CN113219117A - 一种timp1蛋白标准物质的质谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,本发明的有益效果为:本发明首次使用同位素稀释质谱法对TIMP1标准物质进行绝对定量分析,填补了现有技术空白,对TIMP1标准物质的溯源分析研究和质控体系建立具有重要意义;本发明结合了质谱平行反应监测模式,在高分辨精度下采集数据,相比于常规的多反应监测模式(MRM),显著减小了基质共流出物对肽段分析的干扰;本发明提供的分析方法对其他蛋白类标准物质的定值和溯源分析研究具有指导借鉴意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质分析检测技术,具体涉及一种基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP1蛋白)标准物质的质谱分析方法。
背景技术
基质金属蛋白酶抑制因子1(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)可以通过抑制金属蛋白酶的活性,广泛参与组织重构和肿瘤血管生成、肿瘤细胞的侵袭和转移的发展,是一种重要的癌症早期诊断和预后生物标志物。
临床检测中对TIMP1的定量测定结果是否可靠,取决于该蛋白标准物质定值的准确性。常用的蛋白浓度测定方法如考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法、BCA法具有选择性差、灵敏度和准确度低的缺点。质谱法是近年来蛋白质分析领域逐渐发展起来的一种新技术,其专属性强、精密度高、结果准确可靠,其中同位素稀释质谱法是目前蛋白类标准物质定值的基准方法。
本发明采用同位素稀释质谱法,对TIMP1蛋白标准物质进行绝对定量分析,填补了该领域的技术空白,具有良好的准确性、可靠性和溯源性。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种具有良好的准确性、可靠性和溯源性的基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP1蛋白)标准物质的质谱分析方法。
一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,包括以下步骤:
(1)选取两条特征肽段GFQALGDAADIR(下文称TIMP1a)和SEEFLIAGK(下文称TIMP1b)用于TIMP1蛋白定量;
(2)使用稳定同位素13C和15N对上述特征肽段GFQALGDAADIR的精氨酸进行标记,得到对应的内标肽段GFQALGDAADIR*13C6,15N4(下文称TIMP1a_IS);使用稳定同位素13C和15N对上述特征肽段SEEFLIAGK的赖氨酸进行标记得到对应的内标肽段SEEFLIAGK*13C6,15N2(下文称TIMP1b_IS);
(3)优化与建立TIMP1的特征肽段和内标肽段的质谱分析方法;
(4)建立标准曲线:将步骤(1)和步骤(2)所述的特征肽段和内标肽段溶解后按一定比例混合,分别进行质谱分析,并建立标准曲线;
(5)TIMP1蛋白样本的处理及分析:将TIMP1蛋白样本依次经还原、烷基化、酶解、干燥复溶处理,处理产物使用质谱分析,并对TIMP1蛋白进行绝对定量分析。
上述一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,作为一种优选的实施方案,步骤(1)和(2)中,对选取的特征肽段和内标肽段进行液相色谱分离纯化、紫外检测器纯度分析和氨基酸纯度分析,从而获取所选肽段的紫外纯度PUV和氨基酸纯度PAA。
上述一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,作为一种优选的实施方案,步骤(3)中,TIMP1的特征肽段和内标肽段的质谱方法的优化和建立流程为:将上述特征肽段和内标肽段分别进行纳升液相色谱-质谱分析,并在平行反应监测(Parallel ReactionMonitor-ing,PRM)模式下采集数据;通过Skyline软件分析上述平行反应监测模式下采集的数据,选取每个肽段母离子碎裂后峰强度最高的5个碎片离子作为对应的目标肽段子离子,完成TIMP1的特征肽段和内标肽段的离子对的筛选和优化。
优选地,纳升液相色谱-质谱分析方法为:
分析柱为C18毛细管色谱柱3um,75um*15cm,柱温为55℃;流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液;进样量为2uL。
优选地,纳升液相色谱-质谱分析方法的梯度洗脱程序包括:0min,500nL/min,20%B;12min,500nL/min,50%B;13min,1000nL/min,100%B;18min,1000nL/min,100%B。
优选地,纳升液相色谱-质谱分析方法的毛细管电压为2.1kV,分辨率为30000,碰撞能量NCE为27,在PRM扫描模式下采集质谱数据。
上述一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,作为一种优选的实施方案,步骤(4)中,标准曲线的建立方法为:
a、将特征肽段TIMP1a和TIMP1b的冻干粉溶解于5%乙腈的水溶液中,配成等浓度的混合特征肽段溶液,并用10%乙腈水溶液稀释成浓度为0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20.0ng/mL和50.0ng/mL的溶液;
b、将内标肽段TIMP1a_IS冻干粉和内标肽段TIMP1b_IS冻干粉溶解于5%乙腈的水溶液中,配成等浓度的混合内标肽段溶液,并用10%的乙腈稀释成浓度为5.0ng/mL的溶液;
c、将上述不同浓度的混合特征肽段溶液与5.0ng/mL的混合内标肽段溶液等体积混合,然后采用步骤(3)建立的质谱方法进行质谱分析,以特征肽段的浓度为横坐标,特征肽段及其内标肽段的峰面积比值为纵坐标,建立标准曲线。
上述一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,作为一种优选的实施方案,步骤(5)中,TIMP1蛋白样本的处理为:
取适量TIMP1标准蛋白,精确记录体积Vsample,加入40uL 50mM碳酸氢铵水溶液和2.5uL 0.5mol/L三(2-羧乙基)膦,在37℃下反应30min;
待反应结束,加入2.5uL 500mmol/L碘乙酰胺,在室温下避光反应30min,然后加入20uL 100ng/uL胰蛋白酶溶液,在37℃下酶解24小时,再加入6uL 10%甲酸水溶液终止酶解反应;
将酶解产物进行冰冻干燥,再用10%乙腈水溶液复溶,并与5.0ng/mL的混合内标肽段溶液等体积混合,取2uL混合液按照步骤(3)建立的质谱方法进行分析,并通过Skyline软件分析采集的质谱数据。将样本中特征肽段及其内标肽段的峰面积比值代入标准曲线中,求得样本中特征肽段的浓度Cpeptide。
上述一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,作为一种优选的实施方案,加入的碳酸氢铵水溶液含有10%的乙腈;加入的胰蛋白酶溶液的溶剂为50mM碳酸氢铵水溶液。
上述一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,作为一种优选的实施方案,步骤(5)中,TIMP1标准物质的蛋白浓度Cprotein的计算公式为:
Cprotein=Cpeptide×VDilution×PUV×PAA×Rmol×Mprotein/Vsample×Mpeptide;
式中:
Cprotein表示原始蛋白样本中的蛋白浓度;
Cpeptide表示上机样本中测定的特征肽段浓度;
VDilution表示冰冻干燥复溶后的样本体积;
PUV表示测定的特征肽段紫外纯度;
PAA表示测定的特征肽段氨基酸纯度;
Rmol表示测定蛋白与测定的特征肽段的摩尔比;
Mprotein表示测定蛋白的分子量;
Vsample表示原始蛋白样本的体积;
Mpeptide表示测定的特征肽段分子量。
相对于现有技术,本发明的有益效果为:
(1)本发明首次使用同位素稀释质谱法对TIMP1标准物质进行绝对定量分析,填补了现有技术空白,对TIMP1标准物质的溯源分析研究和质控体系建立具有重要意义。
(2)本发明结合了质谱平行反应监测模式,在高分辨精度下采集数据,相比于常规的多反应监测模式(MRM),显著减小了基质共流出物对肽段分析的干扰。
(3)本发明提供的分析方法对其他蛋白类标准物质的定值和溯源分析研究具有指导借鉴意义。
附图说明
图1为特征肽段TIMP1 a的标准曲线;
图2为特征肽段TIMP1 b的标准曲线;
图3为特征肽段TIMP1 a的色谱图;
图4为内标肽段TIMP1 a_IS的色谱图;
图5为特征肽段TIMP1 b的色谱图;
图6为内标肽段TIMP1 b_IS的色谱图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案,下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本申请保护的范围。
一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,包括以下步骤:
(1)选取两条特征肽段GFQALGDAADIR(TIMP1a)和SEEFLIAGK(TIMP1b)用于TIMP1蛋白定量;
(2)使用稳定同位素13C和15N对上述特征肽段GFQALGDAADIR的精氨酸进行标记,得到对应的内标肽段GFQALGDAADIR*13C6,15N4(TIMP1 a_IS);使用稳定同位素13C和15N对上述特征肽段SEEFLIAGK的赖氨酸进行标记得到对应的内标肽段SEEFLIAGK*13C6,15N2(TIMP1 b_IS);
(3)优化与建立TIMP1的特征肽段和内标肽段的质谱分析方法;将上述特征肽段和内标肽段分别进行纳升液相色谱-质谱分析,并在平行反应监测模式下采集数据;通过Skyline软件分析上述平行反应监测模式下采集的数据,选取每个肽段母离子碎裂后峰强度最高的5个碎片离子作为对应的目标肽段子离子,完成TIMP1的特征肽段和内标肽段的离子对的筛选和优化;
纳升液相色谱-质谱分析方法为:
分析柱为C18毛细管色谱柱3um,75um*15cm,柱温为55℃;流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液;进样量为2uL;
纳升液相色谱-质谱分析方法的梯度洗脱程序包括:0min,500nL/min,20%B;12min,500nL/min,50%B;13min,1000nL/min,100%B;18min,1000nL/min,100%B;
纳升液相色谱-质谱分析方法的毛细管电压为2.1kV,分辨率为30000,碰撞能量NCE为27,在PRM扫描模式下采集质谱数据。
PRM扫描信息如表1所示;
表1 TIMP1的PRM扫描信息
(4)建立标准曲线:将特征肽段TIMP1a和TIMP1b的冻干粉溶解于5%乙腈的水溶液中,配成等浓度的混合特征肽段溶液,并用10%乙腈水溶液稀释成浓度为0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20.0ng/mL和50.0ng/mL的溶液;
将内标肽段TIMP1a_IS冻干粉和内标肽段TIMP1b_IS冻干粉溶解于5%乙腈的水溶液中,配成等浓度的混合内标肽段溶液,并用10%的乙腈稀释成浓度为5.0ng/mL的溶液;
将上述不同浓度的混合特征肽段溶液与5.0ng/mL的混合内标肽段溶液等体积混合,然后采用步骤(3)建立的质谱方法进行质谱分析,以特征肽段的浓度为横坐标,特征肽段及其内标肽段的峰面积比值为纵坐标,建立标准曲线;特征肽段TIMP1a的标准曲线如图1所示,特征肽段TIMP1b的标准曲线如图2所示;
(5)TIMP1蛋白的处理及分析:
取适量TIMP1标准蛋白,精确记录体积Vsample,加入40uL 50mM含有10%乙腈的碳酸氢铵水溶液和2.5uL 0.5mol/L三(2-羧乙基)膦,在37℃下反应30min;
待反应结束,加入2.5uL 500mmol/L碘乙酰胺,在室温下避光反应30min,然后加入20uL 100ng/uL胰蛋白酶溶液(溶于50mM碳酸氢铵中),在37℃下酶解24小时,再加入6uL10%甲酸水溶液终止酶解反应;
将酶解产物进行冰冻干燥,再用10%乙腈水溶液复溶,并与5.0ng/mL的混合内标溶液等体积混合,取2uL混合液进行纳升液相色谱-质谱分析,记录色谱图,如图3-图6所示;
通过Skyline软件分析采集的质谱数据,将样本中特征肽段及其内标肽段的峰面积比值代入标准曲线中,求得样本中特征肽段的浓度Cpeptide;
TIMP1标准物质的蛋白浓度Cprotein的计算公式为:
Cprotein=Cpeptide×VDilution×PUV×PAA×Rmol×Mprotein/Vsample×Mpeptide;
式中:
Cprotein表示原始蛋白样本中的蛋白浓度;
Cpeptide表示上机样本中测定的特征肽段浓度;
VDilution表示冰冻干燥复溶后的样本体积;
PUV表示测定的特征肽段紫外纯度;
PAA表示测定的特征肽段氨基酸纯度;
Rmol表示测定蛋白与测定的特征肽段的摩尔比;
Mprotein表示测定蛋白的分子量;
Vsample表示原始蛋白样本的体积;
Mpeptide表示测定的特征肽段分子量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)选取两条特征肽段GFQALGDAADIR和SEEFLIAGK用于TIMP1蛋白定量;
(2)使用稳定同位素13C和15N对上述特征肽段GFQALGDAADIR的精氨酸进行标记,得到对应的内标肽段GFQALGDAADIR*13C6,15N4;使用稳定同位素13C和15N对上述特征肽段SEEFLIAGK的赖氨酸进行标记得到对应的内标肽段SEEFLIAGK*13C6,15N2;
(3)优化与建立TIMP1的特征肽段和内标肽段的质谱分析方法;
(4)建立标准曲线:将步骤(1)和步骤(2)所述的特征肽段和内标肽段溶解后按一定比例混合,分别进行质谱分析,并建立标准曲线;
(5)TIMP1蛋白样本的处理及分析:将TIMP1蛋白样本依次经还原、烷基化、酶解、干燥复溶处理,处理产物使用质谱分析,并对TIMP1蛋白进行绝对定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,其特征在于,步骤(3)中,TIMP1的特征肽段和内标肽段的质谱方法的优化和建立流程为:
将权利要求1所述的特征肽段和内标肽段分别进行纳升液相色谱-质谱分析,并在平行反应监测模式下采集数据;通过Skyline软件分析上述平行反应监测模式下采集的数据,选取每个肽段母离子碎裂后峰强度最高的5个碎片离子作为对应的目标肽段子离子,完成TIMP1的特征肽段和内标肽段的离子对的筛选和优化。
3.根据权利要求2所述的一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,其特征在于,纳升液相色谱-质谱分析方法为:
分析柱为C18毛细管色谱柱3um,75um*15cm,柱温为55℃;流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液;进样量为2uL。
4.根据权利要求2所述的一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,其特征在于,纳升液相色谱-质谱分析方法的梯度洗脱程序包括:0min,500nL/min,20%B;12min,500nL/min,50%B;13min,1000nL/min,100%B;18min,1000nL/min,100%B。
5.根据权利要求2所述的一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,其特征在于,纳升液相色谱-质谱分析方法的毛细管电压为2.1kV,分辨率为30000,碰撞能量NCE为27,在PRM扫描模式下采集质谱数据。
6.根据权利要求1所述的一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,其特征在于:步骤(4)中,标准曲线的建立方法为:
将不同浓度的TIMP1的特征肽段溶液与固定浓度的内标肽段溶液等体积混合,然后采用步骤(3)建立的质谱方法进行质谱分析,以特征肽段的浓度为横坐标,特征肽段及其内标肽段的峰面积比值为纵坐标,建立标准曲线。
7.根据权利要求1所述的一种TIMP1蛋白标准物质的质谱分析方法,其特征在于,步骤(5)中,TIMP1蛋白样本的处理步骤为:
在TIMP1标准蛋白样本中加入碳酸氢铵水溶液和三(2-羧乙基)膦,37℃进行还原反应;再加入碘乙酰胺,室温下避光反应;然后加入胰蛋白酶溶液,37℃下酶解,加入甲酸终止酶解反应;再将样本进行冰冻干燥,复溶后加入内标肽段溶液,按照步骤(3)建立的质谱方法进行分析,并对TIMP1蛋白进行准确定量。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114705849A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-05 | 广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院) | 一种基于silac进行血清胱抑素c绝对定量的质谱方法 |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100255500A1 (en) * | 2007-10-08 | 2010-10-07 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Identification method of glycoproteins using a specific lectin precipitation |
US20140335535A1 (en) * | 2009-12-29 | 2014-11-13 | Korea Basic Science Institute | Peptide marker for cancer diagnosis and cancer diagnosis method using the same |
US20150087003A1 (en) * | 2012-05-03 | 2015-03-26 | bioMérieux | Method for obtaining peptides |
CN104792900A (zh) * | 2015-05-06 | 2015-07-22 | 武汉华美生物工程有限公司 | 一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法 |
WO2016032319A1 (en) * | 2014-08-28 | 2016-03-03 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Protein quantitation with mass spectrometry. |
CN106770821A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-05-31 | 南通大学附属医院 | 肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白i含量的方法 |
CN106770866A (zh) * | 2015-12-17 | 2017-05-31 | 中国医科大学 | 可实现人血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法 |
CN109444287A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-03-08 | 杭州同创医学检验实验室有限公司 | 一种甲胎蛋白的lc-ms/ms定量检测方法 |
CN110045028A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-07-23 | 南京智谱分子医学技术研究院有限公司 | 一种贝伐珠单抗的临床前药代动力学研究质谱分析方法 |
CN111239273A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-06-05 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法 |
-
2021
- 2021-05-27 CN CN202110586210.3A patent/CN113219117A/zh active Pending
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100255500A1 (en) * | 2007-10-08 | 2010-10-07 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Identification method of glycoproteins using a specific lectin precipitation |
US20140335535A1 (en) * | 2009-12-29 | 2014-11-13 | Korea Basic Science Institute | Peptide marker for cancer diagnosis and cancer diagnosis method using the same |
US20150087003A1 (en) * | 2012-05-03 | 2015-03-26 | bioMérieux | Method for obtaining peptides |
WO2016032319A1 (en) * | 2014-08-28 | 2016-03-03 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Protein quantitation with mass spectrometry. |
CN104792900A (zh) * | 2015-05-06 | 2015-07-22 | 武汉华美生物工程有限公司 | 一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法 |
CN106770866A (zh) * | 2015-12-17 | 2017-05-31 | 中国医科大学 | 可实现人血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法 |
CN106770821A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-05-31 | 南通大学附属医院 | 肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白i含量的方法 |
CN109444287A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-03-08 | 杭州同创医学检验实验室有限公司 | 一种甲胎蛋白的lc-ms/ms定量检测方法 |
CN110045028A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-07-23 | 南京智谱分子医学技术研究院有限公司 | 一种贝伐珠单抗的临床前药代动力学研究质谱分析方法 |
CN111239273A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-06-05 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种利妥昔单抗的药代动力学研究质谱分析方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
吴慈 等: "基于高分辨质谱技术的婴幼儿食品中过敏原蛋白质的高灵敏检测", 《色谱》 * |
王素兰 等: "基于稳定同位素标记和平行反应监测的蛋白质组学定量技术用于肝癌生物标志物的筛选和验证", 《色谱》 * |
詹丽娜 等: "超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨质谱检测食品中的牛奶过敏原酪蛋白", 《色谱》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114705849A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-05 | 广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院) | 一种基于silac进行血清胱抑素c绝对定量的质谱方法 |
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