CN115919751A - 一种重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其应用；所述重组胶原蛋白水凝胶包括EDC、NHS、重组人Ⅲ型胶原蛋白、水和/或抗菌剂；本发明创造性的引入水溶性EDC和NHS，可促使胶原间发生交联，令重组胶原蛋白长期作用于病灶部位，减少重组胶原蛋白的在递送中的损失、提升了重组胶原蛋白的疗效；有效解决了重组胶原蛋白直接局部应用在宫腔黏连部位重组胶原蛋白流失严重、在病灶作用时间短、治疗效果不理想的问题。并且，所制备的重组胶原蛋白水凝胶生物相容性好，不会对患者病患部位以及衣物造成污染、舒适度高，不仅可以治疗宫腔黏连，同时能够促进子宫内膜快速恢复，具有很高的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其应用。
背景技术
宫腔粘连(IUA)又称Asherman综合，是由于妊娠或非妊娠子宫的创伤，导致子宫内膜基底层受损，使宫腔部分或全部闭塞从而导致月经异常、不孕或反复流产等。其本质是内膜纤维化。宫腔黏连这种疾病在妇科疾病中较为严重，这种疾病对育龄期女性的生育和月经都会造成严重影响，经常会使育龄期的妇女产生生育功能的障碍或月经异常等情况，且治疗之后如护理不当则很可能复发，导致再次黏连。
正常的子宫内膜能进行自身修复与再生。但是人工流产、引产、刮宫、内分泌严重失调、子宫内感染等情况会导致子宫内膜损伤，从而破坏子宫内膜正常结构，引起组织纤维化提高，腺体减少，宫腔或(和)宫颈管部分或全部闭塞，导致宫腔黏连(IUA)。临床上可表现为月经量减少、闭经、精子受阻、绝经期提前、周期性下腹痛、复发性流产、不孕，以及出现胎盘植入、胎盘黏连等产科并发症，是严重危害女性生殖健康的公共卫生问题之一。宫腔黏连的治疗是目前临床面临的难题，尤其中重度宫腔黏连，现有的治疗手段效果欠佳。比如宫腔镜下黏连分离术以及术后预防黏连包括术中宫腔内放置节育器、cook球囊、再生纤维素防黏连膜等物理屏障，并结合术后使用大剂量雌激素促进子宫内膜增长，是目前IUA的主要治疗方法。但是对于中重度宫腔黏连患者的治疗效果较差。
目前，已有阴道栓剂、灌洗剂、口服片剂作为子宫内膜修复制剂已有报道，但其疗效不佳，主要原因在于现有这些制剂无法保证治疗药物与内膜损伤部位紧密接触并维持长时间有效浓度。此外，由于子宫内膜黏液的快速分泌更新，导致受损子宫的腔道内治疗药物快速流失，从而无法达到有效的药物治疗浓度，这些因素成为阻碍目前制剂在子宫内膜损伤修复应用的瓶颈。因此将药物载入凝胶中可以令药物长期作用于病灶部位，减少药物的在递送中的损失和提升了药物的疗效。
重组胶原蛋白在多种创伤修复疾病中均体现出了良好的疗效。研究发现，重组胶原蛋白在病灶部位可以调节疾病微环境，促进损伤组织进行修复和再生，在创伤性疾病的治疗中展现了巨大的潜能。但重组胶原蛋白直接局部应用在宫腔黏连部位重组胶原蛋白流失严重，在病灶作用时间短，治疗效果仍不理想；而且尚未有良好的解决方案。
发明内容
针对现有技术的不足，为解决上述问题，本发明提供了一种重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其应用；本发明创造性的引入水溶性1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，可促使胶原间发生交联。将重组胶原蛋白加入交联剂可以令重组胶原蛋白长期作用于病灶部位，减少重组胶原蛋白的在递送中的损失和提升了重组胶原蛋白的疗效。
为实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明首先提供一种重组胶原蛋白水凝胶，包括下列质量分数的成分：
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺0.75％～2.25％；
N-羟基琥珀酰亚胺0.075％～0.225％；
重组人Ⅲ型胶原蛋白5％～30％。
进一步地，所述重组胶原蛋白水凝胶的溶剂为水。
进一步地，所述水包括去离子水、注射用水、生理盐水。
进一步地，溶剂还可替换为磷酸缓冲液。
进一步地，所述重组胶原蛋白水凝胶还包括抗菌剂，其中抗菌剂在重组胶原蛋白水凝胶中的质量分数为0.001％-0.1％。
进一步地，抗菌剂在重组胶原蛋白水凝胶中的质量分数为0.002％。
进一步地，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量分数为1％，N-羟基琥珀酰亚胺的质量分数为0.1％，重组人Ⅲ型胶原蛋白的质量分数为15％，抗菌剂的质量分数为0.002％。
进一步地，所述抗菌剂包括且不限于苯甲酸钠、苯扎溴铵、羟苯甲酯、尼泊金甲酯、聚乙二醇、聚六亚甲基双胍盐酸盐。
所述抗菌剂优选为聚六亚甲基双胍盐酸盐。
本发明还提供一种重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将重组胶原蛋白原料溶解在溶剂中，形成胶原溶液，调节胶原蛋白溶液的pH后加入交联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀，反应一段时间后得到重组胶原蛋白可吸收水凝胶，对块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸，将重组胶原蛋白可吸收水凝胶块置于磷酸盐缓冲液中，设置磷酸盐缓冲液的渗透压进行透析，经透析后得到块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶；采用含有或不含有抗菌剂的磷酸盐缓冲液对透析后的块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶进行粉碎法制粒，最后得到颗粒均匀的重组胶原蛋白可吸收水凝胶，再经灌装、灭菌即得重组胶原蛋白水凝胶。
进一步地，所述调节胶原蛋白溶液的pH为3-9；所述调节调节胶原蛋白溶液的pH使用的试剂为氯化钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。
进一步地，所述反应一段时间为0.5-2h。
进一步地，设置磷酸盐缓冲液的渗透压为200～500mOsm/kg，透析时间为2-4天。
进一步地，所述对块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸为1-2cm3。
所述的重组胶原蛋白水凝胶应用于制备预防和治疗宫腔黏连、子宫抗纤维化以及促进子宫内膜恢复产品的用途。
最后，本发明提供一种复合制剂，包括所述的重组胶原蛋白水凝胶。
进一步地，所述复合制剂用于制备子宫内膜各种损伤的修复产品中的用途。
进一步地，所述子宫内膜各种损伤的修复包括治疗宫腔黏连、子宫抗纤维化以及促进子宫内膜恢复。
进一步地，所述应用的方式具体是采用宫腔内原位注射的方式。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明创造性的引入水溶性1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，可促使胶原间发生交联。通过交联剂交联的重组胶原蛋白水凝胶相较于未交联的重组胶原水凝胶可以作用于病灶部位更长时间，减少重组胶原蛋白的在递送中的损失，提升重组胶原蛋白的疗效；有效解决了重组胶原蛋白直接局部应用在宫腔黏连部位重组胶原蛋白流失严重、在病灶作用时间短、治疗效果不理想的技术问题。
(2)本发明制备的重组胶原蛋白水凝胶生物相容性好，不会对患者病患部位以及衣物造成污染、舒适度高；而且具有抗黏连作用，在防止术后组织黏连方面具有很高的临床价值。
(3)本发明进一步设定了所述重组胶原蛋白水凝胶中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量分数为0.75％～2.25％、N-羟基琥珀酰亚胺的质量分数为0.075％～0.225％、重组人Ⅲ型胶原蛋白的质量分数为5％～30％。其用量至关重要，如果用量不在本发明的限定范围内，则完全无法实现本发明的目的；如重组胶原蛋白浓度过低或者因交联剂浓度过低导致的交联作用过低会导致水凝胶黏度较低，则不利于应用，无法达到宫腔黏连的治疗效果。
附图说明
图1为实施例1的重组胶原蛋白水凝胶在不同温度条件下的动力黏度图。
图2为模型组的大鼠子宫组织形态图。
图3为治疗组的大鼠子宫组织形态图。
图4为模型组的大鼠左侧子宫瘢痕白光扫描图。
图5为模型组的大鼠右侧子宫瘢痕白光扫描图。
图6为治疗组的大鼠左侧子宫瘢痕白光扫描图。
图7为治疗组的大鼠右侧子宫瘢痕白光扫描图。
图8为模型组的大鼠左侧子宫内膜细胞白光扫描图。
图9为模型组的大鼠右侧子宫内膜细胞白光扫描图。
图10为治疗组的大鼠左侧子宫内膜细胞白光扫描图。
图11为治疗组的大鼠右侧子宫内膜细胞白光扫描图。
图12为模型组和治疗组大鼠的子宫内膜厚度。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的；本发明说明书和实施例仅是示例性的，提供的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，提供的胶原蛋白为重组人Ⅲ型胶原蛋白；但本发明并不局限于所选择的交联剂和胶原蛋白，具有同样或类似作用的交联剂和胶原蛋白视为本发明的常规替换。
本发明首先提供了一种重组胶原蛋白水凝胶，其包括：
a.1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺；
b.重组人Ⅲ型胶原蛋白；
c.磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)；
d.抗菌剂：聚六亚甲基双胍盐酸盐；
e.溶剂：注射用水；
其中，重组人Ⅲ型胶原蛋白是一种通过基因工程获得的胶原蛋白；重组人Ⅲ型胶原蛋白已在专利中公开，专利公开号为：CN103102407A，专利名称：基因重组人胶原蛋白。
所述重组胶原蛋白水凝胶中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量分数为0.75％～2.25％，所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量分数为0.075％～0.225％，重组人Ⅲ型胶原蛋白的质量分数为5％～30％，聚六亚甲基双胍盐酸盐的质量分数为0.001％-0.1％。
重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，步骤如下：
将重组胶原蛋白原料溶解在注射用水中，形成胶原溶液，使用氯化钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠调节胶原蛋白溶液的pH至3.0-9.0；加入交联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，搅拌均匀，反应0.5-2h得到重组胶原蛋白可吸收水凝胶，对块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸，将重组胶原蛋白可吸收水凝胶块置于磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)中进行透析交换交联剂，PBS渗透压为200～500mOsm/kg，透析时间为2-4天，采用含有或不含有抗菌剂的磷酸盐缓冲液对透析后的块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶进行粉碎法制粒，抗菌剂选择聚六亚甲基双胍盐酸盐；最后得到颗粒均匀的重组胶原蛋白可吸收水凝胶，再经灌装、灭菌即得重组胶原蛋白水凝胶。
预实验：
重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，步骤如下：
将重组胶原蛋白原料溶解在注射用水中，形成胶原溶液，使用磷酸氢二钠调节胶原蛋白溶液的pH至7.0；加入交联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，搅拌均匀，反应1h得到重组胶原蛋白可吸收水凝胶，对块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成2cm3小凝胶块，将重组胶原蛋白可吸收水凝胶块置于磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)中进行透析交换交联剂，PBS渗透压为500mOsm/kg，透析时间为2天，采用含有抗菌剂的磷酸盐缓冲液对透析后的块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶进行粉碎法制粒，抗菌剂选择聚六亚甲基双胍盐酸盐；最后得到颗粒均匀的重组胶原蛋白可吸收水凝胶，再经灌装、灭菌即得重组胶原蛋白水凝胶；设定4组不同的比例组分，检测相应的动力粘度，具体见表1。
表1各组分质量分数及相应的动力黏度
通过预实验1-3可知，在本发明所限定的用量范围内，所制备的重组胶原蛋白水凝胶其黏度在1050-1300Pa·s之间；说明在此组分比例范围内的黏度适用于宫腔的黏附，所制备的重组胶原蛋白水凝胶可用于子宫防黏连的治疗；在子宫生理温度条件下能够达到很好的黏连作用，完成对子宫手术后创面的物理隔绝，防止黏连，同时能够促进子宫内膜快速恢复。
对比例：
区别于本发明的用量范围，设立2组对比例，各组分比例及相应的动力黏度见表2；其制备方法和条件同预实验。
表2各组分质量分数及相应的动力黏度
通过对比例1-2可知，改变相应的组分则会直接影响胶凝的黏度；对比例1-2的黏度均在305Pa·s以下，粘度过低不利于应用，无法达到宫腔黏连的治疗效果。
实施例1：
一、原料选择：
a.1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺；
b.重组人Ⅲ型胶原蛋白
c.抗菌剂：聚六亚甲基双胍盐酸盐
d.溶剂：注射用水
表3实施例1组分比例
二、重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，步骤如下：
将重组胶原蛋白原料溶解在注射用水中，形成胶原溶液，重组胶原蛋白的质量分数为15％，使用磷酸氢二钠调节胶原蛋白溶液的pH至7.0；然后加入交联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其质量分数为0.1％；再加入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，其质量分数为1％，搅拌均匀，反应1h得到重组胶原蛋白可吸收水凝胶，对块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成2cm3小凝胶块，将重组胶原蛋白可吸收水凝胶块置于磷酸盐缓冲液(PBS)中进行透析交换交联剂，PBS渗透压为500mOsm/kg，透析时间为2天，采用含有抗菌剂的磷酸盐缓冲液对透析后的块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶进行粉碎法制粒，抗菌剂选择聚六亚甲基双胍盐酸盐，质量分数为0.002％；最后得到颗粒均匀的重组胶原蛋白可吸收水凝胶，再经灌装、灭菌即得重组胶原蛋白水凝胶。
本实施例所制备的重组胶原蛋白水凝胶，对其进行流变学检测，图1是基于流变学做的动力黏度图，如图所示，其在固定温度37℃下，黏度随着剪切速率的增大而减小，这种现象也叫假塑性流动，在低流速或者静止时，由于他们互相缠结，黏度较大，故而显得黏稠。然而流速变大时，这些比较散乱的链状粒子因为会受到流层之间的剪应力作用，减少了它们的互相钩挂，会发生滚动旋转进而收缩成团，于是表现为剪切稀化现象。在相同的剪切速率下，37℃时的黏度始终大于25℃时的黏度，从这一现象也可以看出重组胶原蛋白水凝胶在温度升高时的黏度显著提高。此时的黏度适用于宫腔的黏附，对重组胶原蛋白水凝胶在子宫防黏连的应用上提供了支撑。
三、动物实验
(1)实验对象选择：
选择8周龄，体重约250g，性成熟的雌性大鼠，适应性培养一周，动情期进行手术(动情周期为4-5天)。
(2)所需材料：
试剂：生理盐水、PBS缓冲液、95％乙醇、75％乙醇(或碘伏消毒)、0.1％结晶紫溶液、10％戊巴比妥钠、4％多聚甲醛；
·4％多聚甲醇：称取40g多聚甲醛粉末，溶于1000mL磷酸盐缓冲液(PBS)，加热至60℃，使其充分溶解，冷却至常温，密封阴凉处保存，时间不超过1个月。
·清洗液：30％盐酸或者用5％苯酚水溶液浸泡24小时，取出后充分水洗。此法可用于盖玻片或载玻片的清洗处理。
(3)组别的设立与处理方式：
将10只大鼠随机分为2组，每组5只；2组分别为模型组和治疗组(重组胶原蛋白水凝胶组)。
模型组：进行两侧刮宫，建立宫腔黏连的模型；在两侧子宫注射生理盐水100μL。
治疗组：基于建立的宫腔黏连模型，在两侧子宫注射重组胶原蛋白水凝胶100μL。
(4)动情期的确定:
采用阴道脱落细胞检查法：
注：阴道涂片的采集和发情周期的评估在每天早8：30-9：30分进行，防止细胞到下一个阶段，测评至少一周。
·张开左手虎口，迅速将拇指、食指插入大鼠尾巴根部下，虎口向后，其余三指及掌心压在大鼠身体后半部分，注意不要用力过大。提起尾巴，让其前爪搭在鼠笼上，后肢悬空，可以看到阴道口打开。使用移液枪与移液吸管吸入(50μL)生理盐水，将吸管口放到雌鼠阴道口3-5mm处，缓慢地将液体释放到阴道中然后再吸回，反复4-5次，然后将液体滴到载玻片上，干燥，95％酒精固定，然后用0.1％结晶紫溶液进行染色3min，冲洗后在显微镜下观察。
(5)手术操作：
·采用刮宫：腹部剃毛消毒，麻醉固定。
·耻骨联合上方2-3cm处纵向切开腹壁皮肤3cm左右，逐层切开组织，进入腹腔，缓慢挑出大鼠的Y型子宫。
·双侧宫角同时手术
·眼科直剪于宫颈上方约5mm处作纵行切口，长度约5mm，采用自制大鼠宫腔刮勺经宫颈上方切口行刮宫术，待宫腔四壁出现粗糙感时停止刮宫。
·无菌纱布彻底止血，7-0缝线间断缝合子宫，将子宫还纳至腹腔，生理盐水冲洗腹腔，用3-0缝合线关腹，术后每48h，肌注抗生素200mg/kg。
·模型组只在子宫处做相同长度纵切口
·分别在第两个动情周期后，处死，4％多聚甲醇固定24小时以上，乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中，切片染色观察。
(6)结果处理(检测)：对子宫采用马松染色、苏木精-伊红(HE)染色评价各组子宫愈合的效果。对其组织形态、Masson、HE、内膜细胞和子宫内膜厚度进行检测。
①大鼠子宫组织形态观察：
图2为模型组的大鼠子宫组织形态图；图3为治疗组的大鼠子宫组织形态图。首先分别对两组大鼠腹部进行消毒，麻醉固定。在耻骨联合上方3cm处纵向切开腹壁皮肤3cm左右，逐层切开组织，进入腹腔，缓慢挑出大鼠的Y型子宫。如图2、3所示，模型组的大鼠子宫左侧有明显的组织异常增生，而治疗组的大鼠子宫左侧相对平整，无明显的增生。同样的模型组大鼠子宫右侧相对于治疗组也有明显的增生变厚，与造模大鼠的子宫组织形态相比，治疗后的大鼠子宫组织形态显著改善，说明重组胶原蛋白水凝胶对大鼠子宫组织形态的恢复有着显著的效果。
②子宫瘢痕(MASSON)：
将两组大鼠分别在第两个动情周期后处死，4％多聚甲醇固定24小时以上，乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中，切片脱蜡至蒸馏水；Weigert铁苏木素染色液染色3分钟；盐酸酒精分化15s(铁苏木素染色过深可适当增加分化时间)，水洗；Masson蓝化液返蓝，水洗，蒸馏水洗1min；丽春红品红染色液染色7-8s(根据组织密度控制染色时间)，0.2％弱酸洗1min；磷钼酸溶液洗2min，0.2％弱酸洗1min；苯胺蓝染色液染色90s(根据组织密度控制染色时间)，0.2％弱酸洗1min；95％乙醇快速脱水2-3s，无水乙醇脱水3次，每次5-10s；二甲苯透明3次，每次1-2min，封固。通过MASSON染色观测大鼠子宫瘢痕，如图4、5所示，为模型组的大鼠左、右侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图，可以明显看出，模型组大鼠的左侧和右侧子宫分别出现了明显的黏连；如图6、7所示，为治疗组的大鼠左、右侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图，治疗组大鼠的左侧和右侧子宫形态正常，没有出现黏连，说明重组胶原蛋白水凝胶对治疗子宫黏连有显著的作用。此外，从图片可以看出治疗组大鼠左右两侧的胶原纤维(蓝色)的光密度和面积显著小于模型组大鼠子宫，说明重组胶原蛋白水凝胶对大鼠子宫抗纤维化也有显著的作用。
③子宫内膜细胞(HE)：
将两组大鼠分别在第两个动情周期后处死，4％多聚甲醇固定24小时以上，乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中，切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染细胞核:切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。伊红染细胞质:切片入伊红染液中染色1-3min。脱水封片:将切片乙醇梯度脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。通过HE染色观测大鼠子宫内膜细胞(细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；细胞质和细胞外基质中的成分着红色)，如图8、9、10、11所示，模型组大鼠子宫的左侧和右侧子宫内膜细胞相对于治疗组大鼠子宫的左侧和右侧子宫内膜细胞显著减少，且从图片上可以看出，模型组大鼠左、右侧子宫面积较大，治疗组宫腔面积相对于模型组小，说明治疗后的子宫内膜恢复效果较好，且维持了宫腔的基本形状，没有黏连。
④子宫内膜厚度：
通过HE染色观测大鼠子宫内膜厚度(平均子宫内膜厚度＝面积/周长，使用图像分析软件(Image Pro-Plus)计算子宫内膜面积和周长)，结果如图12所示，治疗组大鼠左侧子宫内膜厚度(Left uterus，709.25μm)与模型组大鼠左侧子宫内膜厚度(Left uterus，607.25μm)相比，治疗组的子宫内膜显著变厚；治疗组大鼠右侧子宫内膜厚度(Rightuterus，727.25μm)与模型组大鼠右侧子宫内膜厚度(Right uterus，428.75μm)相比，治疗组的子宫内膜显著变厚，说明重组胶原蛋白水凝胶对大鼠子宫内膜的恢复有着显著的效果。
由以上分析可知，根据子宫组织形态、子宫瘢痕、内膜细胞和子宫内膜厚度的对比结果可以看出，重组胶原蛋白水凝胶对受损后的子宫内膜具有较好的修复作用，具有显著的抗纤维化、防黏连效果。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (19)
1.一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，包括下列质量分数的组分：
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺0.75％～2.25％；
N-羟基琥珀酰亚胺0.075％～0.225％；
重组人Ⅲ型胶原蛋白5％～30％。
2.根据权利要求1所述的一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述重组胶原蛋白水凝胶的溶剂为水。
3.根据权利要求2所述的一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述水包括去离子水、注射用水、生理盐水。
4.根据权利要求2所述的一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，溶剂还可替换为磷酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述重组胶原蛋白水凝胶还包括抗菌剂，其中抗菌剂在重组胶原蛋白水凝胶中的质量分数为0.001％-0.1％。
6.根据权利要求5所述的一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，抗菌剂在重组胶原蛋白水凝胶中的质量分数为0.002％。
7.根据权利要求6所述的一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量分数为1％，N-羟基琥珀酰亚胺的质量分数为0.1％，重组人Ⅲ型胶原蛋白的质量分数为15％，抗菌剂的质量分数为0.002％。
8.根据权利要求7所述的一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述抗菌剂包括且不限于苯甲酸钠、苯扎溴铵、羟苯甲酯、尼泊金甲酯、聚乙二醇、聚六亚甲基双胍盐酸盐。
9.根据权利要求8所述的一种重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述抗菌剂为聚六亚甲基双胍盐酸盐。
10.根据权利要求1-9任一所述的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将重组胶原蛋白原料溶解在溶剂中，形成胶原溶液，调节胶原蛋白溶液的pH后加入交联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀，反应一段时间后得到重组胶原蛋白可吸收水凝胶，对块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸，将重组胶原蛋白可吸收水凝胶块置于磷酸盐缓冲液中，设置磷酸盐缓冲液的渗透压进行透析，经透析后得到块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶；采用含有或不含有抗菌剂的磷酸盐缓冲液对透析后的块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶进行粉碎法制粒，最后得到颗粒均匀的重组胶原蛋白可吸收水凝胶，再经灌装、灭菌即得重组胶原蛋白水凝胶。
11.根据权利要求10所述的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述调节胶原蛋白溶液的pH为3-9；所述调节调节胶原蛋白溶液的pH使用的试剂为氯化钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。
12.根据权利要求10所述的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述反应一段时间为0.5-2h。
13.根据权利要求10所述的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，设置磷酸盐缓冲液的渗透压为200～500mOsm/kg，透析时间为2-4天。
14.根据权利要求10所述的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述对块状重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸为1-2cm3。
15.根据权利要求1-9任一所述的重组胶原蛋白水凝胶在制备预防和治疗宫腔黏连、子宫抗纤维化以及促进子宫内膜恢复产品的应用。
16.一种复合制剂，其特征在于，包括权利要求1-9任一所述的重组胶原蛋白水凝胶。
17.根据权利要求16所述的一种复合制剂用于制备子宫内膜各种损伤的修复产品中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述子宫内膜各种损伤的修复包括治疗宫腔黏连、子宫抗纤维化以及促进子宫内膜恢复。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述应用的方式具体是采用宫腔内原位注射的方式。
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