 않으면서 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있으며, 이에 따라 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다.

또한, 상기와 같이 다공성 마이크로웰(21)과 그 주변부의 투과율의 차이에 의해 상기 다공성 마이크로웰(21)과 세포배양층을 통과하여 유체가 흐르는 경우 상기 다공성 마이크로웰에서 유체 집중 현상이 발생 할 수 있다. 이러한 유체 집중 현상이 발생하는 경우, 다공성 마이크로웰에서 증식 및 분화 중인 세포에게로 유체에 포함된 산소 및 영양소를 원활하게 공급할 수 있으며, 이에 따라 세포 증식 및 분화가 더 촉진될 수 있다. 또한, 이러한 유체 집중 현상에 의해 다공성 마이크로웰 내로 세포들이 모이게 되는 현상도 발생하여 세포 응집체, 또는 스페로이드의 형성이 용이하다.

또한 본 발명의 세포 배양 용기는 도 1에 도시되어 있는 것과 같이 상부챔버(100) 및 하부챔버(200)를 포함할 수 있다. 상기 하부챔버(200)는 상부챔버(100)가 배치 또는 장착되어 세포 배양액 등이 흐를 수 있는 챔버일 수 있다. 나아가, 본 발명은 여러 세포를 동시에 배양할 수 있도록, 복수개의 상부챔버가 배치될 수 있는 하부챔버를 사용할 수 있으며, 상기 상부챔버의 수는 당업계에서 통상적으로 사용되는 개수라면 제한 없이 사용 가능하다.

이하에서는 3차원 세포 배양 용기를 제조하는 방법을 설명한다. 구체적으로, 상기 방법은, N-이소프로필아크릴아마이드 단량체, 가교제 및 잔부의 물을 포함하며, 상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100 중량부를 기준으로 1중량부 이상 내지 5중량부 미만인 코팅 수용액을 제공하는 단계; 하부에 다공성 마이크로웰을 포함하는 웰 플레이트 챔버의 다공성 마이크로웰 상면에 상기 코팅 수용액을 이용하여 코팅층을 형성하는 단계; 및 상기 코팅층에 UV를 조사하여 세포 배양층을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.

본 실시예는 상기 가교제의 함량을 조절함으로써 세포 배양용 지지체의 온도 변화에 따른 세포의 탈부착률을 조절할 수 있으며, 전술한 바와 같이 상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100 중량부를 기준으로 1중량부 이상 내지 5중량부 미만, 바람직하게는 1중량부 초과 내지 3중량부 미만일 수 있다. 상기 가교제의 함량이 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100 중량부를 기준으로 1중량부 미만인 경우에는 세포 배양용 지지체에 세포가 잘 부착되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 5중량부 이상인 경우에는 LCST 미만의 온도에서 세포의 탈착이 잘 일어나지 않는 문제가 생길 수 있다.

한편, 상기 가교제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체를 폴리이소프로필아크릴아마이드로 중합시키는 역할을 하는 것으로, 폴리이소프로필아크릴아마이드 제조에 사용되는 통상의 방법, 즉 단일중합(homopolymerization), 공중합(copolymerization) 및 3원공중합(terpolymerization), 가교중합(cross-linkedpolymerization) 등에 사용될 수 있는 가교제라면 제한 없이 사용 가능하며, 바람직하게는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide;MBAAm) 및 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine, TEMED) 또는 이들의 혼합이 가교제로서 사용될 수 있다.

상기 코팅 수용액에서 단량체가 UV에 의해 가교결합을 수행할 수 있도록, 상기 코팅 수용액은 광개시제를 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 광개시제는 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부를 기준으로 0.01 내지 0.1중량부일 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 0.05중량부일 수 있다. 상기 광개시제의 함량이 0.01중량부 미만인 경우에는 UV에 의한 가교결합이 수행되지 않는 문제가 생길 수 있고, 0.05중량부를 초과하는 경우에는 가교결합제 자체의 독성으로 인해 추후 세포 배양에서 세포가 상기 독성에 의해 죽는 문제가 생길 수 있다.

한편, 상기 광개시제는 UV를 통해 가교결합을 개시할 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 2-히드록시-1-1[4-(히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1프로파논을 사용할 수 있다.

상기 코팅층을 형성하는 단계는 상기 코팅 수용액에 의한 코팅층이 상기 다공성 마이크로웰로 유체가 투과될 정도로 형성되는 것이라면 제한 없으며, 예를 들어 상기 코팅층을 형성하는 단계는 스핀 코팅 또는 바 코팅을 사용하여 상기 코팅층을 형성할 수 있다. 나아가, 상기 코팅층에 의해 형성된 세포 배양층은 하이드로젤과 같은 형태로 형성되므로 용액의 이동이 원활한 바, 다공성 마이크로웰과 하이드로젤을 통과하여 유체가 흐를 수 있다.

상기 코팅층에 UV를 조사하여 세포 배양층을 형성하는 단계는 단량체를 중합하는 단계로, N-이소프로필아크릴아마이드의 중합체 (폴리이소프로필아크릴아마이드)가 형성될 수 있을 정도로 수행되도록 UV를 조사하는 것이라면 제한 없으며, 예를 들어 UV를 1800w로 10분 간 조사하여 수행될 수 있다.

한편, 배양되는 세포의 탈부착을 위해, 3차원 세포 응집체 배양 방법은 32℃ 초과 내지 40℃ 이하의 온도에서 3차원 세포 응집체를 세포 배양층에 부착시켜 배양시키고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만의 온도에서 3차원 세포 응집체를 세포 배양층으로부터 탈착시키는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 세포는 근아세포(myoblasts), 태아 섬유아세포(embryo fibroblasts), 인간 제정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells), 또는 인간 표피 세포(human epidermal cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1>

실시예 1에서는 하부에 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버를 제조 하였다. 구체적으로 poly methyl methacrylate(PMMA)에 일정 크기의 구멍을 뚫고 접착제와 함께 고분자 나노섬유를 구멍이 뚫린 PMMA와 결합 하여, 다공성 마이크로웰을 제조하였다.

다음으로, 고농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 단량체를 포함하는 용액 내에서 나타나는 상분리 현상을 이용하여 높은 함량 비율의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액과 낮은 함량 비율의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액을 제조하였다. 제조된 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버의 다공성 마이크로웰 상면에 상기 코팅 수용액을 이용하여 다공성 마이크로웰 상면에 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는 세포 배양층이 형성된, 세포 배양 용기를 제조하였다.

구체적으로, N-이소프로필아크릴아마이드 단량체와 증류수를 1:1 질량비로 혼합하고, N-이소프로필아크릴아마이드 단량체가 증류수에 충분히 녹을 수 있도록 5분 동안 교반하였다. 시간이 지남에 따라서, 낮은 농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액과 높은 농도의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액은 안정적으로 나뉘게 되었고, 최종적으로 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액이 안정적으로 분리되었을 때, 파이펫을 이용하여 각각의 용액을 바이알에 옮겨 N-이소프로필아크릴아마이드:물의 질량비가 87:13인 높은 함량 비율의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액 5ml을 수득하였다.

다음으로, 자외선 조사처리를 할 때 자외선에 반응하게 만들기 위한 가교제인 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide; MBAAm) 0.05g (N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부 대비 1중량부) 와 광개시제인 2-히드록시-1-1[4-(히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 0.005g (N-이소프로필아크릴아마이드 단량체 및 물의 혼합물 100중량부 대비 0.01중량부)를 수득한 각각의 N-이소프로필아크릴아마이드 수용액에 첨가하였다.

N-이소프로필아크릴아마이드 수용액에 가교제 및 광개시제를 첨가하여 제조된 조성물을 바 코팅을 이용해서 상기 고분자 나노섬유 위에 얇게 도포 한 후 UV 광원을 10분간 조사하여 다공성 마이크로웰 상면에 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는 세포 배양층이 형성된, 세포 배양 용기를 제조하였다.

도면 11A및 11B는 제조된 다공성 마이크로웰 상면에 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착 되는 세포 배양층이 형성된, 세포 배양 용기를 나타낸다.

<실험예 1>

표면 거칠기의 변화를 측정하기 위해 <실시예 1>의 세포 배양층의 온도 및 시간에 따른 표면 거칠기 변화를 원자간력 현미경(atomic force microscope, Park Systems, Korea)으로 측정한 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 보이는 바와 같이, LSCT를 초과하는 온도인 37℃에서는 <실시예 1>의 세포 배양층의 표면 거칠기 변화가 거의 없는 반면, LSCT 미만의 온도인 20℃에서는 <실시예 1>의 세포 배양층의 표면 거칠기의 변화가 급격하게 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2>

<실시예 1>에서 제조된 세포 배양 용기에 있어서, 32℃ 초과 내지 40℃ 이하에서는 세포가 부착되고, 0℃ 이상 내지 32℃ 미만에서는 세포가 탈착되는 세포 배양층의 형태적 차이를 확인하기 위해서 주사 전자 현미경을 활용해서 표면 형상을 비교 했다.

도면 13A는 N-이소프로필아크릴아마이드를 포함하는 조성물을 고분자 나노섬유에 코팅하기 전을 나타내며 도면 13B는 N-이소프로필아크릴아마이드를 포함하는 조성물이 고분자 나노섬유에 코팅된 후의 세포배양층을 나타낸다. 상기 세포배양층은 고분자 나노섬유와 하이드로젤이 결합된 형태이다.

<실험예 3>

36℃에서 <실시예 1>의 세포 배양 용기에 인간 간암 세포주(HepG2)를 파종(seeding)하여 3일 후 3차원 세포 응집체를 배양하였다. 배양된 3차원 인간 간암 세포주 응집체를 수확하기 위해서 3차원 인간 간암 세포주 응집체를 포함한 상부챔버를 20℃의 환경으로 이동하였다.

도면 14A는 세포를 배양 중인 세포 배양 용기를 촬영한 이미지이며, 도 14B는 배양된 세포를 촬영한 이미지를 나타낸다. 또한, 도 14C는 배양된 세포를 탈착한 세포 배양 용기를 촬영한 이미지를 나타낸다. 도 5C에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 세포 배양 용기에서 배양된 세포는 쉽게 탈착되는 것을 확인할 수 있었다.

이하에서는 도 15 내지 도 18을 참고하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 장치, 더 정확하게는 하단유동을 이용하여 세포 배양 효과를 제고시키는 세포 배양 장치, 그리고 이를 이용한 세포 배양 방법을 알아보기로 한다.

본 실시예는 세포 배양 시 생성되는 노폐물을 용이하게 제거하고 3차원 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있는 3차원 세포 배양 장치에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 개구부 및 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버(100); 및 상기 상부챔버가 배치되며, 다공성 마이크로웰의 하단에서 유체의 유동이 가능한 하부챔버(200)를 포함하는 3차원 세포 배양 장치에 관한 것이다.

도 15를 참고할 때, 상기 상부챔버(100)는 개구부(11) 및 다공성 마이크로웰(21)을 포함하는 웰 형태의 챔버가 플레이트를 관통하여 끼워져 있는 형태를 의미할 수 있다. 나아가, 상기 다공성 마이크로웰(21)의 하단은 다공성 마이크로웰의 하부 영역을 의미하는 것으로, 하부챔버(200) 내의 영역을 의미한다.

상기 상부챔버(100)에는 하부챔버(200)의 유체가 외부와 접촉할 수 있도록 관통부가 형성될 수 있으며, 이때, 상기 관통부는 상부챔버(100)의 다공성 마이크로웰(21)의 인접한 부분에 형성되거나, 상기 상부챔버(100)의 임의의 위치에 관통부가 형성될 수 있다. 상기와 같이 유체가 외부와 접촉되는 경우, 유체의 흐름에 의해 형성된 물리적인 힘에 의해 다공성 멤브레인이 형태가 변형되는 것을 방지할 수 있는 것이라면 상기 관통부의 위치는 특히 제한되는 것은 아니다.

상기 하부챔버(200)는 유체가 유동할 수 있는 유체 유입구(310) 및 유체 배출구(330)를 추가로 구비할 수 있으며, 이를 통해 상기 하부챔버(200)의 유체가 유동할 수 있다. 나아가, 상기 유체 유입구(310) 및 유체 배출구(330)는 유동을 일으킬 수 있는 장치가 추가로 연결될 수 있으며, 예를 들어 상기 하부챔버(200)는 유체가 다공성 마이크로웰(21)의 수평 방향으로 흐르도록 하는 유체 흐름을 유도하는 장치와 연결될 수 있다. 이 때, 상기 유체 흐름을 유도하는 장치로 펌프 등을 사용할 수 있으나, 상기 유체의 유동을 일으킬 수 있는 것이라면, 제한되지 않는다.

이처럼, 상기 3차원 세포 배양 장치는 상기 하부챔버(200)를 흐르는 유체가 다공성 마이크로웰(21)의 하단에 흐르도록 하는 유체 흐름 유도 장치를 통해 상기 하부챔버(200)의 유체가 안정적으로 흐를 수 있도록 하며, 상기 다공성 마이크로웰(21)의 공극의 투과성으로 인해, 상기와 같은 흐름을 가지는 유체가 3차원세포 배양 시 형성되는 노폐물을 다공성 멤브레인의 상면에서 하부챔버(200)로 배출시킬 수 있으며 3차원 세포의 하부까지 영양분을 원활히 공급할 수 있다. 나아가 하부챔버(200)에서 3차원세포 배양 장치 외부로 노폐물을 배출시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 유체 흐름 유도 장치는 시린지 펌프(syringe pump), 튜브연동펌프(peristaltic pump) 또는 교반기 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 3차원 세포 배양 장치는 3차원세포 배양 시 다공성 마이크로웰에 인가되는 압력을 분산시키고, 형성되는 노폐물과 영양분을 효율적으로 제거 및 공급할 수 있도록, 상기 상부챔버(100)는 하부챔버(200)의 유체의 표면이 외부와 접촉할 수 있도록 관통부(400)가 형성될 수 있다.

상기 관통부(400)는 하부챔버(200)의 유체의 표면이 외부와 접촉될 수 있는 구조를 제공하는 것으로, 상기와 같은 구조에 의해 유체 흐름 시 상부챔버(100)에 압력이 걸려 다공성 마이크로웰(21)이 변형되고, 이로 인해 3차원 세포 배양 시 세포의 안착, 증식 및 분화에 악영향을 미치는 문제를 해결할 수 있다.

한편, 본 발명은 본 발명의 3차원 세포 배양 장치를 이용하여 다공성 마이크로웰에 세포 배양액 및 세포를 투입하여 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원세포 배양 방법을 제공하며, 상기 세포는 근아세포(myoblasts), 태아 섬유아세포(embryo fibroblasts), 인간 제정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells), 인간 간암 세포(HepG2 세포) 또는 인간 표피 세포(human epidermal cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 2>

도 15(a)와 같은 형태의 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버(100) 및 하부챔버(200)를 포함하는 3차원 세포 배양 장치에서, 다공성 마이크로웰(21)에 HepG2 세포 및 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media, FBS 10%) 배양액과 함께 주입한 후 이를 37℃에서 48시간 안정화하여 3차원 스페로이드를 형성하였다. 그 후 하부챔버에 유동을 주어 9일동안 배양 하였다.

<비교예 2>

상기 <실시예 2>에서 하단 유동을 주지 않는 것을 제외하고는, <실시예 2>와 동일하게 3차원의 HepG2 스페로이드를 배양하였다.

상기 <실시예 2> 및 <비교예 2>에서 상기 배양 기간 중, 6일차 및 9일차에서 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현량을 측정하였다. 측정된 알부민 발현양을 도 16(a)에 나타내었으며, 도 16(a)에 보이는 바와 같이 <비교예 2>에서 배양된 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현양은 6일차에 1182.64mg/ml, 9일차에 2966.505mg/ml인 반면, <실시예 2>에서 배양된 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현양은 6일차에 4813.99mg/ml, 9일차에 6644.55mg/ml인 것을 확인할 수 있었다. 즉, 하단 유동이 있는 3차원 세포 배양 장치에서 배양시킨 Hep G2 스페로이드의 알부민 발현량이 큰 것을 알 수 있었으며, 이를 통해 하단 유동으로 인해 3차원 Hep G2 스페로이드의 기능성 향상을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

하단 유동에 의한 본 발명의 3차원 세포 배양 장치에서 노폐물이 효율적으로 제거될 수 있음을 확인하기 위해, 도 15(a)과 같은 형태의 3차원 세포 배양 장치의 다공성 마이크로웰에 FITC-Dextran 20kDa을 200ug/ml를 넣고, 하단 유동을 3시간 동안 수행한 후 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC Dextran의 농도를 측정하였다.

<비교예 3>

상기 <실시예 3>에서 하단 유동을 주지 않는 것을 제외하고는, <실시예 3>과 동일하게 FITC-Dextran을 넣고 3시간 후에 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도를 측정하였다.

<실시예 3>에서 노폐물이 축적된 정도를 육안으로 살펴본 결과를 도 17에 나타내었으며, 상기 <실시예 3> 및 <비교예 3>에서 측정된 FITC-Dextran의 농도를 도 16(b)에 나타내었다. 도 16(b)에 보이는 바와 같이, 하단 유동이 있는 <실시예 4>의 경우 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도는 55.6199±3.3429mg/ml인 반면, <비교예 3>의 경우 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-Dextran의 농도는 131.435±7.80245mg/ml임을 확인할 수 있었다.

즉, 하단 유동이 있을 때, 다공성 마이크로웰에 남아있는 FITC-dextran의 농도는 하단 유동이 없는 경우에 비해 현저히 낮은 것으로, 같은 양의 배양액으로도 하단 유동이 있을 때가 다공성 마이크로웰에 있는 세포의 노폐물을 효율적으로 제거할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 도 18(a)와 같이 하부챔버에서 유체 흐름 유도 장치 및 다공성 마이크로웰에 의해 다공성 마이크로웰 상면의 노폐물이 제거되는 것임을 확인할 수 있었다. 도 18(a)는 배양액의 하단 유동이 있을 때 다공성 마이크로웰 내 존재하던 노폐물들이 공극을 통과하여 제거되는 모습, 다시 말해 노폐물들이 유체의 흐름을 따라 공극을 통과하게 됨으로써 마이크로웰 내부로부터 제거되는 모습을 도시한 것이다. 한편, 도 18(b)는 배양액이 하부챔버 내에서 하단 유동이 될 때에 배양액이 자연스럽게 마이크로웰 내부로 확산되는 현상을 도시한 것으로, 배양액의 하단 유동이 있을 시 멤브레인의 공극을 통해서는 노폐물이 제거될 수 있을 뿐만 아니라 배양액의 확산도 동시에 일어날 수 있음을 설명하기 위한 도면이다. 도 18의 (a) 및 (b)를 참고할 때, 당연히 노폐물이 공극을 통과하는 방향과 배양액이 공극을 통과하는 방향은 서로 반대의 방향이 될 것이다.

이하에서는 도 19 내지 도 29를 참고하여, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 배양 장치 및 세포 배양 방법에 대해 살펴보기로 한다.

본 실시예에 의하면, 세포를 배양하는 과정에서 마이크로웰 상부에서 파이펫팅을 통해 사용된 세포 배양액을 제거하고 새로운 세포 배양액을 주입하는 기존 세포 배양액 교체법을 사용하는 경우 파이펫팅에 의한 배양액 유동에 의해 세포 및 세포 응집체의 유실이 발생할 수 있는 문제를 해결할 수 있다. 또한 지속적으로 다공성 마이크로웰을 투과하여 유도되는 세포 응집체 주변의 유동에 의해 영양분과 같은 균일한 세포 미세 환경의 구현이 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면 배양 과정에서 상기와 같은 세포의 유실을 최소화할 수 있으며 이와 동시에 지속적으로 균일한 세포 응집체 주변 미세 환경을 유도하여, 2차원 배양에 비하여 생체 내 현상과 더욱 유사한 현상을 나타내는 3차원의 세포 응집체를 배양할 수 있게 된다.

도 19를 참고할 때, 본 실시예에 따른 세포 배양 장치는 개구부와 다공성 멤브레인 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰(21)을 포함하는 상부챔버(110)를 포함한다. 또한, 상기 상부챔버(110)가 내부에 배치되는 공간을 구비하는 하부챔버(210)를 포함하며, 상기 상부챔버(110)의 상부로 유입된 유체는 상기 상부챔버(110)에서 다공성 마이크로웰(21)을 투과해 상기 하부챔버(210)로 유입되고, 하부챔버(210)의 유체는 배출되어 유체가 유동되도록 구현된다.

또한, 본 상세한 설명에서는 도 19의 세포 배양 장치를 이용하여, 상부챔버(110)의 다공성 멤브레인 상에 세포를 접종하는 단계; 세포 배양액을 상부챔버(110)의 상부로 유입구(311) 또는 개구부를 통해 투입하는 단계; 및 상부챔버(110)에서 다공성 마이크로웰을 투과해 하부챔버(210)로 유입된 세포 배양액을 하부챔버(210)로부터 배출하는 단계;를 포함하는 3차원 세포 응집체 배양 방법에 대해서도 언급하기로 한다. 또한, 상기 3차원 세포 응집체 배양 방법은, 하부챔버(210)로부터 배출되는 세포 배양액에 의해 세포 배양액이 유동하게 되며, 나아가 상기 세포 배양액을 하부챔버(210)로 투입하는 단계;를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 장치는 상부챔버(110)의 상부로 유입된 유체가 상기 상부챔버(110)에서 다공성 마이크로웰(21)을 투과해 상기 하부챔버(210)로 유입되고, 나아가 하부챔버(210)의 유체는 배출되어 유체가 유동되도록 하는 것으로, 이때 상기 하부챔버(210)의 유체는, 하부챔버(210)에 구비된 유체 배출구를 통해 배출되거나 또는 상부챔버(110)와 하부챔버(210)의 사이의 간극 영역을 통해 배출되는 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 간극 영역의 상부를 통해 배출되는 것일 수 있다.

상기 유체 배출구는 하부챔버(210)의 어떠한 위치에서도 형성될 수 있으며, 예를 들어 도 1(c)와 같이 하부챔버(210) 하단에 구비될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 하부챔버(210)에 이와 같은 유체 배출구가 구비되지 않는 경우 도 29의 (a) 내지 (c)와 같이 상부챔버(110)와 하부챔버(210)의 사이의 간극 영역을 통해 유체가 배출되도록 하여 유체의 흐름을 형성할 수 있다. 이때 상부챔버(110)와 하부챔버(210)의 사이의 간극 영역이 존재하기 위해 상부챔버(110)와 하부챔버(210)의 각 측면의 벽 사이에 간극이 존재하도록 각 챔버의 사이즈를 조절할 수 있으며, 이들 사이의 간극 영역에서 공기와 접하는 계면의 상부로부터 유체가 배출되도록 할 수 있다.

정리하면, 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 장치는 하부챔버(210)로부터 유체를 배출할 수 있도록 배출 구조를 구비할 수 있으며, 이 때 배출 구조는 하부챔버(210)에 유체 배출구(331)를 통하여 유체를 유동 시키는 구조, 또는 상부챔버(110)와 하부챔버(210) 사이 간극 영역, 다시 말해 상부챔버(110)와 하부챔버(210) 사이에 존재하는 틈을 통해 배출 시킴으로써 유체를 유동 시키는 구조로 이루어질 수 있다.

한편, 본 상세한 설명에서 구체적으로 언급이 되지 않은 여타의 배출 구조가 존재할 수 있는데, 세포 배양액을 포함한 유체의 흐름이 상부챔버(110)로부터 하부챔버(210)로 이어지는 하방 흐름을 유지할 수 있는 한, 배출 구조의 구체적인 세부적인 조건들에는 제한이 없다 할 것이다.

참고로, 본 실시예에 있어서 상기 다공성 멤브레인은 나노섬유 네트워크로 이루어진 것으로, 공극률이 20 % 내지 60 %의 다공성 멤브레인인 것이며, 예를 들어 공극률이 30 % 내지 50 % 의 다공성 멤브레인일 수 있다. 상기 공극률이 20% 미만인 경우에는 투수계수가 낮아지고, 이에 따라 다공성 멤브레인에 가해지는 수압이 증가함으로써 다공성 멤브레인상에 배양 중인 세포 응집체의 생존률이 저하되는 문제를 발생시킬 수 있다.

또한, 상기 다공성 멤브레인은 10 nm 내지 10 μm의 평균 공극의 입경 크기를 가질 수 있다. 즉, 상기 다공성 멤브레인은 상기와 같은 범위의 평균 공극의 크기를 포함하므로, 단일 세포들은 투과시키지 않으면서 세포 배양액 내 영양분, 성장인자 등의 타 물질들은 선택적으로 투과시키는 선택적 투과막으로 작용할 수 있다. 이로 인해 다공성 멤브레인 상에서 단일 세포의 응집을 유도하여 3차원 응집체 형성을 가능하게 하며, 응집체 형성 후에는 물질 이동 장벽 및 통로의 역할을 수행할 수 있다.

다공성 멤브레인은 상술한 본 발명의 공극률 및 평균 공극의 입경 크기 범위 내에서 높은 투수계수의 특성을 보유 할 수 있다. 또한 상기 다공성 멤브레인은 1 내지 20 μm s^-1의 투수계수(Hydraulic conductivity)를 가질 수 있다. 상기 투수 계수가 1 μm s^-1 미만인 경우에는 다공성 멤브레인에 높은 수압이 야기되며, 1000Pa 이상의 수압이 다공성 멤브레인 및 배양 중인 세포 응집체에 인가되면 세포의 생존률을 저하시 키는 등의 악영향이 있을 수 있다.

상기 다공성 멤브레인은 세포 배양용 나노섬유 네트워크인 것으로, 이의 제조 방법은 특히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 전기 방사에 의해 형성되는 고분자 나노섬유로 이루어진 것일 수 있다.

상기 나노섬유 네트워크의 제조 방법은 예를 들어 폴리카프로락톤을 4 내지 10 wt % 농도가 되도록 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol) 혼합물의 용매에 용해한 용액을 전기방사하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 전기 방사는 10 내지 30 kV 전압 하에서 0.1 내지 2.0 ml hr^-1의 고분자 용액의 토출 속도로 수행되는 것이 바람직하며, 전압이 상기 범위 미만인 경우에는 균일한 나노섬유 제조에 문제가 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 에는 나노섬유의 적층이 불균일해 지는 등 안정적인 나노섬유 제조에 문제가 있을 수 있다.

상기 다공성 마이크로웰은 하부 방향으로 오목하게 형성된 함몰부의 전체 또는 일부분이 다공성 멤브레인일 수 있으며, 바람직하게는 다공성 마이크로웰, 즉 상부챔버의 개구부가 위를 향하도록 배치하는 경우 바닥을 형성하는 면이 다공성 멤브레인으로 형성된다.

한편, 상기 본 발명의 상부챔버(110)의 하면을 이루는 다공성 멤브레인은 돌 출부 및/또는 오목부를 구비하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 도 28과 같이 다공성 멤브레인을 이용하여 오목부를 형성하거나, 또는 도 26과 같이 다공성 멤브레인 상에 오목부에 상응하는 구획을 형성할 수 있는 측벽 또는 돌출부를 추가로 부가하여 오목 부를 형성할 수 있으며, 이때 측벽 또는 돌출부의 재질은 다공성이거나 또는 다공성이 아닐 수 있는 것으로 특히 제한되지 않는다. 바람직하게는 오목부의 하면은 다공성 멤브레인인 것이며, 측벽 또는 돌출부는 다공성이거나 또는 다공성이 아닐 수 있다. 예를 들어 도 21(a) 및 도 21(b)는 관통 구멍이 형성된 추가의 층을 적층함으로써 오목부의 측벽이 다공성 재질이 아닌 경우의 형태를 나타낸 예시이며, 도 21(c)는 다공성 멤브레인 자체에 오목부가 형성된 것으로 오목부 및 오목부가 아닌 부분이 전체적으로 모두 다공성인 재질인 경우이다.

다공성 마이크로웰은 예를 들어 도 26에 나타낸 바와 같이 전기 방사로 제작된 다공성 멤브레인을 쓰루홀 (Thru-hole)의 배열과 결합하여 제조 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 도 21(c)와 같이 다공성 재질의 오목부 및 돌출부 형성은 예를 들어 도 28과 같이 몰드를 활용한 압축 공정을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 다공성 마이크로웰의 다공성 멤브레인의 상면은 세포 배양층으로 작용하는 영역으로, 상술한 바와 같이 다공성 멤브레인이 돌출부 및 오목부를 구비하는 경우에는 형성된 오목부에 세포가 더욱 용이하게 안착하게 되며, 상기 다공성 마이크로웰 내에서 단일 세포의 응집을 유도하여 3차원 세포 응집체가 안정적으로 형성된 후 배양 될 수 있게 된다. 보다 바람직한 본 발명의 다공성 멤브레인은 돌출부 및 오목부를 구비하며, 모든 면이 다공성 멤브레인으로 이루어진 것이다.

한편, 상기 하부챔버(210)는 상부챔버(110)가 내부에 배치되는 공간을 구비하며, 하부챔버(210)에 유체 배출구가 구비되는 경우 이와 같이 유체가 배출될 수 있는 유체 배출구(331)를 통해 상기 상부챔버(110)가 내부에 배치된 상태로 배양액을 담고 있는 하부챔버(210)의 유체가 하부챔버 외부로 배출되면서 배양액이 유동할 수 있다. 이를 위해, 상기 상부 및/또는 하부챔버(210)에는 유동을 일으킬 수 있는 장치가 추가로 연결될 수 있으며, 예를 들어 상기 상부챔버(110)에 세포 배양액을 일정한 유속으로 주입하는 장치가 추가될 수 있고, 상기 하부챔버(210)는 상기 상부챔버(110)에 유입된 유체가 상기 상부챔버(110)의 다공성 멤브레인을 투과해 상기 하부챔버(210)로 흐르면서 일정한 유속으로 배출되도록 하는, 유체의 흐름을 제어하는 장치와 연결 될 수 있으며, 이는 예를 들어 배양액 저장소일 수 있다. 이때, 상기 유체의 유동을 일으킬 수 있는 것이라면, 유체 흐름을 유도하는 장치는 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 유체 흐름 유도 장치는 시린지 펌프(Syringe pump), 튜브연동펌프(Peristaltic pump) 또는 교반기 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 3차원 세포 배양 장치는 상기 하부챔버(210)와 동일한 평면 상에 배치되며, 하부챔버(210)와 유체 연통된, 배양액 저장소(65)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 배양액 저장소(65) 내 배양액의 높이는 하부챔버(210) 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정될 수 있다.

상기 하부챔버(210) 내 배양액의 수위는 상부챔버(110) 하단의 다공성 멤브레인을 기준으로 상부 방향으로 1 내지 20 mm 의 높이인 것일 수 있으며, 예를 들 어 1 내지 19 mm, 바람직하게는 1 내지 18 mm, 예를 들어 1 내지 8mm일 수 있다. 배양액의 수위가 상기 바람직한 범위 미만인 경우 배양중인 세포 응집체에 원활한 영양분 공급이 불가해 질 수 있으며, 상기 바람직한 범위를 초과 할 경우 배양액 의 범람 및 과용을 초래 할 수 있다.

또한, 상기 상부챔버(110) 하단의 다공성 멤브레인과 하부챔버(210) 바닥의 간격은 0.1 내지 8 mm인 것일 수 있으며, 예를 들어 0.2 내지 7 mm, 바람직하게는 1 내 지 5 mm일 수 있다. 간격이 상기 바람직한 범위 미만인 경우 세포 배양액의 유동이 제한되어 배출구를 통한 배출이 불가능 할 수 있다. 또한, 상기 바람직한 범위를 초과할 경우 배양액의 과용을 초래 할 수 있다.

이때, 상기 유체, 즉 세포 배양액은 일정한 속도를 유지하면서 유동 할 수 있다. 이를 위해 상기 유체의 유입과 배출을 일정한 속도로 조절할 수 있다. 이때, 예를 들어, 상기 유체는 0.0001 내지 1 ml hr^-1, 예를 들어, 0.001 내지 1 ml hr^-1의 속도로, 바람직하게는 0.01 내지 1 ml hr^-1의 속도로 유동할 수 있다. 상기 유체의 유동 속도가 0.0001 ml hr^-1 미만인 경우에는 세포 응집체가 필요한 양의 세포 배양액이 공급되지 않는 문제가 생길 수 있으며, 1 ml hr^-1를 초과하는 경우에는 세포 응집체에 유동에 의한 과도한 전단응력이 작용해 세포 응집체에 악영향이 미칠 수 있다. 세포에 악영향을 미치지 않는 전단응력, 예를 들어 0.001 내지 10 dyne cm^-2의 전단응력은 세포에 분화 및 증식에 긍정적인 영향을 끼칠 수 있다.

한편, 상기 세포 배양액은 1000 Pa 미만의 수압으로 상기 다공성 멤브레인에 인가하는 것이 바람직하며, 압력이 적을수록 보다 바람직하고, 예를 들어 1 Pa 내지 100 Pa일 수 있다. 한편, 1000 Pa 초과인 경우 세포 생존률이 저하되는 문제가 있다.

본 발명의 3차원 세포 응집체 배양 장치 및 상기 장치를 이용한 3차 원 세포 응집체 배양 방법에서는 세포주 예를 들면 근아세포(Myoblasts), 태아 섬 유아세포(Embryo fibroblasts), 제정맥 내피세포(Umbilical vein endothelial cells), 간암 세포(HepG2 세포), 표피 세포(Epidermal cells) 또는 이 중 적어도 일종 이상의 혼합 등을 사용 할 수 있다. 또한, 세포주뿐만 아니라 간, 췌장, 소장 등의 1차 세포 또한 사용 될 수 있다. 마지막으로, 줄기세포 예를 들면, 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell), 중간엽유래 줄기세포(Mesenchymal stem cell) 또는 이 중 적어도 일종 이상의 혼합 등의 세포를 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 3차원 세포 응집체인 스페로이드 또는 오가노이드를 배양 할 수 있다.

한편, 본 실시예에 따른 3차원 세포 응집체 배양 방법은 상기 본 발명의 3 차원 세포 배양 장치를 이용하여, 상부챔버(110)의 다공성 멤브레인 상에 세포를 접종하는 단계; 및 세포 배양액을 상부챔버(110)의 상부로 유입구(311) 또는 개구부를 통해 투입하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

상기 세포는 상기 다공성 멤브레인 상에 접종되어 배양될 수 있으며, 상기 접종은, 상기 상부챔버(110)에 유체를 유입하는 단계에 선행하여 배양할 세포를 상기 다공성 멤브레인 상에 접종함으로써 수행될 수 있다. 이에 의해 세포는 위 3차원 세포 배양 장치에 적용될 수 있고, 상기 세포를 접종하는 방법은 당업계에서 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 마이크로파이펫을 이용하여 접종할 수 있다.

상기 방법으로 접종된 세포는 수 시간에서 수 일 내에 3차원 세포 응집체를 형성한다. 세포 응집체 형성 후에 개발된 장치에 의한 세포 배양액의 유동이 인가 될 수 있다.

실시예

1. 다공성 멤브레인의 제조

폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL; Mn = 80,000 g mol^-1), 클로로포름 및 메탄올은 Sigma-Aldrich (미국)에서 구입하였다. 전기 방사를 위한 PCL 용액은 7.5 wt% 농도의 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol)의 혼합물에 PCL을 용해하여 준비하였다. 준비된 PCL 용액을 5 ml 정밀 주사기(Gastight syringe; Hamilton)에 넣고 상업용 전기 방사 기계(ES-robot, NanoNC)를 사용하여 직경 5 cm 의 고리 모양 전극 위에 10cm 거리를 두고 배치된 23 게이지 금속 바늘을 통하여 1ml h^-1 의 유속으로 토출하였다. 금속 바늘과 고리 모양의 전극 사이에 상기 상업용 전기방사 기계를 활용하여 15kV의 고전압을 가하여 전기 방사를 수행하였다. 전기 방사된 PCL 나노섬유(As-electrospun PCL nanofiber)는 고리 모양 전극 사이에 증착되어 기체 및 질량 투과성 나노섬유 멤브레인을 생성하였다. 전기 방사는 상대 습도 50 ~ 60 %, 온도 20 ~ 25 ℃에서 실시하였다. 나노섬유 네트워크 제조 시 방사 시간에 따른 현미경 사진을 도 22에 나타내었으며, 나노섬유 직경은 약 800- 1000 nm인 것을 확인 하였으며, 방사시간이 증가함에 따라 평균 공극의 크기 및 공극률(Porositiy)은 감소하며 반대로 평균 두께는 증가하였다.

상기 나노섬유 네트워크 제조 시 방사 시간에 따른 나노섬유 네트워크의 구조 변화(도 22(a)), 공극률 변화(도 22(b)), 다공성 멤브레인의 투수 계수 (Hydraulic conductivity)(도 22(c)), 및 수압(Induced pressure)(도 22(d))을 각각 도 22에 나타내었다.

이때, 공극률의 계산 방법은 확대 된 현미경 이미지를 이진 이미지로 (Binary image) 변환 한 다음 Image J 소프트웨어 (NIH, USA)를 사용하여 나노 섬유 네트워크 면적 대비 나노섬유 네트워크에 의해 생성된 공극의 면적 분율을 계산하여 나타낸 것이다.

2. 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버 제조

상기 1.에서 획득된 다공성 멤브레인 및 배양액을 수용하는 세포 배양 공간을 구비하는 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버를 제조하기 위해서 일련의 공정을 수행했으며 이를 도 26에 나타내었다. 상세하게, 상부챔버 하단의 다공성 멤브레인 영역은 500μm 두께의 폴리 메틸메타크릴레이트 플레이트 (PMMA, Acryl Choika, South Korea)에 접착제를 도포한 후 레이저 절단기 (ML-7050A, Machineshop, South Korea)를 사용하여 접착제가 도포된 PMMA 플레이트에 쓰루홀의 배열을 천공하였으며 도포된 접착제를 활용하여 쓰루홀과 다공성 멤브레인을 결합함으로써 최종적으로 도 21과 같이 바닥면이 다공성 멤브레인으로 이루어진 오목부를 형성하여 완성하였다.

또 다른 형태의 상부챔버 하단의 다공성 멤브레인 영역을 제작하기 위 한 일련의 공정을 도 28에 나타내었다. 보다 상세하게는, 상기 1.에서 획득된 평평한 다공성 멤브레인을 돌출 몰드 및 오목 몰드를 활용한 압축 공정을 통해 모든 면이 다공성 멤브레인으로 이루어진 돌출부 및 오목부가 형성된 다공성 멤브레인을 구비하는 상부챔버 하단을 완성하였다. 이때 오목 몰드는 10mm 두께의 폴리 메틸메타크릴레이 트 플레이트 (PMMA, Acryl Choika, South Korea)에 기계가공장비(EGX-350, Roland, USA)를 활용하여 드릴링을 통해 제작 하였으며, 폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 돌출 몰드를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물(Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 함몰 몰드에 붓고 55℃에서 12 시간 동안 경화하여 완성했다.

상부챔버 중 개구부 형태를 갖는 나머지 측면 부분은 사출성형기 (SE50D, Sumitomo, Japan)를 활용해 제작하였다. 이렇게 획득된 상기 측면 부분과 상기에서 획득된 상부챔버 하단을 접착제를 활용하여 결합하여 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버를 완성하였다.

3. 3차원 세포 응집체 배양 장치 제조

폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 하부챔버와 이의 덮개를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물(Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 몰드에 붓고 55℃에서 12 시간 동안 경화했다. 하부챔버와 덮개의 몰드는 20 mm 두께의 PMMA 플레이트를 기계가공 장비 (EGX-350, Roland, USA)를 활용하여 제작하였다. 하부챔버는 30 mm × 30 mm × 30 mm 의 크기로 제작 되었으며, 이때 윗면에 2 mm 깊이의 홈을 설계하여 (도 27(a)) 하부챔버 바닥 면으로부터 상기 2.에서 제작된 다공성 마이크로웰의 다공성 멤브레인까지의 거리 간격은 8 mm 로 설정하였다(도 27(b)). 하부챔버 바닥 면과 덮개의 정중앙에 Biopsy punch (Miltex, USA)를 활용하여 1 mm 크기로 천공하여 배출구를 형성하였다.

개구부 덮개의 천공을 통해 튜브(Biokonvision, South Korea)가 연결되었으며 syringe pump (KDS200, KD Scientific, USA)는 상기 튜브를 통해 0.062 ml h^-1의 유속(flow rate)으로 세포배양액을 주입하였다. 하부챔버 바닥 면의 천공 또한 튜브와 연결되어 세포 배양액이 배양액 저장소로 이송될 수 있도록 하였다. 또한, 상기 배양액 저장소 하부에 Z-스테이지(stage)를(Sciencetown, South Korea) 구비해 저장소의 높이는 하부챔버 내 배양액의 수위에 상응하도록 설정하여, 배양 과정에서 시린지 펌프로부터 지속적으로 배양액이 유입됨에도 하부챔버 배양액의 수위를 일정하게 유지할 수 있도록 설계되었다.

4. 응집체 배양 장치를 이용한 세포 배양

<실시예 4>

상기 1에서 제조된 다공성 마이크로웰을 포함하는 상부챔버 및 하부챔버에 더하여 배출된 배양액을 저장할 수 있는 배양액 저장소를 포함하는 3차원 세포 배양 장치를 도 19와 같이 마련하였다. 이때 배양액 저장소의 높이는 하부챔버 바닥면으로부터 하부챔버의 수위가 12 mm에 상응 하도록 설정하였다. 이렇게 획득된 세포 배양 장치와 관련하여서는 '본 발명의 세포 배양 장치' 및 '실시예 4의 세포 배양 장치'를 상호 호환적으로 지칭하기로 한다.

상기 3차원 세포 배양 장치에서, 다공성 마이크로웰에 간 세포(HepG2) 및 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media, FBS 10%) 배양액과 함께 주입한 후 이를 37℃에서 48 시간 동안 유동을 인가하지 않고 정적인 환경에서 3차원 HepG2 응집체 즉 HepG2 스페로이드를 형성하였다. 그 후 시린지 펌프를 이용하여 일정한 유속인 0.062 ml hr^-1으로 상부챔버에 세포 배양액을 지속적으로 주입하였다. 그 후 상기 주입된 유량만큼 유체를 배출하기 위해 하부 방향으로 유체 배출구(331)가 형성된 하부챔버를 통해 배양액 저장소로 배출 되도록 하여 8일 동안 HepG2 스페로이드를 배양 하였다.

<비교예 4>

다공성 멤브레인이 아닌 불투과성 PMMA 플레이트의 바닥면으로 구성된 불투과성 마이크로웰을 사용한 것과 시린지 펌프, 배양액 저장소 등의 세포 배양액의 유동을 인가하는 장치를 사용하지 않고 파이펫팅을 이용한 세포 배양액 교체를 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일하게 HepG2 스페로이드를 배양하였다.

실험예

(1) 시간의 흐름에 따른 3차원 세포 배양 장치 내의 유체 교환 확인

실시예 4의 3차원 세포 배양 장치에서, 상부챔버로 새롭게 유체가 0.062ml hr^-1의 유속으로 주입될 때 3차원 세포 배양 장치 내의 유동 변화(유체 교환 확인)를 확인하기 위한 실험을 진행하였다.

도 25에 보이는 바와 같이, 세포 배양 응집체 내부에 기존에 존재하던 푸른 용액이 새롭게 주입되는 투명한 색의 용액으로 점진적으로 교환되는 것을 확인할 수 있었다. (흑백의 도면에서는 도 25의 좌측으로부터 우측으로 시간이 경과할수록 어두운 색깔의 용액이 점차 밝은 색깔로 변화해 가는 것을 확인할 수 있다) 또한, 이 과정에서 하부챔버의 수위는 일정하게 유지 되는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 실시예 4에서 세포 배양액의 흐름 해석

본 발명의 3차원 세포 배양 장치에서 세포 배양액의 흐름을 측정하기 위한 전산유체해석 방법을 적용하기 위해 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)을 통해서 실시예 4의 3차원 세포 배양 장치에서 내 의 유속(Surface velocity: 0 m s^-1 ~ 8.11 e^-6 m s^-1), 유동방향(검정색 콘 모양), 유선(흰색 선)에 해당하는 내용을 해석 및 계산하였다.

그 결과, 도 20에 보이는 바와 같이, 본 발명의 3차원 세포 배양 장치에서, 세포 배양액은 상부챔버에서 하부챔버로 원활하게 흐르는 것을 확인할 수 있었다.

(3) 세포 배양 시 세포가 유실되는 정도의 비교

실시예 4 및 비교예 4에서 2일 간격으로 간 세포 스페로이드의 유실 정도를 비교하였으며, 그 결과를 도 23에 나타냈다.

도 23에 보이는 바와 같이, 실시예 4에서는 간 세포 스페로이드의 유실이 전혀 없었으나, 비교예 4에서는 지속적으로 스페로이드가 유실되고, 8일 째에는 약 15 % 가량의 HepG2 세포 스페로이드의 유실이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.

(4) 시간의 흐름에 따른 3차원 세포 응집체 주변 영양분 농도 비교

실시예 4 및 비교예 4에서 시간에 흐름에 따른 HepG2 스페로이드 주변의 영양분(Glucose) 농도를 측정하여 비교 분석하기 위하여 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)을 활용 하였다. 이 과정에서 활용된 수치는 하기 표 1에 나타내었다.

분자 (Molecules)	MW [kDA]	확산 계수 [μm²s^-1]	배양액 내 초기 농도 [mol m^-3]	소비율 [mol m^-3s^-1]
글루코스	0.18	580	11.1	5.2E-3

도 24에 보이는 바와 같이, 실시예 4의 세포 배양 장치에서는 36시간 이후 균일한 영양분 농도가 HepG2 세포 응집체 주변에 유도되는 것이 수치 예측되었으나, 비교예 4에서는 파이펫팅 간격 전후로 영양분 농도의 변화가 심하며 세포 응집체 주변에 불균일한 영양분 농도가 유도되는 것이 수치 예측 되었다.

(5) 실시예 4의 3차원 세포 배양 장치에서 다공성 멤브레인의 투수 계수 및 수압 측정

상부챔버로 새롭게 유체가 0.062 ml hr^-1의 유속으로 주입될 때 3차원 세포 배양 장치 내의 다공성 멤브레인에 인가되는 수압(Applied pressure on membrane)을 확인하기 위한 실험을 진행 하였다. 이를 확인하기 위해서, 사전에 투수 계수의 측정은 발명된 장치 외부에서 하기와 같이 Falling-head method를 활용 하여 진행하였다.

구체적으로, 초기 수두(Initial pressure head, h_i) 를 갖는 물이 다공성 멤브레인을 투과하여 최종 수두(Final pressure head, h_f)에 도달하기 까지의 시간을 확인하여 Darcy 's law를 기반하는 공식을 통해 투수 계수를 측정 하였다.

(식 1)

여기서 K는 다공성 멤브레인의 투수 계수, L은 다공성 멤브레인의 두께, t는 h_i 에서 h_f 까지 도달하는 시간이며 본 실험에서는 각 각 100mm 와 10mm의 h_i 및 h_f 를 활용 하였다. 계산된 투수 계수를 기초로 다공성 멤브레인의 투과도(Permeability) 를 다음과 같은 수식을 활용하여 계산 하였다.

(식 2)

여기서 k는 현재 다공성 멤브레인의 투과도, μ는 세포 배양액의 점도, ρ는 세포 배양액의 밀도, g는 중력 가속도이다.

0.062 ml hr^-1의 유속으로 다공성 멤브레인을 투과하는 세포 배양액, 측정된 투수계수와 계산된 투과도를 기반하여 다음과 같은 수식(Kozeny-Carman equation)을 활용하여 다공성 멤브레인에 인가되는 수압을 계산 하였다.

(식 3)

여기서는 현재 다공성 멤브레인을 투과하는 유체의 유속 k는 현재 다공성 멤브레인의 투과성, μ는 세포 배양액의 점도, L는 다공성 멤브레인의 두께이며 p는 다공성 멤브레인에 인가되는 수압이다.

도 22에 보이는 바와 같이, 다공성 멤브레인에 인가되는 수압 즉, 수력 반발력은 다공성 멤브레인을 구성하는 나노섬유의 네트워크가 성길수록 즉, 전기 방사 수행 시간이 짧을수록, 즉 공극률 및 투수 계수가 높을수록 낮은 것을 확인 하였다. 이를 본 발명의 다공성 멤브레인이 아닌 상용 다공성 멤브레인과 비교 분석 하였을 때, 본 발명의 다공성 멤브레인에 훨씬 낮은 수력 반발력이 인가 되는 것을 확인할 수 있었으며 나노섬유 네트워크로 구성된 다공성 멤브레인이 본 발명의 장치에 더 적합함을 확인할 수 있었다.

이하에서는 도 30 내지 도 34를 참고하여, 웰(well) 또는 튜브의 확산에 의한 물질 투과성을 활용하여 스페로이드형 줄기세포 주변 산소농도 또는 분화 인자 농도를 조절함으로써 초자연골세포로 분화를 시키는 방법에 관해 설명하기로 한다.

퇴행성관절염, 연골판 및 인대 파열 등과 같은 연골 질환은 관절연골이 파괴되는 질환으로 관절을 이루는 뼈와 인대에 까지 손상이 이어져 염증과 심한 통증을 동반하여 체형변화 및 행동 제약을 유발하는 심각한 난치성 질환이다. 건강한 관절 연골은 뼈 끝의 관절 단면이 탄성 유리질(Hyaline)으로 구성되어 외부 충격을 완화하거나 뼈 사이의 마찰을 줄인다. 연골 관절의 손상 또는 퇴행 과정 중에 기계적 물성이 높으며 탄성 특성의 초자연골(유리질 연골, Hyaline cartilage) 이 점차 기계적 물성이 낮은 섬유연골(Fibrous cartilage)로 변화되면서 연골 관절의 제 기능을 수행할 수 없게 된다. 관절 연골은 손상 또는 퇴행을 겪으면 혈관과 신경 그리고 림프선이 없으므로 스스로 재생할 수 있는 능력이 거의 없는 비가역적 조직이기 때문에 연골재생 치료를 위해서는 미세천공술(Microfracture), 자가연골 세포 이식술(Autologous chondrocyte implantation, ACI) 또는 줄기세포치료(Stem cell therapy)등의 내생(Endogenous) 또는 외생(Exogenous)의 세포 기반 치료방법 이 필수적이다.

미세천공술을 통해 재생시킨 연골 조직은 초자연골이 아닌 섬유연골로 구성되기 때문에 정상 연골 조직 대비 기계적으로 약한 물성을 갖게 되는 한계가 있으며, 자가연골세포이식술은 신체 전반의 노화가 진행된 환자의 경우 연골재생에 적합한 건강한 연골세포를 분리하는 것이 불가능 하기 때문에 제한된 환자에게만 적용 가능 하는 등 제한된 치료법이다. 이에 반해 최근에 각광 받고 있는 줄기 세포치료는 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)로부터 유도되는 주변분비 효능(Paracrine effect)에 의한 연골재생 효과를 기대할 수 있어 차세대 연골재생 치료법으로 그 가능성을 인정받고 있다.

상기 줄기세포치료처럼 다분화능(Multipotent)의 미분화 중간엽줄기 세포(Undifferentiated MSC)를 이식하는 치료법은 환자에 따라 그 효과가 상이할 수 있다. 이는 이식된 미분화 줄기세포가 다양한 환자 특이적 병변 환경에 의해 분화 양상의 예측 및 조절이 불가능하기 때문이다. 이를 극복하기 위해서는 중간엽줄 기세포를 체외에서 안정적으로 양질의 초자연골로 사전 분화시켜 체내에 이식하는 방법이 필요하다.

줄기세포를 배양하는 방법에 있어서, 일반적인 세포와 마찬가지로 2차원 단일층 세포배양법의 한계를 극복하기 위해 3차원 세포 응집체(3D cell aggregation) 즉, 스페로이드 (Spheroid) 배양 방법이 최근에 널리 활용 되고 있다. 스페로이드형의 줄기세포를 타겟 세포로 분화하는 과정에서 높은 분화 수율을 보장하기 위해서는 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 스페로이드 주변에 균일한 세포미세환경(Cellular microenvironment)를 유도하는 것이 중요하다. 그 이유는 스페로이드 주변 환경이 공간적으로 균일하지 않다면 스페로이드의 일부분은 타겟 세포로 분화가 유도되는 반면 나머지 일부분은 타겟 세포로 분화되지 못하고 비 타겟 세포로 분화가 진행되기 때문이다.

이하에서 설명될 일 실시예는 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 줄기세포응집체 주변의 세포미세환경을 균일하게 유도하여 줄기세포로부터 분화된 세포응집체형 연골 세포 치료제를 만드는 방법에 관한 것으로, 특히 줄기세포를 스페로이드형으로 제조한 뒤 불투과성 튜브 또는 마이크로웰에서 저산소 환경 하에서 배양한 후, 상기 스페로이드형 줄기 세포를 산소 및 분화 인자를 포함한 배지의 투과 및 이동은 허용하나 세포의 이동을 허용하지 않는 나노 섬유로 구성된 투과성 튜브 또는 마이크로웰로 옮겨 배양함으로써 줄기세포로부터 초자연골세포로의 분화 효율을 향상 시키는 것에 관한 것이다.

본 실시예에 따라 줄기세포응집체를 분화시키는 경우, 기존에 지속적으로 불투과성 웰에서만 배양 및 분화를 수행하는 방법에 비해 스페로이드형 줄기세포로부터 초자연골로의 분화 효율이 높아지는 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하는 경우 초자연골 함유량이 높은 줄기세포 유래 세포응집체형 연골 치료제의 생산이 가능하며, 체내에 이식한 경우 유의적으로 증가된 치료 효과를 얻을 수 있다.

참고로 본 실시예에서 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상 의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화능에 따라, 만능 줄기세포(Totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (Pluripotent stem cells) 또는 다분화능(다능성) 줄기세포(Multpotent stem cells)로 분류할 수 있다.

또한, "세포치료제(Cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미 할 수 있다.

또한, "연골 재생"이란 손상된 연골을 복원하거나 또는 부족한 연골조직의 생성을 유도하여 연골을 재생(Regeneration)하는 것을 의미할 수 있다.

기존의 줄기 세포를 스페로이드형 연골 세포로 분화 하에 활용되는 세포는 도 30과 같이 인간 유래 유도 만능 줄기 세포 (Human induced pluripotent cells)를 배아체(embryonic body, EB)로 형성한 후 얻은 줄기 세포인 EB 돌기세포(EB outgrowth cell) 이다. 그 후, 줄기 세포를 불투과성 튜브에서 원심 분리기를 활용하여 응집함으로써 스페로이드형 줄기세포를 제조한 뒤 불투과성 튜브에서 배양 및 분화를 수행하였다. 그러나 이는 스페로이드형 줄기세포 주변에 공간적으로 불균일한 환경이 유도되어 스페로이드형 줄기세포의 일부분은 타겟 세포로 분화가 유도되는 반면 일부 세포는 타겟 세포로 분화 되지 못하고 비 타겟 세포로 분화가 진행되어 분화 수율이 낮다는 한계가 있었다.

이에 본 실시예에서는 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 스페로이드형 줄기세포를 불투과성 튜브 또는 마이크로웰에서 배양한 후, 상기 스페로이드형 줄기세포를 산소 및 연골 분화 유도 인자 (TGF-β 또는 BMP-2 등), 성장인자를 포함하는 배지의 투과 및 이동은 허용하나 세포의 이동을 허용하지 않는 나노 섬유로 구성된 투과성 튜브 또는 마이크로웰에 배양하는 방법을 제안하고자 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명자들은 줄기 세포를 원심 분리기를 활용하여 응집함으로써 스페로이드형 줄기세포를 제조한 뒤 저산소 환경의 불투과성 튜브에서 배양하다가 나노섬유로 구성된 투과성 튜브로 옮겨 스페로이드형 초자연골세포로 분화시켰다 (도 31). 스페로이드형 줄기 세포를 투과성 튜브로 옮겨서 분화를 수행했기 때문에 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 스페로이드형 줄기세포 주변의 세포미세환경을 균일하게 유도 및 조성하여 줄기세포로부터 분화된 스페로이드형 초자연골세포를 제조할 수 있었다.

또한, 기체 질량 투과성 튜브(tube) 또는 마이크로웰 (microwell)을 제작하기 위해 평평한 나노 섬유막의 마이크로 딥 드로잉 공정을 개발하여 50㎛ 두께의 나노 섬유 벽으로 구성된 3.5 mm 깊이의 튜브 웰을 제작하였다 (도 31). 상기 튜브는 기존의 상용 0.4 ㎛ 공극 크기의 투과성 멤브레인 (Polyestere, PET) 보다 투과성이 높았으며 (도 32a), 불투과성 튜브에서 스페로이드형 줄기세포를 배양 및 분화하는 방법보다 산소 (도 32b) 및 연골 분화 유도 인자 (TGF-β3, BMP-2), 성장인자 (도 32c) 관련 세포미세환경을 균일하게 유도하는 것을 시뮬레이션으로 확인 하였다.

본 실시예의 방법으로 제조한 스페로이드형 초자연골세포 및 기존의 불투과성 튜브로 제조한 스페로이드형 초자연골세포를 비교한 결과, 본 실시예에 따라 제조한 스페로이드형 초자연골세포가 COL2a1의 발현량이 증가한 반면에 COL10A1의 발 현량은 감소하는 것을 확인하였다(도 33a). 또한, 본 실시예에 따른 방법으로 투과성 웰에서 14일 동안의 분화를 진행한 스페로이드형 줄기세포의 경우 불투과성 원추형 웰 에서 21일 동안의 분화를 진행한 스페로이드 대비 연골 관련 유전자 발현량이 비슷 하거나 (도 33b, COL2A1) 우수했다 (도 33c, ACAN). 이를 통해 본 실시예에 따른 방법이 불투과성 튜브만을 활용하여 제조하는 방법보다 스페로이드형 줄기세포를 초자연골로 더 빠르게 성숙시키는 것을 확인하였다.

또한, 결손된 쥐의 연골에 본 발명의 연골 치료제와 기존방법으로 제작한 연골 치료제를 각각 이식한 8주 후 이식 부위를 면역 형광 염색법을 통하여 분석하였다. 그 결과, 투과성 웰을 활용하여 제작한 치료제의 경우, 이식 부위에서 초자연골 관련 세포외기질인 Type II collagen이 불투과성 원추형 웰을 활용하여 제작한 연골 치료제 대비 우수하게 발현 되는 반면에, 뼈 관련 세포외기질인 Type X collagen은 오히려 적게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 34).

따라서, 본 발명에 따른 줄기세포를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법은 a) 줄기세포를 응집하여 줄기세포응집체를 제조 하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 제조된 줄기세포응집체를 산소 수준이 0.001 내지 0.15 mol/m³ 인 저산소 조건에서 1일 내지 10일 동안 배양하는 단계; c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포응집체를 투과성 웰 또는 투과성 튜브에서 초자연골세포응집체로 분화시키는 단계; 를 포함할 수 있다.

본 발명에서의 '줄기세포응집체', '초자연골세포응집체'또는 세포응집체형은 즐기세포, 초자연골세포 등의 세포가 평면(2차원 단일층)이 아닌 입체적(3차원)으로 응집되어 있는 모든 형태를 의미할 수 있으며, 바람직하게는 스페로이드 (Spheroid)형 을 의미할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 줄기세포응집체는 직경 50 ㎛ 내지 2000 ㎛일 수 있으며, 바람직하게는 500 ㎛ 내지 1500 ㎛일 수 있고, 보다 바람직하게는 1000 ㎛ (1 mm) 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 b) 의 배양은 불투과성 웰 또는 불투과성 튜브에서 배양하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 산소, 연골 분화 유도 인자 및 성장인자는 이동 가능하지만 세포는 이동할 수 없는 것일 수 있다.

상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 줄기세포응집체를 초자연골로 안정적으로 배양 및 분화하기 위해 나노섬유로 설계 및 구성 되었으며 제작할 스페로이드형 초자연골세포의 크기에 따라 펀치 및 다이의 규격을 조절하여 투과성 웰 또는 투과성 튜브의 입구 직경 및 깊이는 조절할 수 있다. 상기 웰 또는 튜브의 입구 직경은 1 mm 내지 10 mm 일 수 있으며, 바람직하게는 3 mm 내지 7 mm 일 수 있고, 보다 바람직하게는 5mm 일 수 있다. 상기 웰 또는 튜브의 깊이는 1 mm 내지 5 mm 일 수 있으며, 바람직하게는 2 mm 내지 4 mm 일 수 있고, 보다 바람직하게는 3.5 mm 일 수 있다. 또한 상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브의 벽면 두께는 전기방사로 제작된 나노섬유 멤브레인의 두께에 따라 조절 가능하다. 상기 웰 또는 튜브의 벽면 두께는 10 ㎛ 내지 50 ㎛ 일 수 있으며, 바람직하게는 25 ㎛ 내지 40 ㎛일 수 있다.

상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 산소 및 연골 분화 유도 인자 (TGF-β, BMP-2), 성장인자를 포함하는 배지의 이동을 허용하나 세포 이동을 허용 하지 않을 수 있다.

상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브를 구성하는 나노섬유는, 직경이 10 nm 내지 1000 nm 이며, 배지 및 공기의 이동을 허용하나 세포 이동을 허용하지 않을 수 있다. 상기 투과성 웰은 투과성 마이크로웰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 나노 섬유의 직경은 이에 국한 되는 것은 아니며 상기 PCL 용액의 농도에 따라 조절 가능하다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 공극률(Porosity)은 0.05 내지 0.5 인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 투과성 웰 또는 투과 성 튜브의 확산에 의한 물질 투과성은 1.0Х10^-5 cm/s 내지 1.0Х10^-4 cm/s 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 줄기 세포는 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액 유래 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 제대혈 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골 분화 유도 인자는 TGF-β 및 BMP-2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 TGF-β 는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 TGF-β3 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 질환 치료용 세포 치료제를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골 연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포 함하는 연골 재생용 세포 치료제를 제공할 수 있다.

상기 연골은 초자연골(Hyaline cartilage), 섬유연골 (Fibrocartilage) 또는 탄성연골(Elastic cartilage)등을 포함하며, 예를 들어, 관절연골(Articular cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골 (Meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 또는 척추 연골일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

<실시예 5>

투과성 튜브의 제작

<5-1> 기체 및 질량 투과성 나노 섬유 막의 제조를 위한 전기 방사

폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL; Mn = 80,000 g mol^-1), 클로로포름 및 메탄올은 Sigma-Aldrich (미국)에서 구입하였다. 전기 방사를 위한 PCL 용액은 7.5w t% 농도의 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol)의 혼합물에 PCL을 용해하여 준비하였다. 준비된 PCL 용액을 5 ㎖ 정밀 주사기(Gastight syringe; Hamilton)에 넣고 상업용 전기 방사 기계(ES-robot, NanoNC)를 사용하여 직경 5cm의 고리 모양 전극 위에 10cm 거리를 두고 배치된 23 게이지 금속 바늘을 통하여 1 ㎖/h 의 유속으로 토출 하였다. 금속 바늘과 고리 모양의 전극 사이에 상기 상업용 전기방사 기계를 활용하여 15kV의 고전압을 가하여 전기 방사를 수행하였다. 전기 방사된 PCL 나노 섬유(As-electrospun PCL nanofiber)는 고리 모양 전극 사이에 증착되어 기체 및 질량 투과성 나노 섬유 멤브레인을 생성하였다. 전기 방사는 상대 습도 50 ~ 60 %, 온도 20 ~ 25 ℃에서 실시하였다.

<5-2> 펀치 및 다이 제작

폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 펀치를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물 (Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 15 ㎖ 원뿔형 튜브 (Corning, USA)에 붓고 55℃ 에서 12 시간 동안 경화 했다. 레이저 절단기 (ML-7050A, Machineshop)를 사용하여 두께 20 mm의 폴리메틸메타크릴레이트 (Poly (methyl methacrylate); PMMA) 플레이트를 천공하여 관통 구멍을 가진 다이를 제조하였다.

<5-3> 투과성 웰(well)의 제작

펀치의 높이는 높이 조절이 가능하며 모터로 구동되는 스테이지 (KS162-200, Suruga Seiki, Japan) 로 조절되었다. 평평한 나노 섬유 멤브레인은 펀치와 다이 사이에 위치하였다. 펀치를 다이의 관통 구멍 2.0 mm/s 의 속도로 다이에 삽입함에 따라 평평한 나노 섬유 멤브레인이 투과성 튜브 웰로 형상을 변형하여 제작하였다 (도 31). 제작된 투과성 웰의 입구 직경은 5 mm 이며 깊이는 3.5 mm 이다 (도 31 (b) i, ii). 이는 1 mm 크기의 스페로이드형 줄기세포를 초자연골로 안정적으로 배양 및 분화하기 위해 설계되었으며 제작할 스페로이드형 초자연골세포의 크기에 따라 펀치 및 다이의 규격을 조절하여 투과성 웰의 입구 직경 및 깊이는 조절 가능하다. 또한, 투과성 웰의 벽면 두께 (S1 - S3, 약 40 ㎛ 내지 25 ㎛)는 실시예 <5-1> 에서 제작한 나노 섬유 멤브레인의 두께(약 100 ㎛) 대비 얇게 제작 되었다. 투과성 웰의 벽면 두께는 이에 국한되는 것은 아니며, 전기방사로 제작된 나노섬유 멤브레인의 두께에 따라 조절 가능하다.

<실시예 6>

투과성 웰의 특성평가 (모양, 투과도, 벽면 두께, 나노섬유 구조)

투과성 웰(well)의 모양은 카메라 (EOS650, Canon, Japan)로 촬영하였다. 투과성은 멤브레인을 투과도는 20kDa Fluorescein(FITC)-dextran의 확산을 측정하여 평가하였다. 구체적으로, 제작된 투과성 나노 섬유 웰을 12 웰 플레이트에 넣은 후, 1.5 ㎖ 의 인산 완충 식염수를 웰 인서트의 기저 측면에 붓고, 웰 인서트의 상측액에 0.5 ㎖ 의 200 ㎍/㎖ FITC-dextran 용액을 첨가하였다. 실온에서 1 시간 후, 샘플 용액의 100 ㎕ 를 기저 측면에서 수집하여 96 웰 플레이트에 넣었다. 96 웰 챔버의 형광 이미지를 위상차 반전 형광 현미경 (Eclipse TS100, Nikon, Japan)으로 얻고 이를 MATLAB 프로그램으로 분석하였다. PDMS 내부에 투과성 웰을 위치시킨 샘플을 제작하고 이의 단면을 광학현미경 (Eclipse 80i, Nikon, Japan)으로 촬영하여 벽면 두께를 측정하였다. 투과성 웰의 주사 전자 현미경 (Scanning electron microscopy, SEM) 이미지는 전계 방출 주사 전자 현미경 (FE-SEM, SU6600, Hitachi, Japan)으로 촬영 하였다. 제작된 투과성 웰을 구성하는 나노섬유의 직경은 800 nm - 1000 nm 이었다 (도 31 (b) iv). 나노섬유의 직경은 이에 국한 되는 것은 아니며 상기 PCL 용액의 농도에 따라 조절 가능하다. 나노 섬유에 의해 형성된 공극의 크기는 0.1 ㎛ - 10 ㎛ 이며 (도 31 (b) iv) 이는 세포는 투과 및 이동 할 수 없는 크기이나 배지는 투과 및 이동이 가능하다. 또한, 투과성 웰의 투과도(Permeability)는 3.7Х10^-5 cm/s 이었으며 이는 상용 0.4 ㎛ 공극 크기의 투과성 멤브레인 대비 2배 이상 높았다 (도 32 a). 반면, 불투과성 원추형 튜브의 투과도는 0 이었다 (도 32 a).

<실시예 7>

스페로이드 주변의 산소 수준 및 TGF-β3 농도 분석

스페로이드형 줄기세포 주변의 산소 수준과 TGF-β3 농도의 수치 시 뮬레이션은 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)에 의해 수행되었다. 수치 시뮬레이션에 사용된 모든 형상은 불투과성 원추형 튜브 및 투과성 웰의 형상과 동일하였다. 불투과성 원추형 튜브와 투과성 웰 내에서 스페로이드형 줄기 세포 (구형)의 평균 직경 1 mm 에 해당하는 영역을 지정 하였다. 초기 산소 수준은 0.181 mol/m³ 으로 설정되었으며, 이는 세포 배양 인큐베이터의 140 mm Hg 에서의 초기 산소 수준을 인용하였다. 스페로이드형 줄기세포 표면을 따라 산소 소비율은 이전 연구에서 실험적으로 측정된 연골 조직의 산소 소비율을 인용하여 8.2Х10^-3 mol/m³ s 로 설정되었다. 배양액 내 산소의 확산 계수는 2Х10^-9 m²/s 이었다. TGF- β3의 실험 농도가 10 ng/㎖ 인 상황을 반영하여 TGF-β3의 초기 조건은 0.4 μmol m^-3으로 설정되었다. TGF-β3의 소비율을 추정하기 위해, 스페로이드형이 2 일마다 제공되는 신선한 배지에서 TGF-β3의 90 % 를 소비한다고 가정하고, 스페로이드의 TGF-β3 소비율을 5.6 Х 10^-11 mol/m³s 로 설정하였다. TGF-β3 의 확산 계수는 분자량을 반영하여 2.7 Х 10^-11 m²/s 이었다. 투과성 웰의 공극률(Porosity)은 Millington-Quirk 모델을 사용하여 투과성 물질 내에서의 용질 확산성을 예측하기 위해 0.1 로 설정하였다.

그 결과, 불투과성 원추형 웰 내에서는 스페로이드형 줄기세포의 아랫부분(Lower)과 윗부분(Upper)의 산소 수준 차이는 극명하게 시뮬레이션을 통해 확인되었으며 (도 32 b (i); 기존 방법) 스페로이드형 줄기세포의 표면의 산소 수준을 수치화 하였을 때도 아랫부분과 윗부분의 산소 수준 차이를 확인할 수 있었다 (도 32 b (ii); 기존 방법). 반면, 투과성 웰 내부에서는 스페로이드형 줄기세포 주변에 균일한 산소 수준이 확인되었다 (도 32 b (i), (ii); 개발된 방법). 산소 결과와 유사하게, 불투과성 원추형 웰 (기존 방법) 대비 투과성 웰(개발된 방법) 내 스페로이드형 줄기세포 주변 TGF-β3의 농도도 균일하게 형성 되는 것을 확인하였다 (도 32 c). 이틀 간격으로 사용된 배지가 신선한 배지로 교환 되는 상황을 시뮬레이션 하여, 불투과성 원추형 웰 내 스페로이드형 줄기세포 대비 투과성 웰 내 스페로이드형 줄기세포 주변에 높은 TGF-β3 농도가 배양 기간 (15일) 동안 인가되는 것을 확인하였다. 산소 수준 및 TGF-β3 농도를 대표적으로 분석하였지만, 스페로이드형 줄기세포를 초자연골로 분화 하는 것에 영향을 끼칠 수 있는 다른 분화 인자 (예, BMP-2) 또는 성장인자 등도 추가적으로 고려되어 분석될 수 있다.

<실시예 8>

인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)를 이용한 연골 분화

<8-1> 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)의 배양

제대혈 단핵 세포 (CBMC) 유래 iPSC 계통을 사용하였다. 세포주는 비트로-넥틴 코팅된 플레이트 (Vitronectin-coated dish; Thermo Fisher Scientific)에서 유지되었고, 배지는 매일 신선한 Essential 8 (E8) 배지 (Thermo Fisher Scientific)로 교체하였다.

<8-2> 투과성 튜브 웰을 사용한 연골 형성 분화

상기 실시예 <8-1> 에서 유지된 iPSC를 분리하고 수확하였다. E8 배지와 Aggrewell 배지 (STEMCELL Technologies)의 1:1 혼합물을 hiPSC 에 첨가하여 배아체 (Embryoid bodies; EBs)를 생성하였다. 세포는 5% CO2, 37℃에서 24 시간 동 안 유지되었다. 생성된 EB를 수확하여 E8 배지에서 5일 동안 유지한 다음 E7 배지 에서 5% CO2, 37℃에서 추가로 5일 동안 유지하였다. E7 배지는 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12, Thermo Fisher Scientific), 7.5% NaHCO₃ (Thermo Fisher Scientific), 14 ng/㎖ sodium selenite (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 64 ㎍/㎖ ascorbic acid 2-phosphate (Sigma Aldrich), 10.7 ㎍/㎖ transferrin (Sigma Aldrich), 20 ㎍/㎖ insulin (Thermo Fisher Scientific), 및 2 ng/㎖ TGF-β1 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)로 구성되었다. EB를 계수하고, cm² 당 50-70 EB를 DMEM(Thermo Fisher Scientific), 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Thermo Fisher Scientific)으로 구성된 Outgrowth (OG) 유도 배지를 포함하는 젤라틴-코팅 플레이트에 분주하였다. OG 세포의 유도는 37℃ 에서 5 % CO₂ 에서 72 시간 동안 수행되었다. 단일 OG 세포를 수확하고 새로운 젤라틴 코팅 플레이트에 분주하고 (1 Х 10⁴ ~ 5 Х 10⁴ cells/cm²) 사용할 때까지 유지하였다. 연골 분화를 위해 OG 세포를 수확하였다. OG 세포를 계수하고, 튜브 당 3 Х 10^-5 세포를 연골 분화 배지 (Chondrogenic differentiation medium, CDM)가 있는 15 ㎖ 원뿔형 튜브에서 수확 하였다. CDM은 DMEM supplemented with 20% knockout serum replacement, 1Х non- essential amino acids, 1 mM L-glutamine, 1% sodium pyruvate, 1% ITS+ Premix, 10^-7 M dexamethasone, 50 mM ascorbic acid, 40 ㎍/㎖ L-proline 및 10 ng/㎖ TGF- β3 을 포함한다. 원뿔형 튜브를 750Xg에서 5분 동안 원심 분리하였다. 기존의 방법은 15 ㎖ 원뿔형 튜브에 스페로이드를 14일 또는 20일 동안 유지하며 격일로 배지를 교체하여 연골 분화를 하였다. 개발된 방법은 스페로이드는 3 일째에 상기 [실시예 5] 의 투과성 튜브 웰로 옮겨서 배양하였다.

<실시예 9>

PCR 반응

연골 스페로이드(펠렛, pellet) 샘플을 액체 질소에 동결하여 수확 하고 실험 전에 -80 ℃에서 보관하였다. 스페로이드를 TRIzol (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 RNA를 추출하였다. RevertAid™ First Strand cDNA 합성 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 추출된 RNA에서 cDNA를 합성하였다.

LightCycler 480 SYBR Green I Master를 사용하여 mRNA를 측정하였다. 실험에 사용 된 프라이머는 하기 [표 2]와 같다. LightCycler (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)를 사용하여 계산하였다.

마커 종류	타겟 유전자	REFSEQ_ID	프라이머 서열	크기(bp)	서열번호
저산소마커(Hypoxia marker)	HIF1A	NM_181054.3	F:CACAGGCCACATTCACGTA R:ATCCAGGCTGTGTCGACTG	166	1 2
연골원성마커 (Chondrogenic marker)	COL2A1	NM_001844	F:GGCAATAGCAGGTTCACGTACA R:CGATAACAGTCTTGCCCCACTTA	79	3 4
	COL1A1	NM_000088.3	F:TCTGCGACAACGGCAAGGTG R:GACGCCGGTGGTTTCTTGGT	146	5 6
	COL10A1	NM_000493.3	F:CAGGCATAAAAGGCCCACR:GTGGACCAGGAGTACCTTGC	108	7 8
하우스키핑 유전자 (House-keeping gene)	GAPDH	NM_002046.5	F:ACCCACTCCTCCACCTTTGA R:CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT	101	9 10

<실시예 10>

동물 실험

동물과 관련된 모든 절차는 한국 가톨릭 대학교 의과 대학의 동물 실험 및 이용위원회에서 제공한 실험실 동물 복지법, 실험실 동물 관리 및 이용 지침, 설치류 실험 지침 및 정책에 따라 수행되었다. 본 실시예 프로토콜은 가톨릭 대학교 기관 심의위원회 (CUMC-2019-0281-07)의 승인을 받았다. 연골 스페로이드 (펠렛)의 재생 능력을 평가하기 위해 골 연골 결손 골관절염 쥐 모델을 사용하였다. Sprague Dawley 쥐를 마취하고 원위 대퇴골의 활차 홈의 관절 연골에 마이크로 드릴을 사용하여 골 연골을 결손(1.5 Х 1.5 Х 1.5 mm)시켰다. 14 일째 연골 스페로이드를 결손 부위에 배치하였다(결손 부위 당 1 스페로이드(펠렛), n = 5). 관절 절개 및 피부는 단속 나일론 봉합사(interrupted nylon sutures)로 봉합 하였다. 8 주 재생 후, 총체적 및 조직학적 분석을 위해 관절을 수득하였다. 관심 영역은 샘플에서 잘라내어 조직학적 분석을 위해 파라핀 처리 전 상온에서 하루동안 인산 완충 식염수에 보관하였다.

<실시예 11>

조직학적 분석

연골 스페로이드 또는 관절 유래 조직을 인산 완충 식염수로 세척하고 상온에서 4 % 파라포름알데히드(Biosesang)에 고정시켰다 (스페로이드: 2시간, 관절 샘플: 48 시간). 고정 후, 6 시간 동안 석회화 제거 용액 (Sigma Aldrich)으로 관절 샘플만 석회화를 제거하였다. 이후 농도가 증가하는 에탄올 (Biosesang) 용액과 함께 순차적으로 배양하여 시료를 탈수시켰다. 그 다음, 에탄올-자일렌 혼합물과 함께 순차적으로 배양하여 샘플을 제거하고 밤새 파라핀으로 침투시켰다. 파라핀 블록을 고정하고 마이크로톰을 사용하여 5 ㎛ 두께의 섹션을 얻었다. 염색 하기 전에 슬라이드를 60℃ 핫 플레이트에 10분 이상 두었다. 슬라이드는 자일렌을 사용하여 파라핀을 제거하였다. 슬라이드를 감소하는 농도의 에탄올 용액과 함께 순차적으로 배양하여 재수화하고 흐르는 물에 각각 1 분 동안 세척하였다. 면역 조직 화학 염색을 위해 슬라이드를 3 % 과산화수소 (Sigma Aldrich)로 15 분 동안 차단하였다. 그런 다음 슬라이드를 1 % 소혈청 알부민을 함유하는 Tris 완충 식염수 (TBS)로 30 분 동안 차단하였다. 1 차 항체는 다음 비율로 차단 용액에 희석되었다: Type I collagen (1/200; Abcam), Type II collagen (1/100; Abcam) 및 Type X collagen (1/500; Abcam). 1 차 항체 용액으로 덮인 슬라이드를 4℃ 에 서 하루동안 배양하였다. 슬라이드를 0.1 % Tween-20 (TBST)을 포함하는 TBS로 세척하였다. 2 차 항체 (1/200; Vector Laboratories)를 RT에서 40 분 동안 슬라이드에 처리하였다. TBST로 세척한 후 슬라이드를 ABC 시약 방울 (Vector Laboratories)로 30 분 동안 처리한 후 DAB 용액 (Vector Laboratories)으로 5 분 동안 처리하였다. 슬라이드를 수돗물로 세척하고 Mayer의 헤마톡실린 (Sigma Aldrich)으로 1 분 동안 대조 염색하였다. 각 염색 과정 후, 증가하는 농도의 에탄올 용액과 함께 순차적으로 배양하여 슬라이드를 탈수 시켰다. 에탄올은 100 % 자일렌의 두 사이클로 제거되었고, 염색된 슬라이드는 VectaMount™ Permanent Mounting Medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)으로 장착하였다. 불투과성 원추형 웰과 투과성 웰 내에서 분화된 스페로이드형 줄기세포를 각각 초자 연골로 분화된 정도를 비교하기 위하여 Type II collagen 과 Type X collagen 의 발현 정도를 비교하기 위하여 면역 형광 염색법을 활용 하였다. 추가적으로, PCR 분석을 통해 연골 관련 유전자 발현량 또한 비교 분석 하였다.

그 결과, 불투과성 원추형 웰에서 분화를 진행 하였을 때 보다, 투과성 웰에서 분화를 진행 하였을 때 Type II collagen의 발현량은 증가 되었으며 Type X collagen 발현양은 감소되었다 (도 33 a). 이는 초자연골을 얻기 위한 분화는 촉진 되었으며 뼈 분화는 감소되었음을 의미한다. 또한, 투과성 웰에서 14일 동안의 분화를 진행한 스페로이드형 줄기세포의 경우 불투과성 원추형 웰에서 21일 동안의 분화를 진행한 스페로이드 대비 연골 관련 유전자 발현량이 비슷하거나 (도 33 b, COL2A1) 우수했다 (도 33 c, ACAN).

또한, 불투과성 원추형 웰과 투과성 웰을 활용하여 제작한 연골 치료제를 각각 연골을 손상한 쥐 모델에 이식하여 실제 치료능을 비교 분석하였다.

그 결과, 이식 8주 후 이식 부위를 면역 형광 염색법을 통하여 분석 하였을 때, 투과성 웰을 활용하여 제작한 치료제의 경우, 이식 부위에서 초자연골 관련 세포외기질인 Type II collagen이 불투과성 원추형 웰을 활용하여 제작한 연골 치료제 대비 우수하게 발현되는 것을 확인하였다. 반면에, 뼈 관련 세포외기질 인 Type X collagen은 오히려 적게 발현 되었다 (도 34).

Claims

a) 줄기세포를 응집하여 줄기세포응집체를 제조하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 제조된 줄기세포응집체를 산소 수준이 0.001 내지 0.15 mol/m³ 인 저산소 조건에서 1일 내지 10일 동안 배양하는 단계;

c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포응집체를 투과성 웰 또는 투과성 튜브에서 초자연골세포응집체로 분화시키는 단계;

를 포함하는, 줄기세포를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포응집체는 직경 50 ㎛ 내지 2000 ㎛ 인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b) 의 배양은 불투과성 웰 또는 불투과성 튜브에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 산소, 연골 분화 유도 인자 및 성장인자는 이동 가능하지만 세포는 이동할 수 없는 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 10 nm 내지 1000 nm 직경의 나노섬유 로 구성된 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 공극률(Porosity)은 0.05 내지 0.5 인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 확산에 의한 물질 투과성은 1.0Х10^-5 cm/s 내지 1.0Х10^-4 cm/s인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 연골 분화 유도 인자는 TGF-β 및 BMP-2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항의 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 질환 치료용 세포 치료제.
제10항에 있어서, 상기 연골 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 연골 질환 치료용 세포 치료제.
제1항의 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 재생용 세포 치료제.