CN116763724B - 一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其在宫腔粘连治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其在宫腔粘连治疗中的应用。本发明创造性的引入均质处理的姜黄素，其目的在于使得姜黄素由脂溶性变成水溶性，能够更好的被人体所吸收，增强生物利用度；同时以特定浓度结合交联剂促使胶原间发生交联，可以令重组胶原蛋白长期作用于病灶部位，减少重组胶原蛋白的在递送中的损失，并提升了重组胶原蛋白的疗效；所制备的水凝胶有效解决了重组胶原蛋白直接局部应用在宫腔粘连部位重组胶原蛋白流失严重、治疗效果不理想的技术问题；显著提升了重组胶原蛋白在宫腔粘连部位治疗的效果，而且具有抗粘连作用，在防止术后组织粘连方面具有很高的临床价值。

Description

一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其在宫 腔粘连治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其在宫腔粘连治疗中的应用。
背景技术
女性子宫在生理和生殖功能中起着重要的作用，正常的子宫内膜能进行自身修复与再生。但是人工流产、引产、刮宫、内分泌严重失调、子宫内感染等情况会导致子宫内膜损伤，从而破坏子宫内膜正常结构，引起组织纤维化提高，腺体减少，宫腔或(和)宫颈管部分或全部闭塞，导致宫腔粘连(IUA)。宫腔粘连(IUA)又称Asherman综合，临床上可表现为月经量减少、闭经、精子受阻、绝经期提前、周期性下腹痛、复发性流产、不孕，以及出现胎盘植入、胎盘粘连等产科并发症，这种疾病在妇科疾病中较为严重，对育龄期女性的生育和月经都会造成严重影响，经常会使育龄期的妇女产生生育功能的障碍或月经异常等情况，且治疗之后如护理不当则很可能复发，导致再次粘连，是严重危害女性生殖健康的公共卫生问题之一。
宫腔粘连的治疗是目前临床面临的难题，尤其中重度宫腔粘连，现有的治疗手段效果欠佳。比如宫腔镜下粘连分离术以及术后预防粘连包括术中宫腔内放置节育器、cook球囊、再生纤维素防粘连膜等物理屏障，并结合术后使用大剂量雌激素促进子宫内膜增长，是目前IUA的主要治疗方法；但是对于中重度宫腔粘连患者的治疗效果较差。目前，已有阴道栓剂、灌洗剂、口服片剂作为子宫内膜修复制剂已有报道，但其疗效有待提高，主要原因在于现有这些制剂无法保证治疗药物与内膜损伤部位紧密接触并维持长时间有效浓度。此外，由于子宫内膜黏液的快速分泌更新，导致受损子宫的腔道内治疗药物快速流失，从而无法达到有效的药物治疗浓度，这些因素成为阻碍目前制剂在子宫内膜损伤修复应用的瓶颈。因此将药物载入凝胶中可以令药物长期作用于病灶部位，减少药物的在递送中的损失和提升了药物的疗效。
姜黄素是一种从姜科植物姜黄等的根茎中提取得到的黄色色素，姜黄和姜黄素是天然植物成分，具备药用价值，而且无明显的毒副作用。然而，虽然姜黄素的用途广泛并且药用价值较高，但是姜黄素存在难溶于水，被人体摄入后在体内吸收少、代谢速率快等，极大地限制了姜黄素的应用。
重组胶原蛋白在多种创伤修复疾病中均体现出了良好的疗效。研究发现，重组胶原蛋白在病灶部位可以调节疾病微环境，促进损伤组织进行修复和再生，在创伤性疾病的治疗中展现了巨大的潜能。但重组胶原蛋白直接局部应用在宫腔粘连部位重组胶原蛋白流失严重，在病灶作用时间短，治疗效果仍不理想。提升重组胶原蛋白在宫腔粘连部位治疗的效果是亟需解决的技术难题，而且目前尚未有姜黄素结合重组胶原蛋白用于宫腔粘连治疗的研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法及其在宫腔粘连治疗中的应用；本发明创造性的以均质处理的姜黄素为原料，结合交联剂和重组胶原蛋白制备得到一种水凝胶，其可用于宫腔粘连的治疗，并取得了显著的技术效果。
为实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明首先提供了一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶，由下列原料成分组成：
姜黄素、交联剂、重组胶原蛋白和水；原料成分中姜黄素的质量分数为0.15-1.0％，重组胶原蛋白质量分数为5～10％；交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)，其用量均为重组胶原蛋白质量的0.3-0.4％；余量为水；所述姜黄素在使用时先溶于水中，是以均质处理后的均质液添加。
优选的，所述水包括去离子水、注射用水、生理盐水；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：1；重组胶原蛋白为重组人Ⅲ型胶原蛋白，优选用量为8％。
本发明还提供一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)首先称取一定量的姜黄素粉末加入到水中，经磁力搅拌、均质循环处理后得到姜黄素均质液；其中磁力搅拌的时间为1.5-2h，均质循环的次数为20-30次；
(2)将重组胶原蛋白原料溶解在姜黄素均质液中，搅拌均匀，形成负载姜黄素的胶原溶液；然后加入交联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀，反应一段时间得到负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶，对负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸，得到负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶块，置于磷酸盐缓冲液中进行透析交换交联剂，设定PBS渗透压和透析时间进行透析，经透析后，再对块状负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶进行粉碎法制粒，再经灌装、灭菌即得负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶。
上述步骤(2)中，所述反应一段时间为2-6h；设置磷酸盐缓冲液的渗透压为200～500mOsm/kg，透析时间为4-6天；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5-8；所述负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸为1-2cm3。
本发明的负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶在制备预防和治疗宫腔粘连、子宫抗纤维化以及促进子宫内膜恢复产品中的应用。
一种复合制剂，包括所述的负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶。
所述复合制剂用于制备子宫内膜各种损伤的修复产品中的用途，所述子宫内膜各种损伤的修复包括治疗宫腔粘连、子宫抗纤维化以及促进子宫内膜恢复。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明制备的负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶生物相容性好，不会对患者病患部位以及衣物造成污染、舒适度高；而且具有抗粘连作用，在防止术后组织粘连方面具有很高的临床价值。
(2)本发明所使用的姜黄素，是经过均质处理，以均质液的形式添加；其目的一方面在于使得姜黄素由脂溶性变成水溶性，能够更好的被人体所吸收，增强生物利用度；另一方面是实现了基于姜黄素制备的水凝胶在宫腔粘连治疗中的应用，并且取得了显著的技术效果。
(3)本发明进一步限定了所述负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶中姜黄素的用量；姜黄素的用量过低，会导致负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶黏度太低，治疗宫腔粘连效果不明显；姜黄素用量过高，也会导致黏度增大，使水凝胶不利于吸收以及排出体外，对治疗宫腔粘连效果并不好。因此，姜黄素的用量至关重要，过高或过低均不利于应用，无法有效实现宫腔粘连的治疗效果。
(4)本发明创造性的引入姜黄素和交联剂的协同作用，促使胶原间发生交联，可以令重组胶原蛋白长期作用于病灶部位，减少重组胶原蛋白的在递送中的损失和提升了重组胶原蛋白的疗效；两者相结合有效解决了重组胶原蛋白直接局部应用在宫腔粘连部位重组胶原蛋白流失严重、在病灶作用时间短、治疗效果不理想的技术问题。
附图说明
图1为预实验1中A、B组重组胶原蛋白水凝胶的动力黏度图。
图2为预实验1中C、D、E、F组重组胶原蛋白水凝胶的动力黏度图。
图3为实施例1中模型组的大鼠子宫组织形态图。
图4为实施例1中治疗组的大鼠子宫组织形态图。
图5为实施例1中模型组的大鼠左侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图。
图6为实施例1中模型组的大鼠右侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图。
图7为实施例1中治疗组的大鼠左侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图。
图8为实施例1中治疗组的大鼠右侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图。
图9为实施例1中模型组的大鼠左侧子宫内膜细胞(HE)白光扫描图。
图10为实施例1中模型组的大鼠右侧子宫内膜细胞(HE)白光扫描图。
图11为实施例1中治疗组的大鼠左侧子宫内膜细胞(HE)白光扫描图。
图12为实施例1中治疗组的大鼠右侧子宫内膜细胞(HE)白光扫描图。
图13为实施例2中模型组的大鼠子宫组织形态图。
图14为实施例2中治疗组的大鼠子宫组织形态图。
图15为实施例2中模型组的大鼠左侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图。
图16为实施例2中模型组的大鼠右侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图。
图17为实施例2中治疗组的大鼠左侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图。
图18为实施例2中治疗组的大鼠右侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图。
图19为实施例2中模型组的大鼠左侧子宫内膜细胞(HE)白光扫描图。
图20为实施例2中模型组的大鼠右侧子宫内膜细胞(HE)白光扫描图。
图21为实施例2中治疗组的大鼠左侧子宫内膜细胞(HE)白光扫描图。
图22为实施例2中治疗组的大鼠右侧子宫内膜细胞(HE)白光扫描图。
图23为模型组和治疗组A-D大鼠的子宫内膜厚度。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
(1)原料选择：
a.溶质：姜黄素、重组Ⅲ型胶原蛋白、50％(w/w)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(C8H17N3 HCl，EDC)、10％(w/w)N-羟基琥珀酰亚胺(C4H5NO3，NHS)；
b.溶剂水：去离子水；
(2)用量说明：姜黄素在使用时先溶于水中，是以均质处理后的均质液添加，质量分数为0.15-1.0％；重组胶原蛋白质量分数为5～10％；交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)，其用量均为重组胶原蛋白质量的0.3-0.4％；余量为去离子水。
原料说明：本发明所用的试剂、原料都是现有产品，姜黄素购自Adamas；本发明所述使用的重组人Ⅲ型胶原蛋白是一种通过基因工程获得的胶原蛋白。所制备的重组人Ⅲ型胶原蛋白已在专利中公开，专利为：申请号：201310033299.6，专利名称：基因重组人胶原蛋白；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购于东京化成株式会社(TCI)；磷酸盐缓冲液购于Solarbio。
一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)首先称取一定量的姜黄素粉末加入到水中，磁力搅拌1.5-2h，均质机循环20-30次，得到姜黄素均质液；
(2)将重组胶原蛋白原料溶解在姜黄素均质液中，搅拌均匀，形成负载姜黄素的胶原溶液；然后加入交联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀，反应2-6h得到负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶，对载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸，得到负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶块，置于磷酸盐缓冲液中进行透析交换交联剂，PBS渗透压为200～500mOsm/kg，透析时间为4-6天，经透析后，再对块状负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶进行粉碎法制粒，再经灌装、灭菌即得负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶。
预实验1：
负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法同上；设定6组不同的比例组分，检测相应的动力粘度，具体原料组分和检测结果见表1。
表1各组分比例及相应的动力黏度
通过A、B、C、D、E、F各组数据对比来看，交联剂的使用对动力粘度的提升效果有促进作用；同时，姜黄素的用量变化对动力粘度的影响更为显著；通过A组数据可以看出姜黄素的用量过低，会导致负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶黏度太低，不利于应用；B组中姜黄素用量过高，也会导致黏度增大，使水凝胶不利于吸收以及排出体外；因此，姜黄素的用量控制至关重要，过高或过低均不利于应用，无法实现宫腔粘连的有效治疗。
按照表1所列各组分的比例制备负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶，对其进行流变学检测。如图1、2是基于流变学做的动力黏度图，其在固定温度25℃，固定剪切速率0.25(1/s)下，黏度随着交联剂比例及姜黄素浓度的增大而增大。在相同的剪切速率下，25℃时的黏度与37℃时的黏度接近，从这一现象也可以看出负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶在温度升高至接近人体体温(37℃)时的黏度不会改变，具有一定的稳定性。
如图1，姜黄素用量过低，会导致负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶黏度太低，治疗宫腔粘连效果不明显。姜黄素用量过高，也会导致黏度增大，使水凝胶不利于吸收以及排出体外，姜黄素用量过高对治疗宫腔粘连治疗效果并不好。如图2中C、D、E、F各组数据所示的黏度，说明其可适用于宫腔的黏附，对负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶在子宫防粘连的应用上提供了支撑。
预实验2：
不均质组各组分比例及相应的动力粘度；
其制备方法同预实验1，其区别在于步骤(1)中姜黄素粉末加入到水中不进行均质处理；设立2个组别G和H，具体结果见表2；
通过G和H的动力粘度测定结果来看，使用不均质的处理姜黄素溶液，其动力粘度相比于均值组有下降，但是也在可应用范围之内；但是结合图23来看，在相同条件下，不均质组相较于模型组子宫内膜厚度没有显著差异(图23)，不均质的姜黄素水凝胶对大鼠子宫内膜的恢复并没有显著的效果，也进一步说明了均质后的姜黄素所带来意想不到的实质性效果。
动物实验，方法介绍：
(1)实验对象选择：
选择8周龄，体重约250g，性成熟的雌性大鼠，适应性培养一周，动情期进行手术(动情周期为4-5天)。
(2)所需材料：
试剂：生理盐水、PBS缓冲液、95％乙醇、75％乙醇(或碘伏消毒)、0.1％结晶紫溶液、10％水合氯醛、4％多聚甲醛；
·4％多聚甲醇：称取40g多聚甲醛粉末，溶于1000ml磷酸盐缓冲液(PBS)，加热至60℃，使其充分溶解，冷却至常温，密封阴凉处保存，时间不超过1个月。
·清洗液：30％盐酸或者用5％苯酚水溶液浸泡24小时，取出后充分水洗。此法可用于盖玻片或载玻片的清洗处理。
(3)组别的设立与处理方式：
将12只大鼠随机分为4组，4组分别为模型组、低浓度均质姜黄素水凝胶组(治疗组A)、高浓度均质姜黄素水凝胶组(治疗组B)、低浓度不均质姜黄素水凝胶组(治疗组C)、高浓度不均质姜黄素水凝胶组(治疗组D)。
模型组：进行两侧刮宫，建立宫腔粘连的模型；在两侧子宫注射去离子水100μL。
治疗组(治疗组A-治疗组D)：基于建立的宫腔粘连模型，在两侧子宫注射负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶100μL。
(4)动情期的确定:
采用阴道脱落细胞检查法：
注：阴道涂片的采集和发情周期的评估在每天早8：30-9：30分进行，防止细胞到下一个阶段，测评至少一周。
·张开左手虎口，迅速将拇指、食指插入大鼠尾巴根部下，虎口向后，其余三指及掌心压在大鼠身体后半部分，注意不要用力过大。提起尾巴，让其前爪搭在鼠笼上，后肢悬空，可以看到阴道口打开。使用移液枪与移液吸管吸入(50μL)生理盐水，将吸管口放到雌鼠阴道口3-5mm处，缓慢地将液体释放到阴道中然后再吸回，反复4-5次，然后将液体滴到载玻片上，干燥，95％酒精固定，然后用0.1％结晶紫溶液进行染色3min，冲洗后在显微镜下观察。
(5)手术操作：
·采用刮宫：腹部剃毛消毒，麻醉固定。
·耻骨联合上方2-3cm处纵向切开腹壁皮肤3cm左右，逐层切开组织，进入腹腔，缓慢挑出大鼠的Y型子宫。
·双侧宫角同时手术
·眼科直剪于宫颈上方约5mm处作纵行切口，长度约5mm，采用自制大鼠宫腔刮勺经宫颈上方切口行刮宫术，待宫腔四壁出现粗糙感时停止刮宫。
·无菌纱布彻底止血，7-0缝线间断缝合子宫，将子宫还纳至腹腔，生理盐水冲洗腹腔，用3-0缝合线关腹，术后每48h，肌注抗生素200mg/kg。
·模型组只在子宫处做相同长度纵切口
·分别在第两个动情周期后，处死，4％多聚甲醇固定24小时以上，乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中，切片染色观察。
(6)结果处理(检测)：对子宫采用马松染色、苏木精-伊红(HE)染色评价各组子宫愈合的效果。对其组织形态，Masson，HE，内膜细胞和子宫内膜厚度进行检测。
实施例1：
一、原料选择：
a.溶质：姜黄素、重组Ⅲ型胶原蛋白、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(C8H17N3 HCl，EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(C4H5NO3，NHS)；
b.溶剂：去离子水
(2)负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备：
a.称取一定量的姜黄素粉末加入到去离子水中，配制姜黄素水溶液，磁力搅拌2h，均质机循环30次；姜黄素的质量分数为0.15％；
b.将重组Ⅲ型胶原蛋白原料溶解在上述姜黄素水溶液中，搅拌均匀，形成负载姜黄素的胶原溶液，然后加入交联剂，交联剂为10％(w/w)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50％(w/w)的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)联合使用；搅拌均匀，反应2h得到负载姜黄素的重组Ⅲ型胶原蛋白可吸收水凝胶；其中重组Ⅲ型胶原蛋白的质量分数8％；按占重组Ⅲ型胶原蛋白的质量分数计：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为0.37％，N-羟基琥珀酰亚胺为0.37％；
对块状重组Ⅲ型胶原蛋白可吸收水凝胶切成2cm3透析的尺寸，将重组胶原蛋白可吸收水凝胶块置于磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)中进行透析交换交联剂，PBS渗透压为200mOsm/kg，透析时间为4天，均质机粉碎料体，倒入离心瓶中离心(9000rpm/20min)；将凝胶装入预灌封针中，灭菌柜121℃、15min；最终得到负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶。
二、动物实验结果
①大鼠子宫组织形态观察：
首先分别对两组大鼠腹部进行消毒，麻醉固定。在耻骨联合上方2-3cm处纵向切开腹壁皮肤3cm左右，逐层切开组织，进入腹腔，缓慢挑出大鼠的Y型子宫。图3为模型组的大鼠子宫组织形态图；图4为治疗组A的大鼠子宫组织形态图。如图3、4所示，模型组的大鼠子宫左侧有明显的组织异常增生，而治疗组的大鼠子宫左侧相对平整，无明显的增生。同样的模型组大鼠子宫右侧相对于治疗组也有明显的增厚，与造模大鼠的子宫组织形态相比，治疗后的大鼠子宫组织形态显著改善，说明负载低浓度姜黄素(0.15％)的重组胶原蛋白水凝胶对大鼠子宫组织形态的恢复有着显著的效果。
②子宫瘢痕(MASSON)：
将两组大鼠分别在第两个动情周期后处死，4％多聚甲醇固定24小时以上，乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中，切片脱蜡至蒸馏水；Weigert铁苏木素染色液染色3分钟；盐酸酒精分化15s(铁苏木素染色过深可适当增加分化时间)，水洗；Masson蓝化液返蓝，水洗，蒸馏水洗1min；丽春红品红染色液染色7-8s(根据组织密度控制染色时间)，0.2％弱酸洗1min；磷钼酸溶液洗2min，0.2％弱酸洗1min；苯胺蓝染色液染色1min30s(根据组织密度控制染色时间)，0.2％弱酸洗1min；95％乙醇快速脱水2-3s，无水乙醇脱水3次，每次5-10s；二甲苯透明3次，每次1-2min，封固。通过MASSON染色观测大鼠子宫瘢痕，如图5、6所示，为模型组的大鼠左、右侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图，可以明显看出，模型组大鼠的左侧和右侧子宫分别出现了明显的粘连；如图7、8所示，为治疗组A的大鼠左、右侧子宫瘢痕(MASSON)白光扫描图，治疗组大鼠的左侧和右侧子宫形态正常，没有出现粘连，说明负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶对治疗子宫粘连有显著的作用。
另一方面，从图片可以看出治疗组大鼠左右两侧的胶原纤维(蓝色)的光密度和面积显著小于模型组大鼠子宫，说明负载低浓度的姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶对大鼠子宫抗纤维化也有明显的促进作用。
③子宫内膜细胞(HE)：
将两组大鼠分别在第两个动情周期后处死，4％多聚甲醇固定24小时以上，乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中，切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染细胞核:切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。伊红染细胞质:切片入伊红染液中染色1-3min。脱水封片:将切片乙醇梯度脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。通过HE染色观测大鼠子宫内膜细胞(细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；细胞质和细胞外基质中的成分着红色)；
如图9-12所示，模型组大鼠子宫的左侧(图9)和右侧(图10)子宫内膜细胞相对于治疗组大鼠子宫的左侧(图11)和右侧(图12)子宫内膜细胞显著减少；并且从图片上可以看出，模型组大鼠左、右侧子宫面积较大，治疗组A宫腔面积相对于模型组小，说明治疗后的子宫内膜恢复效果较好，维持了宫腔的基本形状，没有粘连。
实施例2：
一、原料选择：
a.溶质：姜黄素、重组Ⅲ型胶原蛋白、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(C8H17N3 HCl，EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(C4H5NO3，NHS)；
b.溶剂：去离子水；
(2)负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法如下：
a.称取一定量的姜黄素粉末加入到去离子水中，配制姜黄素水溶液，磁力搅拌2h，均质机循环30次；姜黄素的质量分数为1％；
b.将重组Ⅲ型胶原蛋白原料溶解在上述姜黄素水溶液中，搅拌均匀，形成负载姜黄素的胶原溶液，然后加入交联剂，交联剂为10％(w/w)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50％(w/w)的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)联合使用；搅拌均匀，反应2h得到负载姜黄素的重组Ⅲ型胶原蛋白可吸收水凝胶；其中重组Ⅲ型胶原蛋白的质量分数8％；按占重组Ⅲ型胶原蛋白的质量分数计：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为0.35％，N-羟基琥珀酰亚胺为0.35％；
对块状重组Ⅲ型胶原蛋白可吸收水凝胶切成2cm3透析的尺寸，将重组胶原蛋白可吸收水凝胶块置于磷酸盐缓冲液(PBS)中进行透析交换交联剂，PBS渗透压为200mOsm/kg，透析时间为4天。均质机粉碎料体，倒入离心瓶中离心(9000rpm/20min)；将凝胶装入预灌封针中，灭菌柜121℃、15min；最终得到负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶。
二、动物实验结果
①大鼠子宫组织形态观察：
首先分别对两组大鼠腹部进行消毒，麻醉固定。在耻骨联合上方2-3cm处纵向切开腹壁皮肤3cm左右，逐层切开组织，进入腹腔，缓慢挑出大鼠的Y型子宫。模型组和治疗组B如图13、14所示，模型组的大鼠子宫左侧有明显的组织异常增生，而治疗组B的大鼠子宫左侧相对平整，无明显的增生。同样的模型组大鼠子宫右侧相对于治疗组B也有明显的增厚，与造模大鼠的子宫组织形态相比，经治疗组B处理后的大鼠子宫组织形态显著改善，说明高浓度姜黄素水凝胶对大鼠子宫组织形态的恢复有着显著的效果。
②子宫瘢痕(MASSON)：
将两组大鼠分别在第两个动情周期后处死，4％多聚甲醇固定24小时以上，乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中，切片脱蜡至蒸馏水；Weigert铁苏木素染色液染色3分钟；盐酸酒精分化15s(铁苏木素染色过深可适当增加分化时间)，水洗；Masson蓝化液返蓝，水洗，蒸馏水洗1min；丽春红品红染色液染色7-8s(根据组织密度控制染色时间)，0.2％弱酸洗1min；磷钼酸溶液洗2min，0.2％弱酸洗1min；苯胺蓝染色液染色1min30s(根据组织密度控制染色时间)，0.2％弱酸洗1min；95％乙醇快速脱水2-3s，无水乙醇脱水3次，每次5-10s；二甲苯透明3次，每次1-2min，封固。
通过MASSON染色观测大鼠子宫瘢痕，如图15-16所示，模型组大鼠的子宫出现了明显的粘连；如图17、18所示，治疗组B大鼠的左侧和右侧子宫形态正常，且没有出现粘连，说明高浓度姜黄素水凝胶可以有效预防粘连。另一方面，从图片可以看出治疗组B大鼠高浓度姜黄素水凝胶左右两侧的胶原纤维(蓝色)的光密度和面积显著小于模型组大鼠子宫，说明高浓度姜黄素水凝胶对大鼠子宫抗纤维化也有明显的促进作用。
③子宫内膜细胞(HE)：
将两组大鼠分别在第两个动情周期后处死，4％多聚甲醇固定24小时以上，乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中，切片脱蜡至蒸馏水，苏木素染细胞核:切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。伊红染细胞质:切片入伊红染液中染色1-3min。脱水封片:将切片乙醇梯度脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。通过HE染色观测大鼠子宫内膜细胞(细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；细胞质和细胞外基质中的成分着红色)。
如图19-22所示，模型组大鼠子宫的左侧(图19)和右侧(图20)子宫内膜细胞相对于治疗组B大鼠子宫的左侧(图21)和右侧(图22)子宫内膜细胞显著减少；同时从图片上可以看出，模型组大鼠左右侧子宫面积较大，而治疗组B宫腔面积相对于模型组小，说明治疗后的子宫内膜恢复效果良好，且维持了宫腔的基本形状，没有粘连。
④子宫内膜厚度：
通过HE染色观测大鼠子宫内膜厚度(平均子宫内膜厚度＝面积/周长，使用图像分析软件(Image Pro Plus)计算子宫内膜面积和周长)，如图23所示，通过HE染色观测大鼠子宫内膜厚度(平均子宫内膜厚度＝面积/周长，使用图像分析软件(Image Pro-Plus)计算子宫内膜面积和周长)，如图23所示，治疗组A大鼠左侧子宫内膜厚度(571μm)与模型组大鼠左侧子宫内膜厚度(360.5μm)相比，治疗组A的子宫内膜显著变厚；治疗组A大鼠右侧子宫内膜厚度(675μm)与模型组大鼠右侧子宫内膜厚度(389.25μm)相比，治疗组A的子宫内膜显著变厚，说明低浓度姜黄素水凝胶对大鼠子宫内膜的恢复有着显著的效果；
治疗组B大鼠左侧子宫内膜厚度(633μm)与模型组大鼠左侧子宫内膜厚度(360.5μm)相比，治疗组B的子宫内膜显著变厚；治疗组大鼠右侧子宫内膜厚度(729μm)与模型组大鼠右侧子宫内膜厚度(389.25μm)相比，治疗组B的子宫内膜显著更加显著，说明高浓度姜黄素水凝胶相对于低浓度姜黄素水凝胶对大鼠子宫内膜的恢复有着更好的效果。
治疗组C大鼠左侧子宫内膜厚度(379.7μm)与模型组大鼠左侧子宫内膜厚度(360.5μm)相比，治疗组C的子宫内膜增厚不明显；治疗组C大鼠右侧子宫内膜厚度(407.3μm)与模型组大鼠右侧子宫内膜厚度(389.25μm)相比，治疗组C的子宫内膜增厚也不明显，说明低浓度不均质姜黄素水凝胶对大鼠子宫内膜的恢复效果不佳。
治疗组D大鼠左侧子宫内膜厚度(405.5μm)与模型组大鼠左侧子宫内膜厚度(360.5μm)相比，治疗组D的子宫内膜增厚不明显；治疗组D大鼠右侧子宫内膜厚度(414.7μm)与模型组大鼠右侧子宫内膜厚度(389.25μm)相比，治疗组D的子宫内膜增厚也不明显，说明高浓度不均质姜黄素水凝胶对大鼠子宫内膜的恢复效果不佳。
由以上分析可知，根据子宫组织形态、子宫瘢痕、内膜细胞和子宫内膜厚度可以看出，不均质的姜黄素水凝胶在具体应用时对大鼠子宫内膜的恢复并没有显著的效果；在负载一定浓度范围内(0.15-1％)且经均质处理后所制备的姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶对受损后的子宫内膜具有较好的修复作用，具有显著的抗纤维化、防粘连效果。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (8)

1.一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，由下列成分组成：姜黄素、交联剂、重组胶原蛋白和水；
其中姜黄素的质量分数为0.15-1.0%；重组胶原蛋白质量分数为5～10％；交联剂为1-( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，其用量均为重组胶原蛋白质量的0.3-0.4%；余量为水；所述姜黄素在使用时先溶于水中，是以均质处理后的均质液添加；
所述负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）首先称取一定量的姜黄素粉末加入到水中，经磁力搅拌、均质循环处理后得到姜黄素均质液；其中磁力搅拌的时间为1.5-2h，均质循环的次数为20-30次；
（2）将重组胶原蛋白原料溶解在姜黄素均质液中，搅拌均匀，形成负载姜黄素的胶原溶液；然后加入交联剂N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀，反应一段时间得到负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶，对载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸，得到负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶块，置于磷酸盐缓冲液中进行透析交换交联剂，设定PBS渗透压和透析时间进行透析，经透析后，再对块状负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶进行粉碎法制粒，再经灌装、灭菌即得负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶。
2. 根据权利要求1所述的一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：1；重组胶原蛋白为重组人Ⅲ型胶原蛋白，质量分数为8%。
3.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述水包括去离子水、注射用水、生理盐水。
4.根据权利要求1所述的负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，步骤（2）中所述反应一段时间为2-6h；设置磷酸盐缓冲液的渗透压为200～500mOsm/kg，透析时间为4-6天；磷酸盐缓冲液的pH为7.5-8。
5.根据权利要求1所述的负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶，其特征在于，步骤（2）中，所述负载姜黄素的重组胶原蛋白可吸收水凝胶切成适合透析的尺寸为1-2cm3。
6.根据权利要求1-5任一项所述的负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶在制备预防和治疗宫腔粘连、子宫抗纤维化以及促进子宫内膜恢复产品中的应用。
7.一种复合制剂，其特征在于，包括权利要求1-5任一所述的负载姜黄素的重组胶原蛋白水凝胶。
8.权利要求7所述的一种复合制剂在制备子宫内膜各种损伤的修复产品中的用途，其特征在于，所述子宫内膜各种损伤的修复包括治疗宫腔粘连、子宫抗纤维化以及促进子宫内膜恢复。
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