CN115956126A - 从真菌中提取透明质酸的方法、植物来源的透明质酸及其用途 - Google Patents
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Abstract
由植物起始材料(例如真菌)进行提取以制备重均分子量为10kDa至600kDa的透明质酸或其盐(HA)的方法。
Description
本发明涉及一种混合物,其包括至少一种从植物起始材料获得的糖胺聚糖或者由其组成,该糖胺聚糖选自包括纯度高、污染物和/或副产物含量低的植物来源的透明质酸或其盐(透明质酸阴离子盐)(共同地或单独地简称为HA)和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐(共同地或单独地简称为CS)的组或由它们组成的组。
此外,本发明还涉及上述混合物作为添加剂、赋形剂或成分在制备医药产品、医疗器械、营养品、特殊医学应用食品(FSMP)、食品或膳食补充剂中的应用。
此外,本发明涉及一种组合物,其包含(i)所述混合物,所述混合物包含植物来源的透明质酸或其盐(透明质酸阴离子盐)(共同地或单独地简称为HA),和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐(简称CS),和(ii)任选的技术添加剂和制药或食品级赋形剂。
此外,本发明还涉及包含用作药物的所述混合物的所述组合物。
此外,本发明涉及包含所述混合物的所述组合物,用于预防或治疗具有特定失调或病理或疾病的人类和动物的方法,这些疾病选自关节炎、骨关节炎、关节病、关节疼痛、四肢和关节的炎症、胃食管反流。
此外,本发明涉及制备所述混合物以及包含所述混合物的所述组合物的方法,该混合物包括植物来源的透明质酸或其盐(透明质酸阴离子盐)(共同地或单独地简称为HA)和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐(简称为CS),或由它们组成。
最后,本发明涉及作为植物起始材料的真菌在制备纯度高且污染物和/或副产物含量低的植物来源的透明质酸或其盐和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐中的应用。
透明质酸是一种阴离子非硫酸化糖胺聚糖(GAG),大量分布于脊椎动物的结缔组织、上皮组织和神经组织中。透明质酸具有重要的结构、流变学和生理功能。
公鸡冠和人类脐带的透明质酸浓度非常高,分别为7500mg/l和4100mg/l。为此,在80年代初,Endre A.Balazs和他的合作者开发从公鸡冠和从人类脐带中分离和纯化透明质酸的程序。从彼时起,透明质酸就开始以工业规模由公鸡冠而生产出来。
硫酸软骨素是由糖、N-乙酰半乳糖胺和葡萄糖醛酸的交替单元的链组成的硫酸GAG。硫酸软骨素链可以由数百个糖单位组成,每个糖单位可以在不同位置以不同的量被硫酸化。由于其高抗压强度,硫酸软骨素是软骨的重要结构成分。
硫酸软骨素具有以下通式(I)的重复单元(二糖):
(I)
其中R2、R4和R6中的至少一个是亚硫酸基(SO3 -)。在单硫酸软骨素中,R2、R4或R6中只有一个基团是亚硫酸基团。因此,三种可能的单硫酸软骨素是6-硫酸软骨素(R2=H;R4=H;R6=SO3 -)、4-硫酸软骨素(R2=H;R4=SO3 -;R6=H)和2-硫酸软骨素(R2=SO3 -;R4=H;R6=H)。
大多数硫酸软骨素是从动物软骨的提取物中获得的,主要来自牛和猪的组织(例如:气管、耳朵和鼻子),但也可以使用其他来源,如鲨鱼、鱼和鸟的软骨。
尽管就疗效而言透明质酸和硫酸软骨素在哺乳动物,特别是在人类中的医学应用众多且无可争议,但通过从动物前体中提取的制备过程今天面临着越来越多的关注和担心,也有伦理、宗教和道德方面的担忧。主要的关注和担心来自于使用来自动物或动物来源的产物来制备透明质酸或其盐和/或软骨素或其盐,如硫酸软骨素,特别是当这些化合物或盐被用于营养、生物医学或药物应用时。此外,从动物来源提取的硫酸软骨素和透明质酸具有高分子量,而具有低分子量的硫酸软骨素和/或透明质酸将是有利的,因为它们具有更好的经皮渗透特性。
在现有技术中,已知通过在经细菌发酵过程获得的非硫酸化软骨素上插入硫酸基团而获得的非动物来源的硫酸软骨素。
因此,在医药产品、医疗器械、营养保健品、特殊医学应用食品(FSMP)、膳食补充剂或食品领域中,市场经营者对以不同于现有产品的方式制备的透明质酸或其盐和/或软骨素或其盐(如硫酸软骨素)有强烈的需求,该产品可用于所有类别的消费者,包括严格素食主义者、素食者、过敏症患者以及因宗教或意识形态原因目前无法使用含有透明质酸或其盐和/或软骨素或其盐的产品或药物的任何人。此外,人们感到有必要用相对于本领域的已知方法在经济上有利并易于应用的方法来生产非动物来源的硫酸软骨素和/或透明质酸。
经过长期紧张的研究和开发工作,申请人开发了一种制备技术和方法,能够充分解决现有的限制、缺点和问题。
因此,形成一个本发明的目的的是一种混合物,其包括至少一种从植物起始材料获得的糖胺聚糖或者由其组成,该糖胺聚糖选自包括具有所附权利要求中定义的特征的植物来源的透明质酸或其盐(透明质酸阴离子盐)(共同地或单独地简称为HA)和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐(共同地或单独地简称为CS)的组,或由其组成的组。
此外,形成一个本发明的目的的是上述混合物作为添加剂、赋形剂或成分在制备医药产品、医疗器械、营养保健品、特殊医学应用食品(FSMP)、食品或膳食补充剂中的应用,所述应用具有所附权利要求中定义的特征。
形成本发明的另一个目的的是一种组合物,其包含(i)所述混合物,其包括植物来源的透明质酸或其盐(透明质酸阴离子盐)(共同地或单独地简称为HA),和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐(简称,CS),和(ii)任选的技术添加剂和制药或食品级赋形剂,具有所附权利要求中定义的特征。
形成本发明的另一个目的的是混合物和至少一种技术添加剂或赋形剂,或组合物,其用作药物(第一医疗应用),具有所附权利要求中定义的特征。
形成本发明的另一个目的的是混合物或包含所述混合物的组合物,其用于预防性或治疗性治疗具有特定失调或病理或疾病的人类和动物的方法,这些失调或病理或疾病选自关节炎、骨关节炎、关节病、关节疼痛、四肢和关节的炎症、胃食管反流(第二医疗应用),所述应用具有如所附权利要求中定义的特征。
此外,形成本发明的另一个目的的是制备所述混合物或包括所述混合物的所述组合物的方法,该混合物包含植物来源的透明质酸或其盐(透明质酸阴离子盐)(共同地或单独地简称为HA)和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐(简称,CS),或由其组成,具有所附权利要求中定义的特征。
最后,形成本发明的一个目的的是真菌的应用,所述真菌作为植物起始材料用于制备纯度高、污染物和/或副产物含量低的透明质酸或其盐和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐,具有所附权利要求中定义的特征。
现在将参照附图对本发明的优选实施方式进行描述,其中,
-图1至4显示了根据不同的实施方式(第一实施方式,P1)的方法,即本发明主题的流程图;
-图5和图6显示了根据第二实施方式(P2)的方法,即本发明主题的流程图;
-图7和图8显示了根据第三实施方式(P3)的方法,即本发明主题的流程图;
-图9和10显示了两个HPLC光谱,分别用于测定含有HA的样品和含有CS的样品中的不饱和二糖。
应指出的是,在本说明的上下文中,表述“HA”是用来表示透明质酸或其盐,或透明质酸盐,或其组合。另一方面,表述“CS”是用来表示软骨素、软骨素盐,优选为硫酸软骨素或其盐,或其混合物。
应该注意的是,在本说明中,术语“植物起始材料”和“植物来源的起始材料”是同义词,因此可以互换使用。
具体实施方式
形成本发明的目的的是一种混合物(m),其包括由植物来源的起始材料获得的至少一种糖胺聚糖,或由其组成。所述植物来源的材料选自包括一种或多种天然真菌的组,或由其组成的组。
所述糖胺聚糖选自包括以下的组或由以下组成的组。
(a)透明质酸或其盐,透明质酸阴离子(简称,HA)。
(b)软骨素或其盐,如硫酸软骨素(简称,CS)或其盐。
(c)(a)和(b)的组合。
植物起始材料是真菌。该真菌是在自然界中生长和可见的真菌,例如可以在树林中发现和收集,但也可以在温室中培养。
该真菌属于双核菌亚界(subkingdom Dikarya),优选为属于担子菌门(divisionBasidiomycota)。
双核菌是包括子囊菌门(division Ascomycota)和担子菌门(divisionBasidiomycota)的真菌亚界。担子菌(Basidiomycota R.T.Moore,1980)是构成真菌界的最大门类之一。
根据一个实施方式,植物起始材料是银耳(Tremella fuciformis)物种的真菌,或所述植物起始材料包括银耳物种的真菌,或由其组成。
银耳(Berk.1856年)(也被称为雪耳,或银色耳真菌)是一种原产于热带和亚热带地区的真菌,在这些地区它在死的硬木上茁壮成长,它也被栽培以应付极高的需求--特别是在日本和中国--用于烹饪和传统药物。银耳产生白色胶状果实体(basidiocarps),类似于叶子。
在本发明中使用银耳是特别有利的,因为从这种植物起始材料出发,本文开发的提取技术(第一实施方式(P1)、第二实施方式(P2)和第三实施方式(P3))使得能生产完全来自植物的HA和CS(且分子量低)。混合物(m)中含有的并从本发明的方法中获得的HA和/或CS糖胺聚糖具有独特的特性,这使得它们相对于根据现有技术从动物软骨中获得的HA和/或CS而言特别有效,尤其是由于它们的分子量降低。低分子量可以使HA和/或CS糖胺聚糖具有改善的经皮渗透特性。
更确切地说,通过本发明的方法(P1和/或P2)获得的透明质酸或其盐(透明质酸盐)的重均分子量为10kDa至600kDa,优选为100kDa至500kDa,甚至更优选为200kDa至400kDa或100kDa至300kDa,例如,重均分子量约为50kDa、150kDa、或250kDa、或300kDa、或350kDa、或450kDa、或550kDa。优选地,相对于从真菌中提取的所述HA的总重量而言,所述HA含有的软骨素(优选非硫酸化软骨素)的重量百分比为0.01%至5%,优选为0.1%至3%,甚至更优选为0.5%至2%,例如1%或2%。
根据本发明的一个有利方面,由于分子的尺寸有限,重均分子量落在这些范围内的HA具有较高的经皮渗透力。
软骨素或其盐,例如通过本发明的方法(P1和/或P2)获得的硫酸软骨素或其盐(CS)的重均分子量为1kDa至50kDa或为大于5kDa至小于50kDa,优选为3kDa至40kDa,甚至更优选为5kDa或大于5kDa至25kDa或大于5kDa至10kDa,例如重均分子量约为4kDa、或6kDa、或8kDa、或10kDa、或12kDa、或14kDa、或16kDa、或18kDa、或22kDa、或24kDa。
根据本发明的另一个有利方面,具有本文所述范围内的重均分子量的CS也证明能有效地减少膝和髋的骨关节炎造成的骨损伤。
本发明的混合物(m)中含有的CS包括硫酸软骨素,其重均分子量为1kDa(1,000.00Da=1×103Da)至50kDa,优选为3kDa至40kDa,甚至更优选为5kDa至25kDa,例如重均分子量约为4kDa、或6kDa、或8kDa、或10kDa、或12kDa、或14kDa、或16kDa、或18kDa、或22kDa、或24kDa。
优选地,所述CS的电荷密度为0.70至0.99或0.70至1.50,优选为0.75至0.98或0.75至1.20,甚至更优选为0.80至0.97,例如0.85、0.87、0.90、0.92、0.94或0.96。
更优选地,所述CS(从P1和/或P3方法中获得)的6-硫酸软骨素相对于所述CS的总重量(或相对于硫酸软骨素所含的二糖总量;例如,通过HPLC测定的百分比)的重量百分比为50%至99.5%,优选为50%至95%,更优选为75%至88%,甚至更优选为78%至86%,例如约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。
除了6-硫酸软骨素,所述CS优选包括非硫酸软骨素(非硫酸化软骨素)。
优选地,非硫酸化软骨素相对于所述CS的总重量(或相对于硫酸软骨素所含的二糖总量;例如,通过HPLC测定的百分比)的重量百分比为0.1%至25%,优选为0.5%至20%或5%至20%,更优选为7%至15%,甚至更优选为8%至13%,例如约0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5.5%、6%、8%、9%、10%、11%或12%。
除了6-硫酸软骨素和非硫酸化软骨素,所述CS优选包括2,6-二硫酸软骨素。
优选地,2,6-二硫酸软骨素相对于所述CS的总重量(或相对于硫酸软骨素所含的二糖总量;例如,通过HPLC测定的百分比)的重量百分比为0.1%至10%,优选为0.2%至8%,甚至更优选为0.3%至5%,例如约0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%或4.5%。
除了6-硫酸软骨素、非硫酸化软骨素和2,6-二硫酸软骨素外,所述CS优选包括4-硫酸软骨素(或相对于硫酸软骨素所含的二糖总量;例如,通过HPLC测定的百分比)。
优选地,4-硫酸软骨素相对于所述CS的总重量(或相对于硫酸软骨素所含的二糖总量;例如,通过HPLC测定的百分比)的重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,甚至更优选为0.1%至1.5%,例如约0.02%、0.03%、0.04%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%。
除了6-硫酸软骨素、非硫酸化软骨素、2,6-二硫酸软骨素和4-硫酸软骨素,所述CS优选包括4,6-二硫酸软骨素。
优选地,4,6-二硫酸软骨素相对于所述CS的总重量(或相对于硫酸软骨素所含的二糖总量;例如,通过HPLC测定的百分比)的重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,甚至更优选为0.1%至1.5%,例如约0.02%、0.03%、0.04%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%。
除了6-硫酸软骨素、非硫酸化软骨素和2,6-二硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和4,6-二硫酸软骨素,所述CS优选包括2,4-二硫酸软骨素(或相对于硫酸软骨素所含的二糖总量;例如,通过HPLC测定的百分比)。
优选地,2,4-二硫酸软骨素相对于所述CS的总重量(或相对于硫酸软骨素所含的二糖总量;例如,通过HPLC测定的百分比)的重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,甚至更优选为0.1%至1.5%,例如约0.02%、0.03%、0.04%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1.0%。
除了6-硫酸软骨素、非硫酸化软骨素、2,6-二硫酸软骨素、4-硫酸软骨素、4,6-二硫酸软骨素和2,4-二硫酸软骨素,所述CS优选包括透明质酸或透明质酸盐(优选非硫酸化)。优选地,所述HA相对于所述CS的总重量的重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,甚至更优选为0.1%至1.5%,例如0.8%或1.0%。
根据一个实施方式,包含在混合物(m)中并通过本发明的方法(P1和/或P3)获得的CS包括:
-6-硫酸软骨素,其重量百分比为50%至99.5%,优选为50%至95±0.5%,更优选为75%至88%,甚至更优选为78%至86%;
-非硫酸化软骨素,其重量百分比为0.1%至25%,优选为0.5%至20%,更优选为7%至15%,甚至更优选为8%至13%。
-2,6-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.1%至10%,优选为0.2%至8%,甚至更优选为0.3%至5%;以及,此外,
-4-硫酸软骨素,其重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,甚至更优选为0.1%至1.5%。
-4,6-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,甚至更优选为0.1%至1.5%,以及
-2,4-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,甚至更优选为0.1%至1.5%。
举例来说,根据下表1,包含在混合物(m)中并通过本发明的方法获得的CS具有CS.1、CS.2、CS.3、CS.4、CS.5或CS.6的组成(值以各组分相对于所述CS.n的总重量的重量百分比表示,n=1-6)。
表1
形成一个本发明的目的的是一种组合物,其包含(i)上述混合物(m),混合物(m)包括以下或由以下组成:(a)重均分子量为10kDa至600kDa(优选为100kDa至500kDa,甚至更优选为200kDa至400kDa,或100kDa至300kDa,例如约150kDa、或250kDa、或300kDa、或350kDa、或450kDa、或550kDa)的HA,和/或(b)重均分子量为1kDa至50kDa或大于5kDa至小于50kDa的CS(优选为3kDa至40kDa,甚至更优选为5或大于5kDa至25kDa,例如约4kDa、或6kDa、或8kDa、或10kDa、或12kDa、或14kDa、或16kDa、或18kDa、或22kDa、或24kDa),以及(ii)任选的技术添加剂和医药或食品级辅料。
这样的组合物可以是药物组合物、医疗器械组合物(EU)2017/745、营养品功能组合物、特殊医疗用食品(FSMP)组合物、膳食补充剂组合物或食品组合物,或新型食品组合物(EU)2015/2283。
这样的组合物可以作为药品使用,或作为用于预防和/或治疗关节炎、骨关节炎、关节病、关节疼痛、四肢和关节的炎症、胃食道反流的组合物使用。
形成本发明的目的的是一种制备透明质酸或透明质酸盐(HA)(方法P1和/或P2)和/或硫酸软骨素或软骨素或其盐(CS)(方法P1和/或P3)的技术和方法,所述方法包括至少一个从植物来源的起始材料提取透明质酸或透明质酸盐和/或硫酸软骨素或软骨素的步骤,例如,植物来源的起始材料包括至少一种属于双核菌亚界,优选为担子菌门,更优选为银耳物种的天然真菌,或由其组成。
本发明的方法(第一实施方式(P1)、第二实施方式(P2)和第三实施方式(P3))不包括用细菌进行发酵和/或消化的步骤,例如专利文件WO 2012/152872 A1和EP 2852437B1中报道的用于制备软骨素或硫酸软骨素的细菌发酵。
图1至图8的流程图中举例说明了这一方法的各种实施方式。
根据第一实施方式(P1),本发明的方法主题包括以下步骤。
(i)鉴别一种或多种天然真菌作为糖胺聚糖的植物起始材料;例如,一种或多种干燥或干制形式的天然真菌,优选包括至少一种属于双核菌亚界,优选为担子菌门,更优选为银耳(Tremella fuciformis)物种的天然真菌,或由其组成;
(ii)任选地,破碎或粉碎植物起始材料;
(iii)使用提取溶剂,优选水性溶剂,甚至更优选水(例如蒸馏水或双蒸馏水)对从步骤(i)或步骤(ii)获得的植物起始材料提取所述糖胺聚糖(HA或CS),以获得所述糖胺聚糖的水性提取物;
(iv)向从步骤(iii)获得的水性提取物中加入溶剂,优选乙醇,以获得液体产物。
(v)对从步骤(iv)获得的液体产物进行离心和/或过滤,以获得液相和固体残余物;
(vi)对从步骤(v)的离心和/或过滤中获得的液相通过以下步骤(vi.a)进行处理,和/或对从步骤(v)的离心和/或过滤中获得的固体残余物通过以下步骤(vi.b)、(vi.c)、(vi.d)和(vi.e)进行处理:
(vi.a)干燥,优选浓缩和干燥从步骤(v)获得的液相以获得重均分子量为10kDa至600kDa的透明质酸或其盐;
和/或
(vi.b)回收和纯化从步骤(v)获得的固体残余物,以获得重均分子量为1kDa到50kDa的软骨素或其盐(CS);
(vi.c)用硫酸源处理从步骤(vi.b)获得的软骨素或其盐(CS)以获得酸化产物,该硫酸源优选为选自包括硫酸、三氧化硫吡啶复合物、三氧化硫二甲基甲酰胺复合物及其混合物的组,或由它们组成的组;
(vi.d)用碱性试剂中和步骤(vi.c)获得的酸化产物,以获得经中和产物;
(vi.e)浓缩和干燥从步骤(vi.d)获得的经中和产物,以获得重均分子量为1kDa至50kDa的硫酸软骨素或其盐。
在步骤(iii)中进行提取的植物起始材料可以是完整的(即单块,例如整个真菌),也可以是在步骤(ii)中被破碎(成块或片)或粉碎(成颗粒、粉末或球)的植物材料。
图1和图2的流程图显示了根据第一实施方式(P1)的本发明方法主题的实施方式,其中在步骤(i)中鉴别的天然真菌或多种天然真菌在步骤(iii)或步骤(iii.a)和(iii.b)中提取以获得水性提取物。
图3和图4的流程图显示了根据第一实施方式(P1的本发明的方法主题的实施方式)(根据本领域技术人员已知的技术和装置进行的方法),其中在步骤(i)中鉴别的天然真菌或多种天然真菌在步骤(ii)中被破碎或粉碎。随后,在步骤(ii)中破碎或粉碎的天然真菌或多种天然真菌在步骤(iii)或步骤(iii.a)和(iii.b)中提取,以获得水性提取物。
在步骤(ii)中,如果植物起始材料被破碎或粉碎(根据本领域技术人员已知的技术和设备),所述植物起始材料的平均粒径分布优选为500μm至2500μm,更优选为800μm至1800μm,甚至更优选为900μm至1,200μm。
根据一个实施方式,在步骤(iii)中提供的植物起始材料(来自步骤(i)或(ii))是破碎成块状或片状,或粉碎成颗粒或球的植物材料。
在步骤(iii)中提供的植物起始材料(来自步骤(i)或(ii))优选为干燥的或干制的,也就是说,它是一种植物起始材料,水含量相对于植物起始材料的总重量而言为约2%至20%,优选5%至15%,甚至更优选8%至10%。
在步骤(iii)中,提取溶剂选自水性溶剂和水。
水性溶剂(或水性溶液)优选为水醇混合物,其中醇(例如乙醇)相对于提取溶剂的总重量的重量百分比为0.1%至50%,更优选为0.5%至25%,甚至更优选为1%至15%,例如重量百分比约为1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、7.5%、10%、20%。
水优选为蒸馏水或双蒸馏水。
在步骤(iii)中,将植物起始材料连续或分批装入容器或提取装置中,其例如配备机械搅拌装置、加热装置、过滤装置以及温度和压力控制装置。
在步骤(iii)中,然后在所述提取容器或设备中通过提取溶剂提取植物起始材料,从而使透明质酸或其盐以液相中进入溶液,在水性提取物中,从而使软骨素留在固体残余物中。
步骤(iii)的提取采用[植物起始材料的重量]:[提取溶剂的体积]为1:1至1:90的比例进行,优选为1:10至1:90,更优选为1:20至1:75,甚至更优选为1:40至1:60,例如1:3、1:5、1:15、1:25、1:45、1:50或1:55。步骤(iii)的提取在1分钟至12小时的时间内进行,优选为10分钟至9小时,甚至更优选为15分钟至4小时,例如在大约30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟或180分钟内。
步骤(iii)优选在大气压(P=1Atm.,20-25℃),以及10℃至90℃,优选为20℃至60℃,甚至更优选为35℃至55℃,例如约25℃、30℃、40℃、44℃、48℃或50℃的提取溶剂温度下进行。
优选地,步骤(iii)中提取溶剂的pH值为3至10,优选为3.5至9,更优选为4至8,甚至更优选为5至7,例如pH值约为4.5;5.5;6;6.5;7.5;8.5;或9.5。
在步骤(iii)的提取中,优选使用蛋白水解酶来降解植物来源的材料的表面果胶,从而提高该方法的产量。优选地,该蛋白水解酶包括菠萝蛋白酶或菠萝蛋白酶提取物,或由其组成。
菠萝蛋白酶是菠萝的果实和/或茎的酶提取物,含有蛋白水解酶和少量其他物质。
为了提高提取的产量,步骤(iii)优选为分两步进行,如下所述。
(iii.a)在10℃至90℃,优选20℃至60℃,甚至更优选35℃至55℃的温度下,用第一体积的提取溶剂对植物起始材料进行时间为1分钟或30分钟至12小时,优选10分钟至9小时,甚至更优选15分钟至4小时的第一提取,获得第一水性提取物;以及
(iii.b)在80℃至120℃,优选90℃至110℃,优选95℃至105℃,甚至更优选98℃至102℃的温度下,优选在压力下或减压下,用第二体积的提取溶剂对植物起始材料(或所述第一提取步骤(iii.a)的固体残余物)进行时间为10分钟至6小时或30分钟至8小时,优选20分钟至4小时,甚至更优选40分钟至2小时,例如时间为约30分钟、60分钟或90分钟的第二提取,获得第二水性提取物。优选地,在第一提取(iii.a)中,使用的第一体积的提取溶剂是植物起始材料重量的25至75倍,优选35至65倍,甚至更优选45至55倍,例如大约30倍,或50倍。
优选地,在第二提取(iii.b)中,使用的第二体积的提取溶剂是植物起始材料重量的10至150倍,优选75至125倍,更优选85至115倍,甚至更优选95至105倍,例如约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或者100倍。
根据所述HA和/或CS(P1)制备方法的第一实施方式,然后将从步骤(iii.a)获得的第一水性提取物和从步骤(iii.b)获得的第二水性提取物合并,并将根据步骤(iv)的溶剂加入其中。
在步骤(iv)中,将溶剂,优选为乙醇加入到步骤(iii)获得的水性提取物中,或加入到步骤(iii.a)获得的第一水性提取物和步骤(iii.b)获得的第二水性提取物中,以获得液体产物。
在步骤(v)中,将从步骤(iv)中获得的液体产物和存在于该产物中的植物起始材料(例如作为上清液或沉淀物)进行离心,和/或使其通过过滤装置(第一次过滤),该装置保留固体部分(固体残余物),并使液相得以通过。
在步骤(vi)中,在步骤(v)之后,通过离心和/或过滤获得的液相通过步骤(vi.a)处理,和/或固体残余物通过步骤(vi.b)、(vi.c)、(vi.d)和(vi.e)处理。
在优选步骤(vi.a)中,将从步骤(v)中获得的液相干燥,可选择浓缩和干燥,以获得重均分子量为10kDa至600kDa的透明质酸或其盐。
在步骤(vi.a)中,待干燥的液相,优选为待浓缩和干燥的液相在冷却到20-25℃时必须优选为不含沉淀物。因此,在存在沉淀物的情况下,由步骤(v)获得的液相在步骤(vi.a)之前要进一步离心和/或过滤。
经离心和/或过滤的液相的浓缩优选在60℃至90℃的温度下进行,更优选65℃至85℃,甚至更优选70℃至80℃,例如在70℃、75℃或80℃下进行。除了温度,浓缩步骤的持续时间也取决于溶解在液相中的物质的理想量。
经离心和/或过滤的液相的浓度优选为使液相中的溶解物质(包括HA)的量增加到每100ml液相1g至35g,优选为5g至25g,甚至更优选为8g至18g。
优选地,从浓缩步骤(vi.a)获得的液相具有的相对密度比率(定义为[经离心和/或过滤的液相密度]:[浓缩结束时的液相密度])为1.01至1.20,优选为1.02至1.15,甚至更优选为1.05至1.08。
优选地,液相的浓缩是在减压(低于1大气压,在25℃)下进行的,更优选在-1.5mPa至-0.1mPa的压力下进行,甚至更优选为-1.0mPa至-0.5mPa,例如-0.8mPa。
优选地,从步骤(vi.a)获得的HA的纯度(相对于HA的总重量的%)为90%至100%,优选为95%至99.5%,甚至更优选为97%至99%(例如,通过HPLC确定的百分比)。
在优选的步骤(vi.b)、(vi.c)、(vi.d)和(vi.e)中,处理从步骤(v)的离心和/或过滤中获得的固体残余物,以获得重均分子量为1kDa至50kDa的硫酸软骨素或盐。
在优选的步骤(vi.b)中,回收和纯化从步骤(v)的离心和/或过滤中获得的固体残余物,以获得重均分子量为1kDa至50kDa的软骨素或其盐(CS)。
在优选的步骤(vi.c)(磺化(或硫酸化)步骤,旨在作为能够在软骨素二聚体上插入硫酸基团的反应步骤)中,在步骤(vi.b)之后,用硫酸源(优选选自包括硫酸、三氧化硫吡啶复合物、硫磺-三氧化硫复合物的组,或由其组成的组)对固体残余物进行处理,以获得酸化产物(其中所述磺化步骤根据本领域技术人员已知的技术和装置进行)。
在步骤(vi.c)中使用的硫酸源的量能够获得相对于步骤(vi.b)的固体残余物中CS二糖的总含量而言,重量百分比为51%至99%,或约95±0.5%(优选为78%至85%,或86%)的6-硫酸软骨素。
优选地,在步骤(vi.c)中,对于从步骤(vi.b)获得的每100g软骨素或其盐(CS)使用1ml至50ml的三氧化硫二甲基甲酰胺复合物(SO3 DMF),优选2ml至40ml,甚至更优选4ml至30ml,例如对于从步骤(vi.b)获得的每100g软骨素或其盐(CS)使用5ml、10ml、15ml、18ml、22ml或25ml的三氧化硫二甲基甲酰胺复合物。更优选地,将三氧化硫二甲基甲酰胺复合物分几步加入步骤(vi.b)获得的软骨素或其盐(CS)中,例如加入2ml至8ml,然后加入8ml至12ml,最后进一步加入8ml至12ml的三氧化硫二甲基甲酰胺复合物。
步骤(vi.c)的处理在20℃至80℃,优选30℃至70℃,甚至更优选40℃至60℃的温度下进行1分钟至4小时,优选10分钟至120分钟,甚至更优选20分钟至60分钟的时间。在步骤(vi.d)中,将由步骤(vi.c)获得的产物用碱性试剂进行中和。
因此,在步骤(vi.d)中,在步骤(vi.c)的酸化产物中仍然游离的硫酸源(即在酸化产物中未与软骨素结合为硫酸软骨素的硫酸源)通过用碱性试剂进行中和来消除,以获得经中和的产物。
在本说明书中,“经中和的”或“中和”的表述用于表示达到的pH值为6至8,优选为6.4至7.6,甚至更优选为6.6至7.4,例如pH值为7.0±0.2。
在步骤(vi.d)中使用的碱性试剂优选为无机碱性试剂。
碱性试剂优选为选自包括氨、氢氧化钠、氢氧化钾及其混合物的组,或由其组成的组。
优选地,在步骤(vi.d)中可使用的氢氧化钠的浓度为1M、2M或4M。
在优选的步骤(vi.e)中,在步骤(vi.d)之后,将从步骤(vi.d)获得的经中和产物浓缩并干燥,以获得重均分子量为1kDa至50kDa的硫酸软骨素。
步骤(vi.e)的浓缩提供用于达到1.0至1.30,优选1.01至1.20,甚至更优选1.05至1.15的相对密度比(定义为[从步骤(vi.d)获得的经中和产物的密度]:[从步骤(vi.e)获得的浓缩产物的密度])。
优选地,步骤(vi.e)的浓缩是通过透析和/或通过真空浓缩进行的。
更优选地,透析是通过透析袋进行的,以便去除可能存在的小杂质。
当从步骤(vi.e)获得的浓缩产物中的固体含量为每100ml中10g至60g,优选为每100ml中20g至50g,甚至更优选为每100ml中35g至45g,例如40g/100ml时,浓缩步骤(vi.e)优选终止。
步骤(vi.e)的干燥是在步骤(vi.e)的浓缩之后进行的,优选为通过真空炉进行。
形成一个本发明的目的的是植物起始材料,优选真菌,更优选双核菌亚界的真菌,甚至更优选担子菌门的真菌,进一步优选银耳物种在制备透明质酸或其盐(HA),透明质酸阴离子盐,和/或软骨素或其盐如硫酸软骨素或其盐(CS)中的应用。
混合物、混合物的应用、包含所述混合物作为添加剂、或赋形剂、或成分(或非活性成分)的组合物、组合物作为药物的应用、组合物在治疗特定失调或疾病或病症中的应用、所述混合物或包含所述混合物的所述组合物的制备方法,所述组合物作为添加剂、或赋形剂、或成分的应用,以及上述植物起始材料的实施方式可由本领域的技术人员根据情况对所述特征进行替换或修改。这些实施方式也应被视为包括在以下权利要求中正式确定的保护范围内。
此外,应该注意的是,任何实施方式都可以独立于所描述的其他实施方式而实施。
本发明的实施方式(FRn)概述如下。
FR1.一种混合物(M),包括从植物起始材料获得的糖胺聚糖,或由其组成;所述糖胺聚糖选自包括以下的组或由以下组成的组:
(a)重均分子量为10kDa至600kDa的透明质酸或其盐,透明质酸阴离子,(HA);
(b)重均分子量为1kDa至50kDa的软骨素或其盐(CS),如硫酸软骨素;
(c)(a)和(b)的组合。
FR2.根据前述FR的混合物(M),其中:
(a)透明质酸或其盐(HA)的重均分子量为100kDa至500kDa,优选为200kDa至400kDa;和/或
(b)软骨素或其盐(CS)的重均分子量为1kDa至50kDa,优选为3kDa至40kDa,甚至更优选为5kDa至25kDa。
FR3.根据前述FR中任一项的混合物(M),其中所述植物起始材料是真菌,优选双核菌亚界的真菌,甚至更优选担子菌门的真菌。
FR4.根据前述FR的混合物(M),其中该真菌是银耳物种的真菌。
FR5.根据前述FR中任一项的混合物(M)作为添加剂、赋形剂或成分在制备医药产品、医疗器械、营养品、特殊医学应用食品(FSMP)、膳食补充剂或食品中的应用。
FR6.一种组合物,包括(i)根据FR1-4中任一项的混合物,和(ii)技术添加剂或医药或食品级赋形剂。
FR7.根据前述FR的组合物,其用作药物。
FR8.根据FR6的组合物,其用于预防或治疗人类或动物的特定失调或小病或疾病,选自关节炎、骨关节炎、关节病(arthrosis)、关节疼痛、四肢和关节的炎症或胃食管反流,和/或用作制备医药产品、医疗器械产品、营养品、特殊医学应用食品(FSMP)、食品或膳食补充剂的添加剂、或赋形剂或成分。
FR9.一种制备透明质酸或透明质酸盐(HA)和/或硫酸软骨素或软骨素(CS)的方法,所述方法包括从植物来源的起始材料中提取透明质酸或透明质酸盐和/或硫酸软骨素或软骨素的至少一个步骤。
FR10.根据前述FR的方法,包括以下步骤。
(i)鉴别一种或多种天然真菌作为糖胺聚糖的植物起始材料;
(ii)任选地将植物起始材料破碎或粉碎;
(iii)使用提取溶剂,优选水性溶剂,甚至更优选水从步骤(i)或步骤(ii)获得的植物起始材料提取所述糖胺聚糖,以获得所述糖胺聚糖的水性提取物;
(iv)向从步骤(iii)获得的水性提取物加入溶剂,优选乙醇,以获得液体产物。
(v)对从步骤(iv)获得的液体产物进行离心和/或过滤,以获得液相和固体残余物;
(vi)对从步骤(v)的离心和/或过滤中获得的液相通过以下步骤(vi.a)处理,和/或对从步骤(v)的离心和/或过滤中获得的固体残余物通过以下步骤(vi.b)、(vi.c)、(vi.d)和(vi.e)进行处理:
(vi.a)干燥,优选浓缩和干燥,从步骤(v)获得的液相以获得重均分子量为10kDa至600kDa的透明质酸或其盐;和/或
(vi.b)回收和纯化从步骤(v)获得的固体残余物,以获得重均分子量为1kDa到50kDa的软骨素或其盐(CS);
(vi.c)用硫酸源处理从步骤(vi.b)获得的软骨素或其盐(CS)以获得酸化产物,该硫酸源优选为选自包括硫酸、三氧化硫吡啶复合物、三氧化硫二甲基甲酰胺复合物及其混合物的组,或由其组成的组;
(vi.d)用碱性试剂中和从步骤(vi.c)获得的酸化产物,以获得经中和产物;
(vi.e)浓缩和干燥从步骤(vi.d)获得的经中和产物,以获得重均分子量为1kDa至50kDa的硫酸软骨素。
FR11.植物起始材料,优选真菌,更优选双核菌亚界的真菌,甚至更优选担子菌门的真菌,进一步优选银耳物种的真菌在制备透明质酸或其盐、透明质酸阴离子盐,和/或软骨素或其盐,例如硫酸软骨素中的应用。
本发明方法的第二实施方式(简而言之,P2)涉及制备透明质酸或其盐(HA)的方法,该方法包括以下步骤或由以下步骤组成:
(i)鉴别一种或多种天然真菌作为透明质酸的植物起始材料;例如,一种或多种干燥或干制形式的天然真菌,优选包括至少一种属于双核菌亚界,优选为担子菌门,更优选为银耳物种的天然真菌,或由其组成;
(ii)任选地,破碎或粉碎植物起始材料(平均粒径分布优选为500μm至1800μm,优选为700μm至1000μm,例如约20目=841μm);
(pre-iii)将从步骤(i)或步骤(ii)获得的植物起始材料在水性水解溶剂,优选水,在10℃至90℃的温度下进行酶促水解,其中向分散在一定体积的水解溶剂中的植物起始材料加入酶,优选蛋白水解酶,以获得步骤(pre-iii)的混合物;
(iii)用水性提取溶剂,优选水,在91℃至110℃,优选95℃至110℃,甚至更优选98℃至105℃(例如约100℃或提取溶剂的沸腾温度)的温度下提取步骤(pre-iii)的所述混合物,以获得水性提取物;
(iv)将沉淀溶剂(通过添加溶剂进行沉淀),优选醇溶剂,更优选乙醇,加入到由步骤(iii)获得的水性提取物中,以获得步骤(iv)的液体产物;优选地,用乙醇进行沉淀,以2至4,优选3的体积/体积比向步骤(iii)获得的所述水性提取物中缓慢添加95%的乙醇,并在8小时至16小时,例如约12小时的时间内搅拌保持;
(vii)通过应用步骤(vii.a)和任选的步骤(vii.b)来加工步骤(iv)的所述液体产物:
(vii.a)去除所述沉淀溶剂(例如通过在低于环境压力的压力值下蒸馏或加热),优选乙醇,以获得步骤(vii.a)的液体产物;
(vii.b)向步骤(vii.a)的所述液体产物添加水(例如以溶解固体产物),以获得步骤(vii.b)的液体产物;
(viii)干燥步骤(vii.b)的所述液体产物,优选浓缩和/或干燥(例如,通过浓缩和/或干燥和/或冷冻干燥,优选冷冻干燥去除水和可能的残留沉淀溶剂(例如,乙醇)),以获得包括以下或由以下组成的产物PR1:透明质酸或其盐,其重均分子量为10kDa至600kDa,优选50kDa至350kDa,更优选100kDa至300kDa,纯度为所述产物PR1总重量的85%至约100%,优选95%至99.5%,更优选97%至99%(例如,通过HPLC确定的百分比)。
本发明方法的第三实施方式(简称P3)涉及制备硫酸软骨素,优选6-硫酸软骨素的方法,该方法包括以下步骤或由以下步骤组成:
(i)鉴别一种或多种天然真菌作为透明质酸的植物起始材料;例如,一种或多种干燥或干制形式的天然真菌,优选包括至少一种属于双核菌亚界,优选为担子菌门,更优选为银耳物种的天然真菌,或由其组成;
(ii)任选地,对植物起始材料进行破碎或粉碎(平均粒径分布优选为500μm至1800μm,优选为700μm至1000μm,例如约20目=841μm);
(pre-iii)将从步骤(i)或步骤(ii)获得的植物起始材料在水性水解溶剂,优选水,在10℃至90℃的温度下进行酶促水解,其中向分散在一定体积的水解溶剂中的植物起始材料中加入酶,优选蛋白水解酶,以获得步骤(pre-iii)的混合物。
(iii)用水性提取溶剂,优选水,在91℃至110℃,优选95℃至110℃,甚至更优选98℃至105℃(例如约100℃或提取溶剂的沸腾温度)的温度下提取步骤(pre-iii)的所述混合物,以获得水性提取物;
(vi.c.)用硫酸源处理(磺化步骤)所述水性提取物,以获得步骤(vi.c)的液体产物,其中所述硫酸源优选为选自包括硫酸、三氧化硫吡啶复合物、三氧化硫二甲基甲酰胺复合物及其混合物的组,或由其组成的组;更优选为三氧化硫二甲基甲酰胺复合物(SO3-DMS);
(vi.d)通过加入碱以中和步骤(vi.c)的所述液体产物,以获得经中和产物,其中所述碱优选为无机碱,更优选为NaOH或KOH或Ca(OH)2或Mg(OH)2,达到中性pH;
(vi.e)浓缩和干燥从步骤(vi.d)中获得的所述经中和产物,以获得包括硫酸软骨素或其盐(简称,CS),或由其组成的产物PR2,其重均分子量为1kDa至45kDa或50kDa(或大于5kDa至小于50kDa),优选为3kDa至40kDa,甚至更优选为5kDa或大于5kDa至25kDa或5kDa或大于5kDa至10kDa,例如约5kDa、或6kDa、或7kDa、或8kDa、或9kDa、或10kDa。
从本发明方法的所述第三实施方式(P3)中获得的表述“硫酸软骨素或其盐(简称,CS)”用于表示非硫酸化软骨素和各种可能位置的单、双和/或三硫酸化软骨素的组合,优选为主要是6-硫酸软骨素。
作为选择,从本发明方法的所述第三实施方式(P3)中获得的表述“硫酸软骨素或其盐(简称,CS)”用于表示在各种可能位置的单硫酸、双硫酸和/或三硫酸化软骨素的组,优选为主要是6-硫酸软骨素。
优选地,从本发明方法的所述第三实施方式(P3)获得的所述硫酸软骨素(CS)具有所述范围内的重均分子量(优选为5kDa或大于5kDa至10kDa,例如约6kDa、或7kDa、或8kDa、或9kDa),包含6-硫酸软骨素,其相对于所述硫酸软骨素(CS)的总重量(或相对于硫酸软骨素中含有的二糖总量)的重量百分比为51%至约95±0.5%,优选75%至90%,甚至更优选78%至86%,并且相对于从步骤(vi.e)获得的产物PR2的总重量而言,其纯度为80%至99.99%(例如94.5%、94.6%、94.7%、94.8%或94.9%),优选为85%至98%(例如86%、87%、88%、89%或89.5%),甚至更优选为90%和94.9%,例如91%、92%、93%、94%或94.5%(例如通过HPLC确定的百分比)。
甚至更优选地,从本发明方法的所述第三实施方式(P3)获得的所述硫酸软骨素(CS)具有所述范围内的重均分子量(优选为5kDa或大于5kDa至10kDa,例如约6kDa、或7kDa、或8kDa、或9kDa),包含6-硫酸软骨素,其相对于所述硫酸软骨素(CS)的总重量(或相对于硫酸软骨素中含有的二糖总量)的重量百分比为51%至约95±0.5%,(优选75%至90%,甚至更优选78%至86%),和4-硫酸软骨素,其相对于所述硫酸软骨素(CS)的总重量(或相对于硫酸软骨素中含有的二糖总量)的重量百分比为0.01%至约5%,(优选0.05%至3%,更优选0.1%至1.5%),并且相对于从步骤(vi.e)获得的产物PR2的总重量而言,其纯度为80%至99.99%,优选为85%至98%(例如86%、87%、88%或89%),更优选为90%至95%,例如91%、92%、93%、94%或94.5%(例如通过HPLC方法确定的百分比)。
HA和/或CS的重均分子量可以根据本领域技术人员常见和已知的方法和仪器来计算,例如,通过高效尺寸排除色谱法(HPSEC)来计算;优选地,HA和/或CS的重均分子量可以通过配备有集成专用凝胶渗透色谱法(GPC)软件的HPSEC来测定。
在本发明方法的第二和第三实施方式(P2和P3)中的酶促水解步骤(pre-iii)中,将酶(例如果胶酶和/或纤维素酶和/或蛋白酶)加入到在一定体积的水解溶剂(例如水性溶剂或水,其重量为植物起始材料的25至100倍,优选为35至75倍,更优选为45至55倍(例如50倍))中的本发明所述的植物起始材料中,并在10℃至90℃,优选20℃至65℃,更优选45℃至55℃(例如50℃)的温度下加热,时间为0.5小时至12小时,优选1小时至8小时,甚至更优选2小时至6小时(例如约4小时),以获得步骤(pre-iii)的所述混合物,其将进行提取步骤(iii)或第一提取步骤(iii.a)(如以下所述)。
此外,有利的是,所述酶促水解步骤(pre-iii)是在酶促水解溶液的pH值为2至9,优选3至5或5至8,更优选3至4(例如3.5)或6至7下进行;和/或在所述酶促水解步骤(pre-iii)中,相对于待提取的植物起始材料的质量(体积/质量),或者,相对于待提取的植物起始材料在水解溶剂中的溶液的体积(体积/体积),使用一定量的酶(重量/重量或重量/体积为1%-20%、或2%-10%、或3%-6%的酶水溶液),其体积百分比为0.001%至1%,优选0.005%至0.1%,更优选0.008%至0.05%(例如0.01%)。
根据一个优选的实例,酶促水解步骤(pre-iii)是在(近似地)以下条件下进行的:体积0.01%;温度50℃;实际pH值3.5;持续时间4小时。
第二和/或第三实施方式(P2和/或P3)的步骤(pre-iii)中使用的所述酶可以是果胶酶和/或纤维素酶和/或蛋白酶。
适合用于本发明方法的酶的实例是:
-商品Ultra Tropical,组成:酶:果胶裂解酶或果胶酶,防腐剂:山梨酸钾,稳定剂:蔗糖、甘油、山梨醇、氯化钠、氯化钾;复合活性:果胶裂解酶或果胶酶(PECTU)=5,000PECTU/g;大约密度1.18(g/ml);果胶裂解酶是一种催化消除裂解(1,4)-α-D-半乳糖醛酸甲酯的酶,这在其非还原端获得具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳糖-4-烯酰的寡糖;其他活性剂:纤维素酶、聚半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶(内切-1,3(4)-)。
-商品Ultra SP-L,组成%w/w:45%甘油(CAS N°56-81-5),45%水(CASN°7732-18-5),5%聚半乳糖醛酸酶(CAS N°9032-75-1;定义为酶浓度(基于干重)),5%氯化钾(CAS N°7447-40-7);复合活性:多聚半乳糖醛酸酶(PGNU)=3300PGNU/g;近似密度1.17(g/ml);多聚半乳糖醛酸酶是一种水解果胶和其他半乳糖醛酸中的(1,4)-α-D-半乳糖醛酸键的酶。
-商品成分%w/w:56.8%水(CAS N°7732-18-5),9%β-葡聚糖酶(内切-1,3(4)-)(CAS N°62213-14-3;定义为酶浓度(基于干重)),24%蔗糖(CAS N°57-50-1),10%氯化钠(CAS N°7647-14-5),0.20%山梨酸钾(CAS N°24634-61-5);复合活性:β-葡聚糖酶(内切-1,3(4)-)(FGB)=100FBG/g;近似密度1.21(g/ml);内切β-葡聚糖酶是一种水解β-D-葡聚糖中的(1,3)-或(1,4)-键的酶,其他活性剂:木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶。
在本发明方法的第二和第三实施方式(P2和/或P3)中,提取步骤(iii)优选包括以下或由以下组成:第一提取步骤(iii.a),其包括或由以下组成:在91℃至110℃(例如约100℃)的温度或提取溶剂的沸腾温度下用第一体积的提取溶剂进行提取,时间为0.5小时至12小时,优选1小时至9小时,更优选1小时至4小时(例如约2小时或3小时),以获得第一水性提取物;随后的第二提取步骤(iii.b),其包括或由以下组成:在90℃至110℃(例如约100℃)的温度或提取溶剂的沸腾温度下用第二体积的提取溶剂进行提取,时间为0.5小时至8小时,优选0.5小时至4小时,更优选1小时至3小时(例如1.5小时、或2小时、或2.5小时),以获得第二水性提取物;将所述第一提取物和所述第二提取物合并,以获得最终的水提取物;以及,任选地,进行浓缩所述最终水提取物的步骤(iii.c),以获得浓缩的水提取物。
在本发明方法的第二和第三实施方式(P2和P3)中,优选地,在第一提取(iii.a)中,使用第一体积的提取溶剂,其重量为植物起始材料重量的25至100倍,优选为35至65倍,甚至更优选为45至55倍,例如50倍。例如,将为植物起始材料重量25至100倍的所述第一提取量加入到酶促水解溶剂体积中,达到为植物材料重量50至200倍的溶剂总体积(例如约100倍)。
在本发明方法的第二和第三实施方式(P2和P3)中,优选地,在第二提取(iii.b)中,使用第二体积的提取溶剂,其重量为植物起始材料重量的25至75倍,优选为35至65倍,更优选为45至55倍(例如约50倍)。
在本发明方法的第二和第三实施方式(P2和P3)中,在第一提取步骤(iii.a)之后,进行过滤步骤(iii.a):滤液相当于从步骤(iii.a)获得的第一水性提取物,残余物则进行第二提取步骤(iii.b)。在第二提取步骤(iii.b)之后,进行过滤步骤(iii.b),滤液相当于从步骤(iii.b)获得的第二水性提取物。例如,所述步骤(iii.a)和(iii.b)的过滤(或提取步骤(iii)的过滤)是用140至270目,优选200目的过滤器进行的。任选地,在所述第二和第三实施方式(P2和P3)中,将从步骤(iii.a)获得的第一水性提取物和从步骤(iii.b)获得的第二水性提取物合并并进行真空浓缩步骤(iii.c),例如在60℃至90℃,优选70℃至80℃,更优选约75℃的温度下,达到约0.8至1.5,优选1.00至1.20(例如约1.05-1.08)的相对密度。
在本发明方法的第三实施方式(P3)中,优选地,在步骤(vi.c)(磺化步骤)中,每100g从步骤(vi.b)获得的软骨素或其盐(CS)使用1ml至50ml的三氧化硫二甲基甲酰胺复合物(SO3 DMF),优选2ml至40ml,甚至更优选4ml至30ml,例如每100g从步骤(vi.b)获得的软骨素或其盐(CS)约5ml、10ml、15ml、18ml、22ml或25ml的三氧化硫二甲基甲酰胺复合物。更优选地,将三氧化硫二甲基甲酰胺复合物分几步加入步骤(vi.b)获得的软骨素或其盐(CS)中,例如加入2ml至8ml,然后加入8ml至12ml,最后进一步加入8ml至12ml的三氧化硫二甲基甲酰胺复合物。步骤(vi.c)的处理在20℃至80℃,优选30℃至70℃,甚至更优选40℃至60℃(例如约50℃)的温度下进行1分钟至4小时,优选10分钟至120分钟,甚至更优选20分钟至60分钟(例如约30分钟)。根据一个优选的实例,所述磺化步骤(vi.c)是在40℃至60℃(例如50℃)的温度下,持续进行20分钟至60分钟(例如30分钟),向约100ml来自步骤(iii)或(iii.b)或(iii.c)的水性提取物(固体含量10-15g/100ml,相对密度1.05-1.08)中加入SO3-DMF(5ml、15ml、25ml)。
在本发明方法的第三实施方式(P3)中,优选地,步骤(vi.d)中使用的碱性试剂优选为选自包括氨、氢氧化钠、氢氧化钾及其混合物的组,或由其组成的组的无机碱性试剂,优选为氢氧化钠(例如,浓度为1M、2M或4M)。
在本发明方法的第三实施方式(P3)中,优选地,所述步骤(vi.e)包括通过透析进行膜过滤,例如通过1,000Da透析袋进行18小时至36小时,优选24小时的透析,直到达到1.3至1.5,优选约1.1的相对密度,然后进行干燥,例如在真空炉中干燥。
根据本发明的一个方面,在本发明方法的所述第一和第三实施方式(P1和P3)中,本发明的硫酸软骨素或其盐(CS)的重均分子量为大于5kDa至小于50kDa,优选大于5kDa至25kDa,并且其包括:
-6-硫酸软骨素,其重量百分比为50%至95±0.5%,优选为75%至90%;
-非硫酸化软骨素,其重量百分比为5%至20%,优选为7%至15%;
-2,6-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.1%至10%,优选为0.2%至8%;以及
-4-硫酸软骨素,其重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,所有百分比都是相对于硫酸软骨素所含的二糖总量或相对于硫酸软骨素的总重量而言的。
根据本发明的一个优选方面,本发明的硫酸软骨素或其盐(CS)(方法P1和/或P3)的重均分子量为大于5kDa至10kDa,并且其中所述硫酸软骨素或其盐包括:
-6-硫酸软骨素,其重量百分比为78%至86%;
-非硫酸化软骨素,其重量百分比为8%至13%;
-2,6-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.3%至5%;以及
-4-硫酸软骨素,其重量百分比为0.1%至1.5%,所有百分比都是相对于硫酸软骨素所含的二糖总量或相对于硫酸软骨素的总重量而言的。
根据本发明的另一个方面,本发明的硫酸软骨素或其盐(CS)(方法P1和/或P3)的重均分子量为大于5kDa至小于50kDa,优选为大于5kDa至小于25kDa,并且其中所述硫酸软骨素或其盐包括:
-6-硫酸软骨素,其重量百分比为50%至95±0.5%,优选为75%至90%;以及
-4-硫酸软骨素,其重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,所有百分比都是相对于硫酸软骨素所含的二糖总量或相对于硫酸软骨素的总重量而言的。
根据本发明的另一个甚至更优选的方面,本发明的硫酸软骨素或其盐(CS)(方法P1和/或P3)的重均分子量为大于5kDa至10kDa,并且其中所述硫酸软骨素或其盐包括:
-6-硫酸软骨素,其重量百分比为78%至86%;以及
-4-硫酸软骨素,其重量百分比为0.1%至1.5%,所有百分比都是相对于硫酸软骨素所含的二糖总量或相对于硫酸软骨素的总重量而言的。
根据本发明的另一个优选方面,本发明的硫酸软骨素或其盐(CS)(方法P1和/或P3)的重均分子量为大于5kDa至小于50kDa,优选为大于5kDa至小于25kDa,并且其包括:
-6-硫酸软骨素,其重量百分比为50%至95±0.5%,优选为75%至90%;
-非硫酸化软骨素,其重量百分比为5%至20%,优选为7%至15%;
-2,6-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.1%至10%,优选为0.2%至8%;
-4-硫酸软骨素,其重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%;
-4,6-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%;以及
-2,4-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.01%至5%,优选为0.05%至3%,所有百分比都是相对于硫酸软骨素所含的二糖总量或相对于硫酸软骨素的总重量而言的。
根据一个实施方式,本发明的硫酸软骨素或其盐(CS)(方法P1和/或P3)的重均分子量为大于5kDa至10kDa,并且其中所述硫酸软骨素或其盐包括:
-6-硫酸软骨素,其重量百分比为78%至86%;
-非硫酸化软骨素,其重量百分比为8%至13%;
-2,6-二硫酸软骨素,其重量百分比为0.3%至5%;以及
-4-硫酸软骨素、4,6-二硫酸软骨素和2.4-二硫酸软骨素,各自的重量百分比为0.1%至1.5%。
实验部分
I.根据第二实施方式(P2)的透明质酸的制备方法
(I)准备属于银耳物种的干制真菌;
(ii)通过研磨将所述干燥的真菌破碎或粉碎(约20目),获得破碎/粉碎的干真菌;
(pre-iii)通过以下方式使用果胶酶作为酶进行酶促水解:向破碎/粉碎的干真菌和果胶酶(Ultra Tropical,体积0.01%)中加入蒸馏水(50体积/重量),在约50℃下加热约3小时,获得水解混合物;
(iii.a)通过以下进行第一提取:向所述水解混合物加入蒸馏水(50体积/重量)并在约100℃(沸腾)下加热约2.5小时,用200目筛过滤并收集滤液和固体残余物;
(iii.b)通过加入蒸馏水(50体积/重量)并在约100℃(沸腾)加热约2小时,对从所述第一提取(iii.a)获得的所述固体残余物进行第二提取,然后用200目筛过滤并收集滤液;并将从所述第一提取(iii.a)获得的滤液与从所述第二提取(iii.b)获得的滤液合并,
获得水性提取物;
(iii.c)在约75℃下浓缩所述水性提取物,以获得相对密度约为1.05的浓缩水性提取物;随后
(iv)在搅拌下,向所述浓缩水性提取物中缓慢加入95%的乙醇(体积/体积=3),并放置12小时;去除乙醇,保留提取物;
(vii)向所述提取物中加入蒸馏水并冷冻干燥,以获得包括透明质酸或其盐(HA),或由其组成的PR1产物,其平均分子量为100kDa至300kDa,相对于所述产物PR1的总重量的纯度按重量百分比计为95%至99%。
II.根据第三实施方式的硫酸软骨素的制备方法(P3)
(i)准备属于银耳物种的干制真菌;
(ii)通过研磨将所述干燥的真菌破碎或粉碎(约20目),获得破碎/粉碎的干真菌;
(pre-iii)通过以下方式使用果胶酶作为酶进行酶促水解:向破碎/粉碎的干真菌和果胶酶(Ultra Tropical,体积0.01%)中加入蒸馏水(50体积/重量),在约50℃下加热约2小时,获得水解混合物(pH为5-7);
(iii.a)通过以下进行第一提取:向水解混合物中加入蒸馏水(50体积/重量)并在100℃(沸腾)下加热约2.5小时,然后用200目筛过滤(如有必要在过滤前进行离心),收集滤液和固体残余物;
(iii.b)通过加入蒸馏水(50体积/重量)并在100℃(沸腾)下加热约1.5小时,对从所述第一提取获得的所述固体残余物进行第二提取,然后用200目筛过滤并收集滤液;并将从所述第一提取(iii.a)获得的所述滤液与从所述第二提取(iii.b)获得的所述滤液合并,获得水性提取物;
(iii.c)在约75℃下浓缩所述水性提取物,以获得相对密度约为1.05-1.08的浓缩水性提取物;然后
(vi.c)通过每100ml浓缩水性提取物中加入SO3 DMF 5ml、15ml、55ml,在约75℃下进行磺化(或硫酸化)反应约30分钟;
(vi.d)用NaOH中和至pH值约为7;
(vi.e)将获得的溶液放入透析袋(1,000Da)中至少24小时,直到溶液的相对密度达到约1.1。在真空炉中干燥,获得包括硫酸软骨素或其盐(CS),或由其组成的产物PR2,其平均分子量为大于5kDa至10kDa(例如,约8kDa),其中所述CS的组成与表1中报告的化合物CS.1相似,相对于所述产物PR2的总重量的纯度以重量百分比计为89%至94.5%。
Claims (8)
1.一种制备透明质酸或其盐的方法,其包括以下步骤:
(i)鉴别植物来源的材料,其包括至少一种天然真菌,或由其组成,所述天然真菌属于双核菌亚界(subkingdom Dikarya),优选为担子菌门(division Basidiomycota);
(ii)任选地,对植物起始材料进行破碎或粉碎以获得所述破碎或粉碎的植物来源的起始材料;
(pre-iii)将从步骤(i)或步骤(ii)获得的所述植物起始材料在水性水解溶剂中在10℃至90℃的温度下进行酶促水解,所述水性水解溶剂优选为水,其中向分散在一定体积的水解溶剂中的所述植物起始材料加入酶,优选蛋白水解酶,以获得步骤(pre-iii)的混合物;
(iii)用水性提取溶剂在91℃至110℃的温度或沸腾温度下对步骤(pre-iii)的所述混合物中含有的所述植物来源的材料进行提取,以获得水性提取物,所述水性提取溶剂优选为水;
(iv)将沉淀溶剂加入到由步骤(iii)获得的水性提取物中,以获得液体产物,所述沉淀溶剂优选为醇;
(vii)通过进行步骤(vii.a)和任选的步骤(vii.b),对由步骤(iv)获得的液体产物进行处理:
(vii.a)从由步骤(iv)获得的所述液体产物中去除所述沉淀溶剂,优选通过在低于室温的压力下在15℃至25℃的室温下的加热来去除;
(vii.b)通过添加水而稀释;
(viii)干燥,优选浓缩和干燥,以获得产物PR2,其包括重均分子量为10kDa至600kDa的透明质酸或其盐,或由其组成。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述至少一种真菌属于银耳物种(Tremellafuciformis)(Berk.1856)。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中在所述步骤(pre-iii)中,所述酶选自包括以下酶或由以下酶组成的组:果胶酶、纤维素酶、蛋白酶以及它们的混合物。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述提取步骤(iii)包括以下步骤或由以下步骤组成:
(iii.a)在91℃至110℃的温度或沸腾温度下,用第一体积的提取溶剂对步骤(pre-iii)的所述混合物中含有的所述植物来源的材料进行时间为0.5小时至12小时的第一提取,以获得第一水性提取物和固体残余物;然后
(iii.b)在90℃至110℃的温度下,用第二体积的提取溶剂对从步骤(iii.a)中获得的所述固体残余物进行时间为0.5小时至8小时的第二提取,以获得第二水性提取物;并且将所述第一提取物和所述第二提取物合并,以获得第二水性提取物;并且任选地,(iii.c)浓缩所述第一水性提取物和第二水性提取物,以获得浓缩水性提取物。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中在所述酶促水解步骤(pre-iii)中,将所述植物起始材料的重量的25至100倍(质量/质量)、优选35至75倍的量的水性溶剂、优选水,加入所述植物起始材料中,加入的所述酶的体积百分比为0.001%至1%,优选0.005%至0.01%,并且将所得混合物用0.5小时至12小时、优选1小时至8小时的时间加热至10℃至90℃、优选20℃至65℃的温度,以获得步骤(pre-iii)的混合物,其将经历提取步骤(iii)或第一提取步骤(iii.a)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法,其中由所述方法获得的所述透明质酸或其盐的重均分子量为50kDa至350kDa,优选100kDa至300kDa。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法,其中在步骤(iv)中,所述沉淀溶剂是乙醇。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述干燥步骤(viii)包括冷冻干燥,或由其组成。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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