CN109444053B - 瞬态传热显微镜及其进行微区热测量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种瞬态传热显微镜，包括提供待测样品微区温度变化信号的温敏纳米探针、向待测样品提供热扰动的纳秒脉冲激光系统、对温敏纳米探针进行显微观察的暗场显微镜系统、进行图像信息采集处理的成像系统和提供延迟触发信号的延迟发生器系统，延迟发生器系统分别与成像系统及纳秒脉冲激光系统相连。本发明还公开了使用瞬态传热显微镜进行微区热测量的方法。本发明使用纳秒脉冲激光对待测样品进行加热，然后通过延迟发生器系统产生的延迟触发信号来控制暗场显微镜系统和成像系统采集温敏纳米探针在冷却过程中不同时刻的散射图像，最终可获得温敏纳米探针的冷却曲线进而得到温敏纳米探针周围液体介质的传热系数。

Description

瞬态传热显微镜及其进行微区热测量的方法

技术领域

本发明涉及一种显微成像系统，尤其涉及一种瞬态传热显微镜及其进行微区热测量的方法。

背景技术

最近，微区的热测量受到了科研工作者的广泛关注。到目前为止，科学家们已经开发出多种测量微区(如细胞内)温度的手段，比如扫描探针法(Scanningthermalmicroscopy，A.Majumdar，Annual Review of Materials Science，1999，29，505-585)和纳米钻石测温技术(Nanometre-scale thermometry in a living cell，G.Kucsko，P.C.Maurer，N.Y.Yao Kucsko，Georg，et al.，Nature，2013，500，54)等等。

但是，温度是一个状态量，而传热则是一个过程量，它的测量将会更加困难。想要准确测量物质的传热特性必须首先添加扰动，然后同步测量温度变化，并且要求添加的扰动对体系本身影响尽量小。并且想要准确测细胞内的传热，就要将扰动和监测体系的体积缩小到细胞内的微米甚至纳米尺度，这点就非常困难。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种能够对物理、化学领域中液体介质的传热特性以及分子生物学领域中细胞内介质的传热特性进行研究，进行微区热测量的瞬态传热显微镜。

技术方案：本发明提供一种瞬态传热显微镜，该瞬态传热显微镜包括提供待测样品微区温度变化信号的温敏纳米探针、向待测样品提供热扰动的纳秒脉冲激光系统、对温敏纳米探针进行显微观察的暗场显微镜系统、进行图像信息采集处理的成像系统和提供延迟触发信号的延迟发生器系统，延迟发生器系统分别与暗场显微镜系统、成像系统及纳秒脉冲激光系统相连。

上述温敏纳米探针中的“温敏”是指纳米探针可受周围环境温度影响发生温度变化；优选地，上述温敏纳米探针为粒径为20-80nm的纳米金颗粒，纳米金颗粒的粒径较小，瞬态传热显微镜可以测量微小尺度(纳米/微米尺度)的微区传耗散。待测样品可以是液体介质(如：水、油、甘油等)或生物介质(如细胞)。

优选地，上述纳秒脉冲激光系统包括依次设置的纳秒脉冲激光器、光参量振荡器、倍频器、第一反射镜、可变中性密度滤光片、第二反射镜和平板分束镜；纳秒脉冲激光系统中，纳秒脉冲激光器输出初始激光束，在纳秒脉冲激光器前端放置的光参量振荡器和倍频器调节激光束波长，经过一系列的分光和反射输入暗场显微镜物镜，照射在载物台的载玻片上，形成的激光光斑直径约为200μm，用以加热温敏纳米探针形成热扰动。

上述暗场显微镜系统包括依次设置的脉冲氙灯、多模光纤、扩束器、第三反射镜、第一成像物镜、载物台和第二成像物镜；脉冲氙灯产生的探测用白光光束经过扩束、反射和聚焦照射在下方固定在载物台的样品上，然后使用第二成像物镜收集温敏探针的散射光信号。

上述成像系统包括依次设置的CCD图像采集器、光谱仪、第四反射镜和长通滤波片；暗场显微镜系统中的成像物镜采集的光束经过光谱仪由CCD图像采集器进行探测成像。

延迟发生器系统包括延迟发生器、监测TTL信号的示波器和将延迟发生器系统分别与暗场显微镜系统、成像系统及纳秒脉冲激光系统相连的信号线；延迟发生器7控制脉冲激光器的TTL信号输入延迟发生器，然后产生2个通道延迟的TTL信号，分别控制脉冲氙灯和CCD图像采集器进行探测。

本发明另一方面提供一种使用上述瞬态传热显微镜进行微区热测量的方法，该方法包括以下步骤：

1)将表面包裹有待测样品的温敏纳米探针置于载物台上，使用纳秒脉冲激光系统对包裹有待测样品的温敏纳米探针加热；

2)通过延迟发生器系统控制暗场显微镜系统和成像系统，获得所述包裹有待测样品的温敏纳米探针在冷却过程中不同时刻的散射光图像。

优选地，步骤2)中，通过延迟发生器系统控制暗场显微镜系统和成像系统，获得包裹有待测样品的温敏纳米探针在冷却过程中不同时刻的散射光图像的具体方法包括：

a)用纳秒脉冲激光系统对包裹有待测样品的温敏纳米探针加热；

b)在步骤a)加热停止后，用延迟发生器系统控制暗场显微镜系统和成像系统每隔时间tb探测包裹有待测样品的温敏纳米探针的散射光信号。

上述步骤1)中，对包裹有待测样品的温敏纳米探针加热是指，将包裹有待测样品的温敏纳米探针加热至温度升高0～40K，具体升高的温度本领域技术人员可根据待测样品实际理化性质进行设置，只要使该方法能在步骤2)中清楚地获得散射光图像即可；类似地，纳秒脉冲激光器、光参量振荡器和倍频器的波长，以及tb的数值本领域技术人员可根据待测样品实际理化性质进行设置，只要使该方法能在步骤2)中清楚地获得散射光图像即可。

有益效果：本发明的瞬态传热显微镜使用纳秒脉冲激光对包裹有待测样品的温敏纳米探针进行加热，然后通过延迟发生器系统产生的延迟触发信号来控制暗场显微镜系统和成像系统采集温敏纳米探针在冷却过程中不同时刻的散射图像，最终获得温敏纳米探针的冷却曲线进而得到温敏纳米探针周围液体介质的传热系数。由于温敏纳米探针的粒径在纳米尺度，因此本发明可以测量纳米/微米尺度的微区传耗散。本发明的瞬态传热显微镜适用于物理和化学领域研究液体介质的传热特性以及分子生物学领域研究细胞内介质的传热特性等方面。

附图说明

图1为瞬态传热显微镜的示意图；

图2为瞬态传热显微镜对液体介质的微区热测量结果；

图3为瞬态传热显微镜对细胞内介质的的微区热测量结果；

图1中，1-脉冲氙灯；2-CCD图像采集器；3-光谱仪；4-脉冲激光器；5-光参量振荡器；6-倍频器；7-延迟发生器；8-示波器；s1-多模光纤；s2-准直透镜；s3-第三反射镜；s4-第一成像物镜；s5-第二成像物镜；s6-平板分束镜；s7-长通滤波片；s8-第四反射镜；s9-第二反射镜；s10-可变中性密度滤光片；s11-第一反射镜；s12，s13，s14，s15-信号线。

具体实施方式

如图1所示，瞬态传热显微镜包括提供待测样品微区温度变化信号的温敏纳米探针、向待测样品提供热扰动的纳秒脉冲激光系统、对温敏纳米探针进行显微观察的暗场显微镜系统、进行图像信息采集处理的成像系统和提供延迟触发信号的延迟发生器系统，延迟发生器系统分别与成像系统及纳秒脉冲激光系统相连。上述温敏纳米探针为粒径为20-80nm的纳米金颗粒。

纳秒脉冲激光系统包括依次设置的纳秒脉冲激光器4、光参量振荡器5、倍频器6、第一反射镜s11、可变中性密度滤光片s10、第二反射镜s9和平板分束镜s6。纳秒脉冲激光系统主要由纳秒脉冲激光器4输出波长为355nm的激光，经由光参量振荡器5和倍频器6调节至合适的波长出射，之后经过反射镜s11调节方向，可变中性密度滤光片s10调节光源强度，反射镜s9调节方向，然后经过分束镜s6反射，最后通过成像物镜s5照射在温敏纳米探针上，产生热扰动。

暗场显微镜系统包括依次设置的脉冲氙灯1、多模光纤s1、准直透镜s2、第三反射镜s3、第一成像物镜s4、载物台和第二成像物镜s5。成像系统包括依次设置的CCD图像采集器2、光谱仪3、第四反射镜s8和长通滤波片s7。暗场显微镜系统主要由脉冲氙灯1提供探测所需白光光源，光线经过成像物镜s4照射在置于载物台的待测样品上，经由成像物镜s5收集，之后经过平板分束镜s6、550nm长通滤波片s7和反射镜s8进入光谱仪3最终在CCD图像采集器2上成像，并将信号输出至计算机。

延迟发生器系统包括延迟发生器7、示波器8、将延迟发生器7与脉冲氙灯1相连的信号线s12、将延迟发生器7与CCD图像采集器2相连的信号线s13、将延迟发生器7与脉冲激光器4相连的信号线s14、s15。延迟发生器7控制脉冲激光器4发出脉冲激光的TTL信号经由延迟发生器7处理延迟之后，分别输入脉冲氙灯1和CCD图像采集器2用以控制脉冲氙灯1和CCD图像采集器2的工作时刻。

瞬态传热显微镜中的上述各组成部分的位置排布如图1所示。

实施例1

测定液体介质的传热：

(1)样品制备：

将粒径分布在20-80nm的纳米金颗粒溶液铺在洁净的玻璃板上吸附20分钟，之后用超纯水将纳米金颗粒溶液冲洗掉并用N₂吹干。接着将待测定传热的介质甘油)滴在玻璃片上使之包裹在纳米金颗粒周围。

(2)介质传热性能测定：

将经步骤(1)处理的玻璃片固定在瞬态传热显微镜的载物台上。调节纳秒脉冲激光系统的纳秒脉冲激光器4、光参量振荡器5和倍频器6至532nm波长，用以加热待测液体介质和纳米金颗粒。在t＝0时刻打开纳秒脉冲激光器4对待测液体介质和纳米金颗粒进行加热，加热时间5～7ns，使纳米金颗粒的温度升高ΔT(≈5K)。停止加热，调节延迟发生器7，分别在停止加热后延迟Δt＝5μs，15μs...3005μs之后打开脉冲氙灯1和CCD图像采集器2来探测纳米金颗粒的散射光信号，进而得到纳米金颗粒在冷却过程中不同时刻的散射图像，如图2所示。

提取纳米金颗粒冷却过程中不同时刻的散射图像的光强度记为I_Δt，然后将未加热时的纳米金颗粒的散射光强度记为I₀，以(I_Δt-I₀)/I₀对Δt作图(如图2所示)，通过拟合得到热时间常数τ＝156μs，由公式

即可求得待测液体介质的传热系数h＝213W.m^-2.K^-1。图2中，DF表示暗场图像，Δt表示不同的延迟时间。

实施例2

测细胞内介质的传热性能：

(1)样品制备：

将待测细胞在圆形玻片上贴壁生长，将聚乙二醇(PEG)稳定的纳米金颗粒和该细胞混合培养，然后用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗，最后在圆形玻片上滴加PBS溶液防止细胞干瘪。

(2)细胞内介质传热性能测定：

将经步骤(1)处理的圆形玻片固定在瞬态传热显微镜的载物台上。调节纳秒脉冲激光系统的纳秒脉冲激光器4、光参量振荡器5和倍频器6至532nm波长，用以照射细胞加热细胞和细胞内的纳米金颗粒。在t＝0时刻打开纳秒脉冲激光器4对纳米金颗粒进行加热，加热时间5～7ns，使纳米金颗粒的温度升高ΔT(≈5K)。停止加热，调节延迟发生器7，分别在停止加热后延迟Δt＝5μs，15μs...3005μs之后打开脉冲氙灯1和CCD图像采集器2来探测纳米金颗粒的散射光信号，进而得到细胞内不同位置的纳米金颗粒在冷却过程中不同时刻的散射光图像，如图3所示。

如图3所示，提取纳米金颗粒冷却过程中不同时刻的散射图像的光强度记为I_Δt，然后将未加热时的纳米金颗粒的散射光强度记为I₀，以(I_Δt-I₀)/I₀对Δt作图，通过拟合得到热时间常数τ，由公式

即可求得细胞内介质不同位点的传热系数h。图3中，DF表示暗场图像，Δt表示不同的延迟时间。如果将细胞不同时刻的散射图像进行点对点拟合，最终可以绘制出细胞内介质的传热系数分布图(h map)。

本发明以纳米金颗粒为探针，使用纳秒脉冲激光对其进行加热，然后通过暗场显微镜系统和成像系统采集纳米金颗粒在冷却过程中不同时刻的散射图像，最终将传热这一过程量进行成功测定。本发明提供的瞬态微区显微测量系统对于物理和化学领域中液体介质的传热特性以及分子生物学领域中细胞内介质的传热特性等方面的研究具有重要意义。

Claims (8)

1.一种瞬态传热显微镜，其特征在于，该瞬态传热显微镜包括提供待测样品微区温度变化信号的温敏纳米探针、向待测样品提供热扰动的纳秒脉冲激光系统、对所述温敏纳米探针进行显微观察的暗场显微镜系统、进行图像信息采集处理的成像系统和提供延迟触发信号的延迟发生器系统，所述延迟发生器系统分别与所述暗场显微镜系统、成像系统及纳秒脉冲激光系统相连。

2.根据权利要求1所述的瞬态传热显微镜，其特征在于，所述温敏纳米探针为粒径为20-80nm的纳米金颗粒。

3.根据权利要求1所述的瞬态传热显微镜，其特征在于，所述纳秒脉冲激光系统包括依次设置的纳秒脉冲激光器(4)、光参量振荡器(5)、倍频器(6)、第一反射镜(s11)、可变中性密度滤光片(s10)、第二反射镜(s9)和平板分束镜(s6)。

4.根据权利要求1所述的瞬态传热显微镜，其特征在于，所述暗场显微镜系统包括依次设置的脉冲氙灯(1)、多模光纤(s1)、扩束器、第三反射镜(s3)、第一成像物镜(s4)、载物台和第二成像物镜(s5)。

5.根据权利要求1所述的瞬态传热显微镜，其特征在于，所述成像系统包括依次设置的CCD图像采集器(2)、光谱仪(3)、第四反射镜(s8)和长通滤波片(s7)。

6.根据权利要求1所述的瞬态传热显微镜，其特征在于，所述延迟发生器系统包括延迟发生器(7)、监测TTL信号的示波器(8)和将所述延迟发生器(7)分别与所述暗场显微镜系统、成像系统及纳秒脉冲激光系统相连的信号线。

7.一种使用权利要求1～6中任意一项所述的瞬态传热显微镜进行微区热测量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)将表面包裹有待测样品的温敏纳米探针置于载物台上，使用纳秒脉冲激光系统对所述包裹有待测样品的温敏纳米探针加热；

2)通过延迟发生器系统控制暗场显微镜系统和成像系统，获得所述包裹有待测样品的温敏纳米探针在冷却过程中不同时刻的散射光图像。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述通过延迟发生器系统控制暗场显微镜系统和成像系统，获得所述包裹有待测样品的温敏纳米探针在冷却过程中不同时刻的散射光图像的具体方法包括：

a)用纳秒脉冲激光系统对所述包裹有待测样品的温敏纳米探针加热；

b)在步骤a)加热停止后，用延迟发生器系统控制暗场显微镜系统和成像系统每隔时间t_b探测所述包裹有待测样品的温敏纳米探针的散射光信号。

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