CN114522258A - 一种生物软组织病毒的灭活方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生物软组织病毒的灭活方法，灭活方法步骤如下，步骤一：将生物软组织放置于灭活容器中；步骤二：在20℃‑30℃的温度环境下，以0.15‑0.2％过氧乙酸及2‑8％乙醇溶液浸没灭活容器中的生物软组织，浸泡0.5h‑4h；步骤三：加入纯化水清洗，直至灭活容器中的洗脱液PH为中性，且过氧乙酸含量低于1mg/L，得到灭活组织X；步骤四：将灭活组织X在15‑25KGy辐照剂量的电子束辐下照射，得到灭活组织Y；本发明的优点在于一方面有效去除了组织内病毒，一方面保留了组织完整结构。
Description
技术领域
本发明涉及病毒灭活领域，更具体的说是涉及一种生物软组织病毒的灭活方法。
背景技术
皮肤及软组织损伤容易造成感染，其原因为细菌或病毒的繁殖衍生，最常见的为化脓性致病菌侵犯表皮、真皮和皮下组织引起的炎症性疾病，并且在生物医药领域中，针对研生物软组织病毒的研究时需要对其进行灭活，因此生物软组织灭活的方法也较为重要，现有的灭活方法多种多样，但是目前的现有方法病毒灭活效率低，且灭活程度达不到指定要求，灭活步骤复杂，耗时长。
现有技术(专利号为：CN104524606A、CN102210854B、CN102286095B、USP5116950以及USP5639730)均使用加热灭活发，温度从60℃-121℃不等，但是对于生物组织而言，超过40℃即可发生变性趋势，60℃可发生不可逆改变；其中(专利号为：CN103785065A)公开了使用过氧乙酸-乙醇溶溶液处理软骨组织，但没有验证其对于软组织的病毒灭活功效。此外，仅介绍一步灭活工艺，不符合NMPA出台法规的要求，其中(专利号为：CN103648508A)公开了使用的SD灭活法，主要针对血液制品，但没有验证其对于软组织的病毒灭活功效；其中(专利号为：CN103191466A)公开了使用过氧乙酸、氯化钠、表面活性剂及烧碱等溶液进行灭活，步骤繁琐，时间长，且烧碱溶液对人体有危害性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种生物软组织病毒的灭活方法，该种灭活方法采用过氧乙酸-乙醇溶液联合EB电子束灭菌两步法对生物软组织进行病毒灭活，一方面有效去除了组织内病毒，一方面保留了组织完整结构。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种生物软组织病毒的灭活方法，所述灭活方法步骤如下，
步骤一：将生物软组织放置于灭活容器中；
步骤二：在20℃-30℃的温度环境下，以0.15-0.2％过氧乙酸及2-8％乙醇溶液浸没灭活容器中的生物软组织，浸泡0.5h-4h；
步骤三：加入纯化水清洗，直至灭活容器中的洗脱液PH为中性，且过氧乙酸含量低于1mg/L，得到灭活组织X；
步骤四：将灭活组织X在15-25KGy辐照剂量的电子束辐下照射，得到灭活组织Y。
进一步的，所述生物软组织与0.15-0.2％过氧乙酸及2-8％乙醇溶液的溶液比为1kg：5L-10L。
进一步的，所述洗脱液PH在6.0-7.5。
进一步的，所述生物软组织为肺脏或心脏或肠道或胎盘或角膜或皮肤。
本发明的有益效果：1、采用过氧乙酸-乙醇溶液联合EB电子束灭菌两步法对生物软组织进行病毒灭活，一方面有效去除了组织内病毒，一方面保留了组织完整结构；
2、将生物软组织经过过氧乙酸-乙醇溶液联合EB电子束灭菌两步法处理后，使得灭活组织Y中指示病毒灭活效果均大于6logs，且过氧乙酸-乙醇溶液单一处理即可降低4logs以上。
3、该种生物软组织的病毒灭活方法操作简单，时间短，不会对操作人员与使用者产生潜在危害。
附图说明
图1是本发明的流程图；
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。其中相同的零部件用相同的附图标记表示。需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“底面”和“顶面”、“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
现有的灭活方法多种多样，但是目前的现有方法病毒灭活效率低，且灭活程度达不到指定要求，灭活步骤复杂，耗时长，比如：现有技术(专利号为：CN104524606A、CN102210854B、CN102286095B、USP5116950以及USP5639730)均使用加热灭活发，温度从60℃-121℃不等，但是对于生物组织而言，超过40℃即可发生变性趋势，60℃可发生不可逆改变；其中(专利号为：CN103785065A)公开了使用过氧乙酸-乙醇溶溶液处理软骨组织，但没有验证其对于软组织的病毒灭活功效。此外，仅介绍一步灭活工艺，不符合NMPA出台法规的要求，其中(专利号为：CN103648508A)公开了使用的SD灭活法，主要针对血液制品，但没有验证其对于软组织的病毒灭活功效；其中(专利号为：CN103191466A)公开了使用过氧乙酸、氯化钠、表面活性剂及烧碱等溶液进行灭活，步骤繁琐，时间长，且烧碱溶液对人体有危害性；因此本发明设计这种生物软组织病毒的灭活方法，灭活方法步骤如下，
步骤一：将生物软组织放置于灭活容器中，其中的生物软软组织可以为肺脏或心脏或肠道或胎盘或角膜或皮肤等；
步骤二：在20℃-30℃的温度环境下，以0.15-0.2％过氧乙酸及2-8％乙醇溶液浸没灭活容器中的生物软组织，浸泡0.5h-4h，其中生物软组织与0.15-0.2％过氧乙酸及2-8％乙醇溶液的溶液比为1kg：5L-10L；
步骤三：加入纯化水清洗，直至灭活容器中的洗脱液PH为中性(具体的洗脱液PH在6.0-7.5)，且过氧乙酸含量低于1mg/L，得到灭活组织X，此步骤完成后，经过实验验证，生物软组织中的病毒滴度下降4logs以上；
步骤四：将灭活组织X在15-25KGy辐照剂量的电子束辐下照射，得到灭活组织Y，此步骤完成后，经过实验验证，生物软组织中的病毒滴度下降2logs以上，因此，经过上述所有步骤的处理后，所得到的灭活组织Y的病毒滴度累计下降6logs以上，一方面有效去除了组织内病毒，一方面保留了组织完整结构，且该种灭活方法操作简单，时间短，不会对操作人员与使用者产生潜在危害。
实施例1：
1、步骤一，病毒选择：选择伪狂犬病毒(PRV)、水疱性口炎病毒(VSV)、猪细小病毒(PPV)以及脑心肌炎病毒(EMCV)，上述4种病毒的信息如表1所示：
表1 4种猪源指示病毒信息
| 病毒名称 | 基因组 | 囊膜 | 耐受性 |
| 伪狂犬病毒(PRV) | DNA | 有 | 中 |
| 水疱性口炎病毒(VSV) | RNA | 有 | 低 |
| 猪细小病毒(PPV) | DNA | 无 | 很高 |
| 脑心肌炎病毒(EMCV) | RNA | 无 | 中 |
2、步骤二和步骤三，过氧乙酸-乙醇浸泡：
0.15-0.2％过氧乙酸及2-8％乙醇溶液浸泡后病毒灭活有囊膜病毒的效果，具体如表2所示：
表2过氧乙酸-乙醇溶液灭活有囊膜病毒的效果(lgTCID50/0.1mL，注：最低检测限为0.5lgTCID50/0.1mL)
如表2所示，结果表明,过氧乙酸/乙醇溶液常温下处理0.5小时后即可使PRV和VSV降低系数均超过4logs，且均未检出。
0.15-0.2％过氧乙酸及2-8％乙醇溶液浸泡后病毒灭活无囊膜病毒的效果，具体如表3所示：
表3过氧乙酸-乙醇溶液灭活无囊膜病毒的效果(lgTCID50/0.1mL，注：最低检测限为0.5lgTCID50/0.1mL)
如表3所示，结果表明,过氧乙酸-乙醇溶液常温下处理胎盘0.5小时后即可使PPV和EMCV降低系数均超过4logs，且均未检出。
3、步骤4，电子束辐照：
电子束辐照灭有囊膜病毒的效果，具体如表4所示：
表4电子束辐照灭活有囊膜病毒的效果(lgTCID50/0.1mL)
如表4所示，结果表明,电子束辐照处理脱细胞胎盘生物材料后，可使PRV和VSV降低系数均超过2logs。
电子束辐照灭有囊膜病毒的效果，具体如表5所示：
表5电子束辐照灭活无囊膜病毒的效果(lgTCID50/0.1mL)
如表5所示，结果表明,电子束辐照处理脱细胞胎盘生物材料后，可使PPV和EMCV降低系数均超过2logs。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种生物软组织病毒的灭活方法，其特征在于：所述灭活方法步骤如下，
步骤一：将生物软组织放置于灭活容器中；
步骤二：在20℃-30℃的温度环境下，以0.15-0.2％过氧乙酸及2-8％乙醇溶液浸没灭活容器中的生物软组织，浸泡0.5h-4h；
步骤三：加入纯化水清洗，直至灭活容器中的洗脱液PH为中性，且过氧乙酸含量低于1mg/L，得到灭活组织X；
步骤四：将灭活组织X在15-25KGy辐照剂量的电子束辐下照射，得到灭活组织Y。
2.根据权利要求1所述一种生物软组织病毒的灭活方法，其特征在于：所述生物软组织与0.15-0.2％过氧乙酸及2-8％乙醇溶液的溶液比为1kg：5L-10L。
3.根据权利要求1所述一种生物软组织病毒的灭活方法，其特征在于：所述洗脱液PH在6.0-7.5。
4.根据权利要求1所述一种生物软组织病毒的灭活方法，其特征在于：所述生物软组织为肺脏或心脏或肠道或胎盘或角膜或皮肤。
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Effective date of registration: 20220818 Address after: Room 202, Building 1, Zhigu Apartment, Xiuyuan Road, Xiuzhou District, Jiaxing City, Zhejiang Province, 314000 Applicant after: Huang Mei Address before: 310000 room 112, building 3, No. 88, Jiangling Road, Xixing street, Binjiang District, Hangzhou, Zhejiang Province (self declaration) Applicant before: Hangzhou Beirong Biotechnology Co.,Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20221020 Address after: 310000 room 112, building 3, No. 88, Jiangling Road, Xixing street, Binjiang District, Hangzhou, Zhejiang Province (self declaration) Applicant after: Hangzhou Beirong Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Room 202, Building 1, Zhigu Apartment, Xiuyuan Road, Xiuzhou District, Jiaxing City, Zhejiang Province, 314000 Applicant before: Huang Mei |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220524 |