CN103418001A - 一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物组织处理和组织基质材料制备技术领域，公开了一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液。采用本发明的方法和溶液，至少可使制备的动物组织材料减少细菌数量10的6次方，同时不破坏动物细胞外基质材料原有组织的基本支架结构、主要生物化学成分和生物力学性能。经本发明方法预处理的动物组织，细胞已经破碎，大部分蛋白酶已经去除，有利于组织的保存和进一步脱细胞处理，制备成完整的组织基质支架材料。

Description

一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液

技术领域

本发明涉及生物组织处理和组织基质材料制备技术领域，具体涉及一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液。

背景技术

脱细胞的组织器官基质已应用于人体组织修复、各种组织工程试验和再生医学研究。人体和许多动物组织及器官的细胞外基质有极大的相似性和同源性。由同种异体或异种异体组织器官脱细胞制成的生物基质材料，已经成功地用于人体组织临床医学修补和修复。良好的组织器官基质，在植入宿主后，基质支架材料提供初始的生物力学支持，通过与宿主细胞相互作用来调节细胞的行为（如粘附，迁移，增殖和分化），随着宿主细胞的长入，组织器官基质本身逐步转化成新组织。

除去动物组织器官的原有细胞成分后，也可在体外结合人体细胞，使已有三维框架结构的组织器官基质再次细胞化和功能化，生产可移植到人体的组织及器官。

组织器官基质是由各种复杂的结构蛋白质和功能蛋白质构成的三维立体框架，并含有许多有活性的其他复合物。主要成分包括胶原纤维、糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有氨基葡聚糖（透明质酸、硫酸软骨素）等糖类、一些脂质和生长因子。制备组织器官基质的生物工艺流程十分复杂，包括组织器官的采集、保存、清洗、消毒、脱细胞、降低抗原性、病毒灭活和终端灭菌等过程。其中动物组织消毒灭菌处理对组织器官基质的破坏极大，在灭活细菌和病毒的同时，严重地改变组织器官基质生物化学组成成分，破环三维立体框架的超微结构和降低生物力学性能。这些改变影响宿主对植入基质材料的反应，可能致使组织基质产品临床效果变差，难以达到人体组织修复的要求。

动物组织材料的消毒、灭菌和病毒灭活的方法贯穿在整个组织基质支架制备过程中的各工艺步骤中。目前应用方法主要有以下几种。一是物理方法，通过冲洗和稀释来减低细菌和真菌数量，在无菌环境下操作防止再次感染；二是在制备溶液中添加微生物生长抑制剂和抗生素；三是制备工艺流程中加上专门的灭菌步骤，控制菌量；四是产品终端灭菌处理。制备工艺流程中的灭菌方法有的用化学氧化剂（过氧乙酸、次氯酸钠、双氧水或碘溶液等），有的用酒精，还有的用酸碱处理（醋酸、盐酸、氢氧化钠）。实验结果表明这些常用消毒灭菌处理方法都对组织基质有不同程度的破坏。如何更有效的消毒、灭菌和病毒灭活，而不会损坏细胞外组织基质原有的基本结构、不改变主要生物化学成分和生物力学性能，是组织工程科学和生物材料科学领域还需深入研究的课题之一。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种动物组织材料的消毒灭菌方法，其包括如下步骤：

1、将动物组织材料放在碱性的含有金属过氧化物和洗涤剂的浸泡溶液中摇动；

2、用中性清洗液洗净在浸泡过程中释放的微生物和动物组织细胞的有机成分；

3、用微酸性清洗液洗净组织基质；

4、在中性溶液中低温保存或冻干保存组织基质。

在本发明优选的实施方案中，步骤（1）中的动物组织浸泡溶液含有0.01～0.2%（w/v）的金属过氧化物和0.05～1.0%（w/v）的洗涤剂，溶液酸碱度在9.0～12.0之间。金属过氧化物优选过氧化钙、过氧化镁、过氧化钠或过氧化钡，洗涤剂优选聚乙二醇辛基苯基醚，脱氧胆酸钠或十二烷基磺酸钠。

过氧化钙，又称二氧化钙，在农业上用作种子及谷物的无毒性消毒剂；在食品、化妆品等制造中用作添加剂；在药物制造中用作高温氧化剂或增氧剂。因此，在本发明更加优选的实施方案中金属过氧化物使用低浓度或过饱和度的过氧化钙碱性水溶液，其一般含量在0.01～0.2%（w/v）之间。实际应用中过氧化钙的含量可根据溶液体积和动物原组织器官材料的比例加以调整，例如0.01%，0.02%，0.03%……，直至0.2%范围内的任何浓度。此外，可以在本发明中使用的金属过氧化物，除过氧化钙外，也包括过氧化钠、过氧化镁、过氧化钡等其它金属过氧化物。

本发明使用的过氧化钙或其它金属过氧化物水溶液，可以使用碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、乙酸、盐酸等溶液调至初始酸碱度在8.5～12.5之间，优选在9.0～12.0之间，更加优选在9.5～11.5之间。最终的碳酸钠和碳酸氢钠含量可在0.01～2.0%之间，氢氧化钠含量可在1.0～100mM之间。优选碳酸钠和碳酸氢钠的含量可在0.5～1.0%之间，氢氧化钠的含量可在5～10mM之间。实际应用中各成分含量可根据溶液体积和动物原组织器官材料的比例加以变化。

本发明中的金属过氧化物可以和不会引起组织基质蛋白质变性的低浓度的洗涤剂或去污剂结合使用。合适这一应用目的的洗涤剂或去污剂种类很多，包括离子表面活性剂和非离子型表面活性剂。常用的有聚乙二醇辛基苯基醚，脱氧胆酸钠，十二烷基磺酸钠，脂肪酸钠盐，3-[（3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸，聚(乙烯二醇)甲基醚甲丙烯酰酸，和聚乙二醇等。优选聚乙二醇辛基苯基醚，脱氧胆酸钠或十二烷基磺酸钠。溶液中聚乙二醇辛基苯基醚的浓度可在0.05～1.0%（w/v）之间，脱氧胆酸钠的浓度可在0.1～1.0%（w/v）之间，十二烷基磺酸钠的浓度可在0.05～1.0%（w/v）之间。

在本发明的消毒灭菌处理溶液中，根据需要可加入蛋白酶抑制剂，如苯甲磺酰氟和N-乙基马来酰亚胺，以防止细胞裂解后释放的蛋白酶破坏组织基质材料。

在本发明优选的实施方案中，步骤1在预处理动物组织器官材料时，可在5～42摄氏度中进行，组织材料浸泡在处理溶液中，并加以摇动。使用溶液的体积一般为组织材料重量的1～10倍。预处理时间一般在6～48小时。同时，可根据处理温度、组织材料种类、带菌数目和体积重量比等，加以适当调整。

本发明的消毒灭菌方法还包括在消毒灭菌浸泡后，对组织材料进行彻底清洗。在优选的实施方案中，步骤2可采用中性清洗液进行，中性清洗液是经过无菌过滤的纯水、生理盐水或生物缓冲液，如10mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸。具体方法为组织材料经纯水、生理盐水和生物缓冲液浸洗2～5次，每次1～3小时。

本发明的消毒灭菌方法在彻底清洗后，还需要采用微酸性清洗液对组织材料进行清洗。步骤3中的微酸性清洗液是用乙酸、乙酸钠或盐酸把酸碱度调至5.0～6.0之间并经过无菌过滤的生理盐水或2～20mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。具体方法是采用微酸性处理液浸洗组织材料2～5次，每次1～3小时。

本发明洗净后的组织材料放入中性保存溶液中低温保存或冻干保存。步骤4中的中性保存溶液是酸碱度在7.0～8.0之间的2～20mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或其它兼容的生物缓冲液。

在实施本发明的方法时，在清理组织浸泡溶液后，在最后清洗溶液中也可加入适当的抗生素，如每升含有100毫克的庆大霉素。在加有抗生素的溶液中，组织材料可在5～10摄氏度短暂保存。

本发明另一方面还涉及一种用于对动物组织材料进行消毒灭菌的动物组织浸泡溶液，其含有0.01～0.2%（w/v）的金属过氧化物和0.05～1.0%（w/v）的洗涤剂，溶液酸碱度优选在9.0～12.0之间，更加优选在9.5～11.5之间。金属过氧化物优选过氧化钙、过氧化镁、过氧化钠或过氧化钡，洗涤剂优选聚乙二醇辛基苯基醚，脱氧胆酸钠或十二烷基磺酸钠。

本发明针对现有各种制备技术中原材料消毒、灭菌和病毒灭活存在的问题，提供了一种动物组织材料的消毒灭菌方法以及相应的动物组织浸泡溶液。通过采用该方法和该溶液，至少可以使制备的动物组织材料减少细菌数量10的6次方，同时不破坏动物细胞外基质材料原有组织的基本支架结构、主要生物化学成分和生物力学性能。同时，本发明也结合使用不会引起蛋白质变性的低浓度洗涤剂，促使动物细胞裂解、破碎，释放细胞内有机成分，从而在浸泡和清洗过程中能够清除组织中的部分动物细胞成分。此外，本发明的消毒灭菌方法安全绿色环保，不涉及使用有毒化学物质，也不在组织基质支架中留下化学残留物质。

附图说明

图1：用0.1%过氧化钙溶液对猪皮进行消毒灭菌的效果图。

左图：对照；

右图：过氧化钙溶液处理24小时后的材料，经检测未观察到细菌的存在。

图2：0.1%过氧化钙溶液（初始酸碱度，11.6）处理对猪真皮基质的差示扫描量热仪分析图。

图3：猪皮真皮材料在不同酸碱度溶液中的吸涨（图A）和消毒灭菌液酸碱度对组织基质的差示扫描量热仪分析图（图B）。

图4：高酸碱度（12.2）溶液消毒灭菌预处理对猪脱细胞真皮组织基质结构的组织切片HE染色图。

A：未处理前的猪真皮组织；

B：消毒灭菌和脱细胞处理后的组织基质材料。

图5：几种消毒灭菌方法对组织基质支架损伤的差示扫描量热仪分析图。

图6：几种消毒灭菌方法对组织基质结构改变的扫描电子显微图。

A：磷酸缓冲液对照；

B：1N氢氧化钠（1小时）；

C：0.2%过氧乙酸（2小时）；

D：3.0%双氧水（2小时）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

实施例1：动物组织材料的消毒灭菌及其对脱细胞的影响

将四头九个月大的普通生猪屠宰后，先去毛。从每头猪身上收取1～2毫米厚的新鲜猪皮（无皮下脂肪）。将猪真皮切成约3厘米见方的小块，放入250毫升的塑料瓶中。每猪4瓶，每瓶20克猪真皮材料。其中两瓶每瓶加入125毫升磷酸缓冲液（初始酸碱度，7.5）作为对照，一瓶加入125毫升0.1%的过氧化钙溶液（初始酸碱度，11.6），另一瓶加入125毫升0.1%的过氧化钙和0.1%聚乙二醇辛基苯基醚溶液（初始酸碱度，11.6）。在摇动浸泡1小时后，一瓶磷酸缓冲液对照用来测定初始的活菌数量。100微升经不同稀释倍数溶液（10，1000和1000000倍）过虑清洗后，在营养琼脂/普通肉汤琼脂培养基中培养24小时（37摄氏度）后计算活菌数量。所有试验瓶在回旋式摇床摇洗（50转/分钟）浸泡过夜24小时。组织原料消毒和灭菌的效果，以测定活菌数量来衡量。结果显示，瓶中初始的活菌数量平均为10的8.7次方（±0.1，N=4）；在对照的磷酸缓冲液中，24小时后活菌数量增加了245倍，平均为10的11.1次方（±0.1，N=4）；在过氧化钙溶液中，没有测出活菌，具体参见图1。

对用0.1%的过氧化钙和0.1%聚乙二醇辛基苯基醚溶液预处理过的猪皮组织，进一步做了脱细胞处理，用于评估消毒和灭菌预处理对后续加工的影响。猪皮组织在用无菌生理盐水（0.9%氯化钠）清洗两次后，加入100毫升0.5%脱氧胆酸钠（溶于5mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中，酸碱度8.0）。脱细胞浸泡22小时后，用无菌生理盐水清洗五次，每次2小时。用差示扫描量热仪对消毒和灭菌预处理对组织基质的影响进行了分析。差示扫描量热仪分析在磷酸缓冲液（pH=7.5）中进行，从2摄氏度升温到125摄氏度，升温速度为每分钟2摄氏度。未处理的新鲜猪皮组织基质的变性起点温度为60.5±0.3℃，焓值为65.2±1.4焦耳/克（N=3）。预处理后组织基质的变性起点温度为61.9±0.2℃，焓值为62.3±1.1焦耳/克（N=3）。测定结果表明同新鲜猪真皮相比，本发明的消毒和灭菌预处理没有损伤真皮组织基质，具体参见图2。

实施例2：动物组织材料的消毒灭菌

将六个月大的普通生猪屠宰后，经表面清洗和去毛。切取新鲜猪皮，并刮除皮下脂肪（2-3毫米厚）。采集到的猪皮原料暂时冷藏在5-10℃环境中。将猪真皮切成约30厘米见方的大块，放入2%碳酸钠+0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（用饱和的过氧化钙浓液调初始酸碱度至12.0～12.2）的溶液中，每400克猪皮原料用1升溶液。在回旋式摇床摇洗（90转/分钟）浸泡过夜（16-24小时）。清理浸泡溶液后，在无菌环境里用每升含有100毫克庆大霉素的纯水冲洗后，用1N盐酸将酸碱度调低至5.0-6.0之间，进一步清洗两次。再用1N盐酸将酸碱度调高至7.0-8.0之间，进一步清洗两次，完成了组织原材料的消毒和灭菌预处理。

实施例3：动物组织材料的消毒灭菌及其对组织基质的影响

将六个月大的普通生猪屠宰后，经表面清洗和去毛。切取新鲜猪皮，并刮除皮下脂肪。采集到的猪皮原料暂时冷藏在5-10℃环境中。将猪真皮切成约30厘米见方的大块，放入0.5%碳酸钠+0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（用饱和的过氧化钙浓液调初始酸碱度至11.0）的溶液中，每100克猪皮原料用1升溶液。在回旋式摇床摇洗（60转/分钟）浸泡过夜（16-24小时）。清理浸泡溶液后，用每升含有100毫克庆大霉素的纯水清洗，再用0.2M醋酸将酸碱度调至7.0-8.0之间，完成了对组织原料的消毒和灭菌预处理。采用差示扫描量热仪对预处理对组织基质的影响进行了分析，差示扫描量热仪分析在磷酸缓冲液（酸碱度，7.5）中进行，从2摄氏度升温到125摄氏度，升温速度为每分钟2摄氏度。未处理的新鲜猪皮组织基质的变性起点温度为60.5±0.3℃，焓值为65.2±1.4焦耳/克（N=3）。预处理后组织基质的变性起点温度为61.9±0.4℃，焓值为66.7±1.5焦耳/克（N=3）。测定结果表明同新鲜猪真皮相比，本发明的消毒和灭菌预处理没有损伤真皮组织基质。

实施例4：确定消毒灭菌时，动物组织浸泡溶液的适宜酸碱度

消毒和灭菌溶液同猪皮原料之间会有反应。加入新鲜猪皮材料后，酸碱度降低明显。本实施例确定了合适的过氧化钙溶液酸碱度。试验中将1～2毫米厚的新鲜猪皮，放入到预先用氢氧化钠调好不同酸碱度的碳酸氢钠（1%）和过氧化钙（0.1%）溶液中，从原料吸涨评估组织在预处理时的变化。预处理后的猪皮组织用无菌生理盐水（0.9%氯化钠）清洗后，再加入0.5%脱氧胆酸钠（溶于5mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中，酸碱度8.0）过夜脱细胞浸泡处理。脱细胞组织基质用无菌生理盐水清洗五次，每次2小时。差示扫描量热仪分析表明当酸碱度大于11.5时，猪皮吸涨显著增加，组织基质会发生不可逆的改变，组织基质表现出不稳定，具体参见图3。组织切片研究也显示，酸碱度大于11.5时，组织基质结构遭到破坏，具体参见图4。

实施例5：现有的消毒灭菌方法对组织基质材料造成的损伤

为了比较现有的消毒和灭菌方法对组织基质材料造成的损伤，本实施例在试验中将大约1毫米厚的新鲜猪皮放入了几种不同的溶液中，包括0.2%次氯酸钠（2小时），0.2%过氧乙酸（2小时），3.0%双氧水（2小时），7.5%碘溶液（2小时），1N氢氧化钠（1小时）和磷酸缓冲液对照（酸碱度，7.5）。在这些溶液中处理后，对猪皮组织用磷酸缓冲液做了彻底地清洗（5次，每次两小时）。差示扫描量热仪分析结果表明这些常用消毒灭菌处理方法都对组织基质有不同程度上的破坏，特别是氢氧化钠、次氯化钠和碘溶液，具体参见图5。扫描电子显微图片也可清晰地看到组织基质结构的一些改变，具体参见图6。然而，同这些现有的消毒灭菌方法不同，本发明使用金属水合氧化物或过氧化物同低浓度的脱细胞洗涤剂结合，在合适的酸碱度（10.0～11.5）下，不会破坏动物细胞外基质材料原有组织的基本支架结构、主要生物化学成分和生物力学性能。

Claims (10)

1.一种动物组织材料的消毒灭菌方法，其包括如下步骤： 

（1）将动物组织材料放在碱性的含有金属过氧化物和洗涤剂的浸泡溶液中摇动； 

（2）用中性清洗液洗净在浸泡过程中释放的微生物和动物组织细胞的有机成分； 

（3）用微酸性清洗液洗净组织基质； 

（4）在中性溶液中低温保存或冻干保存组织基质。 

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（1）中的动物组织浸泡溶液含有0.01～0.2%（w/v）的金属过氧化物和0.05～1.0%（w/v）的洗涤剂，溶液酸碱度在9.0～12.0之间，金属过氧化物优选过氧化钙、过氧化镁、过氧化钠或过氧化钡，洗涤剂优选聚乙二醇辛基苯基醚，脱氧胆酸钠或十二烷基磺酸钠，溶液酸碱度优选在9.5～11.5之间。 

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤（1）中具体的方法是将每公斤动物组织材料用2～8升浸泡溶液，在5～42摄氏度中浸泡6～48小时，浸泡过程中加以摇动。 

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（2）中的中性清洗液是经过无菌过滤的纯水或生理盐水。 

5.根据权利要求1或4所述的方法，其中步骤（2）中的组织材料用中性清洗液洗2～5次，每次1～3小时。 

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（3）中的微酸性清洗液是用乙酸、乙酸钠或盐酸把酸碱度调至5.0～6.0之间并经过无菌过滤的生理盐水或2～20mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。 

7.根据权利要求1或6所述的方法，其中步骤（3）中组织材料用微酸性 清洗液洗2～5次，每次1～3小时。 

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（4）中所述的中性保存溶液是2～20mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或其它兼容的生物缓冲液，酸碱度为7.0～8.0之间。 

9.一种用于对动物组织材料进行消毒灭菌的动物组织浸泡溶液，其含有0.01～0.2%（w/v）的金属过氧化物和0.05～1.0%（w/v）的洗涤剂，溶液酸碱度在9.0～12.0之间。 

10.根据权利要求9所述的动物组织浸泡溶液，其中金属过氧化物为过氧化钙、过氧化镁、过氧化钠或过氧化钡，优选为过氧化钙，洗涤剂为聚乙二醇辛基苯基醚，脱氧胆酸钠或十二烷基磺酸钠，溶液酸碱度在9.5～11.5之间。 

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