KR101453000B1

KR101453000B1 - 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스 cs21 및 이의 배양액

Info

Publication number: KR101453000B1
Application number: KR1020120125630A
Authority: KR
Inventors: 조수정; 문여황; 신평균; 유영복
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2014-10-21
Also published as: KR20140059038A

Abstract

본 발명은 새송이버섯 폐배지에서 분리한 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CS21[수탁번호 : KACC91687P]에 관한 것이다. 버섯 폐배지를 사료 자원으로 활용하기 위해 버섯 폐배지에 본 발명에 따른 새송이버섯 폐배지에서 분리한 섬유소 분해 활성을 가지는 바실러스 서브틸리스 CS21[수탁번호 : KACC91687P] 균주를 포함시킴으로써 섬유성 물질의 구조적 변화를 일으켜 사육 동물의 소화율을 개선할 수 있는 사료 첨가물을 제조할 수 있으며, 상기의 섬유소 분해 활성을 이용하여 다양한 용도로 사용할 수 있다.

Description

섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스 CS21 및 이의 배양액{Cellulase-producing Bacillus subtilis CS21 and culture fluid therof}

본 발명은 새송이버섯 폐배지에서 분리한 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CS21[수탁번호 : KACC91687P]에 관한 것이다.

전국적으로 재배되는 버섯의 종류는 느타리버섯, 새송이버섯, 팽이버섯, 양송이버섯, 영지버섯, 상황버섯 등 다양한 종류의 버섯이 생산되고 있으며, 그에 따른 버섯 폐배지의 종류도 다양한 상태로 배출되고 있다.

종래 배출된 폐배지는 재활용을 위해 거의 퇴비로 이용되었으며 일부는 퇴비 제조시 수분조절제로 사용되었다. 그러나 버섯 폐배지의 대부분의 원료는 사료 자원이기 때문에 버섯 폐배지는 사료 자원으로 영양학적 가치가 있는 자원이다. 우리나라에서 사료적 가치가 있는 버섯 폐배지는 연간 약 97만톤정도 발생하고 있으며, 여기서 팽이, 새송이, 느타리버섯 폐배지의 발생량이 약 89%를 차지하고 있다(농림수산식품부, 2010)

다만, 버섯 폐배지의 주요 구성성분인 톱밥은 난분해성 물질로써 사육 동물의 소화율이 낮아 사료로 이용되기 어렵기 때문에 섬유성 물질의 구조적 변화를 일으켜 사육 동물의 소화율을 개선시키기 위한 연구도 필요한 실정이다.

버섯균의 균사체는 다량의 단백질로 구성되어 있기 때문에 균사체 자체가 가축의 영양원이 될 수 있으며 버섯폐배지에는 버섯균사체에 포함되어 있는 베타글루칸, 폴리페놀 등의 다양한 기능성 물질이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

종래 기술로서, 본 발명자에 의해 발견된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 CS47에 관한 한국등록특허공보 제10-1137401호에는 섬유소 분해 활성을 갖는 신균주가 기재되어 있다.

한국등록특허공보 제10-1137401호

이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과, 섬유소 분해 활성을 가지는 균주를 개발하기에 이르렀다.

결국, 본 발명의 목적은 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CS21 및 이의 배양액을 제공하는 것이다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해,

본 발명의 일 측면에 따르면, 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CS21[수탁번호 : KACC91687P]가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CS21[수탁번호 : KACC91687P]의 배양액이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 배양배지를 준비하는 단계; 상기 배양배지에 상기 바실러스 서브틸리스 CS21[수탁번호 : KACC91687P]를 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 배양된 배양액을 수거하는 단계;를 포함하는 배양액의 제조방법이 제공될 수 있다.

버섯 폐배지를 사료 자원으로 활용하기 위해 버섯 폐배지에 본 발명에 따른 새송이버섯 폐배지에서 분리한 섬유소 분해 활성을 가지는 바실러스 서브틸리스 CS21[수탁번호 : KACC91687P] 균주를 포함시킴으로써 섬유성 물질의 구조적 변화를 일으켜 사육 동물의 소화율을 개선할 수 있는 사료 첨가물을 제조할 수 있으며, 상기의 섬유소 분해 활성을 이용하여 다양한 용도로 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 신균주의 섬유소, 자일란 및 만난의 분해효소와 항균물질인 surfactin의 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 신균주가 첨가된 처리구와 대조구의 새송이버섯 폐배지의 입자 세절 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 바이러스 식별 키트를 이용한 본 발명에 따른 신균주의 당 발효/이용성을 확인한 Bacillus ID 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 신균주의 16S rDNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 신균주의 16S rDNA 염기서열의 유사도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 신균주의 수탁증이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, '버섯 폐배지'는 버섯을 재배하기 위해 배지를 조성하고 버섯 종균을 접종한 후 버섯 생산을 한 다음 그 역할을 다 하였을 때 발생되는 버섯 배지를 버섯 폐배지라 한다. 상기 버섯 배지의 조성은 버섯의 종류와 재배 방식에 따라 다르기 때문에 폐배지도 다양한 상태로 배출되고 있다. 본 발명에서 사용되는 버섯 폐배지는 느타리버섯, 팽이버섯, 새송이버섯 재배 후 발생한 폐배지 중에서 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 새송이버섯 폐배지를 사용할 수 있다.

상기 버섯 재배 배지는 재배하는 버섯 종류와 재배 방식에 따라 차이가 있지만 섬유소(NDF, ADF, lignin)를 많이 함유하고 있는 공통점이 있으며, 사료화 과정에 있어서 상기 섬유성 물질의 소화율을 개선시키기 위해 화학적 또는 생물학적 처리과정이 수반될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 새송이버섯 폐배지에서 분리한 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CS21[수탁번호 : KACC91687P]가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 신균주의 섬유소, 자일란 및 만난의 분해효소와 항균물질인 surfactin의 활성을 나타낸 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 신균주 바실러스 서브틸리스 CS21이 분비하는 섬유소 분해효소(C) 외에 수팩틴(A), 자일라나아제(B) 및 만나아제(D)의 활성은 클리어존 형성 여부(클리어존의 크기에 따라 +++, ++, + 및 -로 기록)를 확인할 수 있다.

그 결과는 하기의 표 1에 기재되어 있다.

분비 물질	수팩틴(A)	자일라나아제(B)	섬유소 분해효소(C)	만나아제(D)
(a) CS21	++	+++	+++	+++
(b) 대장균(대조구)	-	-	-	-
배양온도(℃)	40
배양시간(시간)	24

상기의 표 1에 기재된 바에 따르면, 본 발명에 따른, 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스 CS21는 섬유소를 분해할 수 있는 섬유소 분해효소뿐만이 아니라, 자일란을 가수분해하여 자일로즈 및 그 올리고당을 생성하는 반응을 촉매하는 효소인 자일라나아제(자일란 분해효소, xylanase), β-D-만노시드를 비환원 말단에서 가수분해하여 만노오스를 유리하는 만나아제(만난 분해효소, mannase) 및 세균의 원형질체를 용해하는 물질로서 항균물질에 해당하는 수팩틴(surfactin)을 대조구인 대장균에 비하여 다량으로 합성하는 것을 확인할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CS21[수탁번호 : KACC91687P]를 생균제로 사용하여 새송이버섯 폐배지를 발효한 후 상온에서 6개월이 경과된 경우 도 2에 나타난 바와 같이, 생균제가 첨가되지 않은 대조구보다 1% 바실러스 서브틸리스 CS21 배양액 처리구에서 입자가 세절된 것을 확인할 수 있다.

즉, 상기의 결과는 본 발명에 따른 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스 CS21의 섬유소분해효소 활성에 의해 난분해성 물질인 톱밥 등이 분해되어 입자가 세절되었다는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 CS21 배양액을 새송이버섯 폐배지를 포함한 다양한 버섯 폐배지를 이용한 사료화 과정에 사료 첨가물 또는 생균제로서 첨가할 경우 난분해성 물질인 섬유성 물질의 구조적 변화를 야기시켜 사육 동물의 소화율을 개선할 수 있는 사료를 제조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 배양배지를 준비하는 단계; 상기 배양배지에 상기 바실러스 서브틸리스 CS21[수탁번호 : KACC91687P]을 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 배양된 배양액을 수거하는 단계;를 포함하는 배양액의 제조방법이 제공될 수 있다.

1. 신균주의 분리 및 동정

새송이버섯 재배농가에서 폐배지를 채취하고, 여기에 살균수를 가하여 희석한 다음 1% 트립토판 블루(tryptopan blue)와 0.5% CMC가 포함된 LB(Luria-Bertani) 배지에 도말하고 38 ℃에서 18 내지 24 시간동안 배양하여 단일 콜로니를 얻는 과정을 수차례 반복하여 순수 분리된 균주 CS21을 얻었다.

균주의 동정은 버지스 메뉴얼(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology)에 준하여 이루어졌으며, 균주의 생리 및 생화학적 특성을 파악하기 위하여 바이오로그 자동 식별 시스템(BIOLOG automatic identification system, BIOlog Inc. 미국)과 바실러스 식별 키트(Bacillus ID kit, Microgen Bioproduct Ltd., 영국)를 이용하여 당 발효/이용성을 조사하였으며, 균체의 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다.

도 3은 바이러스 식별 키트(Bacillus ID kit, Microgen Bioproduct Ltd., 영국)를 이용한 본 발명에 따른 신균주의 당 발효/이용성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이에 따르면, 상기 CS21은 아라비노스, 셀레비오스, 이노시톨, 만니톨, 라피노스, 람노스, 살리신, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 자일로스, 메틸-D-글루코사이드, 이눌린, ONPG, 시트레이트, VP 및 니트레이트를 발효 또는 이용하여 산을 생성하는 것으로 나타났다. 반면, 만노즈, 아도니톨, 갈락토스, 메틸-D만노사이드, 멜리지토스(melizitose), 인돌 및 아르기닌은 발효시키지 않는 것으로 나타났다.

상기의 결과로, 본 발명에 따른 신균주 CS21의 생리적, 생화학적 특성이 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 등을 포함하는 B. subtilis 그룹에 속하는 것으로 확인되었다.

도 5는 본 발명에 따른 신균주의 16S rDNA 염기서열의 유사도 비교 결과를 나타낸 것이다. 상기 CS21과 기존에 밝혀진 균주와의 상동성을 비교 분석한 결과 CS21의 16S rDNA 염기서열은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 16S rDNA 염기서열과 99%의 유사도를 나타내고 있음을 확인할 수 있다. 상기 CS21은 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2011년 11월 07일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KACC91687P를 부여받았다(도 6).

2. 신균주가 포함된 배양액의 제조

(1) 종균의 액상 배양

TSA 배지(Trypticase soy broth)를 이용하여 40℃에서 24시간 배양한 액상 종균을 배양한다.

(2) 농산가공부산물을 이용한 종균의 대량 배양

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CS21[수탁번호 : KACC91687P]의 대량생산을 위해 염가배지 조성을 개발하여 균주를 생산하였다. 상기의 염가배지의 조성은 하기의 표 2에 기재된 바와 같다.

배지원	1L
배지원	함량(g)
당밀	5
대두박	3
효모 추출물	0.3
일염기성 인산 칼륨	0.4

상기의 액상 배양된 종균을 5% 수준에서 상기의 표 2에 따른 농산가공부산물을 이용한 염가배지에 접종하고, 40℃ 배양기에서 48시간 진탕배양하여 배양액을 얻었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC91687

20111107

<110> GYEONGNAM NATIONAL UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Cellulase-producing Bacillus subtilis CS21 and culture fluid therof <130> NPF-22787 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1434 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 gctaatacat gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg 60 ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct 120 aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac 180 ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg 240 atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300 ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 360 gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtaccg 420 ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480 gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc 540 gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aacccgggga gggtcattgg 600 aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc 660 gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga 720 ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780 tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact 840 ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 900 gcggtggagc atgtggttta attcgaagca cgcgaagaac ccttaccagg tcttgacatc 960 ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg 1020 ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga 1080 tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga 1140 aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1200 tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca 1260 gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc 1320 agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag 1380 tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc cagccgccga atag 1434

Claims

섬유소 분해 활성, 자일란 분해 활성, 만난 분해 활성 및 항균 활성을 가지는 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CS21[수탁번호 : KACC91687P].
제1항에 따른 바실러스 서브틸리스 CS21[수탁번호 : KACC91687P]의 배양액을 포함하는 섬유소 분해 활성, 자일란 분해 활성, 만난 분해 활성 및 항균 활성을 가지는 조성물.
배양배지를 준비하는 단계;
상기 배양배지에 제1항에 따른 바실러스 서브틸리스 CS21[수탁번호 : KACC91687P]을 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및
상기 배양된 배양액을 수거하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 CS21[수탁번호 : KACC91687P]의 배양액을 포함하는 섬유소 분해 활성, 자일란 분해 활성, 만난 분해 활성 및 항균 활성을 가지는 조성물의 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 배양배지는 당밀 및 대두박을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조방법.