ES2714707T3

ES2714707T3 - Método para la desinfección y esterilización de material tisular animal

Info

Publication number: ES2714707T3
Application number: ES14839546T
Authority: ES
Inventors: Zhigang Liu; Xinhua Liu
Original assignee: BEIJING RUIJIAN GAOKE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: BEIJING RUIJIAN GAOKE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-08-26
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2019-05-29
Anticipated expiration: 2034-05-29
Also published as: WO2015027728A1; EP3025734B1; HUE043550T2; JP2016534118A; US10701928B2; EP3025734A4; EP3025734A1; US20160212986A1; PL3025734T3; PT3025734T; CN103418001A; CN103418001B; JP6253780B2

Abstract

Un método para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal, que comprende las etapas de: (1) poner el material del tejido animal en una solución de remojo alcalina que contiene un peróxido de metal y un detergente, y agitar; (2) lavar el material del tejido animal obtenido en la etapa (1) con una solución de limpieza neutra para eliminar los componentes orgánicos liberados de microorganismos y células de tejido animal durante el remojo; (3) lavar la matriz de tejido obtenida en la etapa (2) con una solución de limpieza débilmente ácida que tiene un pH de 5,0~6,0; (4) crioconservar o liofilizar la matriz de tejido obtenida en la etapa (3) en una solución neutra; en el que la solución de remojo en la etapa (1) contiene el 0,01~0,2% p/v del peróxido de metal y el 0,05~1,0% p/v del detergente, y el pH de la solución de remojo está entre 8,5~11,5.

Description

DESCRIPCION

Metodo para la desinfeccion y esterilizacion de material tisular animal

Campo tecnico

La presente solicitud se refiere a un metodo para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal.

Antecedentes de la tecnica relacionada

Se ha usado una matriz descelularizada de un tejido y organo para la restauracion de tejido humano, diversos estudios de ingeniena tisular e investigaciones de medicina regenerativa. Hay una gran similitud y homolog^a en las matrices extracelulares de tejidos y organos de cuerpos humanos y muchos animales. Un material de matriz biologico fabricado descelularizando un tejido y organo alogenico o xenogenico se ha usado satisfactoriamente para la reparacion y la restauracion de tejidos humanos en medicina clmica. Tras implantar una buena matriz de un tejido y organo en el huesped, el material de andamiaje de matriz proporciona un soporte biomecanico inicial y regula el comportamiento celular (por ejemplo, adherencia, migracion, proliferacion y diferenciacion) al interaccionar con una celula huesped, y la matriz del propio tejido y organo se convierte gradualmente en un nuevo tejido con crecimiento hacia el interior de las celulas huesped.

Tras la retirada de los componentes celulares originales de un tejido y organo de un animal, la matriz del tejido y organo que tiene una estructura de andamiaje tridimensional tambien puede recelularizarse y funcionalizarse incorporando celulas humanas in vitro, produciendo de ese modo finalmente un tejido y organo que puede implantarse en el cuerpo humano.

Una matriz de un tejido y organo es un andamio tridimensional compuesto por diversas protemas estructurales y protemas funcionales complejas, y comprende muchos otros complejos activos. Los componentes principales incluyen fibra colagenosa, glicoprotema, mucoprotema, y otros componentes incluyen sacaridos tales como glicosaminoglicano (acido hialuronico, sulfato de condroitina), algunos lfpidos y factores de crecimiento. Un procedimiento de procesamiento para fabricar la matriz del tejido y organo es muy complejo, incluyendo procesos tales como recoleccion, conservacion, lavado, desinfeccion, descelularizacion, reduccion de antigenicidad, inactivacion de virus y esterilizacion terminal del tejido y organo. Entre estos procesos, el tratamiento de desinfeccion y esterilizacion del tejido animal provoca un gran dano en la matriz del tejido y organo, que cambia de manera grave los constituyentes bioqmmicos de la matriz del tejido y organo, al tiempo que inactiva las bacterias y virus, perturbando de ese modo las ultraestructuras tridimensionales y alterando propiedades biomecanicas. Estos cambios influyen en la respuesta del huesped al material de matriz implantado, y posiblemente dan como resultado los desenlaces clmicos menos deseables del producto de la matriz de tejido, y haciendo asf que sea diffcil conseguir la reparacion de tejido humano apropiada.

Los documentos US2004/057936 y US6482584 dan a conocer un metodo para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal usando una solucion de remojo alcalina que comprende una solucion de peróxido de hidrógeno. El metodo para la desinfeccion, esterilizacion e inactivacion de virus del material del tejido animal se usa a traves de cada etapa de proceso del proceso de fabricacion para el andamio de la matriz de tejido. Actualmente, los metodos aplicables se refieren principalmente a varios metodos tal como sigue. El primero es un metodo ffsico, que reduce el numero de bacterias y hongos mediante enjuagado y dilucion, y funciona en un entorno esteril para impedir una nueva infeccion; el segundo es anadir un inhibidor del crecimiento microbiano y un antibiotico en una solucion de preparacion; el tercero es incorporar una etapa de esterilizacion especial en el procedimiento de procesamiento de la preparacion, para controlar el numero de bacterias; y el cuarto es el tratamiento terminal de esterilizacion del producto. El metodo de esterilizacion en el procedimiento de procesamiento de la preparacion es tratar con un oxidante qmmico (acido peracetico, hipoclorito de sodio, peróxido de hidrógeno o solucion de yodo, o similar), alcohol, o acido o base (acido acetico, acido clorhfdrico, hidróxido de sodio). Los resultados de prueba indican que estos metodos usados comunmente para el tratamiento de desinfeccion y esterilizacion tienen diferentes grados de dano en la matriz de tejido. Una de las cuestiones que requieren un estudio adicional en el campo de la ciencia de la ingeniena tisular y la ciencia de los materiales biologicos es como desinfectar, esterilizar e inactivar virus mas eficazmente, sin danar la estructura basica original de la matriz de tejido extracelular, y cambiar los constituyentes bioqmmicos principales y las propiedades biomecanicas.

Contenido de la invencion

La presente solicitud se refiere a 1) un metodo para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal, que comprende las etapas de: (1) poner el material del tejido animal en una solucion de remojo alcalina que contiene un peróxido de metal y un detergente, y agitar; (2) lavar con una solucion de limpieza neutra para eliminar los componentes organicos liberados de microorganismos y celulas de tejido animal durante el remojo; (3) lavar con una solucion de limpieza debilmente acida que tiene un pH de 5,0 a 6,0; (4) crioconservar o liofilizar la matriz de tejido obtenida en una solucion neutra; conteniendo la solucion de remojo en la etapa (1) el 0,01-0,2% p/v del peróxido de metal y el 0,05-1,0% p/v del detergente, y estando el pH de la solucion de remojo entre 8,5-11,5, y 2) el uso de una solucion de remojo para un tejido animal para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal, comprendiendo la solucion el 0,01-0,2% p/v de un peróxido de metal y el 0,05-1,0% p/v de un detergente, y estando el pH de la solucion entre 8,5-11,5, alternativamente entre 9,0-11,5.

En algunas realizaciones, la solucion de remojo usada para el tejido animal en la etapa (1) contiene el 0,01-0,2% (p/v) del peróxido de metal y el 0,05-1,0% (p/v) del detergente, y el pH de la solucion esta entre 9,0-12,0. El peróxido de metal se selecciona de uno o mas del grupo que consiste en peróxido de calcio, peróxido de magnesio, peróxido de sodio o peróxido de bario, y el detergente se selecciona de uno o mas del grupo que consiste en Triton X-100, desoxicolato de sodio o dodecilsulfonato de sodio.

El peróxido de calcio, tambien denominado dióxido de calcio, se usa como desinfectante no toxico para semillas y cereales en agricultura; se usa como aditivo en la fabricacion de alimentos, cosmeticos; y se usa como oxidante de alta temperatura o un productor de oxfgeno en la fabricacion de medicina. Por tanto, en una realización mas preferible de la presente invencion, el peróxido de metal es una baja concentracion de o solucion acuosa alcalina supersaturada de peróxido de calcio, cuyo contenido esta generalmente entre el 0,01-0,2% (p/v) (que corresponde a 0,01-0,2 g de peróxido de calcio por 100 ml de solucion, teniendo “p/v” a continuacion en el presente documento el mismo significado). El contenido de peróxido de calcio en aplicaciones practicas puede ajustarse dependiendo de la razon del volumen de la solucion con respecto al material original del tejido y organo del animal, tal como el 0,01%, el 0,02%, el 0,03% ..., hasta cualquier concentracion de no mas del 0,2% (p/v). Es mas, ademas de peróxido de calcio, el peróxido de metal que puede usarse en los ejemplos de la presente invencion tambien puede incluir, pero no limitarse a, peróxido de sodio, peróxido de magnesio, peróxido de bario y otros peróxidos de metal.

En el proceso de usar la solucion acuosa de peróxido de calcio u otros peróxidos de metal en los ejemplos de la presente invencion, un pH inicial de la solucion de remojo se ajusta a un pH de entre 8,5-12,5, preferiblemente 9,0-12,0, mas preferiblemente 9,5-11,5, con una solucion de carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de sodio, acido acetico, acido clorlddrico. El contenido final de carbonato de sodio y bicarbonato de sodio esta entre el 0,01-2,0% (p/v), y el contenido de hidróxido de sodio puede estar entre 1,0-100 mM. Preferiblemente, el contenido de carbonato de sodio y bicarbonato de sodio puede estar entre el 0,5-1,0% (p/v) y el contenido de hidróxido de sodio puede estar entre 5-10 mM. El contenido de cada componente en aplicaciones practicas puede variarse dependiendo de la razon del volumen de la solucion con respecto al material original del tejido y organo del animal.

El peróxido de metal en los ejemplos de la presente invencion se usa en combinacion con una baja concentracion de un detergente o un descontaminante que puede no provocar la desnaturalizacion de protemas de matriz de tejido. Hay muchas clases de detergentes o descontaminantes adecuados para esta aplicacion, incluyendo un tensioactivo ionico y un tensioactivo no ionico. Se usan comunmente Triton X-100, desoxicolato de sodio, dodecilsulfonato de sodio, alifatato de sodio, acido 3-[(3-colesterolaminopropil)dimetilamino]-1-propanosulfonico, acido metacnlico de metil eter de poli(etilenglicol) y polietilenglicol. Preferiblemente, se usan uno o mas de Triton X-100, desoxicolato de sodio y dodecilsulfonato de sodio. La concentracion de Triton X-100 en la solucion puede ser de entre el 0,05-1,0% (p/v), la concentracion de desoxicolato de sodio puede ser de entre el 0,1-1,0% (p/v) y la concentracion de dodecilsulfonato de sodio puede ser de entre el 0,05-1,0% (p/v).

En la solucion de remojo usada en los ejemplos de la presente invencion pueden usarse inhibidores de proteasa, tales como fluoruro de fenilmetilsulfonilo y/o N-etilmaleimida, según se requiera para impedir que la proteasa liberada tras la lisis celular dane el material de la matriz de tejido.

En algunas realizaciones, cuando se somete a pretratamiento el material del tejido y organo del animal en la etapa (1), el material del tejido puede remojarse en la solucion de remojo a la temperatura de 5-42°C y entonces agitarse. El volumen de la solucion usada es generalmente 1-10 veces mayor que el peso del material del tejido. El tiempo de pretratamiento es generalmente de entre 6-48 horas. Mientras tanto, puede ajustarse apropiadamente dependiendo de la temperatura de tratamiento, el tipo del material del tejido, el numero de las bacterias presentes y la razon de volumen con respecto a peso.

El metodo para desinfeccion y esterilizacion de los ejemplos de la presente invencion comprende ademas lavar completamente el material del tejido tras remojarse para desinfeccion y esterilizacion. En algunas realizaciones, la etapa (2) puede realizarse con una solucion de limpieza neutra, que es agua pura, una solucion salina normal o una solucion de tampon biologica que se obtiene mediante filtracion esteril, tal como 10 mM de acido hidroxietilpiperazinetanosulfonico. El metodo espedficos es lavar el material del tejido con agua pura, una solucion salina normal o una solucion de tampon biologica 2 -5 veces, cada vez durante 1-3 horas.

En el metodo para desinfeccion y esterilizacion de los ejemplos de la presente invencion, tras lavarse completamente con la solucion de limpieza neutra, se requiere adicionalmente que el material del tejido se lave con una solucion de limpieza acida debil. La solucion de limpieza acida debil en la etapa (3) es una solucion salina normal o una solucion de tampon de 2-20 mM de acido hidroxietilpiperazinetanosulfonico, que se obtiene ajustando el pH a 5,0~6,0 con acido acetico, acetato de sodio o acido clorhndrico y mediante filtracion esteril. El metodo espedfico es lavar el material del tejido con la solucion de limpieza acida debil 2~5 veces, cada vez durante 1~3 horas.

La matriz de tejido lavada de los ejemplos de la presente invencion se pone en una solucion de conservacion neutra para crioconservarse o liofilizarse. La solucion neutra en la etapa (4) es una solucion de tampon de 2~20 mM de acido hidroxietilpiperazinetanosulfonico u otra solucion de tampon biologica compatible, con un pH de entre 7,0~8,0. Cuando se lleva a cabo el metodo de los ejemplos de la presente invencion, tras eliminar la solucion de remojo para el material del tejido, tambien puede anadirse un antibiotico adecuado en la solucion de limpieza posterior, tal como una solucion que contiene 100 mg de gentamicina por litro. El material del tejido puede conservarse temporalmente a 5~10ºC en la solucion a la que se anade un antibiotico.

Se da a conocer una solucion de remojo para un tejido animal para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal, que contiene el 0,01-0,2% (p/v) de peróxido de metal y el 0,05-1,0% (p/v) de detergente, y el pH de la solucion esta preferiblemente entre 9,0-12,0, mas preferiblemente entre 9,5-11,5. El peróxido de metal se selecciona de uno o mas del grupo que consiste en peróxido de calcio, peróxido de magnesio, peróxido de sodio o peróxido de bario, y el detergente se selecciona de uno o mas del grupo que consiste en Triton X-100, desoxicolato de sodio o dodecilsulfonato de sodio.

Se da a conocer una matriz de tejido animal fabricada mediante desinfeccion y esterilizacion de un material de un tejido anim seaglún el metodo descrito anteriormente.

Con respecto a los problemas presentes en la desinfeccion, esterilizacion e inactivacion de virus de una materia prima en diversas tecnologfas de fabricacion de la tecnica anterior, los ejemplos de la presente invencion proporcionan un metodo para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal y una solucion de remojo correspondiente para un tejido animal, y se da a conocer una matriz de tejido animal obtenida mediante este metodo.

Usando este metodo y esta solucion, puede reducirse el numero de bacterias en el material del tejido animal fabricado en al menos 106, sin danar la estructura de andamiaje basica, los componentes bioqmmicos principales y las propiedades biomecanicas del material de la matriz extracelular del tejido original del animal. Mientras tanto, una baja concentracion de detergente que no puede provocar desnaturalizacion de protemas se usa en combinacion con los ejemplos de la presente invencion, para facilitar la lisis y rotura de las celulas animales, y liberar componentes organicos intracelulares, pudiendo de ese modo eliminar algunos componentes de la celula animal del tejido durante los procesos de remojo y lavado. Ademas, el metodo para desinfeccion y esterilizacion de los ejemplos de la presente invencion es seguro, ecologico y protege el medio ambiente, no esta relacionado con el uso de sustancias qmmicas toxicas y tampoco deja sustancias qmmicas residuales en el andamio de la matriz de tejido.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Diagramas del efecto de desinfeccion y esterilizacion de piel porcina con una solucion de peróxido de calcio al 0,1%;

Diagrama izquierdo: control;

Diagrama derecho: para el material tratado con una solucion de peróxido de calcio durante 24 horas, no se observa ninguna bacteria mediante deteccion.

Figura 2: El termograma calorimetrico de barrido diferencial de la matriz dermica porcina tratada con solucion de peróxido de calcio al 0,1% (pH inicial, 11,6).

Figura 3: Imbibicion del material dermico de piel porcina en las soluciones con diferente pH (figura A) y termograma calorimetrico de barrido diferencial de la matriz de tejido tratada con las soluciones de diferente pH para desinfeccion y esterilizacion (figura B).

Figura 4: Histologfa de tincion con HE de secciones de tejido de matriz de tejido dermico acelular porcino pretratada con una solucion de pH alto (12,2) para desinfeccion y esterilizacion;

A: tejido dermico porcino sin tratar;

B: el material de la matriz de tejido tras un tratamiento de desinfeccion y esterilizacion y descelularizacion.

Figura 5: El termograma calorimetrico de barrido diferencial de los andamios de matriz de tejido danados mediante varios metodos para desinfeccion y esterilizacion.

Figura 6: Micrograffas electronicas de barrido de la estructura de la matriz de tejido cambiada mediante varios metodos para desinfeccion y esterilizacion.

A: una solucion de tampon fosfato para control;

B: hidróxido de sodio 1 N (1 hora);

C: acido peracetico al 0,2% (2 horas);

D: peróxido de hidrógeno al 3,0% (2 horas).

Descripcion detallada de realizaciones

La presente invencion se ilustra a continuacion adicionalmente en detalle a modo de ejemplos en el presente documento.

Ejemplo 1: Desinfeccion y esterilizacion de un material de un tejido animal y efecto sobre la descelularizacion del mismo

Se sacrificaron cuatro cerdos de 9 meses de edad y en primer lugar se depilaron. Se recogio una piel porcina nueva con un grosor de 1~2 mm (sin grasa subcutanea) de cada animal. Se corto la dermis porcina en trozos pequenos con una longitud de 3 cm y una anchura de 3 cm, y se pusieron en una botella de plastico de 250 ml. Se prepararon cuatro botellas para cada lote de animales y se pusieron 20 g del material dermico porcino en cada botella. Entre las 4 botellas anteriores, a cada una de dos botellas se les anadieron 125 ml de solucion de tampon fosfato (pH inicial, 7,5) que sirve para control, a una de las otras dos botellas 125 ml de solucion de peróxido de calcio al 0,1% (pH inicial, 11,6) y a otra de las otras dos botellas se le anadieron 125 ml de una solucion (pH inicial, 11,6) de peróxido de calcio al 0,1% y Triton X-100 al 0,1%. Tras agitarse y remojarse durante 1 hora, se uso una botella con solucion de tampon fosfato para control para determinar el numero inicial de bacterias viables. Despues de que la solucion de prueba se diluyera diferentes veces (10, 1000 y 1000000 veces), se filtraron y se lavaron por separado 100 pL de muestras diluidas diferentes veces, los filtros se incubaron en agar nutriente/medio de caldo durante 24 horas (a 37°C), y entonces se conto el numero de bacterias viables. Todas las botellas de prueba se lavaron en un agitador rotatorio (50 revoluciones por minuto) durante la noche durante 24 horas. El efecto de desinfeccion y esterilizacion de la materia prima del tejido se midio mediante la determinacion del numero de bacterias viables. Los resultados mostraron que el numero inicial de bacterias viables en la botella era en promedio 108,7 (±0,1, N=4); en la solucion de tampon fosfato para control, after 24 horas, el numero de bacterias viables aumento 245 veces, en promedio 1011,1 (±0,1, N=4); y en la solucion de peróxido de calcio no se detecto ninguna bacteria viable, vease la Figura 1 para detalles.

El tejido de piel porcina que se habfa pretratado con una solucion de peróxido de calcio al 0,1% y Triton X-100 al 0,1% se trato adicionalmente mediante descelularizacion, para evaluar el efecto del pretratamiento de desinfeccion y esterilizacion sobre los procesos posteriores. Tras lavarse con una solucion salina normal esteril (cloruro de sodio al 0,9%) dos veces, se anadio el tejido de piel porcina a 100 ml de desoxicolato de sodio al 0,5% (disuelto en una solucion de tampon de acido hidroxietilpiperazinetanosulfonico 5 mM, pH 8,0). Tras descelularizarse remojando durante 22 horas, se lavo el tejido de piel porcina con una solucion salina normal esteril cinco veces, cada vez durante 2 horas. Se analizo el efecto del pretratamiento de desinfeccion y esterilizacion sobre la matriz de tejido usando un calonmetro de barrido diferencial. Se realizo al analisis en una solucion de tampon fosfato (pH=7,5) usando un calonmetro de barrido diferencial y se aumento la temperatura desde 2°C hasta 125°C a una tasa de aumento de temperatura de 2°C por minuto. La temperatura inicio de la desnaturalizacion de la matriz de tejido de piel porcina nueva sin tratar era 60,5±0,3°C, con un valor de entalpfa de 65,2±1,4 J/g (N=3). La temperatura de inicio de la desnaturalizacion de la matriz de tejido pretratada era 61,9±0,2°C, con un valor de entalpfa de 62,3± 1,1 J/g (N=3). Los resultados de determinacion indicaron que no se danaba nada de matriz de tejido dermico mediante el pretratamiento de desinfeccion y esterilizacion de los ejemplos de la presente invencion, en comparacion con la dermis porcina nueva, vease la Figura 2 para detalles.

Ejemplo 2: Desinfeccion y esterilizacion de un material de un tejido animal

Se sacrifico un cerdo de seis meses de edad, se trato mediante limpieza de superficie y se depilo. Se corto piel porcina nueva y se raspo grasa subcutanea de la misma (2-3 mm de grosor). La materia prima recogida de la piel porcina se almaceno temporalmente en un entorno de 5-10°C. Se corto la dermis porcina en trozos grandes con una longitud de aproximadamente 30 cm y una anchura de aproximadamente 30 cm, y se pusieron en una solucion de carbonato de sodio al 2% Triton X-100 al 0,2% (ajustandose el pH inicial a 12,0-12,2 con una solucion concentrada saturada de peróxido de calcio), con cada 400 g de la materia prima de la piel porcina en 1 litro de la solucion. Se lavo la muestra en un agitador rotatorio (90 revoluciones por minuto) durante la noche (16-24 horas). Tras eliminar la solucion de remojo, se enjuago con agua pura que contiene 100 mg de gentamicina por litro en un entorno aseptico, y entonces se lavo adicionalmente dos veces tras ajustar el pH a 5,0-6,0 con acido clorhudrico 1 N.

Se lavo adicionalmente de nuevo dos veces tras ajustar el pH a 7,0-8,0 con acido clorhndrico 1 N, completando de ese modo el pretratamiento de desinfeccion y esterilizacion de la materia prima del tejido.

Ejemplo 3: Desinfeccion y esterilizacion de un material de un tejido animal y efecto sobre un tejido matriz del mismo

Se sacrifico un cerdo de seis meses, se trato mediante limpieza de superficie y se depilo. Se corto piel porcina nueva y se raspo grasa subcutanea de la misma. La materia prima recogida de la piel porcina se almaceno temporalmente en un entorno de 5-10°C. Se corto la dermis porcina en trozos grandes con una longitud de aproximadamente 30 cm y una anchura de aproximadamente 30 cm, y se pusieron en una solucion de carbonato de sodio al 0,5% Triton X-100 al 0,1% (se ajusto el pH inicial a 11,0 con una solucion saturada de peróxido de calcio), con cada 100 g de la materia prima de la piel porcina en 1 litro de la solucion. Se lavo la muestra en un agitador rotatorio (60 revoluciones por minuto) durante la noche (16-24 horas). Tras eliminar la solucion de remojo, se lavo con agua pura que contiene 100 mg de gentamicina por litro, y entonces se ajusto el pH a 7,0-8,0 con acido acetico 0,2 M, completando de ese modo el pretratamiento de desinfeccion y esterilizacion de la materia prima del tejido. Se analizo el efecto de pretratamiento sobre la matriz de tejido usando un calonmetro de barrido diferencial, se realizo el analisis en una solucion de tampon fosfato (pH=7,5) usando un calonmetro de barrido diferencial y se aumento la temperatura desde 2°C hasta 125°C a una tasa de aumento de temperatura de 2°C por minuto. La temperatura inicial de desnaturalizacion de la matriz de tejido de piel porcina nueva sin tratar era 60,5±0,3°C, con un valor de entalpfa de 65,2±1,4 J/g (N=3). La temperatura inicial de desnaturalizacion de la matriz de tejido pretratada era 61,9±0,4°C, con un valor de entalpfa de 66,7±1,5 J/g (N=3). Los resultados de determinacion indicaron que no se danaba nada de matriz de tejido dermico mediante el pretratamiento de desinfeccion y esterilizacion de los ejemplos de la presente invencion, en comparacion con la dermis porcina nueva.

Ejemplo 4: Un pH adecuado de una solucion de remojo para desinfeccion y esterilizacion de un tejido animal - ejemplo comparativo

La solucion de desinfeccion y esterilizacion se hana reaccionar con la materia prima de la piel porcina. Tras anadir el material de piel porcina nueva, se redujo significativamente el pH. En este ejemplo se determino un pH adecuado de solucion de peróxido de calcio. En esta prueba, se puso la piel porcina nueva con un grosor de 1~2 mm en una solucion de bicarbonato de sodio (1%) y peróxido de calcio (0,1%), cuyo pH se ajusto previamente a diferentes valores con hidróxido de sodio, y se evaluaron los cambios del tejido durante el pretratamiento a partir de la imbibicion de la materia prima. Tras lavarse con una solucion salina normal esteril (cloruro de sodio al 0,9%), se anadio adicionalmente el tejido de piel porcina pretratado en desoxicolato de sodio al 0,5% (disuelto en una solucion de tampon de acido hidroxietilpiperazinetanosulfonico 5 mM, pH 8,0), se descelularizo remojando durante la noche. La matriz de tejido descelularizado se lavo con una solucion salina normal esteril cinco veces, cada vez durante 2 horas. El analisis calorimetrico de barrido diferencial indico que cuando el pH era mayor de 11,5, se aumentaba significativamente la imbibicion de la piel porcina, la matriz de tejido se cambiana de manera irreversible y la matriz de tejido parecfa ser inestable, vease la Figura 3 para detalles. El estudio de la histologfa del tejido tambien mostro que cuando el pH era de mas de 11,5, se danaba la estructura de la matriz de tejido, vease la Figura 4 para detalles. Ademas, durante la aplicacion practica, que el pH de la solucion provoque el cambio irreversible de la matriz de tejido o no puede depender adicionalmente de factores tales como el tiempo de tratamiento y la razon en volumen de la matriz de tejido con respecto a la solucion.

Ejemplo 5: Dano de un material de la matriz de tejido provocado por los metodos existentes para desinfeccion y esterilizacion - ejemplo comparativo

Para comparar el dano del material de la matriz de tejido provocado por los metodos existentes para desinfeccion y esterilizacion, en la prueba de este ejemplo, se pusieron pieles porcinas nuevas con un grosor de aproximadamente 1 mm en varias clases de diferentes soluciones, incluyendo hipoclorito de sodio al 0,2% (2 horas), acido peracetico al 0,2% (2 horas), peróxido de hidrógeno al 3,0% (2 horas), solucion de yodo al 7,5% (2 horas), hidróxido de sodio 1 N (1 hora) y solucion de tampon fosfato para control (pH, 7,5). Tras tratarse en estas soluciones, los tejidos de piel porcina se lavaron completamente con una solucion de tampon fosfato (5 veces, cada vez durante dos horas). Los resultados de analisis obtenidos mediante un calonmetro de barrido diferencial indicaron que estos metodos usados comunmente para el tratamiento de desinfeccion y esterilizacion teman diferentes grados de dano sobre la matriz de tejido, particularmente hidróxido de sodio, hipoclorito de sodio y solucion de yodo, vease la Figura 5 para detalles. Algunos cambios de la estructura de la matriz de tejido pudieron observarse claramente en micrograffas electronicas de barrido, vease la Figura 6 para detalles. Sin embargo, a diferencia de estos metodos existentes para desinfeccion y esterilizacion, un óxido de metal hidratado o peróxido de metal usado en combinacion con una baja concentracion de un detergente a un pH adecuado (por ejemplo, 8,5-12,5, alternativamente, 10,0-11,5) en los ejemplos de la presente invencion, no dano la estructura de andamiaje basica, los componentes bioqmmicos principales y las propiedades biomecanicas del material de la matriz extracelular del tejido original del animal.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un metodo para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal, que comprende las etapas de:

(1) poner el material del tejido animal en una solucion de remojo alcalina que contiene un peróxido de metal y un detergente, y agitar;

(2) lavar el material del tejido animal obtenido en la etapa (1) con una solucion de limpieza neutra para eliminar los componentes organicos liberados de microorganismos y celulas de tejido animal durante el remojo;

(3) lavar la matriz de tejido obtenida en la etapa (2) con una solucion de limpieza debilmente acida que tiene un pH de 5,0~6,0;

(4) crioconservar o liofilizar la matriz de tejido obtenida en la etapa (3) en una solucion neutra;

en el que la solucion de remojo en la etapa (1) contiene el 0,01-0,2% p/v del peróxido de metal y el 0,05-1,0% p/v del detergente, y el pH de la solucion de remojo esta entre 8,5-11,5.

2. - El metodo seg lúan reivindicac 1ió,n en el que el pH de la solucion de remojo en la etapa (1) esta entre 9,5-11,5, el peróxido de metal es peróxido de calcio, peróxido de magnesio, peróxido de sodio o peróxido de bario, y el detergente es Triton X-100, desoxicolato de sodio o dodecilsulfonato de sodio.

3. - El metodo segú lan reivindicac 1ió,n en el que la solucion de remojo comprende ademas un inhibidor de proteasa que se selecciona de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y N-etilmaleimida.

4. - El metodo segú unna cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el metodo espedfico en la etapa (1) es remojar cada kilogramo del material del tejido animal en 2 -8 litros de la solucion de remojo a la temperatura de 5-42°C durante 6-48 horas, y agitar durante el remojo.

5. - El metodo segú lan reivindicació 1,n en el que la solucion de limpieza neutra en la etapa (2) es agua pura, una solucion salina normal o una solucion de tampon biologica que se obtiene mediante filtracion esteril.

6. - El metodo segú lna reivindicació 1n o 5, en el que el material del tejido animal en la etapa (2) se lava con la solucion de limpieza neutra 2-5 veces, cada vez durante 1-3 horas.

7. - El metodo segú lan reivindicació 1,n en el que la solucion de limpieza debilmente acida en la etapa (3) es una solucion salina normal o una solucion de tampon de 2-20 mM de acido hidroxietilpiperazinetanosulfonico, que se obtiene ajustando el pH a 5,0-6,0 con acido acetico, acetato de sodio o acido clortudrico y mediante filtracion esteril.

8. - El metodo segú lan reivindicació 1n o 7, en el que la matriz de tejido en la etapa (3) se lava con la solucion de limpieza debilmente acida 2 -5 veces, cada vez durante 1-3 horas.

9. - El metodo segú lan reivindicació 1,n en el que la solucion neutra en la etapa (4) es una solucion de tampon de 2-20 mM de acido hidroxietilpiperazinetanosulfonico con un pH de entre 7,0-8,0.

10. - Uso de una solucion de remojo que comprende el 0,01-0,2% p/v de un peróxido de metal y el 0,05-1,0% p/v de un detergente, y el pH de la solucion esta entre 8,5-11,5, alternativamente entre 9,0-11,5 para desinfectar y esterilizar un material de un tejido animal.

11. - El uso según la reivindicació 10n, en el que el peróxido de metal es peróxido de calcio, peróxido de magnesio, peróxido de sodio o peróxido de bario, el detergente es Triton X-100, desoxicolato de sodio o dodecilsulfonato de sodio, y el pH de la solucion esta entre 9,5-11,5.

12. - El uso segú lna reivindicac 1ió1n, en el que el peróxido de metal es peróxido de calcio.