CN110687178A

CN110687178A - 一种结核分枝杆菌cfp-10抗原免疫传感器及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110687178A
Application number: CN201910794022.2A
Authority: CN
Inventors: 李金龙; 张永臣; 张侠; 许传军; 胡凯
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital; Second Hospital of Nanjing
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital; Second Hospital of Nanjing
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110687178B

Abstract

本发明通过靶标循环策略和DNA模拟酶信号放大策略构建了一种可以检测结CFP10抗原的免疫传感器，使用该检测器的检测方法具有以下优势：由于适配体与CFP10较强的结合性能，因此本发明具有极强的特异性；由于靶蛋白的循环利用和DNA模拟酶的辣根过氧化物酶活性，实现了较低CFP‑10抗原检测限(0.01ng.ml^‑1)；该方法没有使用到抗体及辣根过氧化物酶等，降低了检测成本。本发明免疫传感器利用该抗原的DNA适配体代替抗体，来实现该抗原的检测，该电化学免疫传感器利用DNA模拟酶作为信号放大元件，由于DNA空间结构较小，可以富集在金纳米颗粒表面，具有产生放大信号的作用，本发明所提出的CFP‑10抗原检测方法在生物医学研究和临床诊断中有着广阔的应用前景。

Description

一种结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器及其制备方法和应用

背景技术

结核分枝杆菌(MTB)感染在经济发展落后的国家及地区形势依然严峻，传染率极高，且容易引起隐蔽性感染，所以发病率和死亡率居高不下。对于结核病的防控，除了需要及时的治疗措施外，早期诊断，早期发现显得尤为重要。因此，建立一种可以灵敏、快速检测结核分枝杆菌的方法和传感器一直是研究的热点，对人类健康具有重要意义。研究者们已经发展了多种诊断方法，如结核分枝杆菌培养、结核菌素皮肤试验和痰涂片显微镜检查法，但都有其非常明显的确定啊。例如，MTB诊断的金标准方法-结核分枝杆菌培养，一般需要一个月甚至数月，对于结核病人的治疗极为不利；结核菌素皮肤试验，其特异性较低，虽然是目前最广泛使用的方法，但不利于结核病的诊断；而痰涂片显微镜检查方法既取决于痰标本的质量，又取决于痰标本的细菌负荷，且灵敏度低。在过去的几年里，虽然人们致力于改进结核病检测方法，灵敏、快速的结核病检测方法仍然是必要的。

为了克服传统方法的缺点，近年来，人们发展了多种检测新技术对结核分枝杆菌抗原进行检测以达到对结核分枝杆菌感染的诊断，如基于表面等离子体共振 (SPR)的方法检测结核分枝杆菌抗原和通过免疫传感器检测CFP10等结核分枝杆菌抗原。其中，基于电化学免疫传感器方法逐渐引起了科研者的兴趣，电化学免疫传感器是利用电极表面的物质的氧化还原反应，产生电子传递，根据电子传递的多少来对电极表面的反应物质进行定量，传统的免疫传感器利用电极表面修饰的酶标记抗体来对抗原进行定量，随着纳米科技的发展，研究者逐渐将纳米材料应用到电化学免疫传感器，可以实现酶的聚集，及各种信号放大策略的实施，因此该方法更具有灵敏度高、操作简单等内在的独特优势。

中国专利CN201110056230.6公开了用于结核病血清学诊断的特异电化学免疫传感器，该免疫传感器是将免疫测定法与高灵敏的传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究，基于前期的抗原标记筛选工作，选定结核分枝杆菌Rv2175c基因编码蛋白(下称特异性抗原)作为特异性抗原，构建高灵敏度电化学免疫传感器,通过检测人体血清中对应该特异抗原的抗体而实现结核病血清学诊断。通过该免疫传感器电流变化差异，该免疫传感器能很好的将健康人和结核病患者区分开，达到血清学诊断目的，但该发明的检应用范围还不够广泛，灵敏度也待提高。

免疫学方法对结核分枝杆菌进行检测，主要通过对抗原的检测实现，结核分枝杆菌抗原种类繁多，但是标志性的抗原主要包括：结核杆菌抗原85A(Ag85A)，结核杆菌抗原85B(Ag85B)、及Ag85A、Ag85B和Ag85C组成的复合体抗原、人培养滤液蛋白10(CFP10)和结核分枝杆菌分泌性蛋白(ESAT6)等，这些抗原的都有一个共同的特点：浓度低，需要灵敏度高的方法进行检测。由于结核分枝杆菌抗原水平很低，现有的传统免疫方法(如ELISA方法)存在检测限的问题，很难检测到如此低浓度的抗原，对于结核病的早期诊断是一个巨大挑战，综上，临床上迫切需要一种高灵敏度的方法来对结核分枝杆菌抗原检测，以达到为结核病的早期诊断提供依据。

因此，本发明构建了一种双信号放大的结核分枝杆菌抗原CFP10检测的电化学免疫传感器，结核病的早期、快速诊断奠定了基础。

发明内容

本发明原理：如附图1所示，首先将CFP-10DNA适配体修饰到电极表面，在能够与CFP-10APT结合的CFP-10抗原存在的情况下，CFP-10APT的构象改变，与CFP1杂交的互补DNA被释放，这时，DCBO-DNA末端的DCBO基团被暴露，然后，与N3-DNA的叠氮化物基团发生点击化学反应，随后，N₃-DNA 与释放的CP-DNA具有相同的碱基序列，能与CFP-10APT结合，在下一个周期释放CFP-10抗原浸入下一个靶蛋白循环过程，靶蛋白的这种循环可以看作是第一步扩增，与N₃-DNA配对后，CFP-10APT的5′悬突暴露，并与AuNPS-DNA 复合物杂交，可产生明显放大的电化学信号，因此，第二次放大可以通过G-四联体-血红素-DNA酶来实现。

本发明所用材料如下：

①CFP-10抗原和ESAT-6抗原购自Cusabio(Houston,TX,USA)；

②牛血清白蛋白(BSA)、对苯二酚(HQ)、TCEP、EDTA、氯化血红素、和6-巯基-1-己醇(MCH)购自Sigma-Aldrich Chemical Co.Ltd；

③痰标本取自南京市公共卫生医疗中心检验科，样本预处理：用小量杯取 1ml新鲜痰样本加入到含有2ml痰样本处理溶液的量杯中，剧烈震荡，室温下孵育10分钟；

④本实验中所用的DNA寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成；

序列如下(5′至3′端)：

SEQ ID NO.1：Dibenzocyclooctyne(DBCO)-DNA,

SH-CGTACAACCAAC-DBCO；

SEQ ID NO.2：CFP-10aptamer(CFP-10Apt)：

TCCTGAAAGGGGCCTGCCCCACTATCTCACATGGGGTTCAGTTGGTTGTACG；

SEQ ID NO.3：Complementary probe(CP)：

TGAACCCCATGTGAGATAGTGGGGCAGGCCCCTTTCAGGA；

SEQ ID NO.4：DNA 1,TGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-SH；

SEQ ID NO.5：DNA 2,GGGGCAGGCCCCTTTCAGGATTTTTT-SH；

SEQ ID NO.6：azide(N₃)-DNA,N₃-TGAACCCCATGTGAGATAGT；

其中：DNA1是能够与适配体末端部分序列相结合的连接探针；DNA2是富含G碱基序列的DNA；CFP-10APT中的斜体字母碱基序列可以与CFP-10抗原结合。

为达到上述目的，本发明首先提供了一种结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器，本发明通过靶标循环策略和DNA模拟酶信号放大策略构建了一种可以检测结CFP10抗原的免疫传感器。

然后，本发明提供了该结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器的制备方法，具体如下：

1.制备AuNP_S-DNA复合物

1)将两种不同的巯基化寡核苷酸经TCEP活化1-3h，得活化后的DNA溶液；

2)在步骤1)得到的活化后的DNA溶液中加入0.5-2mL的AuNPs，静置 10-14h后，再加入NaCl，并在37℃下轻轻摇动，使氯化钠浓度达到0.3-0.8M，然后离心10-30min，冲洗去除未结合的DNA，制得AuNP_S-DNA复合物储，存在4℃备用；

2.构建电化学免疫传感器

1)制备金电极

a)金电极用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；

b)将步骤2-1)-a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；

c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极 2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0 到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号；2)将步骤1)制得的金电极浸入含有 0.6-2μm的DBCO-DNA缓冲液中孵育8-16h，然后用含有0.5-2mM MCH的水溶液处理20分钟；

3)用去离子水进一步多次冲洗步骤2)制得的电极并用氮气吹干燥，再将电极轻轻浸入含有0.1-1μm的CFP-10适配体、捕获-DNA混合的溶液中孵育 0.5-2h，用去离子水清洗干净，最后将电极浸入含有不同浓度的结核分枝杆菌 CFP-10抗原和N3-DNA(0.25μm)溶液中，在37℃孵育40min，制得电极备用；

4)将8-12μl步骤1制得的AuNP_S-DNA复合物滴加在步骤2-3)制得的电极表面，保持37℃，0.5-2h，用PBS和去离子水依次清洗后，用氮气吹干；

5)将hemin溶液滴加在上述电极表面，37℃，1-3h，形成DNA模拟酶，实现DNA模拟酶的富集；

3.电化学免疫传感器的检测

1)工作电极为金电极，在660E电化学分析仪上进行电化学测量，差分脉冲伏安法(DPV)在PBS中进行，而电化学阻抗谱(EIS)实验在铁氰化钾复合溶液和硝酸钾中进行，实验参数如下：对于DPV实验，扫描范围为-0.1V至0.2V；

优选地，步骤1-1)中两种不同的巯基化寡核苷酸具体浓度、用量和比值为： 10μm，80-120μl，DNA1：DNA 2摩尔比＝1:10；

优选地，步骤1-1)中TCEP的浓度为50mm；

优选地，步骤1-2)中，离心速度为12000rpm/min；

优选地，步骤1-2)中，用10mM PBS，pH7.4冲洗；

优选地，步骤2-1)-a)中的金电极直径为φ＝3mm；

步骤2-1)-b)中的水虎鱼溶液为[V(H₂SO₄)：(30％H₂O₂)＝3：1]；

优选地，步骤2-1)-c)中的硫酸浓度为0.5M；

优选地，步骤2-3)中的捕获-DNA浓度为0.5μm；

步骤2-5)中hemin溶液为[25mM HEPES,50mM KCl,200mM NaCl,12.5 mM MgCl₂]，用量为8-15μL；

优选地，步骤3-1)中PBS为0.1m，含1.0mM过氧化氢和0.2mM对苯二胺；

优选地，步骤3-1)中5mM铁氰化钾复合溶液位5mM和硝酸钾为1M；

其次，本发明提供了用该结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器检测CFP-10 抗原的检测方法。

最后，本发明提供了该结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器及其检测方法在生物医学研究和临床诊断中的应用。

本发明的有益效果

(1)因为CFP-10抗原的浓度很低，本发明应用双重信号放大策略可实现极低的检出限；

(2)本发明不需要CFP10抗体，避免了昂贵抗体的购买，降低检测成本；

(3)本发明分析过程比较简单，因为该检测方法可以在无蛋白酶系统的恒温条件下操作。

附图说明

附图1为免疫传感器的设计原理图。

附图2为实验例1中AuNPs-DNA的表征结果图。

附图3为实验例2中电极修饰过程的表征结果图。

附图4为实验例3中DBCO-DNA浓度影响结果图。

附图5为实验例3中CFP-10Apt浓度的影响。

附图6为实验例3中DNA 1/DNA 2比率的影响。

附图7为实验例3中TE缓冲液pH的影响。

附图8为实验例3中CFP-10孵育时间的影响。

附图9为实验例3中Hemin孵育时间的影响。

附图10为实验例4中不同浓度CFP-10(ng.ml-1)的DPV曲线图。

附图11为实验例5中BSA、ESAT-6和CFP-10存在时DPV峰值电流的比较图。

附图12为实验例6中在用生物样品培养的修饰电极上获得的DPV结果图。

附图13为实验例6中该方法与酶联免疫吸附测定法的比较

具体实施方式

实施例1结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器的制备

1.制备AuNP_S-DNA复合物

1)将两种不同的巯基化寡核苷酸(10μm，100μl，DNA1/DNA 2摩尔比＝1:10) 经TCEP(50mm)活化2h，得活化后的DNA溶液；

2)在步骤1)得到的活化后的DNA溶液中加入1mL的AuNPs，静置12h 后，再加入NaCl，并在37℃下轻轻摇动，使氯化钠浓度达到0.5m，然后离心 20min(12000rpm/min)，冲洗3次(10mM PBS，pH7.4)，去除未结合的DNA，制得AuNP_S-DNA复合物储，存在4℃备用；

2.构建电化学免疫传感器

1)制备金电极

a)金电极(φ＝3mm)用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；

b)将步骤2-a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；

c)再将电极用50％硝酸浸泡20min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极 2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0 到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号；2)将步骤1)制得的金电极浸入含有1μm 的DBCO-DNA缓冲液中孵育12h，然后用含有1mM MCH的水溶液处理20分钟；

3)用去离子水进一步多次冲洗步骤2)制得的电极并用氮气吹干燥，再将电极轻轻浸入含有0.5μm的CFP-10适配体、捕获-DNA(0.5μm)混合的溶液中孵育1h，用去离子水清洗干净，最后将电极浸入含有不同浓度的结核分枝杆菌CFP-10抗原和N3-DNA(0.25μm)溶液中，在37℃孵育40min，制得电极备用；

4)将10μl步骤2制得的AuNP_S-DNA复合物滴加在步骤3-3)制得的电极表面，37℃，1.5h，用PBS和去离子水依次清洗三次后，用氮气轻轻吹干，

5)10μL hemin溶液(25mM HEPES,50mM KCl,200mM NaCl,12.5mM MgCl₂)滴加在上述电极表面，37℃，2h，形成DNA模拟酶，实现DNA模拟酶的富集。

实施例2电化学免疫传感器的检测

工作电极为金电极，在660E电化学分析仪上进行电化学测量，差分脉冲伏安法(DPV)在0.1mPBS(含1.0mM过氧化氢和0.2mM对苯二胺)中进行，而电化学阻抗谱(EIS)实验在5mM铁氰化钾复合溶液和1m硝酸钾中进行。实验参数如下：对于DPV实验，扫描范围为-0.1V至0.2V。

实验例1AuNPs-DNA的表征

如图2中A、B分别显示了合成AuNPs和AuNPs-DNA的TEM图像。结果表明，AuNP为单分散球形颗粒，粒径分布较窄,AuNP与AuNP-DNA复合物的形态和分散性无明显差异。动态光散射(DLS)被用来分析AuNP和AuNP-DNA 复合物的流体动力学直径。如图2中A、B的插图所示，AuNP和AuNP-DNA 复合物的直径约为12.6和20.4纳米。由于DNA模拟酶在本发明中起了产生信号放大的作用，因此本实验例首先利用紫外-可见分光光度法对是否成功合成了 AuNPs-DNA进行了验证，理论上讲，由于金纳米颗粒表面被修饰了DNA，那么经过紫外分光光度计测量后，会在260nm处产生一核酸峰，而且由于金纳米颗粒表面由于修饰了DNA，其原有的紫外分光图会发生位移和偏振，正如图2C 所示，与AuNPs的紫外-可见光谱(曲线A)相比，AuNPs-DNA复合物在260nm 处可检测到一个较强的紫外吸收峰，吸收峰(曲线B)的形状、位置和对称性有明显的变化。综上结果显示，能够产生信号的寡核苷酸已经成功的修饰在了金纳米颗粒表面，本实验例表明AuNPs-DNA成功合成。

实验例2电极修饰过程的表征

免疫传感器的构建过程中，每一步中的DNA及抗原分子是否成功的结合在了电极表面需要验证，以证明本发明成功构建了电化学免疫传感器，为了验证电极的修饰过程，本实验例选择用电化学阻抗谱法(EIS)来验证修饰过程。如附图3显示了不同处理下电极的EIS图。裸金电极在EIS中呈直线(曲线a)，用 mch处理后，EIS图谱中出现一个小半圆(曲线b)。进一步验证该过程，将电极与捕获-DNA和CFP10-适配体共孵育后，半圆直径进一步增大(曲线c)，表明 CFP10-APT与DBCO-DNA结合。随后，在含有N3-DNA和AUNPS-DNA复合物的电极上孵育，并没有明显改变阻抗(曲线d)，这是因为在没有CFP-10抗原的情况下，AuNPs-DNA复合物不能与CFP10-APT结合。然而，在存在CFP-10 抗原的情况下，由于CFP-10与AuNPs-DNA复合物结合，半圆形的直径显著增加(曲线e)，以上结果表明电极的修饰过程是成功的；

其中，图3.(a)裸金电极，(b)经dbco-dna和mch处理的电极，(c)经cp-dna 和cfp-10-apt处理的电极，(d)经cp-dna、cfp-10-apt、n3-dna和aunps-dna复合物处理的电极，以及(e)经cp-dna处理的电极，cfP-10APT、CFP-10、N3-DNA 和AuNPS DNA复合物。inset是等效电路。Rs、Ret、W和Q分别代表溶液电阻、电荷转移电阻、华宝阻抗和恒相元件。

实验例3免疫传感器检测条件优化

附图4为DBCO-DNA浓度的影响结果图；附图5为CFP-10Apt浓度的影响结果图；附图6为DNA 1/DNA 2比率的影响结果图；附图7为TE缓冲液pH 的影响结果图；附图8为CFP-10孵育时间的影响结果图；附图9为Hemin孵育时间的影响结果图。以上所有结果误差线为三次独立重复实验的标准差。

免疫传感器的原理是利用电极表面酶催化的氧化还原反应，产生电子，而产生相应的电流信号，来实现对靶分子的检测，具有高灵敏、快速的作用，因此每一个影响免疫传感器的组件都要进行最适化定量。为了获得最佳的检测性能，本实验例优化了以下参数：(a)dbco-dna的浓度；(b)cfp-10apt的浓度；(c)dna 1/dna 2的比值；(d)te-butter的酸碱度；(e)cfp-10的孵育时间；(f)hemin的孵育时间。实验结果表明：(a)dbco-dna的浓度约为1.0μm(图4)；(b)cfp-10apt的浓度约为0.5μm(图5)；(c)dna 1/dna 2的比值约为1:10(图6)；(d)te的pH 约为7.4(图7)；(eCFP-10的孵育时间约为40分钟；(图8)；(f)血红素的孵育时间约为2小时(图9)。

实验例4CEP-10抗原测定

附图10为不同浓度CFP-10(ng.ml-1)的DPV曲线：(a)0.01，(b)0.05， (c)0.1，(d)0.5，(e)1，(f)5，(g)10，(h)50和(i)100ng.ml-1in 0.1m PBS(pH7.4)，含有1.0mm H2O2和0.2mm HQ。插图是校准图，误差条表示三个独立实验的标准差。

结核分枝杆菌具有低浓度的特点，且病人痰标本的多少，及取痰的部位都会对结果造成影响，因此本检测方法中拟对病人痰液标本中的抗原成分——CEP-10抗原进行分析，以期实现对结核分枝杆菌感染的超灵敏诊断，达到对结核病人的早期诊断和治疗，从而提高结核病的诊断率，提高结核病人的治愈率。在本实验例中发现从0.01ng.ml^-1到100ng.ml^-1范围内(图10)，可以观察到较强的电流峰值信号逐渐增大，抗原浓度越高，信号俞强。进一步研究发现 CEP-10抗原浓度的对数与电流信号呈线性关系，通过origin软件模拟了该曲线的方程式为：y＝-1.33x-4.52，相关系数为r²＝0.996。其中y为DNA模拟酶产生的电流峰值信号，x为结核分枝杆菌抗原CFP10的对数值，根据信噪比3(S/N＝3)，计算检测限为0.01ng.ml^-1，该实验例结果对于痰溶液中低浓度的抗原特别重要，为超灵敏的检测结核分支杆菌抗原奠定了强大的基础，特别适用于低水平结核抗原CFP10的定量分析。

实验例5选择性试验

图11.BSA、ESAT-6和CFP-10存在时DPV峰值电流的比较，所有目标均为100ng.ml^-1，误差条代表三次测量的标准偏差，空白对照：10mm PBS(pH7.4)。

一种免疫学检测方法，除了应该具有上述良好的灵敏度外，还应具有良好的特异性，稳定性。传统的方法中一般选择与靶抗原相近的蛋白作为干扰物来评价方法的特异性，因此为了评价该免疫传感器的选择性，本实验例选择了小牛血清白蛋白(BSA)、HSA和结核分枝杆菌Ag85A抗原作为干扰蛋白。理论上，只有含有靶抗原的样本才能获得较强的信号，经过反复的实验验证，表明实施例2 构建的电化学免疫传感器能够对含有CFP10的样本产生很强信号(图11)。相反，这些干扰蛋白(BSA、HAS、Ag85A)不会产生强的信号。通过上述的实施例表明，本实验例构建的免疫学检测方法不但具有良好的灵敏度，而且具有较强的特异性，因此，本发明的基于双信号放大策略的免疫传感器可用于检测CFP10抗原。

实验例6本发明与现有技术的比较

为了进一步探讨该免疫传感器在复杂样本中的实际应用，本实验例采用该方法检测了南京市公共卫生医疗中心结核病患者及健康志愿者痰标本中的CFP-10 抗原的浓度。如图12所示，结核病患者的CFP-10抗原水平(曲线c)远高于健康志愿者(曲线b)。为了评价该方法的可靠性，将该方法检测痰标本中CFP-10 抗原的结果与酶联免疫吸附试验(ELISA)的参考值进行了比较。如图13所示，用酶联免疫吸附法测得的估计值与我们的方法几乎相同，表明其准确度可接受，结果如表1所示。

表1

附图12在用生物样品培养的修饰电极上获得的DPV。分别从健康志愿者(b) 和结核病人(c)中抽取痰样本。(a)空白对照：10mm PBS(pH7.4)。

附图13为该方法与酶联免疫吸附测定法的比较。1：空白对照：10mM PBS (pH7.4)；2-7:6份健康志愿者痰标本；8-13:6份结核病患者痰标本。误差条表示三个独立实验的标准差。

综上，本发明通过靶标循环策略和DNA模拟酶信号放大策略构建了一种可以检测结CFP10抗原的免疫传感器。该检测方法具有以下优势：首先，由于适配体与CFP10较强的结合性能，因此本发明具有极强的特异性。第二，由于靶蛋白的循环利用和DNA模拟酶的辣根过氧化物酶活性，实现了较低CFP-10抗原检测限(0.01ng.ml^-1)(如表1所示)。第三，该方法没有使用到抗体及辣根过氧化物酶等，降低了检测成本。传统的免疫学方法检测抗原，一般通过酶标记抗体来实现，而本免疫传感器利用该抗原的DNA适配体代替抗体，来实现该抗原的检测，具有很多的优势，首先抗体价格昂贵，不利于结核病人的诊疗，其次，抗体的储存条件较苛刻，一般需要储存在-20℃，如果将其放在4℃，两周左右，其抗体滴度降低严重，而本电化学免疫传感器利用DNA作为抗原结合元件，在室温下储存一个月依然可以达到稳定的结合功能。最后，该电化学免疫传感器利用DNA模拟酶作为信号放大元件，由于DNA空间结构较小，可以富集在金纳米颗粒表面，具有产生放大信号的作用，这是传统的辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶所不具备的。鉴于上述优点，基于本发明所提出的CFP-10抗原检测方法在生物医学研究和临床诊断中有着广阔的应用前景。

序列表

<110> 南京市第二医院鼓楼医院

<120> 一种结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器及其制备方法和应用

<141> 2019-08-26

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtacaacca ac 12

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctgaaagg ggcctgcccc actatctcac atggggttca gttggttgta cg 52

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaaccccat gtgagatagt ggggcaggcc cctttcagga 40

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgggtagggc gggttgggtt tttt 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggcaggcc cctttcagga tttttt 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgaaccccat gtgagatagt 20

Claims

1.一种结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器，其特征在于，该传感器通过靶标循环策略和DNA模拟酶信号放大策略构建而成，是检测结CFP10抗原的免疫传感器。

2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)制备AuNP_S-DNA复合物

2)在步骤1)得到的活化后的DNA溶液中加入0.5-2mL的AuNPs，静置10-14h后，再加入NaCl，并在37℃下摇动，使氯化钠浓度达到0.3-0.8M，然后离心10-30min，冲洗去除未结合的DNA，制得AuNP_S-DNA复合物储，存在4℃备用；

(2)构建电化学免疫传感器

1)制备金电极

a)金电极用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；

c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号；

2)将步骤1)制得的金电极浸入含有0.6-2μm的DBCO-DNA缓冲液中孵育8-16h，然后用含有0.5-2mM MCH的水溶液处理20分钟；

3)用去离子水进一步多次冲洗步骤2)制得的电极并用氮气吹干燥，再将电极轻轻浸入含有0.1-1μm的CFP-10适配体、捕获-DNA混合的溶液中孵育0.5-2h，用去离子水清洗干净，最后将电极浸入含有不同浓度的结核分枝杆菌CFP-10抗原和N3-DNA(0.25μm)溶液中，在37℃孵育40min，制得电极备用；

(3)电化学免疫传感器的检测

1)工作电极为金电极，在660E电化学分析仪上进行电化学测量，差分脉冲伏安法(DPV)在PBS中进行，而电化学阻抗谱(EIS)实验在铁氰化钾复合溶液和硝酸钾中进行，实验参数如下：对于DPV实验，扫描范围为-0.1V至0.2V。

3.如权利要求2所述的结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器的制备方法，其特征在于，5′至3′端序列如下：

SEQ ID NO.1：Dibenzocyclooctyne(DBCO)-DNA,

SH-CGTACAACCAAC-DBCO；

SEQ ID NO.2：CFP-10aptamer(CFP-10Apt)：TCCTGAAAGGGGCCTGCCCCACTATCTCACATGGGGTTCAGTTGGTTGTACG；

SEQ ID NO.3：Complementary probe(CP)：TGAACCCCATGTGAGATAGTGGGGCAGGCCCCTTTCAGGA；

SEQ ID NO.4：DNA 1,TGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-SH；

SEQ ID NO.5：DNA 2,GGGGCAGGCCCCTTTCAGGATTTTTT-SH；

SEQ ID NO.6：azide(N₃)-DNA,N₃-TGAACCCCATGTGAGATAGT。

4.如权利要求2所述的结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器的制备方法，其特征在于：

步骤1-1)中两种不同的巯基化寡核苷酸具体浓度、用量和比值为：10μm，80-120μl，DNA1：DNA 2摩尔比＝1:10；

步骤1-1)中TCEP的浓度为50mm；

步骤1-2)中，离心速度为12000rpm/min；

步骤1-2)中，用10mM PBS，pH7.4冲洗；

步骤2-1)-a)中的金电极直径为φ＝3mm；

步骤2-1)-c)中的硫酸浓度为0.5M；

步骤2-3)中的捕获-DNA浓度为0.5μm；

步骤2-5)中hemin溶液为[25mM HEPES,50mM KCl,200mM NaCl,12.5mM MgCl₂]，用量为8-15μL；

步骤3-1)中PBS为0.1m，含1.0mM过氧化氢和0.2mM对苯二胺；

步骤3-1)中5mM铁氰化钾复合溶液位5mM和硝酸钾为1M。

5.一种用如权利要去1所述的结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器检测CFP-10抗原的检测方法。

6.如权利要求1所述的核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器和权利要求3所述的检测方法在生物医学研究和临床诊断中的应用。