CN105754904B - 一株海洋嗜冷杆菌株及其在水体除磷中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株海洋嗜冷杆菌株及其在水体除磷中的应用，该菌株分类命名为海水嗜冷杆菌X3‑1403(Psychrobacter aquimaris X3‑1403)，已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016155。本发明填补了国内菌株合成纳米羟基磷灰石的空白。该菌在废水中具有自组装功能，在降解海水冲厕废水中污染物的同时利用废水中的钙磷合成纳米羟基磷灰石，变废为宝，环境友好。

Description

一株海洋嗜冷杆菌株及其在水体除磷中的应用
技术领域
本发明涉及一种新菌株，具体涉及一株海洋嗜冷杆菌株及其在水体除磷中的应用。
背景技术
磷是组成生命体的一种重要元素，同时也是生物生长必不可少的营养物质，然而水体中过量的磷会导致水体富营养化，影响水体质量与生态平衡。富营养化给我国的旅游业、工业、农业及水产业都带来了极大的危害，因此有效降低废水中磷浓度是一个急需解决的水污染问题。
目前，国内外污水除磷技术主要有吸附法、化学沉淀法和生物法。其中，吸附法是利用某些多孔或大比表面积的固体物质对水中磷酸根离子的亲和力来实现除磷的过程。但吸附法除磷在吸附剂的抗干扰性、溶解损失和再生等方面还存在诸多问题。由于传统吸附剂吸附容量较低，吸附法作为单独除磷手段目前尚未得到广泛应用，经常作为辅助手段与其它除磷方法结合使用。化学沉淀法是利用金属阳离子与磷酸根结合生成沉淀的过程，但此方法会产生大量化学污泥造成二次污染，同时药剂费用较高导致处理成本较高，残留的金属离子浓度也较高，并且化学沉淀法不适用于低磷废水的处理。
与吸附法和化学沉淀法相比，生物除磷方法具有效率高，成本低及环境友好等优点。依赖于聚磷菌作用的强化生物除磷系统是目前应用最广泛的生物除磷方法。其原理是利用聚磷菌在厌氧条件下释磷、好养条件下过量摄磷，最后通过排泥的方式达到除磷的目的。但该方法只是将磷储存在了细胞内，仍需要进一步的厌氧消解、化学沉淀才能达到磷的稳定回收。而且当处理高盐度废水如海水冲厕废水时，高盐环境会对微生物会产生抑制作用，即使废水被稀释到盐度为1％时处理也很困难，且相比较硝化菌和反硝化菌而言，除磷菌对于盐度更加敏感，有文献报道当盐度从0％上升到0.4％时，盐度对氮的去除没有影响，而磷的去除率从85％下降到25％。因此传统的生物除磷方法在处理高盐废水时受到极大的限制，同时生物污泥又具有驯化周期长、启动困难等缺陷。
海洋微生物由于其特殊的生存环境，往往能在环境中形成特殊的功能。目前已有研究人员探索将特定的海洋菌应用于废水的生物处理技术领域，并取得了一定的进展。但目前这些研究主要停留在纯菌摇瓶实验阶段或作为生物强化剂，而要应用到实际中仍有许多问题需要克服，如纯菌难沉降和强化菌在体系中的竞争力不足等。同时，这些研究主要集中于如何降解废水中的污染物，并不能充分利用废水中的有用物质，在去除污染物的同时生成新的资源，从而达到变废为宝，资源循环利用的目的。此外，研究发现有些海洋菌能够在生长过程中将磷以金属磷酸盐沉淀的形式沉淀下来以达到除磷的目的，在自然界中该过程在也是重要的生物矿化过程。
因此筛选利用生长在高盐环境中具有耐盐性能的除磷菌株，探索其在磷的进一步去除中的应用具有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株海洋嗜冷杆菌株及其在水体除磷中的应用。
本发明为实现上述目的而采用的技术方案是：
本发明的第一个目的是提供一株海洋嗜冷杆菌株，本发明提供的Psychrobacteraquimaris X3-1403(海水嗜冷杆菌X3-1403)，属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)，已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M2016155。
本发明所述的菌株海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)可在15～30℃，培养基pH值7～8、盐度为0～12％(最佳1％～5％)培养条件下生长，菌体形态特征为革兰氏染色呈阴性，电子显微镜下观察为球菌或短杆菌，单独、成双或聚集成团，有荚膜、无鞭毛。菌株固体LB培养基培养24h菌落特征为圆形，光滑，奶油色。
本发明所述的菌株可以自絮凝、自组装产生的纳米羟基磷灰石。
本发明中的盐度是指培养基(或液体)中溶解物质质量与培养基(或液体)质量的比值。
本发明的第二个目的是提供一种微生物混合物，其特点是包含本发明的菌株。
所述微生物混合物可以包含具有水体中除磷作用的其他微生物，这些微生物可以选自沙雷氏菌属或其他金属磷酸盐沉淀菌属。
本发明的第三个目的是提供一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品(或菌剂或组合物)。
优选的，所述产品(或菌剂或组合物)包括载体；所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇；液体载体可以为植物油、矿物油或水。
优选的，所述产品(或菌剂或组合物)为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式、颗粒形式或其他形式。
进一步优选的，所述粉末形式可以为冻干粉末形式；所述片剂形式为含有所述冻干粉末和任选营养素(例如维生素、矿物盐等)的片剂形式。
所述产品(或菌剂或组合物)的活性成分为海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacteraquimaris X3-1403)，该活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。
优选的,所述产品的形式为含有海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacteraquimaris X3-1403)的生物膜或生物膜反应器。该生物膜具体是由人工填料或天然材料作为载体，海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)附着絮凝其表面形成的膜状物。
本发明的第四个目的是提供一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品在水体中除磷的应用，特别适用于高盐度的水体除磷。
本发明中所述的高盐度的水体是指盐度为1％及以上的水体。在本发明的一个具体实施方式中，所述高盐浓度的水体为模拟的海水冲厕废水；在本发明的另一个具体实施方式中，所述的水体为模拟的生活废水。
优选的，该应用方法包括所述菌株、微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品与待处理的水体接触培养的步骤。
优选的，所述菌株与待处理的水体接触培养的步骤在于：用该菌株接种所述待处理水体。
优选的，所述培养基为LB培养基或海水冲厕废水或模拟海水冲厕废水或生活废水或模拟生活废水。所述LB培养基是由海水、蛋白胨和酵母粉制备得到，其中所述蛋白胨的质量分数为1％，酵母粉的质量分数为0.3％。所述模拟海水冲厕废水的配方为表1所示，所述模拟生活废水的配方为表2所示。
优选的，所述待处理的水体中磷元素的浓度为0.3mM-1.3mM。
本发明中的一个较具体的实施方式为：将海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacteraquimaris X3-1403)接种在LB培养基中，经活化培养后，制得活化菌液，将活化菌液按8-12％的体积分数加入到待处理的水体中；或者，
将所述微生物混合物、包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品加入到待处理的水体中。
本发明所述菌株在去除磷的过程中只需要活化后接种到含磷废水中培养就可以，步骤简单，操作容易，成本低廉。
本发明的第五个目的是提供一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品在制备生物纳米材料中的应用。
经过研究发现，本发明的菌株在一定条件下进行培养，可以自絮凝、自组装产生的纳米羟基磷灰石。
该应用方法包括所述菌株、微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品与至少含有钙、磷、氧和氢元素的培养基接触培养的步骤。
优选的，所述菌株与至少含有钙、磷、氢和氧元素的培养基接触培养的步骤在于：用该菌株接种所述中至少含有钙、磷、氧和氢元素的培养基。
优选的，所述培养基为LB培养基或海水冲厕废水或模拟海水冲厕废水或生活废水或模拟生活废水或其他可以使得本发明菌株生长并含有钙、磷元素的培养基。所述LB培养基是由海水、蛋白胨和酵母粉制备得到，其中所述蛋白胨的质量分数为1％，酵母粉的质量分数为0.3％。所述模拟海水冲厕废水的配方为表1所示，所述模拟生活废水的配方为表2所示。
本发明的第六个目的是提供一种水体中除磷的方法，其特点是其包括使需要除磷的水体与本发明菌株接触的步骤。
优选的，所述使需要除磷的水体与本发明菌株接触的步骤在于：用本发明菌株接种所述需要除磷的水体中。
优选的，本发明的方法特别适于海水冲厕废水中除磷和生活废水中除磷。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的菌株对环境条件有很高的适应性，可以在高盐以及广pH、温度、营养范围内生长，解决了现有的生物除磷菌的生长繁殖受限于水体中盐浓度的问题，活菌体能够最大限度的去除污水中的磷，对于高盐废水中磷的去除率可达70％以上；从而有效的防控水体富营养化或赤潮现象的发生。
(2)本发明所述的菌株可以在单一好氧条件下实现磷的去除，简化了磷的去除过程，提高了除磷过程的可操作性，为生物除磷提供了新途径。
(3)本发明的菌株还具有自絮凝和自组装的功能，菌株在降解水体中污染物的同时，还能够利用水体中的钙磷，合成纳米生物材料，变废为宝，实现了磷资源的循环利用。
附图说明
图1是本发明菌株革兰氏染色结果图。
图2是本发明菌株菌体形态AFM图。
图3：Psychrobacter aquimaris X3-1403在模拟海水冲厕废水中对TP、COD、NH4 +-N和TN的去除效果。
图4：菌体在模拟海水冲厕废水中的自絮凝的电镜照片。
图5：菌体在模拟海水冲厕废水中的自组装及合成纳米材料的透射电镜照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1本发明所述的菌株Psychrobacter aquimaris X3-1403的筛选
1、筛选过程
⑴将取自于中国南海的464株菌株在海水LB液体培养基中培养24h(200rpm、25℃)，并观察在振荡培养过程中是否有自絮凝颗粒形成。
⑵将能在振荡培养过程中自絮凝的菌株在5000rpm下离心10min，弃去上清液，用去离子水清洗两遍菌体，然后在透射电镜下观察菌体表面是否有纳米级颗粒产生。
⑶将上面筛选得到的能在振荡培养过程中自絮凝且菌体表面产生纳米级颗粒的菌株在光学显微镜观察菌株是否有自组装现象。
⑷筛选得到的能够在振荡培养过程中自絮凝、自组装且菌体表面产生纳米级颗粒的菌株即为本发明所述的菌株海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)。
2、菌株的鉴定：菌落特征及菌体形态
本发明所述的菌株海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)可在15～30℃，pH值7～8，盐度为0～12％(最佳1％～5％)培养条件下生长，菌体形态特征为革兰氏染色呈阴性，如图1所示，电子显微镜下观察为球菌或短杆菌，单独、成双或聚集成团，有荚膜、无鞭毛。菌株固体LB培养24h菌落特征为圆形，光滑，奶油色，如图2所示。
3、菌株的鉴定：16S rDNA序列分析
海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：
将所测16S rDNA核苷酸序列与输入到NCBI网站的GenBank数据库中的进行相似性序列比对后，结果表明：海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)与Psychrobacter同处于一个最小分支上，其16S rDNA序列与Psychrobacter aquimaris的相似性达99.64％。结合菌落形态和16S rDNA序列分析，鉴定为海洋嗜冷杆菌(Psychrobacteraquimaris)。
通过菌株X3-1403的分子鉴定结果，进一步确认菌株Psychrobacter aquimarisX3-1403为海洋嗜冷杆菌属(Psychrobacter aquimaris)，将海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016155。
实施例2本发明的菌株在含磷盐水处理中的应用
将海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)在LB中培养24h后，以10％的接种量接种到模拟海水冲厕废水中，并按时间点取样测定该菌株对TP、COD、NH4 +-N和TN的去除效果。从图3中可以看到，该菌株对TP和COD具有较高的去除效果，去除率分别为70.5％和75.5％，48h的去除速率分别为0.57mg/(L·h)和18.7mg/(L·h)。而该菌对NH4 +-N和TN的去除效果较差，只有17.8％和19.4％。
实施例3本发明菌株在制备纳米材料纳米羟基磷灰石中的应用
本发明所述的菌株海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)在LB培养基中活化24h，其培养条件为200rpm、25℃。然后①在无菌操作台中用事先灭菌的离心管取25mL活化的培养液，10000rpm离心10min；②去其上清液，然后用10mL的灭菌去离子水重悬菌液，10000rpm离心10min；③重复步骤②一次。将重悬的菌液分别接种到模拟海水冲厕废水和模拟生活废水中(接种量10％)，200rpm、25℃培养48h。将培养液在5000rpm下离心10min，弃去上清液，离心管底部的菌体用去离子水清洗两遍，即得含纳米材料的菌体。重悬一部分该菌体，在铜网上固定并染色，最后烘干后用于透射电镜观察。
上述LB培养基配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制。
表1模拟海水冲厕废水配方为(陈海水配制):
表2模拟生活废水配方为(去离子水配制):
菌体在模拟海水冲厕废水中的自絮凝的电镜照片如图4。菌体在模拟海水冲厕废水中的自组装及合成纳米材料的透射电镜照片如图5，图4和图5显示该纳米颗粒材料呈现蜂巢状，粒径分布均匀，结构紧凑。
实施例4
一种微生物混合物，其特点是包含本发明的菌株-海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)。所述微生物混合物可以包含具有水体中除磷作用的其他微生物，这些微生物可以选自沙雷氏菌属。经过实验验证，该微生物混合物以海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)为主，可以应用在水体除磷，并且可合成纳米羟基磷灰石。
实施例5
一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的菌剂，菌剂中包括载体和该本发明所述的菌株，所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇；液体载体可以为植物油、矿物油或水。菌剂的形式为冻干粉末形式。经过实验验证，该菌剂以海水嗜冷杆菌X3-1403(Psychrobacter aquimaris X3-1403)为活性成分，可以应用在水体除磷，并且可合成纳米羟基磷灰石。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (13)

1.一株海洋嗜冷杆菌菌株，其特征是：该菌株分类命名为海水嗜冷杆菌(Psychrobacter aquimaris)X3-1403，已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016155。
2.微生物混合物，其特征是：该微生物混合物是由权利要求1所述的菌株和沙雷氏菌属组成。
3.包含权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的微生物混合物的产品。
4.权利要求1所述的菌株、权利要求2所述的微生物混合物或者权利要求3所述的产品在水体中除磷的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是：所述应用方法包括：所述菌株、所述微生物混合物或者所述产品与待处理的水体接触培养的步骤。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是：所述水体的盐度为1～5％。
7.如权利要求5所述的应用，其特征是：所述水体为海水冲厕废水或生活废水。
8.权利要求1所述的菌株、权利要求2所述的微生物混合物或者权利要求3所述的产品在制备纳米羟基磷灰石中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是：包括权利要求1所述的菌株、权利要求2所述的微生物混合物或者权利要求3所述的产品与至少含有钙、磷、氧和氢元素的培养基接触培养的步骤。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是：所述菌株的培养条件为：培养温度为15～30℃，培养基pH值7～8、盐度为1～5％。
11.一种水体中除磷的方法，其特征是：该方法包括使需要除磷的水体与权利要求1所述的菌株接触的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征是：所述水体的盐度为1～5％。
13.如权利要求12所述的方法，其特征是：所述水体为海水冲厕废水。
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Optimization of salts in medium for production of carboxymethylcellulas by a psychrophilic marine bacterium, Psychrobacter aquimaris LBH-10 using two statistical methods;Hye-Jin Kim等;《Korean J. Chem. Eng.》;20111205;384-391 *

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