WO2015027728A1 - 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液 - Google Patents

一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液 Download PDF

Info

Publication number
WO2015027728A1
WO2015027728A1 PCT/CN2014/078739 CN2014078739W WO2015027728A1 WO 2015027728 A1 WO2015027728 A1 WO 2015027728A1 CN 2014078739 W CN2014078739 W CN 2014078739W WO 2015027728 A1 WO2015027728 A1 WO 2015027728A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tissue
solution
peroxide
animal tissue
sodium
Prior art date
Application number
PCT/CN2014/078739
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
刘志刚
刘新华
Original Assignee
北京瑞健高科生物科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 北京瑞健高科生物科技有限公司 filed Critical 北京瑞健高科生物科技有限公司
Priority to JP2016537094A priority Critical patent/JP6253780B2/ja
Priority to EP14839546.0A priority patent/EP3025734B1/en
Priority to US14/914,298 priority patent/US10701928B2/en
Priority to ES14839546T priority patent/ES2714707T3/es
Priority to PL14839546T priority patent/PL3025734T3/pl
Publication of WO2015027728A1 publication Critical patent/WO2015027728A1/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts

Definitions

  • the invention relates to the technical field of biological tissue processing and tissue matrix material preparation, and particularly relates to a method for disinfecting and sterilizing animal tissue materials and a corresponding animal tissue soaking solution. Background technique
  • tissue and organ matrices have been used in human tissue repair, various tissue engineering trials, and regenerative medical research.
  • the human body and the extracellular matrix of many animal tissues and organs have great similarities and homology.
  • Biomatrix materials made from allogeneic or xenogeneic tissue and organ decellularization have been successfully used for clinical medical repair and repair of human tissues.
  • Good tissue organ matrix, after implantation in the host, the matrix scaffolding material provides initial biomechanical support, regulating cell behavior by interacting with host cells
  • tissue matrix itself gradually transforms into new tissue.
  • tissue organ matrix of the existing three-dimensional framework structure After removing the original cellular components of animal tissues and organs, it is also possible to combine human cells in vitro to re-cellularize and functionalize the tissue organ matrix of the existing three-dimensional framework structure to produce tissues and organs that can be transplanted into the human body.
  • the tissue organ matrix is a three-dimensional framework composed of various complex structural proteins and functional proteins, and contains many other complexes that are active.
  • the main components include collagen fibers, glycoproteins, sticky proteins, etc.
  • Other ingredients include sugars such as aminodextran (hyaluronic acid, chondroitin sulfate), some lipids and growth factors.
  • the biological process for preparing tissue and organ matrix is very complex, including the process of tissue organ harvesting, storage, cleaning, disinfection, decellularization, antigenicity reduction, virus inactivation and terminal sterilization. The disinfection and sterilization of animal tissues greatly damages the tissue and substrate matrix.
  • the first is physical methods, which reduce the number of bacteria and fungi by washing and dilution, and operate in a sterile environment to prevent re-infection; Microbial growth inhibitors and antibiotics are added to the preparation solution; third, a special sterilization step is added to the preparation process to control the amount of bacteria; and fourth, the product terminal is sterilized.
  • the present invention is directed to the above-discussed deficiencies in the prior art.
  • the present invention provides a method of disinfecting and sterilizing an animal tissue material, comprising the steps of:
  • the animal tissue material is shaken in an alkaline soaking solution containing a metal peroxide and a detergent;
  • the animal tissue soaking solution in the step (1) contains 0.01 to 0.2% (w/v) of metal peroxide and 0.05 to 1.0% (w/v) of detergent, solution pH. Between 9.0 and 12.0.
  • the metal peroxide is preferably calcium peroxide, magnesium peroxide, sodium peroxide or barium peroxide, and the detergent is preferably polyethylene glycol octylphenyl ether, sodium deoxycholate or sodium dodecyl sulfate.
  • the metal peroxide uses a low concentration or supersaturated aqueous solution of calcium peroxide, which is generally present in an amount between 0.01 and 0.2% (w/v).
  • the actual amount of calcium peroxide in the application may be adjusted according to the volume of the solution and the ratio of the original tissue material of the animal, for example, 0.01%, 0.02%, 0.03%, etc., to any concentration within the range of 0.2%.
  • the metal peroxide which can be used in the present invention includes, in addition to calcium peroxide, other metal peroxides such as sodium peroxide, magnesium peroxide, and barium peroxide.
  • the aqueous solution of calcium peroxide or other metal peroxide used in the present invention may use sodium carbonate or carbon.
  • the solution of sodium hydrogen hydride, sodium hydroxide, acetic acid, hydrochloric acid or the like is adjusted to an initial pH of between 8.5 and 12.5, preferably between 9.0 and 12.0, more preferably between 9.5 and 11.5.
  • the final sodium carbonate and sodium bicarbonate content can be between 0.01 and 2.0%, and the sodium hydroxide content can be between 1.0 and 100 mM.
  • the content of sodium carbonate and sodium hydrogencarbonate is between 0.5 and 1.0%, and the content of sodium hydroxide is between 5 and 10 mM.
  • the content of each component in practical applications may vary depending on the volume of the solution and the ratio of the original tissue material of the animal.
  • the metal peroxides of the present invention can be used in combination with low concentrations of detergents or detergents which do not cause denaturation of tissue matrix proteins.
  • a wide variety of detergents or detergents are suitable for this application purpose, including ionic surfactants and nonionic surfactants. Commonly used are polyethylene glycol octyl phenyl ether, sodium deoxycholate, sodium lauryl sulphate, sodium salt of fatty acid, 3-[(3-cholesterylaminopropyl) decylamino] -1- propyl Sulfonic acid, poly(ethylene glycol) mercaptoether acryl acid, and polyethylene glycol.
  • polyethylene glycol octyl phenyl ether Preference is given to polyethylene glycol octyl phenyl ether, sodium deoxycholate or sodium dodecyl sulfonate.
  • concentration of polyethylene glycol octylphenyl ether in the solution may be between 0.05 and 1.0% (w/v)
  • concentration of sodium deoxycholate may be between 0.1 and 1.0% (w/v)
  • dodecane dodecane.
  • concentration of sodium sulphate can be between 0.05 and 1.0% (w/v).
  • protease inhibitors such as phenylsulfonyl fluoride and N-ethylmaleimide may be added as needed to prevent the protease released after cell lysis from damaging the tissue matrix material.
  • step 1 may be carried out at 5 to 42 degrees Celsius when the animal tissue material is pretreated, and the tissue material is immersed in the treatment solution and shaken.
  • the volume of the solution used is typically 1 to 10 times the weight of the tissue material.
  • the pretreatment time is generally 6 to 48 hours. At the same time, it can be appropriately adjusted according to the treatment temperature, the type of tissue material, the number of bacteria, and the volume to weight ratio.
  • step 2 further comprises thoroughly washing the tissue material after sterilization and sterilization.
  • step 2 can be carried out using a neutral cleaning solution which is sterile filtered pure water, physiological saline or biological buffer such as 10 mM hydroxyethylpiperazine. acid.
  • the tissue material is immersed in pure water, physiological saline and biological buffer for 2 to 5 times, each time for 1 to 3 hours.
  • the sterilization and sterilization method of the present invention also requires the use of a slightly acidic cleaning solution to clean the tissue material.
  • the slightly acidic cleaning solution in step 3 is a physiological saline solution or a 2-20 mM hydroxyethylpiperazine ethyl sulphate sulphate buffer adjusted to a pH of 5.0 to 6.0 with acetic acid, sodium acetate or hydrochloric acid.
  • the specific method is to dip the tissue material with a slightly acidic treatment solution for 2 to 5 times, each time for 1 to 3 hours.
  • the washed tissue material of the present invention is placed in a neutral preservation solution for cryopreservation or lyophilization.
  • the neutral preservation solution in 4 is 2-20 mM hydroxyethylpiperazine ethionate buffer or other compatible biological buffer with a pH between 7.0 and 8.0.
  • an appropriate antibiotic may be added to the final cleaning solution, such as 100 mg of gentamicin per liter.
  • tissue material can be stored briefly at 5-10 degrees Celsius.
  • Another aspect of the invention also relates to an animal tissue soaking solution for disinfecting animal tissue material, comprising 0.01 to 0.2% (w/v) of metal peroxide and 0.05 to 1.0% (w/v).
  • the detergent, the pH of the solution is preferably between 9.0 and 12.0, more preferably between 9.5 and 11.5.
  • the metal peroxide is preferably calcium peroxide, magnesium peroxide, sodium peroxide or barium peroxide, and the detergent is preferably polyethylene glycol octylphenyl ether, sodium deoxycholate or sodium dodecyl sulfate.
  • the invention aims at the problems of disinfection, sterilization and virus inactivation of raw materials in various existing preparation techniques, and provides a method for disinfecting and sterilizing animal tissue materials and a corresponding animal tissue soaking solution.
  • the prepared animal tissue material can reduce the number of bacteria 10 to the sixth power without destroying the basic scaffold structure, main biochemical composition and biomechanical properties of the original tissue of the animal extracellular matrix material.
  • the present invention also combines the use of a low-concentration detergent which does not cause protein denaturation, which causes the animal cells to lyse, break, and release intracellular organic components, thereby removing some of the animal cell components in the tissue during soaking and washing.
  • the sterilization and sterilization method of the present invention is safe and environmentally friendly, does not involve the use of toxic chemicals, and does not leave chemical residues in the tissue matrix scaffold.
  • Figure 1 Effect of disinfection of pig skin with 0.1% calcium peroxide solution.
  • FIG 3 Differential scanning calorimetry analysis of the tissue of the pigskin dermis in different pH solutions ( Figure A) and the pH of the disinfectant solution on the tissue matrix ( Figure B).
  • Figure 4 HE staining of tissue sections of porcine acellular dermal tissue matrix with high pH (12.2) solution sterilization and pretreatment.
  • A porcine dermal tissue before treatment;
  • Figure 5 Differential scanning calorimetry analysis of several tissue sterilization methods for tissue matrix scaffold damage.
  • Figure 6 Scanning electron micrograph of changes in tissue matrix structure by several methods of sterilization.
  • A phosphate buffer control
  • Example 1 Sterilization of animal tissue material and its effect on decellularization
  • Pig skin group pretreated with 0.1% calcium peroxide and 0.1% polyethylene glycol octyl phenyl ether solution was used to evaluate the effects of disinfection and sterilization pretreatment on subsequent processing.
  • the effects of disinfection and sterilization pretreatment on tissue matrix were analyzed by differential scanning calorimetry.
  • Example 3 Sterilization of animal tissue material and its effect on tissue matrix
  • the temperature is raised from 2 degrees Celsius to 125 degrees Celsius, and the heating rate is 2 degrees Celsius per minute.
  • the results of the measurements indicate that the disinfection and sterilization pretreatment of the present invention does not damage the dermal tissue matrix as compared to fresh pig dermis.
  • Example 4 Determining the appropriate pH of the animal tissue soaking solution during sterilization
  • the disinfecting and sterilizing solution reacts with the raw material of the pig skin. After adding fresh pigskin material, the pH is significantly reduced.
  • This example determines the pH of a suitable calcium peroxide solution.
  • fresh pig skin of 1 ⁇ 2 mm thick was placed in a solution of sodium bicarbonate (1%) and calcium peroxide (0.1%) adjusted with different sodium hydroxide in advance, and the tissue was evaluated from the raw material. Changes in pretreatment.
  • the pretreated porcine skin tissue was washed with sterile physiological saline (0.9% sodium chloride), then 0.5% sodium deoxycholate (dissolved in 5 mM hydroxyethylpiperazine ethyl sulphate buffer, pH 8.0 ) overnight decellularized soaking treatment.
  • the decellularized tissue matrix was washed five times with sterile physiological saline for 2 hours each time.
  • Differential scanning calorimetry analysis showed that when the pH was greater than 11.5, the pigskins increased significantly, the tissue matrix changed irreversibly, and the tissue matrix showed instability. See Figure 3 for details.
  • Tissue section studies also showed that the matrix structure of the tissue was destroyed when the pH was greater than 11.5, as shown in Figure 4.
  • Example 5 Damage to tissue matrix material by existing sterilization methods
  • this example puts about 1 mm thick fresh pig skin into several different solutions in the test, including 0.2% sodium hypochlorite (2 hours). ), 0.2% peracetic acid (2 hours), 3.0% hydrogen peroxide (2 hours), 7.5% iodine solution (2 hours), 1N sodium hydroxide (1 hour) and phosphate buffer control (pH, 7.5). After treatment in these solutions, the pigskin tissue was thoroughly washed with phosphate buffer (5 times, two hours each time). Differential scanning calorimetry analysis showed that these common sterilization methods have different degrees of damage to the tissue matrix, especially sodium hydroxide, sodium hypochlorite and iodine solution. See Figure 5 for details.

Abstract

一种动物组织材料的消毒灭菌方法及相应的动物组织浸泡溶液。该方法包括将动物组织材料放在碱性的含有金属过氧化物和洗涤剂的浸泡溶液中摇动；用中性清洗液洗净在浸泡过程中释放的微生物和动物组织细胞的有机成分；用微酸性清洗液洗净组织基质；在中性溶液中低温保存或冻干保存组织基质。动物组织浸泡溶液含有0.01〜0.2%(w/v)的金属过氧化物和0.05〜1.0%(w/v)的洗涤剂。经该方法预处理的动物组织，有利于组织的保存和进一步脱细胞处理，制备成完整的组织基质支架材料。

Description

说 明 书 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液 技术领域
本发明涉及生物组织处理和组织基质材料制备技术领域， 具体涉及一种动 物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液。 背景技术
脱细胞的组织器官基质已应用于人体组织修复、 各种组织工程试验和再生 医学研究。人体和许多动物组织及器官的细胞外基质有极大的相似性和同源性。 由同种异体或异种异体组织器官脱细胞制成的生物基质材料， 已经成功地用于 人体组织临床医学修补和修复。 良好的组织器官基质， 在植入宿主后， 基质支 架材料提供初始的生物力学支持， 通过与宿主细胞相互作用来调节细胞的行为
(如粘附， 迁移， 增殖和分化）， 随着宿主细胞的长入， 组织器官基质本身逐步 转化成新组织。
除去动物组织器官的原有细胞成分后， 也可在体外结合人体细胞， 使已有 三维框架结构的组织器官基质再次细胞化和功能化， 生产可移植到人体的组织 及器官。
组织器官基质是由各种复杂的结构蛋白质和功能蛋白质构成的三维立体框 架， 并含有许多有活性的其他复合物。 主要成分包括胶原纤维、 糖蛋白、 黏蛋 白等， 其他成分有氨基葡聚糖（透明质酸、 硫酸软骨素）等糖类、 一些脂质和 生长因子。制备组织器官基质的生物工艺流程十分复杂，包括组织器官的釆集、 保存、 清洗、 消毒、 脱细胞、 降低抗原性、 病毒灭活和终端灭菌等过程。 其中 动物组织消毒灭菌处理对组织器官基质的破坏极大，在灭活细菌和病毒的同时， 严重地改变组织器官基质生物化学组成成分， 破环三维立体框架的超微结构和 降低生物力学性能。 这些改变影响宿主对植入基质材料的反应， 可能致使组织 基质产品临床效果变差， 难以达到人体组织修复的要求。
动物组织材料的消毒、 灭菌和病毒灭活的方法贯穿在整个组织基质支架制 备过程中的各工艺步骤中。 目前应用方法主要有以下几种。 一是物理方法， 通 过冲洗和稀释来减低细菌和真菌数量， 在无菌环境下操作防止再次感染； 二是 在制备溶液中添加微生物生长抑制剂和抗生素； 三是制备工艺流程中加上专门 的灭菌步骤， 控制菌量； 四是产品终端灭菌处理。 制备工艺流程中的灭菌方法 有的用化学氧化剂 （过氧乙酸、 次氯酸钠、 双氧水或碘溶液等）， 有的用酒精， 还有的用酸碱处理（醋酸、 盐酸、 氢氧化钠）。 实验结果表明这些常用消毒灭菌 处理方法都对组织基质有不同程度的破坏。 如何更有效的消毒、 灭菌和病毒灭 活， 而不会损坏细胞外组织基质原有的基本结构、 不改变主要生物化学成分和 生物力学性能，是组织工程科学和生物材料科学领域还需深入研究的课题之一。 发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷， 本发明一方面提供了一种动物组 织材料的消毒灭菌方法， 其包括如下步骤：
1、将动物组织材料放在碱性的含有金属过氧化物和洗涤剂的浸泡溶液中摇 动；
2、用中性清洗液洗净在浸泡过程中释放的微生物和动物组织细胞的有机成 分；
3、 用微酸性清洗液洗净组织基质；
4、 在中性溶液中低温保存或冻干保存组织基质。
在本发明优选的实施方案中， 步骤（ 1 )中的动物组织浸泡溶液含有 0.01 ~ 0.2% ( w/v )的金属过氧化物和 0.05 ~ 1.0% ( w/v )的洗涤剂，溶液酸碱度在 9.0 ~ 12.0之间。 金属过氧化物优选过氧化钙、 过氧化镁、 过氧化钠或过氧化钡， 洗 涤剂优选聚乙二醇辛基苯基醚， 脱氧胆酸钠或十二烷基横酸钠。
过氧化钙， 又称二氧化钙， 在农业上用作种子及谷物的无毒性消毒剂； 在 食品、 化妆品等制造中用作添加剂； 在药物制造中用作高温氧化剂或增氧剂。 因此， 在本发明更加优选的实施方案中金属过氧化物使用低浓度或过饱和度的 过氧化钙碱性水溶液， 其一般含量在 0.01 ~ 0.2% ( w/v )之间。 实际应用中过 氧化钙的含量可根据溶液体积和动物原组织器官材料的比例加以调整， 例如 0.01%, 0.02%, 0.03%……， 直至 0.2%范围内的任何浓度。 此外， 可以在本发 明中使用的金属过氧化物， 除过氧化钙外， 也包括过氧化钠、 过氧化镁、 过氧 化钡等其它金属过氧化物。
本发明使用的过氧化钙或其它金属过氧化物水溶液， 可以使用碳酸钠、 碳 酸氢钠、 氢氧化钠、 乙酸、 盐酸等溶液调至初始酸碱度在 8.5 ~ 12.5之间， 优选 在 9.0 ~ 12.0之间， 更加优选在 9.5 ~ 11.5之间。 最终的碳酸钠和碳酸氢钠含量 可在 0.01 ~ 2.0%之间， 氢氧化钠含量可在 1.0 ~ lOOmM之间。 优选碳酸钠和碳 酸氢钠的含量可在 0.5 ~ 1.0%之间， 氢氧化钠的含量可在 5 ~ 10mM之间。 实际 应用中各成分含量可根据溶液体积和动物原组织器官材料的比例加以变化。
本发明中的金属过氧化物可以和不会引起组织基质蛋白质变性的低浓度的 洗涤剂或去污剂结合使用。 合适这一应用目的的洗涤剂或去污剂种类很多， 包 括离子表面活性剂和非离子型表面活性剂。 常用的有聚乙二醇辛基苯基醚， 脱 氧胆酸钠，十二烷基横酸钠，脂肪酸钠盐， 3-[ ( 3-胆固醇氨丙基）二曱基氨基] -1- 丙磺酸， 聚（乙烯二醇）曱基醚曱丙烯酰酸， 和聚乙二醇等。 优选聚乙二醇辛基 苯基醚， 脱氧胆酸钠或十二烷基磺酸钠。 溶液中聚乙二醇辛基苯基醚的浓度可 在 0.05 ~ 1.0% ( w/v )之间， 脱氧胆酸钠的浓度可在 0.1 ~ 1.0% ( w/v )之间， 十二烷基横酸钠的浓度可在 0.05 ~ 1.0% ( w/v )之间。
在本发明的消毒灭菌处理溶液中， 根据需要可加入蛋白酶抑制剂， 如苯曱 磺酰氟和 N-乙基马来酰亚胺，以防止细胞裂解后释放的蛋白酶破坏组织基质材 料。
在本发明优选的实施方案中， 步骤 1在预处理动物组织器官材料时， 可在 5 ~ 42摄氏度中进行， 组织材料浸泡在处理溶液中， 并加以摇动。 使用溶液的 体积一般为组织材料重量的 1 ~ 10倍。 预处理时间一般在 6 ~ 48小时。 同时， 可根据处理温度、 组织材料种类、 带菌数目和体积重量比等， 加以适当调整。
本发明的消毒灭菌方法还包括在消毒灭菌浸泡后， 对组织材料进行彻底清 洗。 在优选的实施方案中， 步骤 2可釆用中性清洗液进行， 中性清洗液是经过 无菌过滤的纯水、 生理盐水或生物緩冲液， 如 10mM羟乙基哌嗪乙石克横酸。 具 体方法为组织材料经纯水、 生理盐水和生物緩冲液浸洗 2 ~ 5次， 每次 1 ~ 3小 时。
本发明的消毒灭菌方法在彻底清洗后， 还需要釆用微酸性清洗液对组织材 料进行清洗。 步骤 3中的微酸性清洗液是用乙酸、 乙酸钠或盐酸把酸碱度调至 5.0 ~ 6.0之间并经过无菌过滤的生理盐水或 2 ~ 20mM羟乙基哌嗪乙硫横酸緩 冲液。 具体方法是釆用微酸性处理液浸洗组织材料 2 ~ 5次， 每次 1 ~ 3小时。
本发明洗净后的组织材料放入中性保存溶液中低温保存或冻干保存。 步骤 4中的中性保存溶液是酸碱度在 7.0 ~ 8.0之间的 2 ~ 20mM的羟乙基哌嗪乙硫横 酸緩冲液或其它兼容的生物緩冲液。
在实施本发明的方法时， 在清理组织浸泡溶液后， 在最后清洗溶液中也可 加入适当的抗生素，如每升含有 100毫克的庆大霉素。在加有抗生素的溶液中， 组织材料可在 5 ~ 10摄氏度短暂保存。
本发明另一方面还涉及一种用于对动物组织材料进行消毒灭菌的动物组织 浸泡溶液， 其含有 0.01 ~ 0.2% ( w/v )的金属过氧化物和 0.05 ~ 1.0% ( w/v ) 的 洗涤剂， 溶液酸碱度优选在 9.0 ~ 12.0之间， 更加优选在 9.5 ~ 11.5之间。 金属 过氧化物优选过氧化钙、 过氧化镁、 过氧化钠或过氧化钡， 洗涤剂优选聚乙二 醇辛基苯基醚， 脱氧胆酸钠或十二烷基磺酸钠。
本发明针对现有各种制备技术中原材料消毒、灭菌和病毒灭活存在的问题， 提供了一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液。 通过 釆用该方法和该溶液， 至少可以使制备的动物组织材料减少细菌数量 10 的 6 次方， 同时不破坏动物细胞外基质材料原有组织的基本支架结构、 主要生物化 学成分和生物力学性能。 同时， 本发明也结合使用不会引起蛋白质变性的低浓 度洗涤剂， 促使动物细胞裂解、 破碎， 释放细胞内有机成分， 从而在浸泡和清 洗过程中能够清除组织中的部分动物细胞成分。 此外， 本发明的消毒灭菌方法 安全绿色环保， 不涉及使用有毒化学物质， 也不在组织基质支架中留下化学残 留物质。 附图说明
图 1: 用 0.1%过氧化钙溶液对猪皮进行消毒灭菌的效果图。
左图： 对照；
右图： 过氧化钙溶液处理 24小时后的材料， 经检测未观察到细菌的存在。 图 2: 0.1%过氧化钙溶液（初始酸碱度， 11.6 )处理对猪真皮基质的差示 扫描量热仪分析图。
图 3: 猪皮真皮材料在不同酸碱度溶液中的吸涨（图 A )和消毒灭菌液酸 碱度对组织基质的差示扫描量热仪分析图 （图 B )。
图 4: 高酸碱度（12.2 )溶液消毒灭菌预处理对猪脱细胞真皮组织基质结构 的组织切片 HE染色图。 A: 未处理前的猪真皮组织；
B: 消毒灭菌和脱细胞处理后的组织基质材料。
图 5: 几种消毒灭菌方法对组织基质支架损伤的差示扫描量热仪分析图。 图 6: 几种消毒灭菌方法对组织基质结构改变的扫描电子显微图。
A: 磷酸緩冲液对照；
B: 1N氢氧化钠 （ 1小时）；
C: 0.2%过氧乙酸（2小时）；
D: 3.0%双氧水（2小时）。 具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明， 旨在用于说明本发明而非 限定本发明。 应当指出， 对于本领域技术人员而言， 在不脱离本发明原理的前 提下， 还可以对本发明进行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也同样落入本发 明的保护范围之内。 实施例 1 ： 动物組织材料的消毒灭菌及其对脱细胞的影响
将四头九个月大的普通生猪屠宰后，先去毛。从每头猪身上收取 1 ~ 2毫米 厚的新鲜猪皮 （无皮下脂肪）。 将猪真皮切成约 3 厘米见方的小块， 放入 250 毫升的塑料瓶中。 每猪 4瓶， 每瓶 20克猪真皮材料。 其中两瓶每瓶加入 125 毫升磷酸緩冲液（初始酸碱度， 7.5 )作为对照， 一瓶加入 125毫升 0.1%的过 氧化钙溶液（初始酸碱度， 11.6 )，另一瓶加入 125毫升 0.1%的过氧化钙和 0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚溶液（初始酸碱度， 11.6 )。 在摇动浸泡 1小时后， 一瓶磷 酸緩冲液对照用来测定初始的活菌数量。 100微升经不同稀释倍数溶液（10， 1000和 1000000倍）过虑清洗后， 在营养琼脂 /普通肉汤琼脂培养基中培养 24 小时（37摄氏度）后计算活菌数量。 所有试验瓶在回旋式摇床摇洗（50转 /分 钟）浸泡过夜 24小时。 组织原料消毒和灭菌的效果， 以测定活菌数量来衡量。 结果显示， 瓶中初始的活菌数量平均为 10的 8.7次方 （ ± 0.1， N=4 ); 在对照 的磷酸緩冲液中， 24小时后活菌数量增加了 245倍，平均为 10的 11.1次方（ 士 0.1 , N=4 ); 在过氧化钙溶液中， 没有测出活菌， 具体参见图 1。
对用 0.1%的过氧化钙和 0.1%聚乙二醇辛基苯基醚溶液预处理过的猪皮组 织， 进一步做了脱细胞处理， 用于评估消毒和灭菌预处理对后续加工的影响。 猪皮组织在用无菌生理盐水（ 0.9%氯化钠）清洗两次后， 加入 100毫升 0.5%脱 氧胆酸钠 （溶于 5mM羟乙基哌嗪乙硫横酸緩冲液中， 酸碱度 8.0 )。 脱细胞浸 泡 22小时后， 用无菌生理盐水清洗五次， 每次 2小时。 用差示扫描量热仪对消 毒和灭菌预处理对组织基质的影响进行了分析。 差示扫描量热仪分析在磷酸緩 冲液（pH=7.5 ) 中进行， 从 2摄氏度升温到 125摄氏度， 升温速度为每分钟 2 摄氏度。 未处理的新鲜猪皮组织基质的变性起点温度为 60.5 ± 0.3°C， 焓值为 65.2 ± 1.4焦耳 /克 （N=3 )。 预处理后组织基质的变性起点温度为 61.9 ± 0.2°C， 焓值为 62.3 ± 1.1焦耳 /克（N=3 )。 测定结果表明同新鲜猪真皮相比， 本发明的 消毒和灭菌预处理没有损伤真皮组织基质， 具体参见图 2。 实施例 2 ： 动物組织材料的消毒灭菌
将六个月大的普通生猪屠宰后， 经表面清洗和去毛。 切取新鲜猪皮， 并刮 除皮下脂肪 ( 2-3毫米厚）。 釆集到的猪皮原料暂时冷藏在 5-10°C环境中。 将猪 真皮切成约 30厘米见方的大块，放入 2%碳酸钠 +0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（用 饱和的过氧化钙浓液调初始酸碱度至 12.0 ~ 12.2 ) 的溶液中， 每 400克猪皮原 料用 1升溶液。 在回旋式摇床摇洗（90转 /分钟）浸泡过夜（ 16-24小时）。 清 理浸泡溶液后， 在无菌环境里用每升含有 100毫克庆大霉素的纯水冲洗后， 用 1N盐酸将酸碱度调低至 5.0-6.0之间， 进一步清洗两次。 再用 1N盐酸将酸碱 度调高至 7.0-8.0之间， 进一步清洗两次， 完成了组织原材料的消毒和灭菌预处 理。 实施例 3 ： 动物组织材料的消毒灭菌及其对組织基质的影响
将六个月大的普通生猪屠宰后， 经表面清洗和去毛。 切取新鲜猪皮， 并刮 除皮下脂肪。 釆集到的猪皮原料暂时冷藏在 5-10°C 环境中。 将猪真皮切成约 30厘米见方的大块， 放入 0.5%碳酸钠 +0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（用饱和的过 氧化钙浓液调初始酸碱度至 11.0 ) 的溶液中， 每 100克猪皮原料用 1升溶液。 在回旋式摇床摇洗（60转 /分钟）浸泡过夜（16-24小时）。 清理浸泡溶液后， 用每升含有 100毫克庆大霉素的纯水清洗，再用 0.2M醋酸将酸碱度调至 7.0-8.0 之间， 完成了对组织原料的消毒和灭菌预处理。 釆用差示扫描量热仪对预处理 对组织基质的影响进行了分析， 差示扫描量热仪分析在磷酸緩冲液（酸碱度，
7.5 ) 中进行， 从 2摄氏度升温到 125摄氏度， 升温速度为每分钟 2摄氏度。 未 处理的新鲜猪皮组织基质的变性起点温度为 60.5 ± 0.3°C， 焓值为 65.2 ± 1.4焦 耳 /克（N=3 )。 预处理后组织基质的变性起点温度为 61.9 ± 0.4°C， 焓值为 66.7 ± 1.5焦耳 /克（N=3 )。 测定结果表明同新鲜猪真皮相比， 本发明的消毒和灭菌 预处理没有损伤真皮组织基质。
实施例 4 ： 确定消毒灭菌时， 动物组织浸泡溶液的适宜酸碱度
消毒和灭菌溶液同猪皮原料之间会有反应。 加入新鲜猪皮材料后， 酸碱度 降低明显。本实施例确定了合适的过氧化钙溶液酸碱度。试验中将 1 ~ 2毫米厚 的新鲜猪皮， 放入到预先用氢氧化钠调好不同酸碱度的碳酸氢钠（ 1% )和过氧 化钙 （0.1% )溶液中， 从原料吸涨评估组织在预处理时的变化。 预处理后的猪 皮组织用无菌生理盐水（0.9%氯化钠）清洗后， 再加入 0.5%脱氧胆酸钠（溶于 5mM羟乙基哌嗪乙硫横酸緩冲液中， 酸碱度 8.0 )过夜脱细胞浸泡处理。 脱细 胞组织基质用无菌生理盐水清洗五次， 每次 2小时。 差示扫描量热仪分析表明 当酸碱度大于 11.5时， 猪皮吸涨显著增加， 组织基质会发生不可逆的改变， 组 织基质表现出不稳定， 具体参见图 3。 组织切片研究也显示， 酸碱度大于 11.5 时， 组织基质结构遭到破坏， 具体参见图 4。
实施例 5 ： 现有的消毒灭菌方法对组织基质材料造成的损伤
为了比较现有的消毒和灭菌方法对组织基质材料造成的损伤， 本实施例在 试验中将大约 1毫米厚的新鲜猪皮放入了几种不同的溶液中，包括 0.2%次氯酸 钠（2小时）， 0.2%过氧乙酸（2小时）， 3.0%双氧水（2小时）， 7.5%碘溶液（2 小时）， 1N氢氧化钠（ 1小时 )和磷酸緩冲液对照（酸碱度， 7.5 )。 在这些溶液 中处理后， 对猪皮组织用磷酸緩冲液做了彻底地清洗（5次， 每次两小时）。 差 示扫描量热仪分析结果表明这些常用消毒灭菌处理方法都对组织基质有不同程 度上的破坏， 特别是氢氧化钠、 次氯化钠和碘溶液， 具体参见图 5。 扫描电子 显微图片也可清晰地看到组织基质结构的一些改变， 具体参见图 6。 然而， 同 这些现有的消毒灭菌方法不同， 本发明使用金属水合氧化物或过氧化物同低浓 度的脱细胞洗涤剂结合， 在合适的酸碱度（ 10.0 ~ 11.5 )下， 不会破坏动物细胞 外基质材料原有组织的基本支架结构、 主要生物化学成分和生物力学性能。

Claims

1、 一种动物组织材料的消毒灭菌方法， 其包括如下步骤：
( 1 )将动物组织材料放在碱性的含有金属过氧化物和洗涤剂的浸泡溶液中 摇动；
( 2 )用中性清洗液洗净在浸泡过程中释放的微生物和动物组织细胞的有机 成分；
( 3 )用微酸性清洗液洗净组织基质；
( 4 )在中性溶液中低温保存或冻干保存组织基质。
2、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（1 ) 中的动物组织浸泡溶液含 有 0.01 ~ 0.2% ( w/v ) 的金属过氧化物和 0.05 ~ 1.0% ( w/v )的洗涤剂， 溶液酸 碱度在 9.0 ~ 12.0之间， 金属过氧化物优选过氧化钙、 过氧化镁、过氧化钠或过 氧化钡， 洗涤剂优选聚乙二醇辛基苯基醚， 脱氧胆酸钠或十二烷基横酸钠， 溶 液酸碱度优选在 9.5 ~ 11.5之间。
3、 根据权利要求 1或 2所述的方法， 其中步骤（1 ) 中具体的方法是将每 公斤动物组织材料用 2 ~ 8升浸泡溶液，在 5 ~ 42摄氏度中浸泡 6 ~ 48小时，浸 泡过程中加以摇动。
4、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（2 ) 中的中性清洗液是经过无 菌过滤的纯水或生理盐水。
5、 根据权利要求 1或 4所述的方法， 其中步骤（2 ) 中的组织材料用中性 清洗液洗 2 ~ 5次， 每次 1 ~ 3小时。
6、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（3 ) 中的微酸性清洗液是用乙 酸、乙酸钠或盐酸把酸碱度调至 5.0 ~ 6.0之间并经过无菌过滤的生理盐水或 2 ~ 20mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸緩冲液。
7、 根据权利要求 1或 6所述的方法， 其中步骤（3 ) 中组织材料用微酸性 清洗液洗 2 ~ 5次， 每次 1 ~ 3小时
8、 根据权利要求 1所述的方法， 其中步骤（4 ) 中所述的中性保存溶液是 2 ~ 20mM 的羟乙基哌嗪乙硫横酸緩冲液或其它兼容的生物緩冲液， 酸碱度为 7.0 ~ 8.0之间。
9、 一种用于对动物组织材料进行消毒灭菌的动物组织浸泡溶液， 其含有 0.01 ~ 0.2% ( w/v ) 的金属过氧化物和 0.05 ~ 1.0% ( w/v ) 的洗涤剂， 溶液酸碱 度在 9.0 ~ 12.0之间。
10、 根据权利要求 9所述的动物组织浸泡溶液， 其中金属过氧化物为过氧 化钙、 过氧化镁、 过氧化钠或过氧化钡， 优选为过氧化钙， 洗涤剂为聚乙二醇 辛基苯基醚， 脱氧胆酸钠或十二烷基横酸钠， 溶液酸碱度在 9.5 ~ 11.5之间。
PCT/CN2014/078739 2013-08-26 2014-05-29 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液 WO2015027728A1 (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016537094A JP6253780B2 (ja) 2013-08-26 2014-05-29 動物組織材料の消毒・滅菌方法及び動物組織浸漬溶液
EP14839546.0A EP3025734B1 (en) 2013-08-26 2014-05-29 Method for animal tissue material disinfection and sterilization
US14/914,298 US10701928B2 (en) 2013-08-26 2014-05-29 Method for animal tissue material disinfection and sterilization and corresponding animal tissue soak solution
ES14839546T ES2714707T3 (es) 2013-08-26 2014-05-29 Método para la desinfección y esterilización de material tisular animal
PL14839546T PL3025734T3 (pl) 2013-08-26 2014-05-29 Sposób dezynfekcji i sterylizacji tkanki zwierzęcej

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310376627.2A CN103418001B (zh) 2013-08-26 2013-08-26 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液
CN201310376627.2 2013-08-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015027728A1 true WO2015027728A1 (zh) 2015-03-05

Family

ID=49643737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2014/078739 WO2015027728A1 (zh) 2013-08-26 2014-05-29 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10701928B2 (zh)
EP (1) EP3025734B1 (zh)
JP (1) JP6253780B2 (zh)
CN (1) CN103418001B (zh)
ES (1) ES2714707T3 (zh)
HU (1) HUE043550T2 (zh)
PL (1) PL3025734T3 (zh)
PT (1) PT3025734T (zh)
WO (1) WO2015027728A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103418001B (zh) 2013-08-26 2016-01-20 北京瑞健高科生物科技有限公司 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液
CN106913907B (zh) 2015-12-25 2022-04-05 北京瑞健高科生物科技有限公司 一种具有结构记忆特性的细胞生长支架的制备方法
CN109602932B (zh) * 2019-01-24 2020-07-28 上海市同济医院 一种脱细胞蛋白支架消毒方法
CN111202081B (zh) * 2020-01-15 2021-09-21 四川大学 一种干燥胶原基生物材料的灭菌方法
CN111937859A (zh) * 2020-07-13 2020-11-17 北京利物谱生物科技有限公司 一种无血清皮肤冷冻保存液及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1267201A (zh) * 1997-05-08 2000-09-20 奥加诺吉尼西斯公司 生物材料的化学清洗
US6933103B1 (en) * 2001-03-21 2005-08-23 Brennen Medical, Inc. Biocompatible tissue for therapeutic use and method of making same
CN102580153A (zh) * 2012-03-09 2012-07-18 潘银根 一种制备脱细胞真皮基质医用组织补片的方法
CN103418001A (zh) * 2013-08-26 2013-12-04 北京瑞健高科生物科技有限公司 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE608612A (zh) * 1960-09-29
US3852210A (en) * 1972-08-11 1974-12-03 Flow Pharma Inc Stable liquid detergent concentrates containing active oxygen
US5019289A (en) 1988-11-25 1991-05-28 The Clorox Company Stable liquid detergent containing insoluble oxidant
US5336616A (en) 1990-09-12 1994-08-09 Lifecell Corporation Method for processing and preserving collagen-based tissues for transplantation
US6024735A (en) * 1996-03-20 2000-02-15 Lifenet Research Foundation Process and composition for cleaning soft tissue grafts optionally attached to bone and soft tissue and bone grafts produced thereby
US6482584B1 (en) 1998-11-13 2002-11-19 Regeneration Technologies, Inc. Cyclic implant perfusion cleaning and passivation process
US20080077251A1 (en) * 1999-06-07 2008-03-27 Chen Silvia S Cleaning and devitalization of cartilage
US7008763B2 (en) * 2002-09-23 2006-03-07 Cheung David T Method to treat collagenous connective tissue for implant remodeled by host cells into living tissue
EP2104420A2 (en) * 2006-10-30 2009-09-30 George Mason Intellectual Properties, Inc. Tissue preservation and fixation method
US8735054B1 (en) * 2008-01-04 2014-05-27 Lifecell Corporation Acellular tissue matrix preservation solution
US9150318B1 (en) * 2009-01-02 2015-10-06 Lifecell Corporation Method for sterilizing an acellular tissue matrix
CN203447388U (zh) * 2013-08-14 2014-02-26 北京瑞健高科生物科技有限公司 一种基于组织基质材料的乳房假体支撑装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1267201A (zh) * 1997-05-08 2000-09-20 奥加诺吉尼西斯公司 生物材料的化学清洗
US6933103B1 (en) * 2001-03-21 2005-08-23 Brennen Medical, Inc. Biocompatible tissue for therapeutic use and method of making same
CN102580153A (zh) * 2012-03-09 2012-07-18 潘银根 一种制备脱细胞真皮基质医用组织补片的方法
CN103418001A (zh) * 2013-08-26 2013-12-04 北京瑞健高科生物科技有限公司 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液

Also Published As

Publication number Publication date
ES2714707T3 (es) 2019-05-29
EP3025734B1 (en) 2018-12-05
HUE043550T2 (hu) 2019-08-28
US10701928B2 (en) 2020-07-07
EP3025734A4 (en) 2017-02-15
PL3025734T3 (pl) 2019-07-31
JP6253780B2 (ja) 2017-12-27
JP2016534118A (ja) 2016-11-04
US20160212986A1 (en) 2016-07-28
CN103418001A (zh) 2013-12-04
CN103418001B (zh) 2016-01-20
PT3025734T (pt) 2019-03-19
EP3025734A1 (en) 2016-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tao et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal
JP6171101B2 (ja) 動物脱細胞化組織マトリックス材料を製造するための方法及びその製造された組織マトリックス材料
US8883408B2 (en) Tissue implants for implantation and methods of preparing the same
US8475827B2 (en) Tissue implants for implantation and methods for preparing the same
US20100112543A1 (en) Processing soft tissue, methods and compositions related thereto
WO2015027728A1 (zh) 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液
US20120009644A1 (en) Tissue Implants for Implantation and Methods for Preparing the Same
JP2009050297A (ja) 脱細胞処理液、脱細胞化組織の調製方法、移植片、及び培養部材
KR101139434B1 (ko) 돼지피부를 이용한 드레싱재의 제조방법
CN101006790A (zh) 精碘消毒液
EP2236544A1 (en) Collagen Implant
CN114306755B (zh) 一种后巩膜加固术用生物补片及其制备方法
EP2114135A2 (en) Processing skin from living donors
US20180264148A1 (en) Tissue allograft sterilization method
JP4861326B2 (ja) 埋め込み可能または移植可能な生体材料の製造のための滅菌方法
WO2014149953A1 (en) Methods for preparing tissue implants
CN109453427A (zh) 一种动物组织脱细胞化前的清洗方法
CN114848912A (zh) 一种脱细胞真皮及其制备方法
CN105031730A (zh) 一种人工异种抗菌皮肤的制备方法
CN104164312A (zh) 一种溶脂、消毒一体剂及制备方法、使用方法
KR20160127077A (ko) 동물 및 특히 돼지 연골 조직의 보존 저장 방법
NZ614239A (en) Producing a transplant from animal dermis using sodium sulfide solution
NZ614239B2 (en) Producing a transplant from animal dermis using sodium sulfide solution

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14839546

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014839546

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14914298

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016537094

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE