CN109593838A - 一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法 - Google Patents
一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种耐盐碱的异养硝化‑厌氧反硝化菌株的筛选方法。本发明所述方法通过PCR初步筛选提取目标土壤微生物的总DNA，配置培养基，高盐碱环境中异养硝化菌株的分离、纯化与筛选，厌氧反硝化菌株的分子生物学初步鉴定以及高盐碱环境中对异养硝化与厌氧反硝化菌株的能力进行验证获得耐盐碱的异养硝化与厌氧反硝化细菌，建立一种快捷、准确、高效获得目的菌株的方法。根据本发明所提供的方法可以成功筛选得到耐盐碱的异养硝化与厌氧反硝化细菌，并且筛选到的细菌能够有效去除高盐碱水体中的氮素，在实际应用中具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法。
背景技术
随着社会发展和工业化水平的不断提高，环境问题也日益突出，工业产生的高氮素高盐碱废水严重危害着淡水生态系统。氮素主要以NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N等形式存在于生态环境中，生物脱氮技术是一种较为彻底和安全的氮素代谢途径；利用微生物的硝化作用和反硝化作用，硝化作用将铵根氧化为硝酸根，反硝化作用将硝酸根还原为N2O、N2、NO释放。微生物硝化作用以营养类型的不同可分为自养硝化作用与异养硝化作用，异养硝化作用可以克服自养硝化作用生长缓慢的缺点，在实际生产中具有更好的应用前景。同时，异养硝化微生物可以同时具有异养硝化功能和反硝化功能的微生物菌株的分离获取具有重要应用价值。
然而，将传统生物脱氮技术的微生物菌株应用于高氮素高盐碱水体环境时会存在一些突出问题，例如，环境较高的渗透压导致脱氮微生物脱水造成质壁分离，进而导致脱氮微生物失去正常的生长代谢。而耐盐碱的微生物菌株能很好的解决上述问题。
现有报道的异养硝化细菌与厌氧反硝化细菌的筛选方法主要为富集后再进行菌株的驯化与分离，存在工作量巨大，驯化周期较长，目的性不明确等问题。因此，建立一种高效筛选获取耐受高盐碱环境，同时具有硝化作用和反硝化作用的微生物菌株的方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法，该筛选方法具有周期短、工作量小、高效、准确的特点。
为实现上述目的，本发明提供了一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法，包括以下步骤：
(1) 样品筛选：提取目标土壤微生物的总DNA，PCR初步筛选含有耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的微生物土样；
(2)在高盐碱环境中将步骤（1）中筛选出的土样在分离纯化培养基中进行异养硝化菌株的分离、纯化与筛选，获得异养硝化菌株；
(3) 将获得的异养硝化菌株进行PCR扩增以及电泳检测，将目的条带在460-510bp的PCR产物对应的菌株认定为同时具有异养硝化与厌氧反硝化功能的菌株。
(4)高盐碱环境中，将步骤（3）中得到的同时具有异养硝化与厌氧反硝化功能的菌株制备成种子液，验证其异养硝化能力和厌氧反硝化能力。
进一步地，步骤（1）中所述的PCR初步筛选为使用土壤DNA提取试剂盒对目标土壤微生物总DNA的提取，提取方法参照试剂盒所带说明书。
进一步地，步骤（2）中所述的分离纯化培养基组分包括基础成分和其他成分；所述基础成分，以1L计，组成为：氯化钠0.5-2g，氯化钾0.1-0.6g，六水合氯化镁0.3-0.5g，氯化铵0.2-0.3g，磷酸二氢钾0.1-0.3g，二水氯化钙0.05-0.2g和余量的蒸馏水；所述其他成分，以1L计，组成为：微量元素混合液0.5-1.1 ml ，维生素溶液0.5-1.2 ml ，1M 碳酸氢钠溶液1-3 ml，7.5mM EDTA·NA·Fe溶液0.5-1.1 ml ，1M氯化铵溶液0.8-1.2 ml ，1M丙酮酸钠溶液0.9-1.1 ml ，抗生素溶液0.8-1.2 ml和余量的蒸馏水。
其中，所述的微量元素混合液，以1L计，组成为：硼酸 20-40 mg，四水氯化锰90-110 mg，六水合氯化钴180-200 mg，六水合二氯化镍 20-30 mg，二水合氯化铜 1-3 mg，七水硫酸锌100-150 mg，钼酸钠30-40 mg， 25%盐酸10-15ml和余量的蒸馏水。
其中，所述的维生素溶液，以1L计，组成为：Vh 10-30 ml ，VB9 5-20 ml ，VB6 80-110 ml ，VB1 60-80 ml，VB2 40-60 ml ，VB3 40-60 ml ，DL-泛酸钙 40-60 ml ，VB12 0.5-1.1 ml ，对氨基苯甲酸 40-60 ml，氯化胆碱 180-220 ml和余量的蒸馏水。
进一步地，本发明步骤（4）中，所述的种子液的制备在液体富集培养基中进行，所述的液体富集培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8-11g，酵母提取物 4-7 g，氯化钠 8-11 g和余量的蒸馏水。
进一步地，本发明步骤（4）中，所述的厌氧反硝化能力的验证在亚硝酸盐基础培养基和硝酸盐基础培养基中进行，所述的亚硝酸盐基础培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8-12g，牛肉膏 2-5 g，氯化钠 4-7 g，亚硝酸钠0.207 g和余量的蒸馏水；所述的硝酸盐基础培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8-12g，牛肉膏 2-5 g，氯化钠 4-7 g，硝酸钠 0.255 g和余量的蒸馏水。
进一步地，本发明步骤（4）中，所述的异养硝化能力的验证在硝化能力验证培养基中进行，所述的硝化能力验证培养基是以NH4Cl为唯一氮源的分离纯化液体培养基。
进一步地，本发明步骤（4）中，所述的厌氧反硝化能力通过离子色谱仪检测NO3 —N、NO2 —N浓度的变化进行验证；所述异养硝化能力通过NH4+-N浓度的变化进行验证。
进一步地，本发明各步骤中所述培养基的pH值均为8.8-10.5。
进一步地，本发明所述一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法还包括对步骤（3）中获得的同时具有异养硝化与反硝化功能的菌株进行16S rDNA鉴定以及构建系统发育树。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所述的分离耐盐碱的异养硝化与厌氧反硝化细菌的方法得到的目的微生物更加高效、准确，同时具有筛选周期短、工作量小的优点。根据本发明的实施例获得的菌株具有较高的氮素去除率，在48小时内氨氮去除率可达到80％，2天内可达到90％的氨氮去除率，在7天内获得接近100％的硝态氮和亚硝态氮去除率；同时分离得到的脱氮细菌对高盐碱环境具有较好的耐受性，适应极端环境，能有效的缓解污染废水中氮素过多的问题。
附图说明
图1为实施例3中的菌株BJP72的菌落形态图；
图2为实施例3中的菌株BJP72的革兰氏染色图；
图3为实施例3中的菌株BJP72对NO3 --N和NO3 --N的降解效果图；
图4为实施例3中的菌株BJP722对NH4 +-N的降解效果图；
图5为实施例3中的菌株BJP72基于16S rDNA构建的系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行说明，以下实施方式仅用于说明本发明，而不用于限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：
一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法，包括以下步骤：
（1）样品筛选
使用日本和光公司的土壤DNA提取试剂盒（Isoil beads beating）对采集于黑龙江安达市苏打盐碱土的样品进行土壤微生物总DNA的提取，提取方法参照试剂盒所带说明书。对各个土样进行PCR，锁定具有反硝化微生物的土样，
PCR引物为：nirKC1F（SEQ.ID.NO：1）：5’—ATGGCGCCA TCATGGTNYTNCC—3’，
nirKC1R（SEQ.ID.NO：2）：5’-TCGAAGGCCTCGATNARRTTRTg-3’；
nirKC2F（SEQ.ID.NO：3）：5’—TGC ACATCGCCAACGGNATGTWYGG—3’，
nirKC2R（SEQ.ID.NO：4）：5’—GGCGCGGAAGATGSHRTGRTCNAC—3’；
nirKC3F（SEQ.ID.NO：5）：5’—CATCGGCAACGGCATGYAYGGNGC—3’，
nirKC3R（SEQ.ID.NO：6）：5’—CGACCATGGCGTGGS WNACRAANGG—3’；
nirSC1F（SEQ.ID.NO：7）：5’— ATCGTCAACGTCAARGARACVGG—3’，
nirSC1R（SEQ.ID.NO：8）：5’— TTCGGGTGCGTCTTSABGAASAG—3’；
nirSC2F（SEQ.ID.NO：9）：5’— TGGAGAACGCCGGNCARGTNTGG—3’，
nirSC2R（SEQ.ID.NO：10）：5’— GATGATGTCCACGGCNACRTANGG—3’；
PCR反应体系(25μL)为：12.9μL双蒸水（ ddH2O），2.5μL Taq酶缓冲液[10×Ex TaqBuffer（Mg2+ free）]，1μL 细菌DNA模板，0.5μL 上游引物（10μM），0.5μL下游引物（10μM），3μL 氯化镁（MgCl2），2μL dNTP混合物（dNTP Mixture），2.5μL牛血清白蛋白（Bovine SerumAlbumin，5mg/ml），0.1μL Taq酶（Ex Taq）；
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性40s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min。
PCR产物与上样缓冲液混合后点样，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果在凝胶成像系统下观察，选取目的条带460-510bp左右的PCR产物对应的高盐碱土壤样品。
（2）培养基的配置
分离纯化培养基组分包括基础成分和其他成分；所述基础成分，以1L计，组成为：氯化钠0.5g，氯化钾0.1g，六水合氯化镁0.3g，氯化铵0.2g，磷酸二氢钾0.1g，二水氯化钙0.05g和余量的蒸馏水；所述其他成分，以1L计，组成为：微量元素混合液0.5 ml，维生素溶液0.5ml，1M 碳酸氢钠溶液1 ml，7.5mM EDTA·NA·Fe溶液0.5 ml，1M氯化铵溶液0.8ml，1M丙酮酸钠溶液0.9ml，抗生素溶液0.8ml和余量的蒸馏水。固体分离纯化培养基在分离纯化培养基成分外加入15.0g琼脂粉，高压灭菌锅121℃灭菌15分钟，pH调节至8.8。
其中，所述的微量元素混合液，以1L计，组成为：硼酸 20 mg，四水氯化锰90 mg，六水合氯化钴180 mg，六水合二氯化镍 20 mg，二水合氯化铜1 mg，七水硫酸锌100 mg，钼酸钠30 mg，25%盐酸,10ml和余量的蒸馏水。
其中，所述的维生素溶液，以1L计，组成为：Vh 10mg，VB9 5 mg，VB6 80 mg，VB1 60mg，VB2 40 mg，VB3 40 mg，DL-泛酸钙 40 mg，VB12 0.5 mg，对氨基苯甲酸40 mg，氯化胆碱180 mg和余量的蒸馏水。其他成分不能高压灭菌，待基础成分温度降到50℃后，通过0.45μm针头过滤器加入，pH由1M NaOH或1M HCl调节至pH8.8。
亚硝酸盐基础培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8g，牛肉膏2 g，氯化钠4g，亚硝酸钠0.207 g和余量的蒸馏水；
硝酸盐基础培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8g，牛肉膏2 g，氯化钠4g，硝酸钠 0.255g 和余量的蒸馏水。
液体富集培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8g，酵母提取物4g，氯化钠8g和余量的蒸馏水；固体富集培养基在液体富集培养基成分外加入15.0g琼脂粉，分装后121℃高压灭菌15分钟，pH由1M NaOH或1M HCl调节至8.8。
（3）异养硝化菌株的分离、纯化与筛选
取1g步骤（1）中筛选后得到的高盐碱土壤样品，加入9ml无菌水，振荡混匀后该液体记为10-1，以此类推直至形成10-6，分别取100μl上述10-1至10-6梯度的土壤样品于固体分离纯化培养基上均匀涂布，倒置放入恒温培养箱中，培养2d后，对长菌的平板进行纯化得到单菌落，初步获得异养硝化菌株。
（4）反硝化菌株的分子鉴定
使用细菌基因组DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取步骤（3）中初步获得的异养硝化菌株基因组DNA，将其作为PCR的模板DNA，具体步骤见试剂盒说明书。
PCR引物为：nirKC1F（SEQ.ID.NO：1）：5’—ATGGCGCCA TCATGGTNYTNCC—3’，
nirKC1R（SEQ.ID.NO：2）：5’-TCGAAGGCCTCGATNARRTTRTG-3’。
PCR反应体系(25μL)为：12.9μL双蒸水（ ddH2O），2.5μL Taq酶缓冲液[10×Ex TaqBuffer（Mg2+ free）]，1μL 细菌DNA模板，0.5μL 上游引物（10μM），0.5μL下游引物（10μM），3μL 氯化镁（MgCl2），2μL dNTP混合物（dNTP Mixture），2.5μL牛血清白蛋白（Bovine SerumAlbumin，5mg/ml），0.1μL Taq酶（Ex Taq）。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性40s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物与适量上样缓冲液混合后点样，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果在凝胶成像系统下观察，将目的条带在460-510bp左右的PCR产物对应的菌株初步认定为同时具有异养硝化与厌氧反硝化功能的菌株。
（5）高盐碱环境中的同时具有异养硝化与厌氧反硝化功能的菌株进行功能性验证
制备种子液：将步骤（4）中初步认定同时具有异养硝化与厌氧反硝化功能的菌株单菌落接种于含有4ml 液体富集培养基的10ml透明样品瓶中，盖上无菌橡胶塞且用钳口瓶盖固定，在胶塞上插入带有0.22μm针头过滤器的针头，通过在惰性气体手套箱内抽真空三次，冲入氩气以确保厌氧培养，拔去针头且用胶水密封胶塞上的缺口，将透明样品瓶放入厌氧培养罐，罐中放入厌氧产气袋和氧指示剂，37℃、静止培养至浑浊制得种子液。
高盐碱环境中厌氧反硝化能力的验证：取2%（V/V）种子液分别接种到含有5ml亚硝酸盐基础培养基和5ml硝酸盐基础培养基的10ml透明样品瓶中，盖上无菌橡胶塞且用钳口瓶盖固定，厌氧培养方法如上所述，同时每个处理设置空白对照。间隔24h取样测定NO3 —N、NO2 —N的变化，每次测定重复三次。通过NO3 —N、NO2 —N的去除率来验证菌株的厌氧反硝化能力，同时，空白对照内NO3 —N、NO2 —N的浓度变化不大。将去除率10％以上的菌株作为具有厌氧反硝化能力的菌株。NO3 —N、NO2 —N浓度的变化利用瑞士万通833离子色谱仪进行检测。去除率=（初始浓度-最终浓度）/初始浓度×100%。
高盐碱环境中的异养硝化能力的验证：取2%（V/V）种子液接种到硝化能力验证培养基中，每个处理设置空白对照，37℃、160r/min振荡培养，定期取出适量液体培养基测定NH4+-N浓度的变化情况，每次测定重复三次。保证空白对照的NH4+-N变化不大，对NH4+-N的变化情况进行分析；将氨氮去除率10％以上的菌株做为具有异养硝化能力的厌氧反硝化菌株，氨氮去除率=（初始氨氮浓度-最终氨氮浓度）/初始氨氮浓度×100%；NH4+-N浓度的变化采用水杨酸-次氯酸盐光度法进行测定。
实施例2：异养硝化与厌氧反硝化菌株的16S rDNA鉴定和构建系统发育树
分别将实施例1中获得的异养硝化能力的厌氧反硝化菌株进行16S rDNA鉴定和构建系统发育树；将单菌落于接种液体富集培养基，37℃，160r/min培养2d。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，作为PCR的模板，操作步骤见试剂盒说明书。
PCR引物为：27F（SEQ.ID.NO：11）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,
1541R（SEQ.ID.NO：12）；5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。
PCR反应体系(25μL)：8.5μL双蒸水（ ddH2O），12.5μL Taq酶混合物（2×Es TaqMasterMix），2μL 细菌DNA模板，1μL 上游引物[27F（10μM）]，1μL下游引物[ 1541R（10μM）]。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1.5min，29个循环；72℃延伸10min。PCR产物与适量上样缓冲液混合后点样，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果在凝胶成像系统下观察并将目的条带（1500bp左右）亮的PCR产物由上海生工生物技术有限公司进行测序，测序结果经过拼接后与 GenBank 中已提交的菌株的16SrRNA 基因序列通过BLAST进行同源性比较，选取部分菌株的16S rDNA序列利用 MEGA7. 0软件，以Neighbor-joining法构建系统发育树。
实施例3：
将实施例1中获得的多株耐盐碱的异养硝化与厌氧反硝化菌株接种于液体富集培养基，培养至对数生长期，无菌条件下将0.5ml菌液与0.5ml 50%浓度的甘油（体积比1：1）混合于2ml冻存管中，使得甘油终浓度为25%。于-20℃冰箱内过夜，转移至-80℃冰箱内保藏。取其中一株耐盐碱的异养硝化与厌氧反硝化细菌，命名为BJP72，将BJP72菌株在固体富集培养基上划线后37℃培养30h，观察菌落形态，如图1所示，菌落直径大约为0.3-0.5×1.5-3.0μm，颜色为白色，呈圆形，粘稠，表面光滑湿润且凸起，不透明，边缘整齐。将菌株进行革兰氏染色显微镜观察；如图2所示，菌体为杆状，革兰氏染色为红色，说明菌株为革兰氏阴性细菌。
菌株BJP72在高盐碱环境中的厌氧反硝化能力验证：将菌株BJP72分别接种于高盐碱的亚硝酸盐基础液体培养基和高盐碱的硝酸盐基础液体培养基中，其中亚硝酸盐基础培养基中NaNO2的初始浓度为4230mg/L，硝酸盐基础培养基中NaNO3的初始浓度为5580mg/L；如图3所示，随着时间的进程，可以发现NaNO2 和NaNO3的浓度逐步减少，最终至几乎为零，可以发现菌株BJP72对NaNO2和NaNO3的降解率逐步增加，最终至100％。
菌株BJP72在高盐碱环境中的异养硝化能力验证：将菌株BJP72接种于以100mg/LNH4Cl为唯一氮源的高盐碱的分离纯化液体培养基中振荡培养，考察菌株的异养硝化特征，培养基中NH4+-N的起始浓度为100mg/L，如图4所示，3h后NH4+-N浓度开始下降，36h后NH4 +-N的浓度下降速率最大，去除率达30％，48h氨氮浓度下降至20mg/L，去除率达80％；随着时间的延长，在2d内可达到90％的氨氮去除率，在7d内获得接近100％的硝态氮和亚硝态氮去除率。
通过PCR扩增、测序、拼接，将得到的16S rDNA序列提交到Gen bank数据库中进行BLAST，与数据库中的已有细菌16S rDNA序列进行比对，初步得到该菌株与Pseudomonasalcaliphila JCM 10630(T)的相似度为96.7％，与Pseudomonas oleovorans subsp.Lubricantis RS1(T)的相似性为96.78％，与Pseudomonas toyotomiensis HT-3(T)的相似性为96.79％。挑取多株Pseudomonas属菌株的16S rDNA序构建系统发育树，发育树构建如图5所示，可以看出菌株BJP72与其它Pseudomonas属细菌聚类在一起。
实施例4
一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法，本实施例与实施例1的不同点在于培养基的配置不同。
本实施例中分离纯化培养基组分包括基础成分和其他成分；所述基础成分，以1L计，组成为：氯化钠2g，氯化钾0.6g，六水合氯化镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸二氢钾0.3g，二水氯化钙0.2g和余量的蒸馏水；所述其他成分，以1L计，组成为：微量元素混合液1.1 ml，维生素溶液1.2 ml，1M 碳酸氢钠溶液3 ml，7.5mM EDTA·NA·Fe溶液1.1 ml，1M氯化铵溶液1.2ml，1M丙酮酸钠溶液1.1 ml，抗生素溶液1.2 ml和余量的蒸馏水。高压灭菌锅121℃灭菌15分钟。
其中，所述的微量元素混合液，以1L计，组成为：硼酸 40 mg，四水氯化锰110 mg，六水合氯化钴200 mg，六水合二氯化镍 30 mg，二水合氯化铜 3 mg，七水硫酸锌150 mg，钼酸钠40 mg， 25%盐酸15ml和余量的蒸馏水。
其中，所述的维生素溶液，以1L计，组成为：Vh 30mg，VB9 20 mg，VB6 110 mg，VB1 80mg，VB260 mg，VB3 60 mg，DL-泛酸钙 60 mg，VB12 1.1 mg，对氨基苯甲酸60 mg，氯化胆碱220 mg和余量的蒸馏水。其他成分不能高压灭菌，待基础成分温度降到50℃后，通过0.45μm针头过滤器加入，pH由1M NaOH或1M HCl调节至pH10.5。
本实施例中亚硝酸盐基础培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨12g，牛肉膏5 g，氯化钠7 g，亚硝酸钠0.207 g和余量的蒸馏水；
本实施例中硝酸盐基础培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨12g，牛肉膏5 g，氯化钠7 g，硝酸钠 0.255 g 和余量的蒸馏水。
本实施例中液体富集培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨11g，酵母提取物7 g，氯化钠 11 g和余量的蒸馏水；固体富集培养基在液体富集培养基成分外加入15.0g琼脂粉，分装后121℃高压灭菌15分钟，pH由1M NaOH或1M HCl调节至10.5。
其他方法步骤与实施例1相同。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgccat catggtnytn cc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgaaggcct cgatnarrtt rtg 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcacatcgc caacggnatg twygg 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcgcggaag atgshrtgrt cnac 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catcggcaac ggcatgyayg gngc 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcgtcaacg tcaargarac vgg 23
<210> 8
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<212> DNA
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<212> DNA
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tggagaacgc cggncargtn tgg 23
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<212> DNA
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gatgatgtcc acggcnacrt angg 24
<210> 11
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<212> DNA
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agagtttgat cctggctcag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaggaggtga tccagccgca 20
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgccat catggtnytn cc 22
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<212> DNA
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<212> DNA
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aaggaggtga tccagccgca 20
Claims (10)
1.一种耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品筛选：提取目标土壤微生物的总DNA，PCR初步筛选含有耐盐碱的异养硝化-厌氧反硝化菌株的微生物土样；
(2)在高盐碱环境中将步骤（1）中筛选出的土样在分离纯化培养基中进行异养硝化菌株的分离、纯化与筛选，获得异养硝化菌株；
(3) 将获得的异养硝化菌株进行PCR扩增以及电泳检测，将目的条带在460-510 bp的PCR产物对应的菌株认定为同时具有异养硝化与反硝化功能的菌株；
(4)高盐碱环境中，将步骤（3）中得到的同时具有异养硝化与厌氧反硝化功能的菌株制备成种子液，验证其异养硝化能力和厌氧反硝化能力。
2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的分离纯化培养基组分包括基础成分和其他成分；所述基础成分，以1L计，组成为：氯化钠0.5-2g，氯化钾0.1-0.6g，六水合氯化镁0.3-0.5g，氯化铵0.2-0.3g，磷酸二氢钾0.1-0.3g，二水氯化钙0.05-0.2g和余量的蒸馏水；所述其他成分，以1L计，组成为：微量元素混合液0.5-1.1 mg，维生素溶液0.5-1.2 mg，1M 碳酸氢钠溶液1-3 mg，7.5mM EDTA·NA·Fe溶液0.5-1.1 mg，1M氯化铵溶液0.8-1.2 mg，1M丙酮酸钠溶液0.9-1.1 mg，抗生素溶液0.8-1.2 mg和余量的蒸馏水。
3.根据权利要求书2所述的方法，其特征在于，所述的微量元素混合液，以1L计，组成为：硼酸 20-40 mg，四水氯化锰90-110 mg，六水合氯化钴180-200 mg，六水合二氯化镍20-30 mg，二水合氯化铜 1-3 mg，七水硫酸锌100-150 mg，钼酸钠30-40 mg， 25%盐酸10-15ml和余量的蒸馏水。
4.根据权利要求书2所述的方法，其特征在于，所述的维生素溶液，以1L计，组成为：Vh10-30 ml ，VB9 5-20 ml ，VB6 80-110 ml ，VB1 60-80 ml，VB2 40-60 ml ，VB3 40-60 ml，DL-泛酸钙 40-60 ml ，VB12 0.5-1.1 ml ，对氨基苯甲酸 40-60 ml，氯化胆碱 180-220ml和余量的蒸馏水。
5.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的种子液的制备在液体富集培养基中进行，所述的液体富集培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8-11g，酵母提取物4-7 g，氯化钠 8-11 g和余量的蒸馏水。
6.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的厌氧反硝化能力的验证在亚硝酸盐基础培养基和硝酸盐基础培养基中进行，所述的亚硝酸盐基础培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8-12g，牛肉膏 2-5 g，氯化钠 4-7 g，亚硝酸钠0.207 g和余量的蒸馏水；所述的硝酸盐基础培养基，以1L计，组成为：胰蛋白胨8-12g，牛肉膏 2-5 g，氯化钠 4-7g，硝酸钠 0.255 g 和余量的蒸馏水。
7.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的异养硝化能力的验证在硝化能力验证培养基中进行，所述的硝化能力验证培养基是以NH4Cl为唯一氮源的分离纯化液体培养基。
8.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的厌氧反硝化能力通过离子色谱仪检测NO3 —N、NO2 —N浓度的变化进行验证；所述异养硝化能力通过NH4+-N浓度的变化进行验证。
9.根据权利要求书2，5~7任一项所述的方法，其特征在于，所述的培养基的pH值均为8.8-10.5。
10.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤（3）中获得的同时具有异养硝化与反硝化功能的菌株进行16S rDNA鉴定以及构建系统发育树。
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