KR101231033B1

KR101231033B1 - 자일란 분해활성이 우수한 신규한 균주 페니바실러스 자일란에스덴스 ｓｋ2925

Info

Publication number: KR101231033B1
Application number: KR1020100133442A
Authority: KR
Inventors: 김수기; 조상범; 원미영; 곽완섭; 문여황; 오영균; 김수옥
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2013-02-07
Also published as: KR20120071763A

Abstract

본 발명은 자일란 분해활성이 우수한 신규한 균주 페니바실러스 자일란에스덴스 SK2925 및 그 응용에 관한 것이다.

Description

자일란 분해활성이 우수한 신규한 균주 페니바실러스 자일란에스덴스 ＳＫ2925 {Novel stain Paenibacillus xylanexedens SK2925 with high xylanase activity}

섬유소, 특히 헤미셀룰로스는 자연계에서 두 번째로 광범위하게 존재하는 다당류로서 자일란을 기본 구성성분으로 가지고 있다. 이러한 자일란을 분해하는 효소로서 xylanase는 자일란의 베타 D-1,4-xylopyranosyl 결합을 무작위로 가수분해하는 효소이다 (Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 2009. 37:383-388).

자일란은 침엽수에 최대 45%, 활엽수에는 최대 90% 그리고 밀, 보리, 벼, 귀리 등의 짚에는 최대 78%까지 존재하여 목질계 혹은 짚과 같은 사료자원에 풍부하게 존재하고 있다 (Food Engineering Progress. 2010. 14:263-270). 따라서 이러한 자일란의 분해는 산업적으로 큰 의미를 갖는다. 실제 xylanase는 펄프 및 제지 산업, 목질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 생산하는 대체에너지 산업, 당뇨병 환자를 위한 저혈당지수 원료의 생산과 같은 식품산업 및 사료자원의 영양적 가치를 향상시키는 사료첨가제 산업등 다양한 산업분야에서 사용되고 있다. 특히 축산업에 있어서는 기존 이용이 어려운 조사료원이나 부존사료자원의 활용성을 높이기 위한 노력이 집중되고 있으며, 난분해성 물질의 가수분해를 통한 새로운 영양소의 사료로서 이용이 매우 중요하다. 식물세포벽에 존재하는 헤미셀룰로오스와 같은 난분해성 탄수화물은 반추동물에게는 좋은 영양원이 될 수 있으나, 기타 단위가축에게는 소화가 되지 않고, 장내점도를 증가시켜 오히려 다른 영양소의 흡수를 방해한다 (J. Anim. Sci & Technol (Kor.). 2009. 51:427-432).

따라서 헤미셀룰로오스와 같은 난분해성 물질의 주성분인 자일란을 분해시켜 가소화성 탄수화물(digestable carbohydrate)의 비율을 향상시키는 것은 사료적 가치를 향상시키고, 새로운 사료자원을 개발할 수 있다. 또한 반추동물에 있어 자일란분해효소의 첨가는 섬유소 이용률을 높이고, 반추위 미생물태 단백질의 합성을 증진시키고 단백질 분해율을 향상시켜 영양소 이용효율을 증진시키고 결과적으로 반추동물의 생산성을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 자일란 분해활성이 우수한 미생물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 우수한 자일란 분해효소 활성을 가지는 페니바실러스 자일란엑스덴스 SK2925(KACC91594P)를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 전분분해 효소 활성 및 섬유소 분해효소 활성을 추가로 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 난분해성 탄소원 기질에 상기 본 발명의 균주를 처리하여 난분해성 탄소원을 분해하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법의 일 구현예에 있어서, 상기 난분해성 탄소원은 왕겨인 것이 바람직하고, 상기 왕겨는 평연 왕겨 또는 산-알카리처리된 왕겨인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 포함하는 난분해성 탄소원 분해용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 난분해성 탄소원을 포함한 배지에서 상기 본 발명의 균주를 배양한 후에 상기 배양물로부터 자일란 분해효소를 분리정제하는 단계를 포함하는 자일란 분해효소 수득방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서 상기 환원당은 포도당 또는 자당인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명에서 자일란 분해효소 활성이 우수한 신규한 균주 페니바실러스 자일란엑스덴스 SK2925는 다양한 산업적인 분야에 사용될 수 있다.

도 1은 Extracellular xylanase 활성을 나타내는 세균 집락을 나타낸 사진이다.
도 2는 Paenibacillus xylanexedens SK2925균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 나타낸 그림이다.
도 3은 분리된 균주 Paenibacillus xylanexedens SK2925의 분류계통학적 위치 분석결과를 나타낸 표이다.
도 4는 산알칼리 처리 왕겨를 유일한 탄소원으로하는 M9 배지에서 P. xylanexedens SK2925 균주의 성장성을 나타낸 그래프이다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한된 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1. 자일란 분해활성이 우수한 균주의 분리

1. 실험방법

1) 분리원의 준비

자일란 분해활성이 우수한 균주를 분리하기 위하여 토양과 느타리버섯 폐배지 발효액을 분리원으로 사용하였다. 분리원으로 사용된 토양은 건국대학교 동물생명과학대학 인근의 토양을 채취하여 사용하였다. 채취된 토양은 멸균된 0.85% (w/v) NaCl 용액과 1:1의 비율로 혼합한 후에 차가운 얼음물에서 1시간 동안 교반하였다. 다시 현탁액을 1,000 rpm에서 원심분리하여 토양입자와 비중이 높은 불순물을 제거하였다. 원심분리한 상등액을 다시 새로운 용기에 옮기어 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액은 버리고 원심분리된 pellet을 수집하였다. 다시 수집된 pellet을 멸균된 0.85% (w/v) NaCl용액으로 2회 세척한 후에 최종적으로 토양내 세균을 수집하였다. 수집된 토양내 균체는 다시 0.85% (w/v) NaCl 용액에 현탁하였고, DMSO를 10%가 되도록 첨가한 후에 실험에 사용되기 전까지 -70℃에서 보관하였다. 토양 균체 현탁액에 존재하는 포자형성 세균의 분리를 위하여 현탁액을 80℃에서 15분간 열처리하여 사용하였다.

분리원으로 사용된 느타리버섯 폐배지 발효액은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 상기 토양 전처리과정에서 얻어진 토양 균체 현탁액과 열처리된 토양 균체 현탁액을 각각 느타리버섯 폐배지 함유 배양액에 최종 1% (v/v)로 접종한 후에 30 ℃ 항온기에서 3일 이상 배양하여 제조하였다. 느타리버섯 폐배지 발효액 제조를 위한 배양액은 느타리버섯 폐배지 20g과 CHO buffer (K₂HPO₄, 0.1 g/L; MgSO₄, 0.01 g/L, NaCl, 1 g/L, CH₃COONa 1 g/L, pH 7.0) 40 mL을 혼합하여 제조하였다. 토양을 첨가한 느타리버섯 폐배지 발효액에 존재하는 포자형성 세균의 분리를 위하여 현탁액을 80℃에서 15분간 열처리하여 사용하였다.

2) 미생물의 분리

상기의 분리원들로 부터 자일란 분해균주를 분리하기 위하여, 각 분리원들을 0.85% NaCl용액으로 희석한 후에 LB, YM, PDA, MRS 평판배지에 도말한 후에 30 ℃ 항온기에서 배양하였다. 배양 후, 각 평판배지에서 형태학적으로 서로 다른 집락들을 분리하였고, 3회에 걸친 단일 집락 (single colony)을 분리한 후에 액상배지에서 증균하였다. 증균된 배양액에 DMSO용액을 최종 농도가 10%가 되도록 첨가한 후 -70℃에서 보관하였다. 준비된 균주 배양액을 다시 자일란분해효소 활성 평가용 평판배지(표 1)에 희석 도말하여 얻어진 집락들 중에서 congo red와 반응하여 투명환을 형성하는 집락들을 선발하였다.

성분	함량
Tryptone	10 g
Yeast Extract	5 g
NaCl	5 g
Xylan	10 g
Distilled Water	1 L

표 1은 자일란 분해효소 활성 평가용 배지조성을 나타낸 표이다.

상기 실시예의 결과는 아래와 같다.

1) 균주분리

각각의 분리원으로부터 oat spelt xylan과 birchwood xylan을 기질로 하는 LB와 M9 평판배지에서 투명환을 보이는 집락들을 extracellular xylanase를 분비하는 세균으로 판단하였고 총 117개의 집락들을 분리하였고, 이중 활성의 크기가 큰 균주를 분리하여 SK2925균주로 명명하였다 (도 1).

실시예 2. 자일란 분해활성이 우수한 균주의 동정

분리된 세균의 동정을 위하여 세균의 16S rRNA 유전자 서열을 조사하였다. 세균의 16S rRNA 유전자 분석은 27F primer (forward), 1492R primer (reverse)을 이용하였으며, 모든 분석은 솔젠트 (대한민국, 대전)에 의뢰하여 분석하였다. 얻어진 세균들의 16S rRNA 유전자 서열은 GenBank에서 BLAST을 이용하여 homology 검색을 수행하였으며, 가장 높은 homology를 나타낸 균주로 명명하였다.

분리된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과 도 2와 같은 염기서열을 얻을 수 있었다. 염기서열을 이용하여 분류계통학적 위치를 분석할 결과 Paenibacillus xylanexedens와 유사하게 나타났으며(도 3), 이에 분리된 균주를 Paenibacillus xylanexedens SK2925로 명명하였으며, 2010년 11월 11일에 대한민국 경기도 수원시 서둔동 소재 국립농업과학원 농업유전자센터에 KACC91594P로 기탁하였다.

실시예 3. 선발균주의 다양한 효소활성 평가

분리된 세균이 자일란 분해효소활성과 함께 가지고 있는 다양한 효소활성을 평가하였다. 평가된 효소들은 전분분해효소, 섬유소 분해효소 (CMCase), 단백질분해효소 (Protease), 지방분해효소 (Lipase), xylan 분해효소 (Xylanse) 등이다. 전분분해효소 평가용 평판배지는 complex medium (LB, YM, PDA, MRS)에 soluble starch를 1% 첨가하여 제조하였고, 효소활성 검사용액은 0.2% iodine과 0.2% potassium iodine 혼합액을 사용하였고, 투명대의 형성여부로 활성을 평가하였다. 섬유소 분해효소 평가용 평판배지는 complex medium (LB, YM, PDA, MRS)에 carboxymethyl cellulose를 1% 첨가하여 제조하였고, 효소활성 검사용액은 0.2% congo red 용액을 사용하였고, 투명대의 형성여부로 활성을 평가하였다. 단백질 분해효소 평가용 평판배지는 complex medium (LB, YM, PDA, MRS)에 탈지분유를 2% 첨가하여 제조하였고, 투명대의 형성여부로 활성을 평가하였다. 지방 분해효소 평가용 평판배지는 complex medium (LB, YM, PDA, MRS)에 tributyrin을 1% 첨가하여 제조하였고, 투명대의 형성여부로 활성을 평가하였다. Xylan 분해효소 평가용 평판배지는 complex medium (LB, YM, PDA, MRS)에 oat spelt xylan 혹은 birchwood xylan을 1% 첨가하여 제조하였고, 효소활성 검사용액은 0.2% congo red용액을 사용하였고, 투명대의 형성여부로 활성을 평가하였다.

자일란 분해효소외에 선발균주가 함유하고 있는 효소활성을 조사한 결과는 표 2와 같다.

	전분분해효소	섬유소분해효소	단백질분해효소	지방분해효소
Paenibacillus xylanexedens SK2925	+	+	-	-
-, 활성없음; +, 활성있음; ++, 강한활성

표 2는 선발균주의 기타 효소활성을 나타낸 표이다.

실시예 4. 난분해성 탄소원을 유일 탄소원으로하는 배지에서 선발균주의 성장, 환원당 생산능력 및 자일란 분해효소 생산성 평가

1) 난분해성 탄소원을 유일한 탄소원으로하는 배지에서의 성장성 평가

선발된 균주에 대하여 난분해성 탄소원을 유일한 탄소원으로하는 최소배지 M9 배지(표 3)에서의 성장성을 평가하였다. 난분해성 탄소원으로는 왕겨, 팽연왕겨, 산알칼리 처리 팽연왕겨를 사용하였다. 성장성 평가방법은 상기 왕겨-M9 평판배지에서의 성장성과 액체배지 상에서의 성장성을 평가하였다.

성분	함량
KH₂PO₄·2H₂O	15.1 g
KH₂PO₄	3 g
NaCl	0.5 g
NH₄Cl	1 g
Distilled Water	1 L

표 3은 M9 배지조성을 나타낸 표이다.

2) 생균수 측정 (Viable cell count)

생균수 측정은 배양 종료 후에 배양액 1 ml를 취하여 9 ml의 0.85% 멸균 NaCl 용액에서 순차적으로 희석한 후에 각 단계의 희석액 0.1 ml를 complex medium 평판배지에 무균적으로 도말하였다. 분주된 평판배지는 30℃ 항온 배양기에서 20~24시간 동안 배양한 후에 형성된 균 집락의 수를 counting 하였다.

3) 환원당 측정

배양 상등액의 환원당 측정은 Dinitrosalicylic acid (DNS)를 이용하여 평가하였다. 대략적인 방법은 배양 상등액 300 uL와 DNS용액 500 uL를 혼합한 후에 100℃에서 10분간 반응시킨 후, 상온으로 냉각한 후에 40% potassium sodium tartrate 용액을 100 uL를 첨가하였고, 575 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 포도당을 사용하였으며, 회귀방정식을 이용한 검량선으로 환원당의 농도를 측정하였다.

4) Xylanase 효소 활성분석

분리된 세균들에 대하여 xylanase 효소 활성을 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 효소활성의 기질로는 1% birchwood xylan (Sigma)를 사용하였고, 반응용액으로는 10 mM Tris-HCl (pH 7.0)을 사용하였다. 기질용액 300 uL와 반응용액 600 uL 그리고 배양 상등액을 100 uL를 혼합하여 37℃ 항온기에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 1% dinitrosalicylic acid 용액을 1.5 mL 첨가한 후에 100℃에서 10분간 열처리한 후, 상온까지 냉각한 후에 0.5 mL의 40% potassium sodium tartrate 용액을 첨가하였다. 575 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 xylose를 사용하였다. 효소활성은 mg xylose/ml/min으로 나타내었다.

상기 실시예의 결과는 아래과 같다.

1) 난분해성 탄소원 (왕겨)를 기질로하는 최소배지에서의 성장성 평가

선발된 균주를 대상으로 난분해성 탄소원으로 왕겨를 단일 탄소원으로 하는 M9 평판배지에서의 성장성을 평가하였다. M9 최소배지에 유일 탄소원으로 팽연왕겨가루를 5%, 10% 및 20%를 각각 첨가하여 제조하였다. 왕겨 단일 탄소원 배지에 선발균주를 스트리킹한 후에 48시간 동안 30℃ 항온기에서 배양한 후에 형성된 집락의 크기로 성장성을 평가하였다. 그 결과 분리된 세균의 성장성이 우수하게 나타났다 (표 4).


	난분해성 탄소원(왕겨) 첨가량
	5%	10%	20%
Paenibacillus xylanexedens SK2925	++	++	++
-, 성장성 없음; +, 성장; ++, 잘 성장; +++, 매우 잘 성장

표 4는 난분해성 탄소원 유일 배지에서 선발균주의 성장성 평가를 나타낸 표이다.

2) 난분해성 탄소원 (산-알칼리처리 왕겨)에서의 성장성 평가

선발된 균주들이 난분해성 탄소원을 유일 탄소원으로 하는 배지에서의 성장성을 평가하였다. 난분해성 탄소원으로는 왕겨를 사용하였고, 이용성을 높이기 위하여 산알칼리 처리 후에 사용하였다. 그 결과 배양 시간이 지남에 따라서 잘 성장하는 것으로 나타났다 (도 4).

3) 난분해성 탄소원으로부터 환원당 생산력 평가

난분해성 탄소원으로 팽연왕겨와 산알칼리 처리 왕겨를 포함하는 배지에서 성장한 P. xylanexedens SK2925가 생산한 환원당을 평가하였다. 그 결과 팽연왕겨로부터는 44 ug/mL의 환원당이 생산되었고, 산알칼리처리 왕겨로부터는 39 ug/mL의 환원당이 생산되었다 (표 5)

표 5는 팽연왕겨와 산알칼리처리 왕겨를 유일한 탄소원으로하는 배지에서 배양 후 생산된 환원당을 나타낸 표이다.

4) 자일란 분해효소 활성

난분해성 탄소원으로 팽연왕겨와 산알칼리처리 왕겨를 사용한 M9 배지에서 선발된 균주를 배양한 후에 배양기간동안 자일란 분해효소 활성을 평가하였다. 그 결과 팽연왕겨, 산알칼리 처리 왕겨 모두에서 배양 2일차에 높은 효소활성을 나타내었다 (표 6).

표 6은 배양과정 중 자일란 분해효소의 생산성을 나타낸 표이다.

농업생명공학연구원

KACC91594P

20101111

Claims

자일란 분해효소 활성, 전분분해 효소 활성 및 섬유소 분해효소 활성을 가지는 페니바실러스 자일란엑스덴스 SK2925(KACC91594P).
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