CN111650263A - γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒及使用其的检测方法 - Google Patents

γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒及使用其的检测方法 Download PDF

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CN111650263A CN202010577147.2A CN202010577147A CN111650263A CN 111650263 A CN111650263 A CN 111650263A CN 202010577147 A CN202010577147 A CN 202010577147A CN 111650263 A CN111650263 A CN 111650263A
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Abstract

本发明提供一种γ‑谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒及使用其的检测方法，所述检测试剂盒包括电泳胶板、阴极缓冲液、阳极缓冲液、底物A、助溶剂、底物B液、呈色液A、呈色液B、示踪剂、阳性对照品、阴性对照品、醋酸纤维膜。本发明中，GGT各同工酶的分子量和等电点不同，在同一电场的聚丙烯酰胺凝胶中泳动速度不一，而得到分离，将被用GGT特异性底物打湿的醋酸纤维膜敷于聚丙烯酰胺凝胶上，经分离后的各同工酶即与特异的底物反生酶催化反应，再通过新生成产物的重氮偶联反应，从而将GGT各同工酶区带在醋酸纤维膜上显成红色。用本发明的试剂盒检测患者血清中GGT同工酶，可将GGT分离出7～9条不等的同工酶区带，GGT‑Ⅱ检测方便，检测结果精度高。

Description

γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒及使用其的检测方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，具体涉及一种γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒及使用其的检测方法。
背景技术
γ-谷氨酰转肽酶同工酶为富含唾液酸的糖蛋白，酶蛋白一级结构无明显差别，由于糖基部分的修饰可出现不同的分子形式，较之其它同工酶，GGT-II因含较多的唾液酸，使其等电点偏低。目前GGT-II的检测仍以采用不同分离介质的电泳法为主。
血清GGT-Ⅱ阳性多见于肝脏恶性疾病患者，但在少部分良性疾患（如急性肝炎、肝硬化）和孕妇亦可见GGT-II血清阳性，此外，亦有10%～20%的肝癌患者GGT-Ⅱ呈阴性表达，因此，GGT-Ⅱ仅可用于肝癌的辅助临床管理，肝癌的诊断需结合其它检查指标、患者临床病情等多方面因素综合考虑；另外，肝癌患者GGT-Ⅱ阳性与AFP升高之间并无明确相关性，目前，临床上主要将GGT-Ⅱ用于AFP阴性肝癌的辅助诊断。目前检测GGT-Ⅱ多使用γ-谷氨酰转肽酶同工酶 Ⅱ 检测试剂盒，本发明即提供一种γ-谷氨酰转肽酶同工酶 Ⅱ 检测试剂盒及使用其的检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒及使用其的检测方法，检测方便，检测结果精度高。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种γ-谷氨酰转肽酶同工酶 Ⅱ 检测试剂盒，包括如下组分：
电泳胶板 10孔；
阴极缓冲液 13 ml；
阳极缓冲液 10 ml；
底物A 9.6 mg；
助溶剂 0.3 ml；
底物B液 2 ml；
呈色液A 10 ml；
呈色液B 0.3 ml；
示踪剂 0.05 ml；
阳性对照品 0.025 ml；
阴性对照品 0.025 ml；
醋酸纤维膜 9.5cm*9.5 cm。
其中，所述电泳胶板为已聚合的聚丙烯酰胺凝胶，用于γ-谷氨酰转肽酶同工酶的分离；
所述阴极缓冲液为Tris缓冲溶液，作为电泳过程中的阴极电极液；
所述阳极缓冲液为Tris缓冲溶液，作为电泳过程中的阳极电极液；
所述助溶剂为浓度约1N的稀盐酸，用于底物A的溶解；
所述底物A为γ-L-谷氨酰对硝基苯胺-水合物，为γ-谷氨酰转肽酶同工酶作用的底物；
所述底物B液为Tris- N-甘氨酰甘氨酸溶液，与底物A协同反应；
所述呈色液A为三氯醋酸-甘油溶液，起同工酶的显色作用；
所述呈色液B为亚硝酸钠溶液，与呈色液A协同反应；
所述示踪剂为蔗糖溴酚兰溶液，起示踪作用；
所述阳性对照品包含GGT-Ⅱ；
所述阴性对照品不包含GGT-Ⅱ；
所述醋酸纤维膜用于吸附底物液，并最终显示同工酶区带。
其中，所述电泳胶板的制备步骤包括：
1.1、聚丙烯酰胺溶液：准确称取29 g聚丙烯酰胺，1 g N，N，-亚甲基双丙烯酰胺，均放入100 ml的烧杯中，加入蒸馏水60 ml，加热并搅拌使之完全溶解，定容至100 ml，2～10℃放置备用；
1.2、分离胶缓冲液：准确称取Tris 8.5 g，放入 100ml的烧杯中，加入蒸馏水50 ml，搅拌使之完全溶解，加入TEMED 0.46 ml，用浓盐酸滴定至pH8.30，蒸馏水定容至100 ml，2～10℃放置备用；
1.3、浓缩胶缓冲液：准确称取Tris 6.5 g，放入100ml的烧杯中，加入蒸馏水50 ml，搅拌使之完全溶解，加入TEMED 0.46 ml，用浓盐酸滴定至pH6.80，蒸馏水定容至100 ml，2～10℃放置备用；
1.4、过硫酸铵液：准确称取1.9 g过硫酸铵，定容至100 ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
其中，所述阴极缓冲液的配制方法为：Tris 50 g，硼酸40 g，加水定容至1000 ml，室温放置备用；
所述阳极缓冲溶液的配制方法为：Tris 70 g，溶解后以HCl调pH至7.5，加水定容至1000 ml，室温放置备用。
其中，所述助溶剂的配制方法为：8.3 ml浓盐酸，蒸馏水定容至100ml；
所述底物A的配制方法为：9.6 mg γ-L-谷氨酰对硝基苯胺-水合物，黑色离心管贮存，2～10℃放置；
所述底物B液的配制方法为：Tris 12.9 g，N-甘氨酰甘氨酸13.1 g，加水定容至100ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
其中，所述示踪剂的配制方法为：蔗糖4.0 g、溴酚兰20 mg，加水至10 ml，2～10℃放置备用；
所述呈色液A的配制方法为：三氯乙酸100 g，丙三醇50 ml，加水定容至1000 ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用；
所述呈色液B的配制方法为：亚硝酸钠10 g，加水定容至100 ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
本发明还提供一种使用上述的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
（1）先将阴极缓冲液试剂瓶连同阴极缓冲液充分颠倒混匀后，置沸水中5 min，再充分颠倒混匀，直至结晶完全溶解后，将13 ml阴极缓冲液以蒸馏水稀释至140 ml；
（2）将10 ml阳性缓冲溶液以蒸馏水稀释至220 ml；
（3）从试剂盒中取出电泳胶板，用剪刀从一侧封口线内侧水平剪开包装袋，倒去包装袋内的胶板保护液，取出电泳胶板，短玻璃面向加样者，以微量加样器分别取示踪剂2μl及待测血清20μl，混匀，从左到右的顺序依次加入电泳胶板的上样孔内；同时做阴、阳性对照，取示踪剂2μl分别与20μl阴、阳性对照品混匀上样，并另外记录好上样标本顺序号，从左到右依次为1～10号，并记录相对应的标本检验编号；
（4）将电泳胶板插入电泳槽，短玻璃面向加样者，压紧胶板，电泳胶板内侧加入稀释好的阴极缓冲液，电泳胶板外侧加入稀释好的阳极缓冲液；
（5）加好样后，接上电极，将电泳槽置37℃水浴箱中，电泳槽底接触水面即可，以支撑物（纸团或布团等）支撑水浴箱盖，以水浴箱盖不压碰电泳槽顶端为合适，同时便于电极线进出。以恒压60V电泳50 min后，改恒压120 V电泳4 h，结束电泳；
（6）从电泳槽中取出电泳胶板，短玻璃面向上平放于操作台面，以扁头小镊子从右下角轻轻撬起短玻璃板，取去短玻璃板，此过程操作需缓慢、轻柔，注意不要将凝胶拉坏。将长玻璃板连同凝胶一起放入直径15 cm的玻璃培养皿中，此时长玻璃板在下，凝胶在上，凝胶上加样孔从左到右为原加样的1～10号；
（7）取0.2 ml助溶剂加入装有底物A的塑料管中，可轻轻吹打助溶，待底物A溶解后，将其吸至另一直径16 cm的玻璃培养皿（玻璃培养皿用前需洗净，烘干）中，再加入底物B液2ml，混匀；从试剂盒中取出醋酸纤维膜，用剪刀剪去一个小角作为标记，将醋酸纤维膜浸入配制好的底物液中，以此底物液打湿醋酸纤维膜；
（8）将以底物液打湿的醋酸纤维膜（使剪角在左上方）以滚动法（先以两手拎起醋酸纤维膜两侧，再将醋酸纤维膜中间先敷于凝胶中央，再慢慢同时放下两侧醋酸纤维膜）敷于凝胶上，两者间不能留有气泡，将直径16 cm的玻璃培养皿以自来水冲洗干净，盖于15 cm的玻璃培养皿上，37℃孵育1小时；
（9）取一干净培养皿，加入10 ml呈色液A及0.2 ml呈色液B并混匀，取出醋酸纤维膜浸于其中，并不断摇晃培养皿使呈色液与醋酸纤维膜充分接触，1 min后垂直拎起醋酸纤维膜，使剪角仍在左上方，同时使之与观察者视线相平，按从左到右的顺序，对光肉眼读取膜上1～10号标本呈色结果。
其中，检测时，每一电泳槽可同时进行两块电泳胶板的电泳，当同一电泳槽进行两块电泳胶板的电泳时，只需将两试剂盒中的两瓶阴极缓冲液混匀后稀释至140 ml，两瓶阳极缓冲液混匀后稀释至220 ml，分别加入阴、阳极电泳槽侧即可。
其中，步骤（1）中，阴极缓冲液在冷藏保存后会有结晶析出，使用前请先将阴极缓冲液试剂瓶连同阴极缓冲液充分颠倒混匀后，置沸水中水浴5 min，再充分颠倒混匀，直至结晶完全溶解后，将阴极缓冲液用蒸馏水稀释至140 ml。
其中，步骤（3）和步骤（7）中，助溶剂、底物A、示踪剂、阳性对照品、阴性对照品及呈色液B的剂量相对较少，大部分可能附于管壁，故在使用前需以离心法或手甩法将试剂甩至管底后再用。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
本发明中，GGT各同工酶的分子量和等电点不同，在同一电场的聚丙烯酰胺凝胶中泳动速度不一，而得到分离，将被用GGT特异性底物打湿的醋酸纤维膜敷于聚丙烯酰胺凝胶上，经分离后的各同工酶即与特异的底物反生酶催化反应，再通过新生成产物的重氮偶联反应，从而将GGT各同工酶区带在醋酸纤维膜上显成红色。用本发明的试剂盒检测患者血清中GGT同工酶，可将GGT分离出7～9条不等的同工酶区带，Ⅰ带靠近阳极端，其后为Ⅱ带，最后一条位于加样原位，由此，GGT-Ⅱ检测方便，检测结果精度高。
附图说明
图1为本发明中检测GGT-Ⅱ的结果示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供了一种γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒，只适用于血清，不适用于全血的检测。血液采集后待血清析出，应立即分离血清，尽量避免溶血。血清分离后若不立即检测，2～10℃保存不超过3周，-15℃～-20℃保存，避免反复冻融，不超过6月均不影响检测结果。
所述检测试剂盒包括如下组分：
电泳胶板 10孔；
阴极缓冲液 13 ml；
阳极缓冲液 10 ml；
底物A 9.6 mg；
助溶剂 0.3 ml；
底物B液 2 ml；
呈色液A 10 ml；
呈色液B 0.3 ml；
示踪剂 0.05 ml；
阳性对照品 0.025 ml；
阴性对照品 0.025 ml；
醋酸纤维膜 9.5cm*9.5 cm。
注：均在有效期内的不同批号试剂盒中各组份可以互换使用。
收到本试剂盒后，需将包装于泡沫盒盖顶部凹槽内的GGT-Ⅱ阳性对照及阴性对照取出置-15℃～-20℃环境储存，其它组份须存放在2～10℃避光保存，防止冷冻。试剂盒自生产之日起4个月内有效。
本试剂盒适用于任何厂家、任何型号的电泳仪，但电泳槽必须使用本公司指定的MV-Ⅱ型双垂直板专用电泳槽。
上述的检测试剂盒的主要成分及作用如下：
电泳胶板：主要为已聚合的聚丙烯酰胺凝胶，用于γ-谷氨酰转肽酶同工酶的分离；
阴极缓冲液：主要为Tris缓冲溶液，作为电泳过程中的阴极电极液；
阳极缓冲液：主要为Tris缓冲溶液，作为电泳过程中的阳极电极液；
助溶剂：主要为浓度约1N的稀盐酸，用于底物A的溶解；
底物A：主要为γ-L-谷氨酰对硝基苯胺-水合物，为γ-谷氨酰转肽酶同工酶作用的底物；
底物B液：主要为Tris- N-甘氨酰甘氨酸溶液，与底物A协同反应；
呈色液A：主要为三氯醋酸-甘油溶液，起同工酶的显色作用；
呈色液B：主要为亚硝酸钠溶液，与呈色液A协同反应；
示踪剂：主要为蔗糖溴酚兰溶液，起示踪作用；
阳性对照品：主要包含GGT-Ⅱ；
阴性对照品：不包含GGT-Ⅱ；
醋酸纤维膜：用于吸附底物液，并最终显示同工酶区带。
上述的检测试剂盒的主要原料如下：
丙烯酰胺：白色小晶体，美国FluKa公司产品，符合FluKa Chemie AG，CH-9470标准，分子量71.08。
N，N，-亚甲基双丙烯酰胺：白色粉末，美国FluKa公司产品，符合FluKa Chemie AG，CH-9470标准，分子量154.17。
三羟甲基氨基甲烷（Tris）：白色细粒状粉末，易溶于水；分析纯，进口分装，符合Q/CYDZ-11-2003标准；分子量121.14，熔点168～169℃，干燥失重<0.15%。
硼酸：无色透明结晶或白色粉末，易溶于热水，乙醇及丙三醇中；分析纯，符合GB628-78标准；分子量61.83，纯度达99.5%。
盐酸：强酸，有腐蚀性，不易燃，无色透明液体，符合GB622-89标准；相对分子量36.46。
过硫酸铵：符合GB655-77；分子量228.19，白色结晶。
四甲基乙二胺：符合Q/BKJS1-92；分子量116.21，为无色透明液体。
γ-L-谷氨酰对硝基苯胺-水合物：符合Q/CYDZ-R-3314-99；分子量285.26，熔点184～192℃。
N-甘氨酰甘氨酸(又名“双甘肽”或“双甘氨肽”)：符合Q/CYDZ-299-98；分子量132.12，干燥失重<0.5%，纸电泳甘氨酸含量小于1%，氯离子含量不大于0.01%。
三氯乙酸：无色结晶，分析纯，符合HG3-1105-77代替HGB3363-60；分子量163.39。
丙三醇：分析纯，澄清，粘稠液体，无嗅，溶于水、醇，不溶于醚、苯、三氯甲烷及二硫化碳，于空气中吸收水份，符合国家标准GB-76，分子量92.09。
蔗糖：符合GH3-1001-76，分子量342.30，比旋光度[α]20/D为+66.40～+66.60。
溴酚兰：符合HGB3389-60，分子量670.02，从黄色到紫色的变色域（pH）为3.0～4.6。
亚硝酸钠：符合GB633-77，分子量69.00，白色或浅黄色结晶，NaNO2含量不少于99.0%。
上述的检测试剂盒所用试剂的配制与贮存如下：
丙烯酰胺溶液：准确称取29 g聚丙烯酰胺，1g N，N，-亚甲基双丙烯酰胺，均放入100 ml的烧杯中，加入蒸馏水60 ml，加热并搅拌使之完全溶解，定容至100 ml。2～10℃放置备用。
分离胶缓冲液：准确称取Tris 8.5 g，放入 100 ml的烧杯中，加入蒸馏水50 ml，搅拌使之完全溶解，加入TEMED 0.46 ml，用浓盐酸滴定至pH8.30，蒸馏水定容至100 ml。2～10℃放置备用。
浓缩胶缓冲液：准确称取Tris 6.5 g，放入 100 ml的烧杯中，加入蒸馏水50 ml，搅拌使之完全溶解，加入TEMED 0.46 ml，用浓盐酸滴定至pH6.80，蒸馏水定容至100 ml。2～10℃放置备用。
过硫酸铵液：准确称取1.9 g过硫酸铵，定容至100 ml。棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
阴极缓冲溶液：Tris 50 g，硼酸40 g，加水定容至1000 ml。室温放置备用。
阳极缓冲溶液：Tris 70 g，溶解后以HCl调pH至7.5，加水定容至1000 ml。室温放置备用。
助溶剂：8.3 ml浓盐酸，蒸馏水定容至100 ml。
示踪剂：蔗糖4.0 g、20 mg溴酚兰，加水至10 ml，2～10℃放置备用。
底物A：9.6 mg γ-L-谷氨酰对硝基苯胺-水合物。黑色离心管贮存，2～10℃放置。
底物B液：Tris 12.9 g，N-甘氨酰甘氨酸13.1 g，加水定容至100 ml。棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
呈色液A：三氯乙酸100 g，丙三醇50 ml，加水定容至1000 ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
呈色液B：亚硝酸钠10g，加水定容至100ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
阳性对照品：检验合格后，-15℃～-20℃保存。
阴性对照品：检验合格后，-15℃～-20℃保存。
本发明还提供一种使用上述的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒的检测方法，只能对γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ作定性检测，包括如下步骤：
（1）先将阴极缓冲液试剂瓶连同阴极缓冲液充分颠倒混匀后，置沸水中5 min，再充分颠倒混匀，直至结晶完全溶解后，将13ml阴极缓冲液以蒸馏水稀释至140 ml；
其中，阴极缓冲液在冷藏保存后会有结晶析出，使用前请先将阴极缓冲液试剂瓶连同阴极缓冲液充分颠倒混匀后，置沸水中水浴5 min，再充分颠倒混匀，直至结晶完全溶解后，将阴极缓冲液用蒸馏水稀释至140 ml。
（2）将10 ml阳性缓冲溶液以蒸馏水稀释至220 ml；
（3）从试剂盒中取出电泳胶板，用剪刀从一侧封口线内侧水平剪开包装袋，倒去包装袋内的胶板保护液，取出电泳胶板，短玻璃面向加样者，以微量加样器分别取示踪剂2μl及待测血清20μl，混匀，从左到右的顺序依次加入电泳胶板的上样孔内；同时做阴、阳性对照，取示踪剂2μl分别与20μl阴、阳性对照品混匀上样，并另外记录好上样标本顺序号，从左到右依次为1～10号，并记录相对应的标本检验编号；
（4）将电泳胶板插入电泳槽，短玻璃面向加样者，压紧胶板，电泳胶板内侧加入稀释好的阴极缓冲液，电泳胶板外侧加入稀释好的阳极缓冲液；
（5）加好样后，接上电极，将电泳槽置37℃水浴箱中，电泳槽底接触水面即可，以支撑物（纸团或布团等）支撑水浴箱盖，以水浴箱盖不压碰电泳槽顶端为合适，同时便于电极线进出。以恒压60 V电泳50 min后，改恒压120V电泳4 h，结束电泳；
（6）从电泳槽中取出电泳胶板，短玻璃面向上平放于操作台面，以扁头小镊子从右下角轻轻撬起短玻璃板，取去短玻璃板，此过程操作需缓慢、轻柔，注意不要将凝胶拉坏。将长玻璃板连同凝胶一起放入直径15 cm的玻璃培养皿中，此时长玻璃板在下，凝胶在上，凝胶上加样孔从左到右为原加样的1～10号；
（7）取0.2 ml助溶剂加入装有底物A的塑料管中，可轻轻吹打助溶，待底物A溶解后，将其吸至另一直径16 cm的玻璃培养皿（玻璃培养皿用前需洗净，烘干）中，再加入底物B液2ml，混匀；从试剂盒中取出醋酸纤维膜，用剪刀剪去一个小角作为标记，将醋酸纤维膜浸入配制好的底物液中，以此底物液打湿醋酸纤维膜；
（8）将以底物液打湿的醋酸纤维膜（使剪角在左上方）以滚动法（先以两手拎起醋酸纤维膜两侧，再将醋酸纤维膜中间先敷于凝胶中央，再慢慢同时放下两侧醋酸纤维膜）敷于凝胶上，两者间不能留有气泡，将直径16 cm的玻璃培养皿以自来水冲洗干净，盖于15 cm的玻璃培养皿上，37℃孵育1小时；
（9）取一干净培养皿，加入10 ml呈色液A及0.2 ml呈色液B并混匀，取出醋酸纤维膜浸于其中，并不断摇晃培养皿使呈色液与醋酸纤维膜充分接触，1min后垂直拎起醋酸纤维膜，使剪角仍在左上方，同时使之与观察者视线相平，按从左到右的顺序，对光肉眼读取膜上1～10号标本呈色结果。
步骤（3）和步骤（7）中，助溶剂、底物A、示踪剂、阳性对照品、阴性对照品及呈色液B的剂量相对较少，大部分可能附于管壁，故在使用前需以离心法或手甩法将试剂甩至管底后再用。
检测时，每一电泳槽可同时进行两块电泳胶板的电泳，当同一电泳槽进行两块电泳胶板的电泳时，只需将两试剂盒中的两瓶阴极缓冲液混匀后稀释至140 ml，两瓶阳极缓冲液混匀后稀释至220 ml，分别加入阴、阳极电泳槽侧即可。
检测时的参考范围为：正常人GGT-Ⅱ均为阴性；乳糜血、高胆红素及溶血对GGT-Ⅱ检测结果无明显影响。
使用本发明的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒检测GGT-Ⅱ的检测结果为：
呈色后醋纤膜上GGT同工酶区带呈红色，从阳极端向阴极端观察，其中最靠近阳极端的第一条同工酶区带为Ⅰ带，该区带为正常肝细胞分泌，每例标本均可检出显色强弱不等的该带，Ⅰ带的检出无特殊临床意义。Ⅰ带后为Ⅱ带，Ⅱ带主要为原发性肝癌细胞所分泌，其位置可参照阳性对照品的结果，待测样本只要检出肉眼可见的GGT-Ⅱ区带，均可判定Ⅱ带为阳性，反之则为阴性。Ⅱ带向后各区带较弥散，且无特殊临床意义，图1中以灰色代替红色，图1中1、3泳道为GGT-Ⅱ检测阳性，2泳道为GGT-Ⅱ检测阴性。
本发明提供的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒具有如下产品性能指标：
1、重现性：取1份GGT-Ⅱ阳性对照品，每个样本孔加样20微升，重复加9个样本孔，结果应均为阳性，且条带清晰。
2、阳性符合率：以9例不同来源的阳性对照品，每个样本孔加样20微升，按本法检测每批试剂盒，每个样品测试1次，检测结果均应为阳性。
3、阴性符合率：以9例不同来源的阴性对照品，每个样本孔加样20微升，按本法检测每批试剂盒，每个样品测试1次，检测结果均应为阴性。
使用本发明提供的γ-谷氨酰转肽酶同工酶 Ⅱ 检测试剂盒的注意事项如下：
1、阴极缓冲液在冷藏保存后会有结晶析出，使用前请先将阴极缓冲液试剂瓶连同阴极缓冲液充分颠倒混匀后，置沸水中水浴五分种，再充分颠倒混匀，直至结晶完全溶解后，将阴极缓冲液用蒸馏水稀释至140 ml。
2、因助溶剂、底物A、示踪剂、GGT-Ⅱ阳性对照、阴性对照及呈色液B剂量相对较少，大部分可能附于管壁，故在使用前需以离心法或手甩法将试剂甩至管底后再用。
3、阴、阳极电泳缓冲液不可混淆，阴极缓冲液加在电泳胶板内侧，阳极缓冲液加在电泳胶板外侧。
4、注意标本加入时的顺序，观察结果时标本顺序必须与加入时一致。
5、电泳过程中注意观察电泳状况，电极连接时否正常，示踪剂泳动是否正常等。
6、电泳结束后在取去短玻璃板过程中，操作需缓慢、轻柔，注意不要将凝胶拉坏。
7、由助溶剂、底物A及底物B液配制成的底物液需临用前配制。
8、底物液打湿的醋酸纤维膜（任一面均可）敷于凝胶上时，最好一次敷成，不要将醋酸纤维膜频繁在胶上移动，同时注意两者间不能留有气泡。
9、呈色后结果必须立即观看，并做好记录，呈色后时间过长，区带没有刚呈色时清楚。
10、同一实验室最好有备用电泳槽，将电泳槽一天隔一天轮换使用，使电泳槽上胶皮水分干透，加入电极缓冲液后就不易渗漏。
11、本试剂盒中阳性对照及阴性对照取自人血清，可能有潜在的传染性，所有临床样本都可能是潜在的污染源，操作应戴手套，同时建立规范的器具操作和废物处理规程。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：
电泳胶板 10孔；
阴极缓冲液 13 ml；
阳极缓冲液 10 ml；
底物A 9.6 mg；
助溶剂 0.3 ml；
底物B液 2 ml；
呈色液A 10 ml；
呈色液B 0.3 ml；
示踪剂 0.05 ml；
阳性对照品 0.025 ml；
阴性对照品 0.025 ml；
醋酸纤维膜 9.5cm*9.5 cm。
2.根据权利要求1所述的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，所述电泳胶板为已聚合的聚丙烯酰胺凝胶，用于γ-谷氨酰转肽酶同工酶的分离；
所述阴极缓冲液为Tris缓冲溶液，作为电泳过程中的阴极电极液；
所述阳极缓冲液为Tris缓冲溶液，作为电泳过程中的阳极电极液；
所述助溶剂为浓度约1N的稀盐酸，用于底物A的溶解；
所述底物A为γ-L-谷氨酰对硝基苯胺-水合物，为γ-谷氨酰转肽酶同工酶作用的底物；
所述底物B液为Tris- N-甘氨酰甘氨酸溶液，与底物A协同反应；
所述呈色液A为三氯醋酸-甘油溶液，起同工酶的显色作用；
所述呈色液B为亚硝酸钠溶液，与呈色液A协同反应；
所述示踪剂为蔗糖溴酚兰溶液，起示踪作用；
所述阳性对照品包含GGT-Ⅱ；
所述阴性对照品不包含GGT-Ⅱ；
所述醋酸纤维膜用于吸附底物液，并最终显示同工酶区带。
3.根据权利要求2所述的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，所述电泳胶板的制备步骤包括：
1.1、聚丙烯酰胺溶液：准确称取29 g聚丙烯酰胺，1 g N，N，-亚甲基双丙烯酰胺，均放入100 ml的烧杯中，加入蒸馏水60 ml，加热并搅拌使之完全溶解，定容至100 ml，2～10℃放置备用；
1.2、分离胶缓冲液：准确称取Tris 8.5 g，放入 100 ml的烧杯中，加入蒸馏水50 ml，搅拌使之完全溶解，加入TEMED 0.46 ml，用浓盐酸滴定至pH8.30，蒸馏水定容至100 ml，2～10℃放置备用；
1.3、浓缩胶缓冲液：准确称取Tris 6.5 g，放入100 ml的烧杯中，加入蒸馏水50 ml，搅拌使之完全溶解，加入TEMED 0.46 ml，用浓盐酸滴定至pH6.80，蒸馏水定容至100 ml，2～10℃放置备用；
1.4、过硫酸铵液：准确称取1.9 g过硫酸铵，定容至100 ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
4.根据权利要求2所述的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，所述阴极缓冲液的配制方法为：Tris 50 g，硼酸40 g，加水定容至1000 ml，室温放置备用；
所述阳极缓冲溶液的配制方法为：Tris 70g，溶解后以HCl调pH至7.5，加水定容至1000ml，室温放置备用。
5.根据权利要求2所述的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，所述助溶剂的配制方法为：8.3 ml浓盐酸，蒸馏水定容至100 ml；
所述底物A的配制方法为：9.6 mg γ-L-谷氨酰对硝基苯胺-水合物，黑色离心管贮存，2～10℃放置；
所述底物B液的配制方法为：Tris 12.9g，N-甘氨酰甘氨酸13.1g，加水定容至100 ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
6.根据权利要求2所述的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒，其特征在于，所述示踪剂的配制方法为：蔗糖4.0 g、溴酚兰20 mg，加水至10 ml，2～10℃放置备用；
所述呈色液A的配制方法为：三氯乙酸100 g，丙三醇50 ml，加水定容至1000 ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用；
所述呈色液B的配制方法为：亚硝酸钠10 g，加水定容至100 ml，棕色瓶贮存，2～10℃放置备用。
7.一种使用如权利要求1～6中任一项所述的γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）先将阴极缓冲液试剂瓶连同阴极缓冲液充分颠倒混匀后，置沸水中5 min，再充分颠倒混匀，直至结晶完全溶解后，将13 ml阴极缓冲液以蒸馏水稀释至140 ml；
（2）将10 ml阳性缓冲溶液以蒸馏水稀释至220 ml；
（3）从试剂盒中取出电泳胶板，用剪刀从一侧封口线内侧水平剪开包装袋，倒去包装袋内的胶板保护液，取出电泳胶板，短玻璃面向加样者，以微量加样器分别取示踪剂2μl及待测血清20μl，混匀，从左到右的顺序依次加入电泳胶板的上样孔内；同时做阴、阳性对照，取示踪剂2μl分别与20μl阴、阳性对照品混匀上样，并另外记录好上样标本顺序号，从左到右依次为1～10号，并记录相对应的标本检验编号；
（4）将电泳胶板插入电泳槽，短玻璃面向加样者，压紧胶板，电泳胶板内侧加入稀释好的阴极缓冲液，电泳胶板外侧加入稀释好的阳极缓冲液；
（5）加好样后，接上电极，将电泳槽置37℃水浴箱中，电泳槽底接触水面即可，以支撑物支撑水浴箱盖，以恒压60 V电泳50 min后，改恒压120 V电泳4 h，结束电泳；
（6）从电泳槽中取出电泳胶板，短玻璃面向上平放于操作台面，以扁头小镊子从右下角轻轻撬起短玻璃板，取去短玻璃板，将长玻璃板连同凝胶一起放入直径15 cm的玻璃培养皿中，此时长玻璃板在下，凝胶在上，凝胶上加样孔从左到右为原加样的1～10号；
（7）取0.2 ml助溶剂加入装有底物A的塑料管中，可轻轻吹打助溶，待底物A溶解后，将其吸至另一直径16 cm的玻璃培养皿，再加入底物B液2 ml，混匀；从试剂盒中取出醋酸纤维膜，用剪刀剪去一个小角作为标记，将醋酸纤维膜浸入配制好的底物液中，以此底物液打湿醋酸纤维膜；
（8）将以底物液打湿的醋酸纤维膜以滚动法敷于凝胶上，两者间不能留有气泡，将直径16 cm的玻璃培养皿以自来水冲洗干净，盖于15 cm的玻璃培养皿上，37℃孵育1小时；
（9）取一干净培养皿，加入10 ml呈色液A及0.2ml呈色液B并混匀，取出醋酸纤维膜浸于其中，并不断摇晃培养皿使呈色液与醋酸纤维膜充分接触，1 min后垂直拎起醋酸纤维膜，同时使之与观察者视线相平，按从左到右的顺序，对光读取膜上1～10号标本呈色结果。
8.根据权利要求7所述的使用γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒的检测方法，其特征在于，检测时，每一电泳槽可同时进行两块电泳胶板的电泳，当同一电泳槽进行两块电泳胶板的电泳时，只需将两试剂盒中的两瓶阴极缓冲液混匀后稀释至140 ml，两瓶阳极缓冲液混匀后稀释至220 ml，分别加入阴、阳极电泳槽侧即可。
9.根据权利要求7所述的使用γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，阴极缓冲液在冷藏保存后会有结晶析出，使用前请先将阴极缓冲液试剂瓶连同阴极缓冲液充分颠倒混匀后，置沸水中水浴5 min，再充分颠倒混匀，直至结晶完全溶解后，将阴极缓冲液用蒸馏水稀释至140 ml。
10.根据权利要求7所述的使用γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（7）中，助溶剂、底物A、示踪剂、阳性对照品、阴性对照品及呈色液B的剂量相对较少，在使用前需以离心法或手甩法将试剂甩至管底后再用。
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CN2758765Y (zh) * 2004-08-10 2006-02-15 钱坤艳 γ－谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ检测试剂盒
CN102353791A (zh) * 2011-06-30 2012-02-15 倪润洲 一种分离检测afp亚型的新方法

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