CN113181433A - 一种促血管化三维纳米纤维管状支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种促血管化三维纳米纤维管状支架及其制备方法，其特征在于：该支架包括三维纳米纤维管状支架内层和三维纳米纤维管状支架外层，所述的三维纳米纤维管状支架外层为P(LLA‑CL)/PEO共混物经过静电纺丝制备而成。具有能实现早期血管化，为管状组织的再生提供充足的营养物质和氧气，制备方法简单，经济效益高的优点。

Description

一种促血管化三维纳米纤维管状支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种管状支架及其制备方法，特别涉及一种促血管化三维纳米纤维管状支架及其制备方法。
背景技术
在人体中含有丰富的管状组织，如神经、尿道、肠道、血管、气管等。当这些管状组织缺损或发生病变时，都需要进行移植手术。临床上常采用自体或异体移植，但是存在着供区损伤、供体不足、易引发排异反应等缺陷。随着组织工程学的发展，组织工程支架成为自体或异体移植的替代物。最理想的组织工程支架就是仿生天然细胞外基质的结构和功能。天然细胞外基质是由蛋白和多糖组成的纳米纤维网络结构。因而，近年来采用静电纺的方法制备各种纳米纤维管状支架，专利CN201410279780.8公开了一种轴向取向纳米纤维神经导管的制备方法，专利CN201910360216.1公开了一种共轭电纺纳米纤维人工小口径血管支架的制备方法及产品，CN201911314166.X公开了一种组织工程化尿道支架移植物及其制备方法和应用。虽然这些静电纺管状支架能够用于管状组织修复与再生，但是与自体移植相比还有一定差距，尤其是对于长距离管状组织再生。其重要原因是静电纺纳米纤维管状支架的管壁都是二维纳米纤维膜状结构，其纤维结构较为紧密，孔径小，通透性差，细胞难以长入，植入体内后尚无法在短期内快速构建血管网，为细胞的生长提供充足的营养物质和氧气，而自体移植体与断端之间能很快建立自身血供。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能实现早期血管化，为管状组织的再生提供充足的营养物质和氧气，制备方法简单，经济效益高的促血管化的三维纳米纤维管状支架。
为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：一种促血管化的三维纳米纤维管状支架，该支架包括三维纳米纤维管状支架内层和三维纳米纤维管状支架外层，所述的三维纳米纤维管状支架外层为P(LLA-CL)(乳酸己内酯共聚物)/PEO(聚氧化乙烯)共混物经过静电纺丝制备而成。
进一步的，所述的纳米纤维管状支架内层为由丝素蛋白和P(LLA-CL)经过静电纺丝制备而成。
进一步的，所述的管状支架的长度，内径,管壁厚度可以根据需要采用不同尺寸的模具进行调节。
本申请还提供一种促血管化的三维纳米纤维管状支架的制备方法，具体包括：
(1)首先制备三维纳米纤维管状支架内层
(1.1)纳米纤维的制备：丝素蛋白和P(LLA-CL)以比例为90:10-60:40(重量比)混合、然后溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度8.0-12.0％(质量百分含量)，静电纺丝参数：电压8-16kV，流速1.0-3.0mL/h，接收距离10-20cm；
(1.2)三维纳米纤维管状支架内层的制备：将步骤(2)制备的纳米纤维剪碎后加入到叔丁醇中、在叔丁醇中的浓度为1.5-2.5％的质量百分含量，然后通过高速分散机高速分散，浇注到模具中进行冷冻干燥24-48小时，然后用质量百分比浓度为20-30％的戊二醛交联12-24小时，从模具中取出得到三维纳米纤维管状支架内层；
(2)三维纳米纤维管状支架外层的制备
将上述制备的三维纳米纤维管状支架内层套入静电纺丝装置的旋转接收钢管上，将混合比例为80:20-60:40(重量比)P(LLA-CL)(乳酸己内酯共聚物)/PEO(聚氧化乙烯)共混物溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度为12-14％质量百分比，溶解完全后静电纺丝，静电纺丝的参数为：电压8-16kV,流速1.0-3.0mL/h，接收距离10-20cm，接收装置的旋转速率为50-100rpm，纺丝时间20-40mmin获得本申请的双层三维纳米纤维管状支架。
进一步的，本申请所述的丝素蛋白通过如下方法制备而成：先将100克蚕茧加入到1升0.5w/v％的Na2CO3水溶液中，煮沸30min，重复处理三次，用蒸馏水充分洗净，洗净后放入45℃的干燥箱中烘干,得到脱胶后的蚕丝纤维；以CaCl2:C2H5OH:H2O＝1:2:8的摩尔比配制三元溶剂，将蚕丝纤维以1:10的浴比，置于70℃的水浴锅内恒温溶解1h，得到完全溶解的丝素蛋白溶液；丝素蛋白溶液装入透析袋中，用蒸馏水透析72h，将透析好的丝素蛋白溶液放入－80℃预冻12h，然后在-58℃冷冻干燥至干，得到白色，疏松的多孔、海绵状的丝素蛋白；本发明上述步骤制备的丝素蛋白相对比于现有市售的具有分子量均一，纺丝效果好的优势，在后续的三维纳米纤维管状支架上应用之后，具有更加优异的性能。
本申请的优点和有益效果：
1.与二维纳米纤维膜形成的管状支架相比，三维纳米纤维管状支架具有更高的孔隙率和更大的孔径以及孔孔连接率、可以引导外周血管更为深入的生长，从而使得血管的密度得到增加；此外，本申请首次设计一种具有双层的、管状结构的三维结构支架，外层主要起到增加力学性能的作用，为支架的稳定性和作用时间提供更好的保证；在外层结构中还引入了PEO组分、该组分的加入可以有效的增加亲水性，且在水中会溶解，从而增大孔径、更加方便细胞的长入，植入体内后可以在短期内快速构建血管网，为细胞的生长提供充足的营养物质和氧气。
2.本申请此种特定结构的促血管化三维纳米纤维管状支架的内径的大小、壁厚以及长度可以根据需要进行调节，更加的灵活方便，此外，本申请的制备方法简单易行，原料安全可靠，可重复性好，使其在各种管状组织中具有很好地应用前景，易实现工业化生产。
3.本申请为了实现早期管状支架的血管化，采用纳米纤维分散、模板成型、冷冻干燥和交联相结合的方法，制备具有双层结构的三维纳米纤维结构的管状支架，不仅保留了纳米纤维的优点，还提高了管状支架的孔径和孔隙率，本申请的三维纳米纤维结构的管状支架的孔径为0-100μm之间、孔隙率90-95％,而传统二维纳米纤维管状支架的孔径为0-12μm之间、孔隙率56-70％，因此，本申请的双层三维纳米纤维管状支架具有更好的通透性，有利于内皮细胞从管状支架外部向内部的迁移和生长，实现早期管状支架的血管化，为细胞生长提供充足的营养物质和氧气，而且本申请为了进一步提高三维纳米纤维结构管状支架的力学性能，在外层纺制一层微纳结构的纤维膜层，这样既提高了力学性能，又不影响细胞的长入和早期血管的形成。
4.本申请采用将通过特定工艺制备的丝素蛋白作为原料之一，与P(LLA-CL)作用进行静电纺丝来获得三维纳米纤维管状支架，有效的提高纺丝效果，获得更好性能的三维纳米纤维管状支架，为后续的细胞的长入和早期血管的形成提供保障。
附图说明
图1丝素蛋白-P(LLA-CL)复合纳米纤维(B)的扫描电镜(SEM)图。
图2促血管化三维纳米纤维管状支架的图片其中A为数码照片图，B为管状支架截面的SEM图，C为B放大后的内外层交界的SEM图，D为内层三维纳米纤维的SEM图。
图3人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与二维纳米纤维支架和三维纳米纤维支架共培养后增殖(A)图，并通过ELISA(B)，qRT-PCR(C)，Western blotting(D)检测成血管关键指标VEGFA的释放水平图。
图4通过micro CT扫描三维重建肌肉包埋后支架新生血管网形态(A)并统计出血管直径(B)和血管容量(C)图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
先将100克蚕茧加入到1升0.5w/v％的Na2CO3水溶液中，煮沸30min，重复处理三次，用蒸馏水充分洗净，洗净后放入45℃的干燥箱中烘干,得到脱胶后的蚕丝纤维；以CaCl2:C2H5OH:H2O＝1:2:8的摩尔比配制三元溶剂，将蚕丝纤维以1:10的浴比，置于70℃的水浴锅内恒温溶解1h，得到完全溶解的丝素蛋白溶液；丝素蛋白溶液装入透析袋中，用蒸馏水透析72h，将透析好的丝素蛋白溶液放入－80℃预冻12h，然后在-58℃冷冻干燥至干，得到白色，疏松的多孔、海绵状的丝素蛋白；本发明上述步骤制备的丝素蛋白相对比于现有市售的具有分子量均一，纺丝效果好的优势，在后续的三维纳米纤维管状支架上应用之后，具有更加优异的性能。
纳米纤维的制备：
丝素蛋白和P(LLA-CL)(质量比为80:20)溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度为8.0％,静电纺丝参数，电压8-16kV,流速1.0-3.0mL/h,接收距离10-20cm，纳米纤维的平均直径为210±56nm,图1为纳米纤维扫描电镜图。
三维纳米纤维管状支架内层的制备：
将上述剪碎后的纳米纤维0.8克加入到40mL叔丁醇中通过高速分散机高速分散，然后浇注到模具中进行冷冻干燥24小时，干燥后用25％戊二醛交联12小时，从模具中取出得到三维纳米纤维管状支架内层(内芯)。
三维纳米纤维管状支架外层的制备：
将上述制备的三维纳米纤维管状支架内层套入静电纺丝装置的旋转接收钢管上。将P(LLA-CL)/PEO共混物(其比例80:20)溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度为12.0％，溶解完全后在上述的三维纳米纤维管状支架内层外侧进行静电纺丝，静电纺丝参数:电压8-16kV,流速1.0-3.0mL/h,接收距离10-20cm，接收装置的旋转速率为50-100rpm，纺丝时间半小时，得到双层结构的促血管化三维纳米纤维管状支架，图2(A,B,C,D)为促血管化三维纳米纤维管状支架的数码照片和扫描电镜图。
(1)促血管化三维纳米纤维管状支架体外促血管化研究
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植于三维纳米纤维管状支架和二维纳米纤维管状支架上，利用CCK8试剂盒检测HUVECs与材料共培养后的增殖能力(3d，5d，7d)结果如图3(A)。三维纳米纤维管状支架和二维纳米纤维管状支架与HUVECs共培养7d后，采用ELISA分析试剂盒、real-time PCR(qQRT-PCR)、Western blotting等方法检测成血管关键指标VEGFA释放水平，结果如图3(B,C,D)。这些结果均表明三维纳米纤维管状支架促血管化性能明显优于二维纳米纤维管状支架。
实施例2
将上述剪碎后的纳米纤维0.8克加入到40mL叔丁醇中通过高速分散机高速分散，然后浇注到模具中进行冷冻干燥24小时，干燥后用25％戊二醛交联12小时，从模具中取出得到三维纳米纤维管状支架。
三维纳米纤维管状支架外层的制备
将上述制备的三维纳米纤维管状支架内层套入静电纺丝装置的旋转接收钢管上。将P(LLA-CL)/PEO共混物(其比例60:40)溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度为14％，溶解完全后静电纺丝，静电纺丝参数，电压8-16kV,流速1.0-3.0mL/h,接收距离10-20cm，接收装置的旋转速率为50-100rpm，纺丝时间半小时，得到促血管化的三维纳米纤维管状支架。
实施例3
将上述剪碎后的纳米纤维0.6克加入到40mL叔丁醇中通过高速分散机高速分散，然后浇注到模具中进行冷冻干燥，干燥后用25％戊二醛交联12小时，从模具中取出得到三维纳米纤维管状支架。
三维纳米纤维管状支架外层的制备
将上述制备的三维纳米纤维管状支架内层套入静电纺丝装置的旋转接收钢管上。将P(LLA-CL)/PEO共混物(其比例80:20)溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度为14％，溶解完全后静电纺丝，静电纺丝参数，电压8-16kV,流速1.0-3.0mL/h,接收距离10-20cm，接收装置的旋转速率为50-100rpm，纺丝时间半小时，得到促血管化的三维纳米纤维管状支架。
实施例4
纳米纤维的制备：
丝素蛋白和P(LLA-CL)(质量比为70:30)溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度8.0％,静电纺丝参数，电压8-16kV,流速1.0-3.0mL/h,接收距离10-20cm，纳米纤维的平均直径为350±45nm。
三维纳米纤维管状支架内层的制备：
将上述剪碎后的纳米纤维0.8克加入到40mL叔丁醇中通过高速分散机高速分散，然后浇注到模具中进行冷冻干燥24小时，干燥后用25％戊二醛交联12小时，从模具中取出得到三维纳米纤维管状支架内层(内芯)。
三维纳米纤维管状支架外层的制备
将上述制备的三维纳米纤维管状支架内层套入静电纺丝装置的旋转接收钢管上。将P(LLA-CL)/PEO共混物(其比例70:30)溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度为13％，溶解完全后静电纺丝，静电纺丝参数，电压8-16kV,流速1.0-3.0mL/h,接收距离10-20cm，接收装置的旋转速率为50-100rpm，纺丝时间半小时，得到促血管化的三维纳米纤维管状支架。
促血管化三维纳米纤维管状支架体内促血管化研究
取SD大鼠双腿外侧备皮、消毒，于大腿中段切开长约2cm切口于股外侧肌，将材料埋置于肌肉内，支架两端用6-0缝线与肌肉缝合，防止后期移动，缝合肌肉、皮肤。
Microfil灌注观察支架大体水平新生血管生成
于不同植入时间，用4％水合氯醛0.7mL/100g麻醉SD大鼠后，剑突下打开腹腔向上打开横膈，暴露心脏，输液针插入左心室输注负载肝素钠生理盐水15-30min后灌注多聚甲醛，待大鼠尾巴变硬后灌注造影剂，4℃冰箱24h后取材，利用micro CT扫描三维重建肌肉包埋后支架新生血管网形态。如图4(A)并通过micro CT扫描三维重建肌肉包埋后支架新生血管网形态统计出血管直径图4(B)和血管容量图4(C)。无论从新生血管网形态还是新生血管直径和血管容量的结果均表明，促血管化三维纳米纤维管状支架促血管化明显优于二维纳米纤维支架。

Claims (5)

1.一种促血管化三维纳米纤维管状支架，其特征在于：该支架包括三维纳米纤维管状支架内层和三维纳米纤维管状支架外层，所述的三维纳米纤维管状支架外层为P(LLA-CL)/PEO共混物经过静电纺丝制备而成。
2.根据权利要求1所述的促血管化三维纳米纤维管状支架，其特征在于：所述的纳米纤维管状支架内层为由丝素蛋白和P(LLA-CL)经过静电纺丝制备而成。
3.根据权利要求1所述的促血管化三维纳米纤维管状支架，其特征在于：所述的管状支架的长度，内径,管壁厚度的同尺寸为可调节尺寸。
4.一种促血管化三维纳米纤维管状支架的制备方法，其特征在于：具体包括：
(1)首先制备三维纳米纤维管状支架内层
(1.1)纳米纤维的制备：丝素蛋白和P(LLA-CL)以比例为90:10-60:40(重量比)混合、然后溶解在六氟异丙醇中，溶液的浓度8.0-12.0％(质量百分含量)，静电纺丝参数：电压8-16kV，流速1.0-3.0mL/h，接收距离10-20cm；
(1.2)三维纳米纤维管状支架内层的制备：将步骤(2)制备的纳米纤维剪碎后加入到叔丁醇中、在叔丁醇中的浓度为1.5-2.5％的质量百分含量，然后通过高速分散机高速分散，浇注到模具中进行冷冻干燥24-48小时，然后用质量百分比浓度为20-30％的戊二醛交联12-24小时，从模具中取出得到三维纳米纤维管状支架内层；
(2)三维纳米纤维管状支架外层的制备
将上述制备的三维纳米纤维管状支架内层套入静电纺丝装置的旋转接收钢管上，将混合比例重量比为80:20-60:40的P(LLA-CL)/PEO共混物溶解在六氟异丙醇中，溶液的质量百分比浓度为12-14％，溶解完全后静电纺丝，静电纺丝的参数为：电压8-16kV,流速1.0-3.0mL/h，接收距离10-20cm，接收装置的旋转速率为50-100rpm，纺丝时间20-40mmin，获得双层三维纳米纤维管状支架。
5.根据权利要求4所述的促血管化三维纳米纤维管状支架的制备方法，其特征在于：所述的丝素蛋白通过如下方法制备而成：本申请所述的丝素蛋白通过如下方法制备而成：先将100克蚕茧加入到1升0.5w/v％的Na2CO3水溶液中，煮沸30min，重复处理三次，用蒸馏水充分洗净，洗净后放入45℃的干燥箱中烘干,得到脱胶后的蚕丝纤维；以CaCl2:C2H5OH:H2O＝1:2:8的摩尔比配制三元溶剂，将蚕丝纤维以1:10的浴比，置于70℃的水浴锅内恒温溶解1h，得到完全溶解的丝素蛋白溶液；丝素蛋白溶液装入透析袋中，用蒸馏水透析72h，将透析好的丝素蛋白溶液放入－80℃预冻12h，然后在-58℃冷冻干燥至干，得到白色，疏松的多孔、海绵状的丝素蛋白。
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