KR102007919B1

KR102007919B1 - 마이크로유체 칩 및 이를 이용한 독립형 다공성 막의 제조방법

Info

Publication number: KR102007919B1
Application number: KR1020170146380A
Authority: KR
Inventors: 김수현; 정영미; 박도연
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2017-11-06
Filing date: 2017-11-06
Publication date: 2019-10-21
Also published as: KR20190051096A

Abstract

본 발명은 마이크로유체 칩 및 이를 이용한 독립형 다공성 막의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 코어액이 주입되는 제1주입구, 상기 주입되는 코어액을 2 이상의 흐름으로 분리하는 흐름분리기, 시스액이 주입되는 제2주입구, 상기 2 이상의 흐름으로 분리되는 코어액과 상기 시스액이 반응하여 다중 가닥의 미세섬유가 제조되는 반응채널부, 및 상기 제조되는 다중 가닥의 미세섬유가 배출되는 배출구를 포함하는 상부층; 상기 상부층의 배출구와 연결되어 상기 배출되는 다중 가닥의 미세섬유가 축적되는 축적챔버; 및 상기 축적챔버에 구비되어 상기 축적되는 다중 가닥의 미세섬유로부터 잔여 시스액을 여과하는 필터;를 포함하고, 상기 코어액 및 상기 시스액은 극성 용액이며, 상기 코어액의 극성은 상기 시스액에 비하여 큰 것을 특징으로 마이크로유체 칩을 이용한 독립형 다공성 막의 제조방법에 있어서, (a) 상기 제1주입구 및 제2주입구에 각각 코어액 및 시스액을 주입하여 다중 가닥의 미세섬유를 제조하고 상기 축척챔버에 축적하는 단계; 및 (b) 상기 축적된 다중 가닥의 미세섬유를 갖는 마이크로유체 칩을 시스액에 침지시켰다가 들어올리는 과정을 2회 이상 반복하여 막을 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법을 통하여, 종래 마이크로유체 방사법(microfluidic spinning method)에서 얻을 수 없었던 서브미크론(submicron) 두께의 다중 가닥의 미세섬유를 동시에 수득하고, 이를 이용하여 미세기공을 갖는 독립형 다공성 막을 제조하여 약물 전달 및 조직공학용 지지체와 같은 조직 공학 분야에 응용할 수 있다.

Description

마이크로유체 칩 및 이를 이용한 독립형 다공성 막의 제조방법{Microfluidic chip and preparation method of free-standing porous membrane using the same}

본 발명은 마이크로유체 칩 및 이를 이용한 독립형 다공성 막의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 마이크로유체 방사법(microfluidic spinning method)에서 얻을 수 없었던 서브미크론(submicron) 두께의 다중 가닥의 미세섬유를 동시에 수득하고, 이를 이용하여 미세기공을 갖는 독립형 다공성 막을 제조하여 약물 전달 및 조직공학용 지지체와 같은 조직공학 분야에 응용하는 기술에 관한 것이다.

생물체는 기반 물질, 섬유질, 세포로 구성된 다량의 결합 조직으로 구성된다. 특히, 콜라겐과 엘라스틴을 포함한 다양한 섬유가 결합 조직의 형태를 형성하고 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 자연적 특징은 많은 과학자들로 하여금 고도의 다공성 구조를 가진 섬유 지지체를 사용하여 실험실에서 세포 부착 및 증식을 돕는 등의 세포-조직의 조작을 하게 만들었다. 전기방사 및 미세 유체 방사는 각각 섬유 조직을 모사하기 위한 나노섬유 혹은 마이크로섬유를 제조하는 데 사용되었다. 전기방사는 건조한 상태에서 나노미터 크기의 폴리머 섬유를 제조하는 공정으로 단위 질량 당 매우 큰 표면적을 갖는 섬유를 생산하는 데 사용되어 왔다. 60 년 동안 사용되어 왔음에도 불구하고, 이 방법은 다양한 천연 및 합성 고분자로부터 조직공학을 위한 나노 섬유 막을 생산할 수 있기 때문에 아직도 많은 연구가 진행되고 있다. 정렬된 나노 섬유 또는 관 형태의 나노 섬유를 제작하는 다양한 방법이 소개되고 있고, 이에 따라 다양한 분야에 적용되고 있다. 그러나, 전기 방사에 대한 몇 가지 문제가 남아있다. 섬유 제조를 위한 높은 전력에 대한 필요성, 유해한 용매의 사용, 세포 기반 연구에 맞는 충분히 큰 공극 생성의 어려움 및 막 제작 후의 다루기 어려움 등이 대표적인 문제라고 하겠다[비특허문헌 1; 2].

이에 반해, 습식 섬유 방사 공정인 마이크로 유체 방사는 상대적으로 최근에 본 발명자와 타 그룹에 의해 개발되었다. 마이크로 기술의 진보로 인해 미세 유체 플랫폼은 효율적인 화학 분석을 수행할 수 있을 뿐 아니라 복잡한 장치 및 설비를 사용하지 않고 입자, 섬유 및 막을 포함한 마이크로 구조물의 대량 생산을 가능하게 하였다. 미세 유체 플랫폼을 사용하여 본 발명자는 시공간적으로 코딩된 미세섬유와 자기 집합 섬유와 같은 다양한 유형의 미세섬유를 도입하였다. 모양, 표면 및 화학적 조성과 같은 단일 섬유의 다양한 특성을 손쉽게 제어하는 것이 이 방법의 주요 이점이다. 그러나 미세 유체 플랫폼을 이용한 섬유 제작 시에는 전기 방사와는 달리 서브미크론의 직경을 갖는 섬유를 제조하는 것은 어려웠고, 세포 배양을 위한 지지체로서의 다공성 시트를 제조하는 것도 어려웠다. 실제로, 본 발명자의 이전 연구에서, 막 형태를 갖지 않는 다공성 3차원 지지체를 만들었지만 이는 막 형태가 아니었다. 따라서, 전기 방사 및 미세 유체 방사 기술의 응용을 확장시키기 위한 개선점이 여전히 남아있다고 하겠다.[비특하문헌 3; 4].

최근에는 전기 방사 나노막, 미세섬유 기반 지지체, 및 미세 유체 플랫폼 등이 개발되어 세포 행동을 관찰하거나 조절하는 데에 있어 전통적인 세포 배양의 한계를 극복하고 있다. 그러나, 위에서 언급했듯이 전자 방사 나노막과 미세섬유 기반 인공 지지체는 취급 및 크기의 문제가 있다. 미세유체 플랫폼의 경우, 다른 종류의 세포를 공간적으로 분리함과 동시에 기공을 통해 연결해주는 등의 생리적 미세 환경을 모방하기 위해 종종 다공성 막을 사용하고 있다. 또한, 세포 기반 연구를 위한 많은 종류의 마이크로 유체 플랫폼은 세포 배양 기질을 포함하고 있다. 단세포 구조직(spheroid)에서 혼합 세포 스페로이드(spheroids)에 이르는 단순한 3 차원 조직 모델은 생체 내에서의 세포 및 조직의 행동을 모사하여 더 의미 있는 체외실험을 가능하게 하는 것으로 나타났다. 그러나 우리 몸의 조직은 일반적으로 두세 가지 이상의 다양한 세포로 이루어져 있다. 따라서 더 복잡한 미세 조직 또는 유기체가 매우 필요하며, 이를 얻기 위해서는 생체 내에서와 같은 시공간적 구조를 모사한 미세 환경의 조성이 필요하다. 즉, 시공간 제어성을 갖는 새로운 형태의 in vivo 모방 세포 기질은 다양한 세포 기반 실험에 매우 유용할 것이다[비특허문헌 5; 6].

비특허문헌 1. Cheng, Jie, et al. Biomaterials 114 (2017): 121-143. 비특허문헌 2. Lowery, Joseph L., Neha Datta, and Gregory C. Rutledge. Biomaterials 31.3 (2010): 491-504. 비특허문헌 3. Choi, Chang-Hyung, et al. Lab on a Chip 11.8 (2011): 1477-1483. 비특허문헌 4. Park, D. Y., et al. Biofabrication 6.2 (2014): 024108. 비특허문헌 5. Huh, Dongeun, et al. Science 328.5986 (2010): 1662-1668. 비특허문헌 6. Park, DoYeun, et al. Stem cells translational medicine 4.11 (2015): 1352-1368.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 고려하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 종래 마이크로유체 방사법(microfluidic spinning method)에서 얻을 수 없었던 서브미크론(submicron) 두께의 다중 가닥의 미세섬유를 동시에 수득하고, 이를 이용하여 미세기공을 갖는 독립형 다공성 막을 제조하여 약물 전달 및 조직공학용 지지체와 같은 조직공학 분야에 응용하고자 하는 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일측면은 코어액이 주입되는 제1주입구, 상기 주입되는 코어액을 2 이상의 흐름으로 분리하는 흐름분리기, 시스액이 주입되는 제2주입구, 상기 2 이상의 흐름으로 분리되는 코어액과 상기 시스액이 반응하여 다중 가닥의 미세섬유가 제조되는 반응채널부, 및 상기 제조되는 다중 가닥의 미세섬유가 배출되는 배출구를 포함하는 상부층; 상기 상부층의 배출구와 연결되어 상기 배출되는 다중 가닥의 미세섬유가 축적되는 축적챔버; 및 상기 축적챔버에 구비되어 상기 축적되는 다중 가닥의 미세섬유로부터 잔여 시스액을 여과하는 필터;를 포함하고, 상기 코어액 및 상기 시스액은 극성 용액이며, 상기 코어액의 극성은 상기 시스액에 비하여 큰 것을 특징으로 마이크로유체 칩에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 마이크로유체 칩을 이용한 독립형 다공성 막의 제조방법에 있어서, (a) 상기 제1주입구 및 제2주입구에 각각 코어액 및 시스액을 주입하여 다중 가닥의 미세섬유를 제조하고 상기 축척챔버에 축적하는 단계; 및 (b) 상기 축적된 다중 가닥의 미세섬유를 갖는 마이크로유체 칩을 시스액에 침지시켰다가 들어올리는 과정을 2회 이상 반복하여 막을 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 제조방법에 따라 제조된 독립형 다공성 막에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 독립형 다공성 막을 포함하는 세포배양용 지지체에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 종래 마이크로유체 방사법(microfluidic spinning method)에서 얻을 수 없었던 서브미크론(submicron) 두께의 다중 가닥의 미세섬유를 동시에 수득하고, 이를 이용하여 미세기공을 갖는 독립형 다공성 막을 제조하여 약물 전달 및 조직공학용 지지체와 같은 조직공학 분야에 응용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예로부터 a), b), c), d) 마이크로유체 칩 상에서 다중 가닥의 미세섬유 및 독립형 다공성 막이 제조되 과정을 나타낸 이미지, 및 e) 독립형 다공성 막의 주사전자 현미경(SEM) 이미지이다[스케일바는 10 μm].
도 2는 본 발명의 실시예로부터 a) 다중 가닥의 미세섬유가 형성되는 기본원리, b) 형성된 다중 가닥의 미세섬유의 주사전자 현미경(SEM) 이미지, 및 c) 실시예 1 내지 5로부터 형성되는 다중 가닥의 미세섬유들의 직경을 측정한 그래프이다[b)의 스케일바는 1 μm, c는 각 조건마다 6회 측정;*,p<0.001].
도 3은 본 발명의 실시예 1 내지 5로부터 제조된 독립형 다공성 막들의 a-1 내지 a-5), b-1 내지 b-5) 주사전자 현미경(SEM) 이미지, c) 시스액의 유속 및 코어액의 농도에 따른 기공크기 분포 그래프, 실시예 6으로부터 제조된 독립형 다공성 막의 주사전자 현미경(SEM) d) 100 배율 이미지, e) 50 배율 이미지, 및 f) 독립형 다공성 막의 실제 이미지이다[a), b), d), e) 및 f)의 스케일바는 각각 20 μm, 20 μm, 50 μm, 200 μm 및 2 mm].
도 4는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 독립형 다공성 막을 a) 세포배양 플랫폼에 통합하는 과정을 나타낸 모식도, L929 세포배양 실험의 b) 대조군 및 c) 실험군에 대한 L29 세포의 생존력 실험 결과 이미지, d) 그래프, 및 e) NSPC 세포배양 실험 결과 그래프이다[b-1)및 c-1)은 살아있는 세포, b-2) 및 c-2)는 죽은 세포를 나타냄].
도 5는 본 발명의 실시예 7의 비균일한 다중 가닥의 미세섬유를 a) 형성하는 데 사용되는 마이크로유체 칩의 모식도, b) 제조된 비균일한 다중 가닥의 미세섬유를 함유하는 독립형 다공성 막의 주사전자 현미경(SEM) 이미지, c) 무작위로 선택된 60 개의 미세섬유의 평균 직경 그래프, d) 독립형 다공성 막의 공초점 2차원 이미지, e) 3차원 이미지, 및 f) 비균일한 다중 가닥의 미세섬유가 제조되는 마이크로유체 칩의 광학 이미지이다[b), d), e) 스케일바는 10 μm, 200 μm, 200 μm].
도 6은 본 발명의 실시예로부터 다중 가닥의 미세섬유가 형성되는 인자를 나타낸 이미지이다.
도 7은 본 발명의 실험예 1의 확산 테스트 a) 플랫폼 및 b) 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실험예 2의 세포 배양 테스트의 a) 3차원 Z-스택 공초점 레이저 스캐닝 이미지 및 b) 실제 실험 장비 이미지이다.
도 9는 본 발명의 실시예 7로부터 제조된 비균일한 다중 가닥의 미세섬유를 함유하는 독립형 다공성 막의 a) 제조되는 모식도, b) 공초점 이미지, c) 내지 e) Image 프로그램을 사용하여 확인한 각 형광염료에 따른 분할 이미지이다[c) 적색 형광염료, d) 녹색 형광염료, e) 청색 형광염료].

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일측면은 코어액이 주입되는 제1주입구, 상기 주입되는 코어액을 2 이상의 흐름으로 분리하는 흐름분리기, 시스액이 주입되는 제2주입구, 상기 2 이상의 흐름으로 분리되는 코어액과 상기 시스액이 반응하여 다중 가닥의 미세섬유가 제조되는 반응채널부, 및 상기 제조되는 다중 가닥의 미세섬유가 배출되는 배출구를 포함하는 상부층; 상기 상부층의 배출구와 연결되어 상기 배출되는 다중 가닥의 미세섬유가 축적되는 축적챔버; 및 상기 축적챔버에 구비되어 상기 축적되는 다중 가닥의 미세섬유로부터 잔여 시스액을 여과하는 필터;를 포함하고, 상기 코어액 및 상기 시스액은 극성 용액이며, 상기 코어액의 극성은 상기 시스액에 비하여 큰 것을 특징으로 마이크로유체 칩에 관한 것이다.

종래 전기방사나 마이크로유체 기반 기술을 통해 제조되는 미세섬유는 제조시에 유해한 용매의 사용, 막 형태에서 기공 크기 조절 및 섬유 크기 축소의 어려움으로 인하여 약물 전달 및 조직 공학용 지지체와 같은 조직 공학으로의 응용이 제한적이라는 문제가 있었다.

따라서, 본 발명자는 이러한 문제를 해결하고, 종래 마이크로유체 방사법(microfluidic spinning method)에서 얻을 수 없었던 서브미크론(submicron) 두께의 다중 가닥의 미세섬유를 동시에 방사할 수 있는 새로운 방법 및 방사된 다중 가닥의 미세섬유를 이용하여 미세기공을 갖는 독립형 다공성 막을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 종래의 전기방사에서 독립형 막을 얻기 위해선 이미 제조된 막을 자르거나, 감아 올리는(rolling up) 등의 추가적인 공정이 필요한 반면, 본 발명에 따른 독립형 다공성 막은 마이크로유체 칩 상에서 제조된 그 자체로 독립형 구조이다. 게다가 제조된 후에 그 형태를 유지할 수 있어 타 장치에 삽입 등의 작업이 용이하며, 섬유 상에 다양항 물질을 탑재할 수 있는 이점이 있어, 조직공학, 장기칩(organ-on-a-chip) 및 약물전달 분야에 응용될 수 있다.

상기 코어액 및 시스액은 실린지 펌프를 이용하여 각각의 주입구로 주입될 수 있다.

또한, 상기 흐름분리기는 복수개의 채널(interval channel)이 소정의 간격으로 형성되어 코어액의 흐름을 분리할 수 있는데, 상기 채널의 폭은 바람직하게는 25 내지 35 μm이고, 채널 사이의 간격은 바람직하게는 15 내지 20 μm일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 필터는 바람직하게는 30 내지 50 μm의 나일론 메쉬를 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 마이크로유체 칩은 폴리디메틸시록산(PDMS; polydimethylsiloxane)으로 구성될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 (a) 단계는 제1주입구 및 제2주입구를 통해 각각 주입된 코어액 및 시스액이 반응채널 내에서 반응하여 다중 가닥의 미세섬유가 제조되고, 축적챔버에 축적되는 단계로서, 구체적으로, 상기 제1주입구를 통해 주입된 코어액은 상기 흐름분리기에 의해 2 이상의 흐름으로 분리되어 흐르게 되고, 상기 제2주입구를 통해 주입된 시스액에 의해 둘러싸이게 된다. 이때 두 용액의 극성차이로 인하여 상기 분리된 흐름을 유지하면서 두 용액 사이에서 불안정한 계면이 형성된다. 이후 코어액 내의 고분자 사슬이 저극성의 시스액에 의한 탈수로 인하여 자가-응집(self-aggregation)됨과 동시에 시스액의 흐름에 따른 전단력(shear)으로 인해 압축됨으로써 다중 가닥의 미세섬유가 제조될 수 있다.

상기 제조된 다중 가닥의 미세섬유는 상부층으로부터 배출되어 축적챔버에 축적된다.

다음으로 상기 (b) 단계는 축적된 다중 가닥의 미세섬유를 이용하여 독립형 다공성 막을 형성하는 단계로서, 구체적으로, 상기 축적챔버에 구비된 필터에 의해 섬유에 존재하는 잔여 시스액을 여과하고, 이후 상기 축적된 다중 가닥의 미세섬유를 갖는 마이크로유체 칩을 시스액이 담긴 조(bath)에 침지시켰다가 들어올리는 과정을 2회 이상 반복함으로써 추가적인 가교결합을 수행하고, 미세섬유들 사이의 공간을 제거하여 축적챔버 전체에 고르게 분포시켜 최종적으로 독립형 다공성 막을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, (c) 상기 형성된 막을 탈수용액으로 탈수하는 단계;를 더욱 포함할 수 있다.

상기 형성된 막을 탈수용액에 침치시켰다 들어올림으로써, 탈수하는 과정을 더욱 포함할 수 있으며, 바람직하게는 점차적으로 더욱 농축된 에탄올 용액, 구체적인 예로 25, 50, 70, 95 및 99.9 중량%의 에탄올 용액을 순차적으로 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 코어액의 농도 및/또는 시스액의 유속을 조절하여 상기 다중 가닥의 미세섬유의 직경을 조절할 수 있다.

특이하게도, 상기 코어액의 농도가 증가할수록 미세섬유의 직경이 증가하고, 시스액의 유속이 증가할수록 미세섬유의 직경이 감소함을 확인하였다.

시스액의 유속이 증가할수록 분리된 코어액의 흐름을 억제하기 위하여 더 강한 전단력을 나타냈다. 대조적으로, 코어액의 농도가 증가하여 점도가 증가하면 변형에 대한 저항성이 증가하였다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 시스액의 유속을 조절하여 상기 독립형 다공성 막의 기공 크기를 조절할 수 있다.

특이하게도, 시스액의 유속이 코어액의 유속보다 상대적으로 큰 상태에서, 시스액의 유속이 증가할수록 제조되는 독립형 다공성 막의 기공 크기가 감소함을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 코어액은 알긴산나트륨 수용액이고, 상기 시스액은 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액일 수 있다.

특히, 상기 코어액이 알긴산나트륨 수용액이고, 상기 시스액이 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액일 경우에는 다른 조건일 경우에 비하여 더욱 작은 크기의 기공을 가진 독립형 다공성 막이 제조되는 것을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, (c) 상기 형성된 막을 에탄올 용액으로 탈수하는 단계를 더욱 포함하고; 상기 코어액은 1 내지 5 중량%의 알긴산나트륨 수용액이며; 상기 시스액은 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액이며; 상기 코어액의 유속은 0.1 내지 1.5 μL/min이며; 상기 시스액의 유속은 0.01 내지 1 ml/min일 수 있다.

특히, 하기 실시예 또는 비교예 등에는 명시적으로 기재하지는 않았지만, 상기 마이크로유체 칩을 이용하여 독립형 다공성 막을 제조하는 과정에 있어서, 다양한 종류의 코어액에 대하여, (c) 단계의 수행 여부, 코어액의 농도, 시스액의 종류, 코어액의 유속 및 시스액의 유속을 달리하여 제조된 독립형 다공성 막에 대하여 비틀림 강도를 측정하였으며, 주사전자현미경(SEM)을 통하여 외부 표면의 거칠기를 확인하였다.

그 결과, 다른 종류의 코어액과 다른 수치 범위에서와는 달리, 아래 조건이 모두 만족하였을 때 300 회 비틀림 강도 측정 후에도 전혀 파괴되지 않았고, 초기 외부 표면의 거칠기가 상당히 매끄러웠을 뿐만 아니라, 300 회 비틀림 강도 측정 후에도 외부 표면의 거칠기의 변화 및 결점이 관찰되지 않았다.

다만, 아래 조건 중 어느 하나라도 충족되지 않는 경우에는 비틀림 강도 측정에 따른 파괴가 일어났을 뿐만 아니라, 외부 표면에 상당한 결점 및 거칠기 변화가 관측되었다.

(ⅰ) (c) 상기 형성된 막을 에탄올 용액으로 탈수하는 단계를 더욱 포함, (ⅱ) 코어액은 1 내지 5 중량%의 알긴산나트륨 수용액, (ⅲ) 시스액은 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액, (ⅳ) 코어액의 유속은 0.1 내지 1.5 μL/min, (ⅴ) 시스액의 유속은 0.01 내지 1 ml/min.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 흐름분리기는 비균일한 간격으로 복수개의 채널이 형성되어 비균일한 직경의 다중 가닥의 미세섬유가 제조될 수 있다.

상기 흐름분리기 내의 복수개의 채널이 비균일한 간격으로 형성될 경우, 상기 제1주입구를 통해 주입된 코어액이 비균일한 폭의 흐름으로 분리되며, 상기 시스액과의 반응을 통하여 비균일한 직경의 다중 가닥 미세섬유가 제조될 수 있다.

이렇게 비균일한 직경의 다중 가닥 미세섬유를 이용하여 독립형 다공성 막을 형성할 경우에는 다양한 물질을 다양한 양으로 로딩할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 독립형 다공성 막은 다른 장치에 통합될 때도 그 다공성을 유지할 뿐만 아니라, 서브미크론 두께의 미세섬유로 구성되어 세포에 적합한 기공 크기를 갖는다. 반면, 종래 마이크로유체 방사를 이용하여서는 본 발명과 같이 얇은 두께의 섬유를 제조하기 어려웠었고, 본 발명의 독립형 다공성 막의 기공크기 또한 종래 전기방사된 나노막에서는 형성되기 어려워었다.

특히, 요즘 장기칩(organ-on-a-chip) 영역의 막은 막 전체적으로 세포의 접착, 상호작용, 증식 및 이동을 촉진시키는 적절한 물질로 구성되고, 적절한 기공 크기를 갖을 것을 기대한다.

이와 같이, 본 발명에 따른 독립형 다공성 막은 세포 기반 연구에 대한 적절한 조건을 제공하고, 다양한 조직 공학 응용에 도움이 될 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 제조예 및 실시예를 첨부된 도면과 함께 구체적으로 설명한다.

<실시예>

실시예 1 내지 6: 독립형 다공성 막의 제조(시스액 유속 0.1/0.2/0.3/0.4/0.5/5 mL/min)

본 발명에 따른 마이크로유체 칩을 이용하여 독립형 다공성 막을 제조하였다. 마이크로유체 칩 내의 흐름분리기는 20 μm 폭을 갖는 7 개의 채널을 30 μm의 간격으로 형성하였다. 또한, 축적챔버 내의 필터로 나일론 메쉬(메쉬 크기 40 ㎛, BD Falcon)를 구비하였다.

제1주입구에 1 중량% 알긴산나트륨 수용액(코어액)을 1 μL/min의 유속으로 주입하였고, 제2주입구에 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액(시스액)을 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 및 5 mL/min의 유속으로 변화시켜 주입하였다(시스액의 각 유속에 따라서 실시예 1 내지 6으로 하였다). 상기 시스액의 유속은 주입구에 주입시 실린지 펌프를 이용하여 조절하였다.

이후 주입된 코어액 및 시스액의 반응으로 다중 가닥의 미세섬유가 생성되고 축적챔버에 축적되면, 마이크로유체 칩을 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액(시스액)이 담긴 조(bath)에 침시시켰다가 들어올리는 과정을 10 분 마다 30 분 동안 수행하고, 에탄올 용액을 이용하여 막을 탈수시킴으로써 최종적으로 독립형 다공성 막을 제조하였다.

실시예 7: 비균일한 다중 가닥의 미세섬유를 함유하는 독립형 다공성 막의 제조

본 발명에 따른 마이크로유체 칩을 이용하여 독립형 다공성 막을 제조하였다. 마이크로유체 칩 내의 흐름분리기는 20 μm 폭을 갖는 5 개의 채널을 20, 40, 60 및 80 μm의 간격으로 형성하였다. 또한, 축적챔버 내의 필터로 나일론 메쉬(메쉬 크기 40 ㎛, BD Falcon)를 구비하였다.

특히, 각 간격에 대하여 코어액의 주입구를 따로 설정하였고, 주입구에 따라 다른 색의 형광염료(300 nm Fluorescent PS beads, Thermo)로 1 중량% 알긴산나트륨 수용액(코어액)을 염색하였다. 20 μm 간격에 대해서는 염료를 염색하지 않았고, 40 μm 간격에 대해서는 적색, 60 μm 간격에 대해서는 녹색, 및 80 μm 간격에 대해서는 청색의 염료로 염색하였다.

코어 주입구에 상기 네 가지 색상의 알긴산나트륨 수용액을 주입하되, 코어 유속의 합이 1 μL/mi가 되도록 유지하고, 제2주입구에 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액(시스액)을 0.1 mL/min의 유속으로 주입하였다.

이후 주입된 코어액 및 시스액의 반응으로 비균일한 다중 가닥의 미세섬유가 생성되고 축적챔버에 축적되면, 마이크로유체 칩을 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액(시스액)이 담긴 조(bath)에 침시시켰다가 들어올리는 과정을 10 분 마다 30 분 동안 수행하고, 에탄올 용액을 이용하여 막을 탈수시킴으로써 최종적으로 독립형 다공성 막을 제조하였다.

도 1은 본 발명의 실시예로부터 a), b), c), d) 마이크로유체 칩 상에서 다중 가닥의 미세섬유 및 독립형 다공성 막이 제조되 과정을 나타낸 이미지, 및 e) 독립형 다공성 막의 주사전자 현미경(SEM) 이미지이다[스케일바는 10 μm].

도 1을 참조하면, 다중 가닥의 미세섬유는 흐름분리기, 쌍극자-쌍극자 상호작용 및 전단력의 결합된 효과로부터 생성됨을 알 수 있다.

먼저, 흐름분리기는 코어액을 2 이상의 작은 흐름으로 분리한다(도 1b). 다음으로, 분리된 코어액은 시스액에 의해 둘러싸이게 되고, 이때 코어액 내의 고분자 사슬이 저극성의 시스액에 의한 탈수로 인하여 자가-응집(self-aggregation)된다(도 1c). 다음으로, 반응채널 내부의 시스액 흐름에 따른 전단력(shear)으로 인해 자가-응집된 고분자 사슬이 압축됨으로써 다중 가닥의 미세섬유가 생성될 수 있다(도 1c). 마지막으로, 생성된 다중 가닥의 미세섬유는 상부층으로부터 배출되어 축적챔버에 축적되고, 축적된 다중 가닥의 미세섬유는 축적챔버 내의 필터를 통해 잔여 시스액을을 여과한다(도 1d, 왼쪽). 이후 축적된 다중 가닥의 미세섬유를 함유하는 마이크로유체 칩을 시스액이 담긴 조(bath)에 침지시켰다가 들어올리는 과정을 2회 이상 수행하여 축적챔버 전체에 고르게 막을 형성시킨다(도 1d, 중간), 최종적으로 점차적으로 농축된 에탄올 용액(25, 50, 70, 95 및 99.9 중량%)을 사용하여 막을 탈수시킴으로써 독립형 다공성 막을 제조할 수 있다(도 1d, 오른쪽).

<실험예>

실험예 1: 확산 테스트

상기 실시예 1로부터 제조된 독립형 다공성 막의 실용 가능성을 검증하기 위해, 확산 테스트(도 7)를 위한 장치를 독립형 다공성 막과 통합하였다.

구체적으로, 두 개의 PDMS 플랫폼을 제작하고 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 독립형 다공성 막을 통합하였다. 먼저, 확산 테스트 플랫폼을 제작하였다(도 7a). 두 개의 입구가 있는 대칭형 그릇으로 설계되었으며, PDMS는 독립형 다공성 막을 그릇의 중앙에 부착시키는 접착제로 사용하였다. 그릇은 탈이온수(DW)로 채우고 청색 잉크는 한 쪽 입구를 통해 떨어뜨렸다. 그런 다음 마이크로 플레이트 판독기(Victor X3, PerkinElmer)를 사용하여 염료의 흡광도를 측정하여 누들 막을 통한 확산의 발생을 확인하였다.

실험예 2: 세포 배양 테스트

상기 실시예 1로부터 제조된 독립형 다공성 막의 실용 가능성을 검증하기 위해, 세포 배양 테스트(도 4 및 8)를 위한 장치를 독립형 다공성 막과 통합하였다.

독립형 다공성 세포 지지체로서의 독립형 다공성 막의 유용성을 확인하기 위해, 독립형 다공성 막을 이용하여 세포 배양 플랫폼을 제작하였다. 두 개의 PDMS 링 사이에 독립형 다공성 막을 삽입하고 PDMS 접착제를 사용하여 링에 부착하였다. 배지가 플랫폼의 하부로 흘러들어갈 수 있도록 두 개의 유리 슬라이드가 추가하였다(도 4a). 이후 2 시간 동안 콜라겐으로 독립형 다공성 막을 코팅하고 밤새 부드러운 기류 하에서 생성물을 건조시켰다.

먼저, L929를 콜라겐 코팅된 독립형 다공성 막 위에 배양하고 소태아혈청(FBS, Gibco, USA)을 함유하지 않는 고포도당 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM, Sigma-Aldrich, USA)에 노출시켰다. 그 다음, 플랫폼의 하부를 FBS를 함유하는 고포도당 DMEM으로 채웠다(도 4a). 두 시간의 세포 증식 후 여분의 부유 세포를 씻어 내고 새로운 배지를 막의 윗면에 가해주었다. 대조군은 하부에 FBS를 함유시키지 않았다(도 4a). 이 플랫폼의 광학 이미지를 도 8에 나타내었다.

둘째, L929 대신에 일차 신경줄기/전구세포(primary NSPCs)를 배양하였다. NSPC를 배양하기 위한이 과정은 L929에 사용된 것과 유사하며, 고포도당 DMEM 대신 Neurobasal 배지(미국 Gibco)를 사용하였고 FBS 대신 신경성장인자(nerve growth factor)(NGF, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 일차 NSPC는 Texas Southern University의 기관 동물 관리 및 이용 공동체(IACUC)가 승인한 수술 절차를 사용하여 배아 16 일 쥐 태아(DBL, Incheon, South Korea)의 대뇌 피질 영역에서 분리되었다. NSPC는 B-27 보충제(Gibco), 0.5 mM L- 글루타민 및 10,000 단위 페니실린(Gibco) 및 스트렙토 마이신을 함유하는 항생제 용액 1 %가 보충된 Neurobasal 배지(Gibco)에서 유지하였다. 두 가지 유형의 세포를 5 일 동안 배양하였다.

그 다음, Live/Dead 분석 키트(Invitrogen) 및 셀 카운팅 키트-8(CCK-8; Dojindo, Tabaru, Japan)을 사용하여 제조사가 기술한대로 L929 및 일차 NSPC에 대한 FBS 및 NGF의 영향을 각각 분석하였다. 간략하게, Live/Dead 분석을 위해, 세포를 염색하고 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 또한, CCK - 8 분석을 위해 독립형 다공성 막이있는 각 PDMS 세포 배양 플랫폼에는 100 μL의 배지마다 10 μL의 CCK-8 용액을 포함하였다. 가습 5 % CO₂ 분위기 조건으로 37 ℃에서 3 시간 동안 배양한 후, 마이크로 플레이트 리더(Victor X3, PerkinElmer)를 사용하여 파장 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.

독립형 다공성 세포 지지체로서 독립형 다공성 막의 타당성을 보여주는 실험을 L929 및 NSPC 모두 6 회 반복하였다(도 4). 데이터는 평균±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성은 양측 t-검정을 사용하여 평가하였으며, 0.05보다 작은 p-값이 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

실험예 3: 비균일한 다중 가닥의 미세섬유를 함유하는 독립형 다공성막의 관측

상기 실시예 7로부터 제조된 비균일한 다중 가닥의 미세섬유를 함유하는 독립형 다공석 막의 주사전자 현미겸(SEM) 이미지를 촬영하여 임의로 선택한 60 개의 섬유의 직경을 측정하였다. 상기 비균일한 다중 가닥의 미세섬유 수는 각 1 마이크론 직경의 빈에 최소 6 개의 마이크로 파이버를 산출하였다. 14, 23, 17, 6 개의 마이크로 섬유가 각각 1.5 ~ 2.5 μm, 2.6 ~ 3.5 μm, 3.6 ~ 4.5 μm, 및 4.6 ~ 5.5 μm의 직경을 가지고 있음을 확인하였고, 공초점 레이저 스캐닝 이미지를 촬영하여 막 내부의 다양한 크기를 갖는 섬유의 분포 양상을 관찰하였다.

<실험결과>

도 2(각 조건에 대해 6회 측정)와 같이 섬유 직경에 대한 재현성을 보여주는 제안된 방법으로 서브미크론에서 10 마이크로미터 이하 까지의 단일 가닥의 미세섬유를 성공적으로 제조하고 도 3 및 4에서와 같이 추가 실험을 수행하였다. 극성 알지네이트와 저 극성 유기용매 사이의 극성은 계면이 교란되고 알긴산 염이 탈수되어 섬유 형성을 유발한다(도 2a). 섬유는 거친 표면을 보였으며(도 2b), 이러한 관찰은 섬유 형성 메커니즘에 대한 증거를 제공할 수 있다. 도 2c에 도시 된 바와 같이, 미세섬유 직경은 1.05 ㎛에서 2.71 ㎛로 증가하였다. 또한, 각 유속에서, 1.0 % 알긴산 염은 0.5 % 알긴산 염보다 섬유 직경이 약 30 % 더 컸다. 더 빠른 시스액의 유속은 분열된 코어액 유속을 억제하기 위해 명백하게 더 강한 전단력을 산출하였다. 대조적으로, 보다 농축된 알지네이트 용액의 점도가 클수록 변형에 대한 저항성이 더 강해졌으며, 0.5 % 알긴산 염보다 1.0 % 알긴산 염에서 샘플 사이의 더 두꺼운 섬유 형성 및 더 작은 직경 편차를 설명하였다. 따라서, 시스액 유속에 의해 섬유가 억제되는 정도는 섬유의 직경을 결정하는 중요한 요인 중 하나 인 것으로 명백하게 보이며, 이 인자는 흐름분리기 및 두 용액간의 극성차와 결합될 때 마이크론(micron)보다 작은 섬유의 직경을 만드는데 사용될 수 있다. 1 마이크론보다 작은 직경을 가진 마이크로유체-방사 섬유(microfluidic-spun fiber)는 이전에 거의 보고된 적이 없다. 또한 섬유 표면에 범프가 형성되면(도 2b의 흰 화살표) 세틀라이트 흐름(satellite flow)을 생성하기 위해 범프를 확장 할 수 있다면 더 작은 마이크로 파이버를 생성할 수 있다는 힌트를 얻을 수 있다[Chae, Su-Kyoung, et al. Advanced Materials 25.22 (2013): 3071-3078].

축적챔버를 반응채널의 말단(상부층의 배출구)에 연결함으로써, 독립형 다공성 막이 성공적으로 구성되었다. 축적된 미세섬유는 칩을 시스액이 담긴 조(bath)에 반복적으로 침지시켰다가 들어올릴 때 서로 잘 분포되어 부착되어(도 5b의 황색 원) 독립형 다공성 막을 형성한다. 이 결과는 독립형 다공성 막의 구조 안정성을 나타낸다. 또한 본 발명에 따른 독립형 다공성 막의 제조방법을 사용하여 다공성 막의 기공크기를 조절할 수 있다. 도 3a 및 3b에 도시된 바와 같이, 세공은 시스액 유속이 증가함에 따라 더 작아진다. 또한, SEM 이미지의 정성 분석은 독립형 다공성 막 전체에 걸쳐 작은 기공의 존재와 더 얇은 다중 가닥의 미세섬유에 대한 기공 크기의 더 좁은 범위를 나타내었다(도 3c). 특히 시스액 유속을 0.5 mL/min에서 5.0 mL/min으로 10 배 증가시키면 직경이 1 미크론 미만인 섬유, 특히 0.5 μm가 생성되고 독립형 다공성 막의 상단에서부터 하단까지 열린 구멍이 거의 발견되지 않았다(도 3d, 3e). 이러한 다공성 제어 가능한 다공성 막은 탈수되었을 때 독립형 다공성 막으로 취급하기 용이하다(도 3f). 상용 멤브레인(Transwellㄾ 투과성 지지체, 코닝)에 표시된 것처럼 트위저(tweezer)로 다공성 막을 처리하고 다른 장치와 통합하는 것은 쉽지 않았다. 본 발명의 독립형 다공성 막을 사용하여 확산 테스트와 세포 배양 테스트를 위한 두 가지 플랫폼을 성공적으로 제작하였다. 고정된 1 μL/min 코어액 유속, 0.1 mL/min의 시스액 유속 및 1 % 알긴산 나트륨 용액의 조건을 이들 2 가지 실험을 위한 독립형 다공성 막의 구조에 적용하였다. 우선, 독립형 다공성 막을 대칭형 트랜스 웰 모양의 그릇의 중앙에 삽입하여 두 개의 구획을 형성시켰다(도 7a). 두 번째 구획에 있는 액체의 490 nm 파장 광 흡광도는 청색 염료가 첫 번째 구획으로 떨어지는 즉시 거의 증가하기 시작했으며, 이 흡광도는 약 35 분 후에 안정화되었다(도 7b). 둘째, 트랜스 웰 모양의 플랫폼은 합성 고분자(폴리에스테르) 멤브레인 대신 본 발명의 독립형 다공성 막으로 맞춤 제작되었다. 간단한 세포 배양 실험 결과를 도 4b-e에 나타내었다. 독립형 다공성 막은 한 구획에 세포를 보관하고 다른 구획에는 보관하지 않았으며, FBS 또는 NGF(실험군)와 함께 배양한 세포의 생존력은 FBS 또는 NGF가 없는(대조군) 세포의 생존력과 달랐다. 구체적으로, FBS를 갖는 L929 세포(도 4c)는 배양 5 일 후에 FBS없는 세포(도 4b, 71.01 %)보다 높은 생존율(87.40 %)을 나타내었다(도 4d, p <0.001); 유사하게, NGF를 가진 NSPCs는 NGF가없는 NSPCs보다 더 높은 증식률을 보였다(도 4e, p <0.05). 이러한 결과를 통하여, 독립형 다공성 막이 섬유아세포 세포주 L929의 세포뿐만 아니라 다공성 특성을 유지하면서 일차 NSPC에 대한 독립형 세포 지지체으로서 유용한 도구임을 확인하였다.

또한, 비균일한 직경의 다중 가닥의 미세섬유로 구성된 독립형 다공성 막을 성공적으로 제조하였다. 비균일한 간격 채널을 갖는 흐름분리기가 칩 상에 구축함으로써, 결과적인 막의 SEM 이미지 및 직경 분석에 의해 확인된 바와 같이(도 5b, c), 비균일한 직경을 갖는 다수의 섬유가 동시에 생성되었다(도 5a). 0.1 mL/min의 시스액 유속과 1 % 알긴산나트륨 수용액의 조건에서 가장 큰 채널(interval channel)인 80 μm는 코어액 유속이 0.4 μL/min이었고 평균 직경이 4.7 μm 인 섬유를 생성하는 반면, 가장 작은 것은 채널은 코어액 유속이 0.1 μL min이었고 평균 직경이 1.46 μm인 섬유가 생성되었다. 기본 칩과 비교하여, 20 μm 폭의 각 7 개의 채널(도 1)은 약 0.14 μL/min의 분리된 코어액 유속을 가지며 1.8 μm의 평균 직경을 산출하였다. 결과적으로, 의도적으로 조절된 크기의 섬유가 막의 일부를 채우며, 청색 형광 염료를 함유하는 가장 큰 채널로부터의 섬유가 도 5d 및 5e에서 전반적으로 잘 관찰되었다. 녹색 및 적색 형광 염료를 갖는 섬유는 규칙적으로 잘 관찰되었으며, 이는 간격의 크기 순서와 일치하였다(도 5d, 도 9). 3 차원 Z-스택 공 초점 레이저 스캐닝 이미지를 얻었다(도 5e). 또한 실수로 코어액 유속을 의도하지 않은 값으로 주입한 경우로부터 통찰력을 얻었다. 즉, 야누스 섬유(도 5f)로 구성된 독립형 다공석 막을 생산하가 위해 유속을 설정하는 방법을 우연히 습득하였다.

본 발명자는 이전에 보고된 연구[Chae, Su-Kyoung, et al. Advanced Materials 25.22 (2013): 3071-3078]에서, 잘못 정렬된 마이크로 채널에서 다중 가닥의 섬유의 제조를 유도하기 위해 단일 마이크로 섬유의 불안정한 계면(interface)을 만들었다. 본 발명에서는 섬유의 다중 가닥을 동시에 생성하기 위해 흐름분리기, 쌍극자-쌍극자 상호 작용 및 전단 응력이라는 세 가지 다른 요소를 도입하여 채널의 오정렬을 포함할 필요성을 제거하였다. 흐름분리기는 추가 공정이나 다른 복잡한 장치없이 분리된 흐름을 생성하였다. 그 다음, 각 단일 섬유의 표면에서 물과 IPA 사이의 극성의 차이는 분리된 흐름을 분리시키고 Kelvin-Helmholtz 불안정성에 기인한 불안정한 파동을 야기하였다[Gunther, Axel, and Klavs F. Jensen. Lab on a Chip 6.12 (2006): 1487-1503., 43; Tong, Mingming, and David J. Browne. International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering 24.11 (2008): 1171-1181]. 마지막으로, 시스액 흐름은 코어액에서 탈수 과정 동안 반응채널 내의 각 흐름에 가해졌고, 알지네이트 분자는 집합되어 자기 응집되어 마이크로 섬유를 형성하였다. 이러한 요소가 없으면 다중 가닥의 미세섬유 제조가 실패하게 된다(도 6). 첫째, 불완전 흐름분리기 세트는 코어액 흐름의 분리된 흐름을 유발하지 않았다(도 6, 왼쪽). 둘째로, IPA에서 DW로 용매의 변화, 코어액과 시스액 사이의 극성 차이를 없애고 코어 흐름의 분리된 흐름을 형성하지 않았다(도 6, 중심). 셋째, 전단력이 약하거나 전혀 없어서 처음으로 코어액 흐름이 분리될 수 있지만 다중 가닥의 미세섬유 형성을 완전히 확인하는 것만으로는 충분하지 않은 것으로 보인다(도 6, 오른쪽). 다중 가닥의 미세섬유는 축적챔버에 독립형 다공성 막을 형성하기 위해 축적된다. 본 발명에 따른 독립형 다공성 막 영역의 SEM 이미지(도 5b)는 IPA를 시스액의 용매로 사용할 때 칩 내부의 반응시간이 섬유의 완전 탈수에 충분하지 못하다는 것을 의미한다. 즉, 섬유는 반응채널의 출구로부터 압출될 때도 여전히 탈수되지 않은 부분을 갖는다. 섬유의 이들 탈수되지 않은 부분은 축적챔버 내에서 서로 만나게 되고 추가로 가교 결합하는 30 분 동안 연결되어 형상 유지 멤브레인을 형성하게 된다. 그러나 Park의 연구[Park, D. Y., et al. Biofabrication 6.2 (2014): 024108.]와 달리 DW를 시스액의 용매로 사용하는 경우 3 차원 벌크 섬유 지지체에는 연결 영역이나 네트워크가 발견되지 않았다. 따라서, 본 발명에서는 시스액로서의 IPA의 경우, 칩 내에서 미세섬유의 전체적인 생성에 더 많은 시간을 필요로하고, 반응채널의 길이가 막을 유지하는 형상을 만드는 핵심 요소라는 결론에 도달하였다. 반응 채널은 챔버 내에서 완전한 탈수가 일어나지 않도록 충분히 짧아야한다. 알긴산 염 용액의 부분적 탈수는 일부 물이 미세섬유의 표면에 남도록 허용하고, 이 잔여 물은 미세섬유가 자기 응집되어 서로 접촉하여 접착제로서 기능할 때 제거된다.

시스액 유속을 증가시킴으로써 섬유 직경이 감소될 수 있다. 얇은 섬유에 의해 형성된 막은 두꺼운 섬유에 의해 형성된 막보다 더 작고 따라서 덜 다공성인 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 본 발명에 따른 마이크로유체 칩이 미세섬유 막의 다공성을 쉽게 제어할 수 있음을 나타낸다. 또한 독립형 다공성 막의 기공 크기는 전기 방사 섬유로 제조된 막의 기공 크기보다 컸다. 그러나, 도 2c 및 도 3c는 막의 섬유 및 세공의 크기, 및 막의 세공 크기 한계를 보여준다. 이 작업에서 생성된 가장 작은 간격은 20 μm이었고, 재현할 수 있는 섬유의 최소 두께는 약 1μm였다. 이것은 본 발명에 따른 방법이 마이크로 유체 방사법과 전기 방사법에 비해 장점을 가지고 있음을 시사하지만 완전히 대체 할 수는 없다. 특히, 본 방법은 전기 방사 된 나노 섬유-멤브레인(즉, 나노 크기의 기공)의 이점을 실현할 수 없다. 이는 마이크로 유체 칩을 만들기 위해 사용한 포토 리소그래피(photolithography) 유형으로 나노 크기의 채널(또는 간격)을 만드는 것이 어렵기 때문이다. 따라서 본 발명이 위에서 언급 한 멤브레인 제조방법의 방사 방법에서 더 큰 이점을 갖기 위해서는 나노 크기의 채널 또는 간격을 만들기 위해 첨단 제어 기술과 결합해야 한다[Khan, Muhammad Shuja, Noura Sayed Dosoky, and John Dalton Williams. International journal of molecular sciences 14.11 (2013): 21561-21597; Khan, Muhammad Shuja, and John Dalton Williams. Materials 8.11 (2015): 7389-7400; Khan, Muhammad S., et al. European Biophysics Journal 45.8 (2016): 843-852].

막의 탈수 후 축적 챔버 내에서 독립형 다공성 막을 두 가지 간단한 실험: 확산 테스트 및 세포 배양 테스트를 위해 주문형 플랫폼에 본 발명에 따른 독립형 다공성 막을 삽입하였다. 막의 확산성은 확산 시험 플랫폼 내에서 명백하게 유지되었다. 그러나 PDMS 플랫폼과 독립형 다공석 막을 결합시키는 접착제로 사용된 PDMS가 막의 기공에 침투하여 확산을 방해할 수 있으므로 독립형 다공성 막의 확산 특성을 향상시킬 수있는 기회가 있어야 한다. 트랜스 웰 모양의 세포 배양 플랫폼에서 L929와 NSPC를 배양하여 세포막 기질 역할을 하는 독립형 다공성 막의 능력을 확인하였다. 이 세포들은 막에 잘 부착되어 독립형 다공성 막을 통해 확산되는 단백질에 노출된 것처럼 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 독립형 다공성 막은 다른 장치와 통합 될 때 그 다공성을 잃지 않았다. 또한 기본 단위가 마이크로미터 이하의 미세섬유로 독립형 다공성 막이 세포에 적합한 기공 크기를 형성하였다. 이와는 대조적으로, 이러한 얇은 섬유는 종래의 미세 유체 방사를 사용하여 제조하기가 쉽지 않았고, 이러한 기공 크기는 전기 방사된 나노 막에서 형성되기가 쉽지 않았다. 요즘, 특히 장기칩(organ-on-a-chip) 영역에서 멤브레인은 일반적으로 적절한 기공 크기를 가질 것으로 기대되며 세포 접착, 상호 작용, 증식 및 멤브레인을 통한 이동을 촉진시키는 적절한 물질로 구성된다. 이 연구에서 보이듯이, 세포 기반 연구는 제안된 막의 유리한 특성으로부터 이익을 수 있다. 즉, 독립형 다공성 막은 세포 기반 연구에 적합한 조건을 제공하며 따라서 다양한 조직 공학 응용에 도움이 될 수 있다[Park, DoYeun, et al. Stem cells translational medicine 4.11 (2015): 1352-1368; Engler, Adam J., et al. Cell 126.4 (2006): 677-689; Park, JinSeok, et al. Integrative Biology 4.9 (2012): 1008-1018].

독립형 다공성 막의 가장 유망한 성질은 여러 농도 및 세포 부착 영역에서 다양한 생체 분자로 시공간적으로 로딩되거나 코딩될 수 있다는 점이다. 이는 세포 기질과 복잡한 조직 재생을 모방한 생체모방(biomimicking)을 가능하게 한다. 코어액 주입구에서 흐름분리기 내의 채널 간격이 비대칭으로 변경되고 각 코어액 흐름에 다른 재료가 로드됨으로써 비균일한 직경의 섬유들이 제조되었다. 이러한 설정은 등급 또는 다른 유형의 생체 분자를 보유하는 다양한 크기의 단일 섬유로 구성된 멤브레인 제작으로 확장될 수 있다. 즉, 임의의 종류의 생체 분자가 어떤 직경의 알긴산 섬유로 만들어진 비균일한 다중 가닥의 미세섬유를 함유하는 독립형 다공성 막에 쉽게 로딩될 수 있기 때문에, 비균일한 다중 가닥의 미세섬유를 함유하는 독립형 다공성 막 위에 배양된 세포는 성장 인자의 상대적으로 조절된 분포를 보유하는 막의 임의의 스폿에 부착될 수 있다. 이는 확산, 증식 또는 차별화와 같은 다양한 행동으로 이어질 수 있다. 예를 들어, NSPC가 독립형 다공성 막에서 매우 실용가능하다는 것을 관찰했기 때문에, 상피 성장 인자(EGF) 또는 염기성 섬유 모세포 성장 인자(bFGF)와 같은 NSPC 분화 조절제의 상이한 양을 마이크로 칩의 각 유입구에 로딩할 수 있다(도 5a). 유입구 δ를 통해 적재된 NSPC용 조절기는 주입구 α를 통해 적재된 것보다 더 넓은 세포 부착 구역 전체에 분포될 것이다. 이러한 방식으로, NSPC 분화 정도는 NSPC가 조절제를 갖는 섬유질 기재에 노출되게 함으로써 쉽게 조절될 수 있다. 같은 방법으로 다양한 세포 유형을 배양할 때 각 세포의 행동을 제어할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 독립형 다공성 막의 제조방법은 세포 행동을 제어하고 복잡한 조직의 재생 연구에 적용될 수 있는 새로운 방법이다.

그러므로, 본 발명에 따르면, 종래 마이크로유체 방사법(microfluidic spinning method)에서 얻을 수 없었던 서브미크론(submicron) 두께의 다중 가닥의 미세섬유를 동시에 수득하고, 이를 이용하여 미세기공을 갖는 독립형 다공성 막을 제조하여 약물 전달 및 조직공학용 지지체와 같은 조직공학 분야에 응용할 수 있으며, 특히, 미세섬유의 크기, 독립형 다공성 막의 다공성 및 상기 막 내의 미세섬유의 크기 분포는 시스액의 유속, 코어액의 농도 및 칩의 구조를 변화시킴으로써 용이하게 조절될 수 있다. 또한, 독립형 다공성 막의 유망한 잠재력은 생리학적으로 중요한 생체 분자가 미세섬유 및 상기 막에 포함될 수 있음을 보여줌으로써 입증하였다. 상기 막은 생리학적 미세환경과 유사하게 만들어질 수 있으며, 따라서 복잡한 조직 재생을 호스트(host) 할 수 있다.

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마이크로유체 칩을 이용한 독립형 다공성 막의 제조방법에 있어서,
상기 마이크로유체 칩은 코어액이 주입되는 제1주입구, 상기 주입되는 코어액을 2 이상의 흐름으로 분리하는 흐름분리기, 시스액이 주입되는 제2주입구, 상기 2 이상의 흐름으로 분리되는 코어액과 상기 시스액이 반응하여 다중 가닥의 미세섬유가 제조되는 반응채널부, 및 상기 제조되는 다중 가닥의 미세섬유가 배출되는 배출구를 포함하는 상부층;
상기 상부층의 배출구와 연결되어 상기 배출되는 다중 가닥의 미세섬유가 축적되는 축적챔버; 및
상기 축적챔버에 구비되어 상기 축적되는 다중 가닥의 미세섬유로부터 잔여 시스액을 여과하는 필터;를 포함하고,
상기 코어액 및 상기 시스액은 극성 용액이며,
상기 코어액의 극성은 상기 시스액에 비하여 큰 것이며,
(a) 상기 제1주입구 및 제2주입구에 각각 코어액 및 시스액을 주입하여 다중 가닥의 미세섬유를 제조하고 상기 축적챔버에 축적하는 단계; 및
(b) 상기 축적된 다중 가닥의 미세섬유를 갖는 마이크로유체 칩을 시스액에 침지시켰다가 들어올리는 과정을 2회 이상 반복하여 막을 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법.
제2항에 있어서,
(c) 상기 형성된 막을 탈수용액으로 탈수하는 단계;를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 코어액의 농도 및/또는 시스액의 유속을 조절하여 상기 다중 가닥의 미세섬유의 직경을 조절하는 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 시스액의 유속을 조절하여 상기 독립형 다공성 막의 기공 크기를 조절하는 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 코어액은 알긴산나트륨 수용액이고, 상기 시스액은 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액인 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법.
제2항에 있어서,
(c) 상기 형성된 막을 에탄올 용액으로 탈수하는 단계를 더욱 포함하고;
상기 코어액은 1 내지 5 중량%의 알긴산나트륨 수용액이며;
상기 시스액은 염화칼슘 및 이소프로판올의 혼합액이며;
상기 코어액의 유속은 0.1 내지 1.5 μL/min이며;
상기 시스액의 유속은 0.01 내지 1 ml/min인 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 흐름분리기는 비균일한 간격으로 복수개의 채널이 형성되어 비균일한 직경의 다중 가닥의 미세섬유가 제조되는 것을 특징으로 하는 독립형 다공성 막의 제조방법.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 독립형 다공성 막.
제9항에 따른 독립형 다공성 막을 포함하는 세포배양용 지지체.