CN111394278A - 一种养殖污染除臭微生物复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于养殖业污染无害化处理和生物除臭技术领域，涉及一种养殖污染除臭微生物复合菌剂以及该复合菌剂的制备方法与应用。本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂为乳酸菌和酵母的混合菌剂包括：保藏号为GDMCC No:60833的鲁氏接合酵母Y7、保藏号为GDMCC No:60834的乳酸片球菌M1、保藏号为GDMCC No:60907的植物乳杆菌M23、保藏号为GDMCC No:60906的戊糖片球菌M9和保藏号为GDMCC No:60905的粉状毕赤酵母Y12，均保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂是一种快速高效、无二次污染、长时间稳定除臭的养殖污染除臭微生物复合菌剂。

Description

一种养殖污染除臭微生物复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于养殖业污染无害化处理和生物除臭技术领域，涉及一种微生物复合菌剂，尤其是涉及一种养殖污染除臭微生物复合菌剂，以及该复合菌剂的制备方法与应用。
背景技术
我国是畜禽养殖大国，养殖业在提高国人生活水平的同时，产生了大量粪污及恶臭气体，养殖厂员工及附近居民深受粪污恶臭干扰无法正常生活。恶臭气体主要包括一些含硫化合物和含氮化合物，如硫化氢、甲硫醇、硫醚、氨气等。它们有强刺激性，经呼吸道等进入体内使人头昏恶心，长期置身其中，人体神经系统受损。充斥恶臭气体的环境也不利于养殖畜禽健康生长。大量化学消毒液和抗生素的使用严重危害人类健康和食品安全，因此应加强畜禽粪污处理，控制恶臭气体排放，对促进畜牧业可持续发展有重大意义。
目前，针对畜禽粪污臭气物质处理主要有物理方法、化学方法和生物方法等。传统的物理方法主要是利用活性炭沸石等多孔介质吸收已达到除臭效果，但存在易饱和和难以解吸附等缺点。化学方法主要通过强氧化剂将恶臭物质氧化以减少臭气，但专一性强。当存在多种混合恶臭物质时难以达到良好的除臭效果，以上物理方法和化学方法均会导致二次污染。近年较有效且环保的去除恶臭的方法是生物法，通过外源功能菌或生物酶作用，直接降解恶臭物质或者抑制产生恶臭物质的。
现有应用较为广泛的除臭剂是由日本琉球大学比嘉照夫教授发明的EM菌剂，其由多种微生物构成，应用于畜禽粪便除臭，但应用效果并不十分理想。中国专利文献CN102851210A(申请号201210190607.1)公开了一种畜禽粪污微生物除臭菌剂、其制备方法及其应用，该菌剂含有保藏号为CGMCC NO：5982的酵母菌种杰丁毕赤酵母Pichia jadinii和保藏号为CGMCC NO：5984的酵母菌种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，应用于畜禽粪便除臭，效果显著，粪便中成分复杂，臭气消除应是众多微生物共同作用的结果，单一功能微生物很难发挥作用，因此，有必要研制对畜禽粪便有针对性的复合菌剂。
发明内容
针对传统物理化学处理方法效率低、成本高、二次污染等缺点，本发明的目的在于提供一种养殖污染除臭微生物复合菌剂，是一种快速高效、无二次污染、长时间稳定除臭的养殖污染除臭微生物复合菌剂。
本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂为乳酸菌和酵母的混合菌剂，包括：保藏号为GDMCC No:60833的鲁氏接合酵母Y7(Zygosaccharomyces rouxiiY7)、保藏号为GDMCC No:60834的乳酸片球菌M1(Pediococcusacidilactici M1)、保藏号为GDMCC No:60907的植物乳杆菌M23(Lactobacillus plantarum M23)、保藏号为GDMCC No:60906的戊糖片球菌M9(Pediococcuspentosaceus M9)和保藏号为GDMCC No:60905的粉状毕赤酵母Y12(Millerozymafarinosa Y12)，均保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。
根据本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的进一步特征，所述鲁氏接合酵母Y7、所述乳酸片球菌M1、所述植物乳杆菌M23、所述戊糖片球菌M9、所述粉状毕赤酵母Y12是按照最终菌落数3:3:1.5:1.5:1的比例混合。
本发明还提供了所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的制备方法。
本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的制备方法包括以下步骤：
A.将所述两种酵母菌和三种乳酸菌分别在YM固体培养平板和MRS固体培养平板上划线接种活化，检测各菌株之间的拮抗作用；
B.将活化好的各菌株分别接种到YM液体培养基和MRS液体培养基中培养，至所述酵母菌的菌落数达到1×108个/ml，所述乳酸菌的菌落数达到1×109个/ml；
C.将所述鲁氏接合酵母Y7、所述乳酸片球菌M1、所述植物乳杆菌M23、所述戊糖片球菌M9、所述粉状毕赤酵母Y12按照最终菌落数3:3:1.5:1.5:1的比例混合，形成所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂。
根据本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的制备方法的进一步特征，所述步骤B中，所述两种鲁氏接合酵母Y7和所述粉状毕赤酵母Y12在28℃、 180rpm/min摇床中培养24小时；所述乳酸片球菌M1、所述植物乳杆菌M23、所述戊糖片球菌M9在28℃、静置(微氧)条件下培养24小时。
本发明还提供了所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的应用，具体是所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂在畜禽粪污处理的除臭处理中的应用。
根据本发明所述的应用，将所述复合菌剂按照7×109个/kg粪污均匀喷洒于畜禽舍和粪污贮存池。
本发明的技术原理是：肠道中的微生物能在缺氧高氨氮等胁迫条件下优势生长，通过物理吸附，分泌胞外酶，吸收进入细胞通过胞内酶降解等综合途径分解有害气体，同时由于这些微生物均为益生菌，因此确保了禽畜的安全和零二次污染。本发明选用了几株具有高效降解禽畜粪便有害气体(主要为氨气和硫化氢) 的菌株，按比例混合及优化后形成所述的微生物复合菌剂，大大提高了单株菌的有害气体分解能力。同时微生物复合菌剂中各菌株的拮抗作用结果，显示菌种两两之间无拮抗作用，可实现长期在粪便胁迫环境下的优势生长，达到长期除臭的效果。
本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂具有以下有益效果：
(1)针对养殖场畜禽舍、粪污贮存池等恶臭气体释放等问题，本发明通过分离筛选高效除臭功能的菌株并优化组合配伍成一种微生物复合除臭菌剂，提供了一种高效的、低廉成本的、无二次污染的复合微生物除臭菌剂，而且，由于微生物在环境中长期存活，从而达到稳定的长时间除臭的效果。
(2)本发明筛选了两株酵母菌和三株乳酸菌，它们具有高效降解氨气和硫化氢的性能，而禽畜粪便等有害气体的主要成分为氨气和硫化氢，按比例混合及优化后形成本发明独有的微生物复合菌剂，相比于单株菌，大大提高了有害气体分解能力。
(3)与现有的物理化学和生物除臭技术相比，本发明所述的微生物复合菌剂没有任何二次污染。该微生物复合菌剂由酵母菌和乳酸菌构成，目前大部分微生物菌剂为单纯的酵母菌或者乳酸菌；本发明的复合菌剂除臭效果明显高于单株菌的除臭效果，也高于目前市面上的现有微生物除臭菌剂，尤其是能高效去除硫化氢；本发明的微生物菌剂可在粪污胁迫环境中长期生长，能够达到长时间除臭的效果。
附图说明
图1是本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂在除臭效果实验中氨气含量及去除率测定结果图。
图2是本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂在除臭效果实验中硫化氢的测定结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例结合附图的方式来进一步详细说明本发明的内容。具体实施方式是为了便于更好的理解本发明，而并非对本发明的任何限制。
步骤一：将上述酵母和乳酸菌分别在YM固体培养平板和MRS固体培养平板上划线接种活化。我们取上述活化的菌种，用平板涂布法检验复合微生物菌剂中各菌株的拮抗作用结果，显示菌种两两之间无拮抗作用。
步骤二：将活化好的菌种分别接种到高温灭菌处理后(115℃、20min)的 YM液体培养基(蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g、水1000 mL、pH6.2±0.2)和MRS液体培养基(蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2g、酵母浸粉4g、硫酸镁0.2g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、硫酸锰0.05g、乙酸钠5g、水1000mL、pH6.2±0.2)中培养。
步骤三：酵母菌在28℃、180rpm/min摇床中培养24小时，乳酸菌在28℃、静置(微氧)条件下培养24h。
步骤四：经过步骤三的培养后，酵母菌的菌落数达到1×108个/ml，乳酸菌的菌落数达到1×109个/ml。
步骤五：将鲁氏接合酵母，乳酸片球菌，植物乳杆菌，戊糖片球菌，粉状毕赤酵母：按照最终菌落数3:3:1.5:1.5:1的比例混合，形成除臭微生物复合菌剂。
步骤六：将上述复合菌剂按照7×109个/kg粪污均匀喷洒于畜禽舍和粪污贮存池。
一、本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的制备
(1)将高温处理(115℃、20min)的YM固体培养基(蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g、水1000mL、琼脂20g、pH6.2±0.2)和 MRS固体培养基(蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2g、酵母浸粉4g、硫酸镁0.2g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、硫酸锰0.05g、乙酸钠5g、水1000mL、琼脂20g、pH6.2±0.2)定量备用。
(2)将表1中的酵母和乳酸菌分别接入灭菌处理过的YM固体培养平板和MRS固体培养平板中活化备用。
本发明所采用的酵母和乳酸菌为发明人从禽畜粪便中筛选的菌种，均保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所。
表1：复合菌剂的保藏信息
保藏号 菌种 分类命名 保藏日期
GDMCC No:60833 鲁氏接合酵母 Zygosaccharomyces rouxiiY7 2019.10.28
GDMCC No:60834 乳酸片球菌 Pediococcusacidilactici M1 2019.10.28
GDMCC No:60905 粉状毕赤酵母 Millerozymafarinosa Y12 2019.11.22
GDMCC No:60906 戊糖片球菌 Pediococcuspentosaceus M9 2019.11.22
GDMCC No:60907 植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum M23 2019.11.22
(3)将高温处理(115℃、20min)的YM液体培养基(蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g、水1000mL、pH6.2±0.2)和MRS液体培养基(蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、吐温801mL、磷酸氢二钾2g、酵母浸粉4g、硫酸镁0.2g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、硫酸锰0.05g、乙酸钠5g、水1000 mL、pH6.2±0.2)定量备用。
(4)将活化的菌种分别接入到相应液体培养基中(酵母菌28℃、180rpm/min，乳酸菌28℃、静置)培养24h。
(5)转接菌液到新的液体培养基，将菌液计数调酵母菌(鲁氏接合酵母和粉状毕赤酵母)的菌含量为108CFU/mL、乳酸菌(乳酸片球菌、戊糖片球菌、植物乳杆菌)的菌含量为109CFU/mL，按相应体积比混合，使得最终复合菌剂中含各种菌数量比例为鲁氏接合酵母：乳酸片球菌：植物乳杆菌：戊糖片球菌：粉状毕赤酵母＝3：3：1.5：1.5：1，即为液态微生物复合除臭菌剂。
二、本发明所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的除臭效果实验
(1)向装有100g新鲜鸡粪的烧杯(1L)中加入10mL液体微生物除臭菌剂，保鲜膜密封烧杯；同时做不加菌剂的对照，每组实验设置三个重复，共进行三次实验，每天测定氨气浓度，测定结果如下表2和图1。
表2：复合菌剂除臭应用中氨气的测定
Figure RE-GDA0002520072120000051
Figure RE-GDA0002520072120000061
由图1和表2可知，鸡粪添加复合菌剂后，在连续9天的测定期间内，前5 天每天检测氨气浓度比不加菌剂的鸡粪产氨气浓度均降低30％以上，在第6-9天，每天每天检测氨气浓度比不加菌剂的鸡粪产氨气浓度仍然降低达20％以上，证明较长时间持续有效。
(2)向装有100g新鲜鸡粪的烧杯(1L)中加入10mL液体复合菌剂，保鲜膜密封烧杯；同时做不加菌剂的对照，每组实验设置三个重复，共进行三次实验，每天测定硫化氢浓度，测定结果如下表3和图2。
表3：复合菌剂除臭效果硫化氢含量及去除率测定
Figure RE-GDA0002520072120000062
由图2和表3可知，鸡粪添加菌剂后，在连续8天的测定期间内，每天检测硫化氢浓度，微生物复合菌剂添加组均比不加菌剂的鸡粪产硫化氢浓度明显降低，在第6-8天，均比不加菌剂的鸡粪产硫化氢浓度降低达80％以上，证明我们的复合菌剂有优越的长时间除硫化氢效果。
(3)向装有200g新鲜鸡粪的烧杯(1L)中加入10mL液体微生物除臭菌剂，保鲜膜密封烧杯；按上述方法，我们检测了复合菌剂中五种菌单株的除氨气和硫化氢的效率，每组实验设置三个重复，共进行三次实验，测定氨气和硫化氢浓度，其中鲁氏接合酵母除氨气和硫化氢效率最高，其余单株菌均低于鲁氏接合酵母。测定结果如下表4。
表4：鲁氏接合酵母和复合菌剂对比氨气和硫化氢降解率
鲁氏接合酵母最高降解率(％) 微生物复合菌剂最高降解率(％)
氨气 25.5 41.8
硫化氢 27.3 84.8

Claims (6)

1.一种养殖污染除臭微生物复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂为乳酸菌和酵母的混合菌剂，包括：保藏号为GDMCC No:60833的鲁氏接合酵母Y7(Zygosaccharomyces Y7)、保藏号为GDMCC No:60834的乳酸片球菌M1(Pediococcusacidilactici M1)、保藏号为GDMCCNo:60907的植物乳杆菌M23(Lactobacillus plantarum M23)、保藏号为GDMCC No:60906的戊糖片球菌M9(Pediococcuspentosaceus M9)和保藏号为GDMCC No:60905的粉状毕赤酵母Y12(Millerozymafarinosa Y12)，均保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。
2.根据权利要求1所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂，其特征在于：所述鲁氏接合酵母Y7、所述乳酸片球菌M1、所述植物乳杆菌M23、所述戊糖片球菌M9、所述粉状毕赤酵母Y12是按照最终菌落数3:3:1.5:1.5:1的比例混合。
3.如权利要求1所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将所述两种酵母菌和三种乳酸菌分别在YM固体培养平板和MRS固体培养平板上划线接种活化，检测各菌株之间的拮抗作用；
B.将活化好的各菌株分别接种到YM液体培养基和MRS液体培养基中培养，至所述酵母菌的菌落数达到1×108个/ml，所述乳酸菌的菌落数达到1×109个/ml；
C.将所述鲁氏接合酵母Y7、所述乳酸片球菌M1、所述植物乳杆菌M23、所述戊糖片球菌M9、所述粉状毕赤酵母Y12按照最终菌落数3:3:1.5:1.5:1的比例混合，形成所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂。
4.如权利要求1所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤B中，所述两种鲁氏接合酵母Y7和所述粉状毕赤酵母Y12在28℃、180rpm/min摇床中培养24小时；所述乳酸片球菌M1、所述植物乳杆菌M23、所述戊糖片球菌M9在28℃、静置(微氧)条件下培养24小时。
5.如权利要求1所述的养殖污染除臭微生物复合菌剂在畜禽粪污处理的除臭处理中的应用。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述复合菌剂按照7×109个/kg粪污均匀喷洒于畜禽舍和粪污贮存池。
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