CN112426568B - 一种基于藕的组织工程支架及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于藕的组织工程支架及其制备方法与应用。该制备包括以下步骤：S1、莲藕预处理：将莲藕去皮、切片，冷冻干燥，得到冻干藕支架；S2、组织工程化处理：将步骤S1中得到的冻干藕支架用生物相容性材料进行组织工程化处理，得到基于藕的组织工程支架。由于藕本身独特的天然结构和化学组成，本发明通过冷冻干燥处理后，该组织工程支架仍然保留了良好的多孔结构，可支撑细胞的粘附与生长，同时具备了良好的生物相容性、抗氧化性和促进细胞迁移、成血管等功能性，有利于促进组织修复，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于组织工程支架技术领域，特别涉及一种基于藕的组织工程支架及其制备方法与应用。
背景技术
组织或器官的损伤或缺失造成身体机能异常已经是严重威胁人类健康的重大疾病之一，传统的治疗方式包括自体移植和同种异体器官移植，存在着供体来源有限、二次损伤、成本高、感染风险高等局限性。随着医疗发展的需求和科学技术的日益增长，“组织工程”的出现为修复治疗受损组织或器官提供了全新的思路。组织工程材料能够有效、快速地作用于损伤部位，相较于器官移植，组织工程材料对身体的影响更小，且免疫排斥性会更低，相对于直接使用药物治疗，组织工程材料对其他器官、组织的影响较小，可以避免肝脏的首过作用，提升药物的使用效率。
组织工程的概念最早由Joseph P.VaCanti和Robert Langer阐释，随后作为一个再生医学新概念被广泛认识和研究。组织工程的研究主要内容则是结合生物支架、干细胞、生长因子等因素，构建适宜的体系来替换或修复受损器官。其中生物支架至关重要，理想的生物支架有如下特点：1、生物相容性良好，安全无毒；2、可模拟细胞外基质，提供细胞生长附着、生长、繁殖必要条件；3、具有可加工性和可操作性，可以根据不同条件的创伤需求调节组分和结构；4、需要具备一定的力学性能和适宜的降解性能。但目前常见的组织工程支架往往面临着材料来源复杂、制备难度大、需要使用有毒溶剂、缺乏生物安全性、缺乏功能性和可操作性等问题。因此，亟需开发更安全、更环保、更有效的新型组织工程支架。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于藕的组织工程支架的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的组织工程支架。
本发明的再一目的在于提供所述基于藕的组织工程支架的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于藕的组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、莲藕预处理：将莲藕去皮、切片(整形)，冷冻干燥，得到冻干藕支架；
S2、组织工程化处理：将步骤S1中得到的冻干藕支架用生物相容性材料进行组织工程化处理，得到基于藕的组织工程支架。
步骤S1中所述的冻干藕支架的形状大小可根据组织修复的需要调整；优选为矩形薄片或圆形薄片；更优选为20mm×10mm、厚度均不超过1mm的矩形薄片或直径为8～15mm、厚度均不超过1mm的圆形薄片。
步骤S1中所述的切片的过程中需要将莲藕浸泡于水中防止氧化。
所述的水为去离子水、蒸馏水或超纯水中的一种或多种；优选为超纯水。
步骤S1中所述的冷冻的温度为-20℃～-80℃；优选为-80℃；当冷冻温度过高(高于-20℃)时，难以达到将样品进一步冷冻干燥的要求。
步骤S1中所述的冷冻的时间为大于2h；优选为2h～24h；更优选为24h；当冷冻时间过短(少于2h)，难以达到将样品进一步冷冻干燥的要求。
步骤S2中所述的生物相容性材料为金属生物材料、生物陶瓷类生物材料、天然高分子材料和人工合成高分子生物材料中的一种或多种；进一步优选为天然高分子材料；再进一步优选为壳聚糖；更进一步优选为中粘度的壳聚糖。
步骤S2中所述的组织工程化处理包括但不限于使用生物医学工程技术形成水凝胶和/或矿化等，以提高冻干藕支架的生物相容性及功能性；进一步优选为使用生物医学工程技术形成水凝胶；再进一步优选为利用物理裹覆和/或壳聚糖相关的交联方法形成水凝胶。
所述的壳聚糖相关的交联方法包括通过壳聚糖上的氨基与交联剂的醛基之间发生化学反应而形成交联结构的交联方法，天然生物交联剂交联法，以及高能量源引发高分子链间的相互作用的交联方法等；优选为甲醛交联法，戊二醛交联法，京尼平交联法，紫外光照交联法；更优选为戊二醛交联法。
所述的组织工程化处理，具体通过如下任一种方式实现：
(1)将冻干藕支架浸入到壳聚糖醋酸溶液中，在完全覆盖后将其取出，冻干，得到基于藕的组织工程支架；
或
(2)将戊二醛溶液加入到壳聚糖醋酸溶液中，搅拌混合均匀，得到混合溶液；然后将冻干藕支架浸入到混合溶液中进行裹覆，待裹覆完全后将其取，冻干，得到基于藕的组织工程支架。
方式(1)和(2)中所述的壳聚糖醋酸溶液通过如下方法配制得到：将壳聚糖粉末加入到醋酸溶液中，加热搅拌溶解，得到壳聚糖醋酸溶液。
所述的壳聚糖为中黏度、脱乙酰度≥80％的壳聚糖。
所述的醋酸溶液的浓度为体积比百分比2％。
所述的壳聚糖醋酸溶液的浓度为质量体积比5％。
所述的加热的温度为40℃～60℃，优选为50℃。
方式(2)中所述的戊二醛溶液的浓度为体积比百分比0.6％。
方式(2)中所述的戊二醛溶液与壳聚糖醋酸溶液的体积比为2:5。
方式(2)中所述的冻干的条件为：在-80℃冷冻2h～24h(优选为24h)。
一种基于藕的组织工程支架，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的基于藕的组织工程支架在制备生物医用材料中的应用。
所述的生物医用材料包括但不限于骨修复与创伤修复的生物医用材料，该组织工程支架可以清除组织损伤部位的自由基和细胞内活性氧，促进创伤愈合。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明利用日常生活中常见的食源性材料植物藕，通过简单的冷冻干燥技术制备基于藕的组织工程支架。由于藕本身独特的天然结构和化学组成，通过冷冻干燥处理后，该组织工程支架保留了良好的多孔结构，可支撑细胞的粘附与生长，同时具备了良好的生物相容性、抗氧化性和促进细胞迁移、成血管等功能性，有利于促进组织修复。
(2)本发明中的新型组织工程支架材料易于获得、价格低廉、绿色安全，同时制备方法简单，不需要复杂的处理技术，可操作性强，避免了人工合成支架材料中常见的有毒有害溶剂的使用及残留、操作工序复杂、成本高等问题，具有良好的应用前景。
(3)本发明中的新型组织工程支架在冷冻干燥藕支架的基础上可有针对性地使用不同生物相容性物质(包括水凝胶在内的各类生物材料)处理，在保证原有的良好孔隙结构、吸水和透气性能及生物相容性的基础上，根据特定的使用场景强化该组织工程支架的功能性和生物活性，使其在快速有效作用于组织损伤部位、提供保护免受继发感染，去除伤口渗出物的同时进一步促进组织修复。
附图说明
图1是冻干藕支架、裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架和裹覆交联壳聚糖的藕的组织工程支架的表面与断面扫描电镜图。
图2是冻干藕支架、裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架和裹覆交联壳聚糖的藕的组织工程支架的溶胀动力学曲线图。
图3是冻干藕支架、裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架和裹覆交联壳聚糖的藕的组织工程支架的体外降解质量损失曲线图。
图4是冻干藕支架、裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架和裹覆交联壳聚糖的藕的组织工程支架MTT法细胞毒性测试结果图。
图5是冻干藕支架、裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架和裹覆交联壳聚糖的藕的组织工程支架的细胞活死染色(CalCein-AM/PI)测试结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1冻干藕支架的制备
处理莲藕：将藕(睡莲科植物根茎，本发明中选用新鲜市售莲藕)去皮，整形，制备过程中将材料浸泡在超纯水中防止氧化。用超纯水清理切片以后将其用自封袋分装，在-80℃冰箱中冷冻24h后，用冷冻干燥机冻干24h(-40℃)，得到冻干藕支架。
所得冻干藕支架主要为20mm×10mm的矩形薄片、直径为15mm的圆形薄片以及直径为8mm的圆形薄片(厚度均不超过1mm)，脆性高。
实施例2裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架制备
(1)壳聚糖醋酸溶液的制备：称取0.5g壳聚糖粉末(中黏度；脱乙酰度≥80％)，缓慢加入10mL 2％(v/v)的醋酸溶液中，边加入边搅拌，若溶解不充分可放入50℃恒温水浴锅中加热至完全溶解为止，制得浓度为5％(w/v)的壳聚糖醋酸溶液。
(2)组织工程支架的制备：将实施例1中的冻干藕支架浸润在壳聚糖醋酸溶液中，在完全覆盖后将其取出置于容器管内，-80℃冷冻24h后，用冷冻干燥机冻干24h(-40℃)，获得淡黄色、疏松片状组织工程支架，有较好的弹性。
实施例3裹覆交联壳聚糖的藕(Chitosan-lotus root hydrogel)的组织工程支架的制备
(1)壳聚糖醋酸溶液的制备：称取0.5g壳聚糖粉末(中黏度；脱乙酰度≥80％)，缓慢加入10mL 2％(v/v)的醋酸溶液中，边加边搅拌，若溶解不充分即放入50℃恒温水浴锅中加热至完全溶解为止，制得浓度为5％(w/v)的壳聚糖醋酸溶液。
(2)戊二醛溶液的制备：原料采用50％(v/v)戊二醛溶液，稀释后制成0.6％(v/v)的戊二醛溶液。
(3)组织工程支架的制备：将4mL制备好的0.6％(v/v)戊二醛溶液加入10mL制备好的5％(w/v)的壳聚糖醋酸溶液中，边加边搅拌让戊二醛与壳聚糖充分接触，混合均匀后，将准备好的冻干藕支架(实施例1制备)放入该未成胶的溶液中进行裹覆，裹覆完全后将其取出于-80℃冻24h后，冷冻干燥机冻干24h(-40℃)，得到成品。
实施例4性能测试
1、表面结构测试
(1)测试方法：取三种组织工程支架(实施例1～3制备)，使用钨灯丝扫描电子显微镜进行成像，观察样品表面及内部结构。由于该组织工程支架本身并不具有良好的导电能力，故对其进行如下处理：取直径约8mm的圆形样品，将其整齐地固定在导电胶上，在材料表面均匀地喷涂覆盖一层金纳米颗粒以实现良好的导电性，并在显微镜中进行观察。
(2)测试结果如图1所示：从图1可以明显看出，三种组织工程支架内部都有明显的多孔结构，说明壳聚糖、交联壳聚糖的裹覆不会影响冻干藕支架内部结构，具备一定的透气、透水以及载药潜能。
2、溶胀性能测试
(1)测试方法：取三种组织工程支架(实施例1～3制备)，各设五个平行样。然后分别将样品浸泡在PBS缓冲溶液中，于37℃下进行溶胀测试。在预定的时间点：20min，40min，60min，80min，100min，140min，180min，220min，1420min取出，除去表面液体后称重，最后计算溶胀率，绘制溶胀率-时间曲线。
其中，溶胀率的计算公式如下：
式中：M0为材料烘干后的初始质量；
Mt为每一个时间点的材料质量。
(2)测试结果如图2所示：从图2中可以看出，三种组织工程支架都具有一定的吸水性能。达到溶胀平衡后，冻干藕支架的平衡溶胀率最高，裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架与裹覆交联壳聚糖的藕的组织工程支架的平衡溶胀率相近，表明壳聚糖/交联壳聚糖在组织工程支架表面的附着减缓了水分的进入。
3、体外降解测试
(1)测试方法：取三种组织工程支架(实施例1～3制备)，每组设五个平行样，于37℃、PBS缓冲溶液条件下进行降解测试，在预定的时间点：0.5d，1d，1.5d，2d，3.5d，6.5d，13.5d，30d取出、烘干至恒重，计算质量损失，并绘制质量损失-时间曲线。其中，质量损失的计算公式如下：
式中：M0为材料烘干后的初始质量；
Mt为每个时间点的材料烘干后的质量。
(2)测试结果如图3所示：从图3中可以看出，冻干藕支架的质量损失速率和降解程度较小，而裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架的质量损失最大。相比于裹覆单独的壳聚糖，裹覆交联壳聚糖在前期的质量损失速率较小，通过调整裹覆壳聚糖的交联程度有望调节其降解速率，更好地发挥该组织工程支架的功能性。
4、细胞毒性测试
(1)测试方法：取三种组织工程支架(实施例1～3制备)，采用MTT法考察其细胞毒性。实验设4组，分别为不加材料的对照组及三种样品组，每组设置5个复孔。取小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)、计数，按细胞数5×103个/孔接种于96孔板，于37℃、5％CO2培养24h至贴壁完全，弃去原培养基，分别加入DMEM培养基(含10％(v/v)血清)、冻干藕支架、裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架和裹覆交联壳聚糖的藕的组织工程支架的浸提液(将三种组织工程支架以30mg/mL的浓度浸泡于DMEM培养基中，在37℃下振摇孵育24h，使用0.22μm无菌滤膜过滤收集，保存于4℃冰箱，使用前恢复至室温并加入10％(v/v)血清)，继续培养1、3、6d后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)继续孵育4h，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振摇10min，通过酶标仪测定490nm的OD值。
(2)测试结果如图4所示：从图4中可以看出3个时间点中，4个组间的OD值并没有显著性差异，表明材料无明显的细胞毒性，细胞相容性好。
5、细胞活死测试
(1)测试方法：取三种组织工程支架(实施例1～3制备)，采用CalCein-AM/PI染色法，观察细胞在不同组织工程支架样品浸提液中的生长情况。实验设4组，每组设置5个复孔。取小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)、计数，按细胞数5×105个/孔接种于12孔板，培养于37℃、5％CO2培养箱24h至贴壁完全，加入DMEM培养基(含10％血清)、冻干藕支架、裹覆壳聚糖的藕的组织工程支架和裹覆交联壳聚糖的藕的组织工程支架的浸提液(将三种组织工程支架以30mg/mL的浓度浸泡于DMEM培养基中，在37℃下振摇孵育24h，使用0.22μm无菌滤膜过滤收集，保存于4℃冰箱，使用前恢复至室温并加入10％(v/v)血清)继续培养4、7d后，弃去孵育液，加入配置好的CalCein-AM/PI试剂，染色20min，用荧光显微镜观测染色情况。
(2)测试结果如图5所示：从图5中可以看出，4天和7天时几乎没有出现死细胞，细胞的形态良好，表明三种组织工程支架都可支持细胞的正常生长，无明显的细胞毒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于藕的组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、莲藕预处理：将莲藕去皮、切片，冷冻干燥，得到冻干藕支架；
S2、组织工程化处理：将步骤S1中得到的冻干藕支架用生物相容性材料进行组织工程化处理，得到基于藕的组织工程支架；
步骤S2中所述的组织工程化处理为使用生物医学工程技术形成水凝胶，以提高冻干藕支架的生物相容性及功能性；
所述的组织工程化处理具体通过如下任一种方式实现：
(1)将冻干藕支架浸入到壳聚糖醋酸溶液中，在完全覆盖后将其取出，冻干，得到基于藕的组织工程支架；
或
(2)将戊二醛溶液加入到壳聚糖醋酸溶液中，搅拌混合均匀，得到混合溶液；然后将冻干藕支架浸入到混合溶液中进行裹覆，待裹覆完全后将其取出，冻干，得到基于藕的组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的基于藕的组织工程支架的制备方法，其特征在于：
方式(1)和(2)中所述的壳聚糖醋酸溶液通过如下方法配制得到：将壳聚糖粉末加入到醋酸溶液中，加热搅拌溶解，得到壳聚糖醋酸溶液；
所述的壳聚糖为中黏度、脱乙酰度≥80％的壳聚糖；
所述的醋酸溶液的浓度为体积比百分比2％；
所述的壳聚糖醋酸溶液的浓度为质量体积比5％；
所述的加热的温度为40℃～60℃。
3.根据权利要求1所述的基于藕的组织工程支架的制备方法，其特征在于：
方式(2)中所述的戊二醛溶液的浓度为体积比百分比0.6％；
方式(2)中所述的戊二醛溶液与壳聚糖醋酸溶液的体积比为2:5；
方式(2)中所述的冻干的条件为：在-80℃冷冻2h～24h。
4.根据权利要求1所述的基于藕的组织工程支架的制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述的冷冻的温度为-20℃～-80℃；
步骤S1中所述的冷冻的时间为大于2h。
5.根据权利要求1所述的基于藕的组织工程支架的制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述的冻干藕支架为20mm×10mm、厚度不超过1mm的矩形薄片或直径为8～15mm、厚度不超过1mm的圆形薄片；
步骤S1中所述的切片的过程中将莲藕浸泡于水中防止氧化；
所述的水为去离子水、蒸馏水或超纯水中的一种或多种。
6.一种基于藕的组织工程支架，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。
7.权利要求6所述的基于藕的组织工程支架在制备生物医用材料中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的生物医用材料为骨修复和/或创伤修复的生物医用材料。
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