CN102192984A

CN102192984A - 用于结核病血清学诊断的特异电化学免疫传感器

Info

Publication number: CN102192984A
Application number: CN2011100562306A
Authority: CN
Inventors: 谢建平; 周培富; 袁若; 袁亚利
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2011-03-09
Publication date: 2011-09-21

Abstract

用于结核病血清学诊断的特异电化学免疫传感器，属于重要传染病防治领域。免疫传感器是将免疫测定法与高灵敏的传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究。基于前期的抗原标记筛选工作，选定结核分枝杆菌Rv2175c基因编码蛋白（下称特异性抗原）作为特异性抗原，构建高灵敏度电化学免疫传感器,通过检测人体血清中对应该特异抗原的抗体而实现结核病血清学诊断。方法如下：⑴克隆结核分枝杆菌H37Rv中Rv2175c基因；⑵在大肠杆菌中异源表达纯化特异性抗原；⑶利用特异抗原在兔子中制备抗体血清作为阳性对照；⑷制备电化学免疫传感器；⑸健康人和结核病人血清检测。通过免疫传感器电流变化差异，该免疫传感器能很好的将健康人和结核病患者区分开，达到血清学诊断目的。

Description

用于结核病血清学诊断的特异电化学免疫传感器

技术领域

本技术涉及特异性电化学免疫传感器和结核病免疫学诊断领域。

背景技术

结核病是严重威胁人类健康的重要慢性传染病。据WHO最新发布的研究报告：2008年度，全球新增结核病感染者940万（其中15%为HIV阳性），结核病患病者1110万，因结核病导致死亡者110万。如果以这样的趋势继续发展，到2015年，全球新增结核病感染者将达到1000万。结核分枝杆菌与HIV共感染，耐多药及广谱耐药结核菌的出现及蔓延更加激了全球结核病防治任务。

诊断是治疗的前提，但目前的诊断技术手段极大的束缚了结核病的控制。目前结核病的诊断方法主要包括影像学、微生物学、免疫学和分子生物学诊断。这些方法具备不同的检测灵敏性和特异性，且针对不同类型的患者各具长短。近年来，基于特异性抗原-抗体反映的血清学免疫诊断因其耗时短，方法简单，样品容易获得及适应人群广泛等优点而备受青睐。开发高特异性和高灵敏性的诊断方法主要依赖于抗原-抗体及检测方法的选择。血清学免疫诊断主要包括基于抗体免疫反应检测针对结核菌的特异性抗体，基于T细胞介导的细胞免疫的检测如γ干扰素检测或直接检测结核菌特异性抗原如脂阿拉伯甘露糖等。但在2008年，WHO/TDR在同一实验室对目前可商业购买的19个快速结核病检测试盒进行了调研，参考分支杆菌培养及临床跟踪结果得到它们的灵敏性和特异性分别介于0.97%-59.7%和53%-98.7%，并强调这些诊断试剂盒不能被推荐使用于结核病诊断。

电化学免疫传感器是将免疫测定法与高灵敏的电化学传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究。能识别较大分子之间的微小差异，具有很强的专一性。其工作原理和传统的免疫测试法相似，都属于固相免疫测试法，即把抗原或抗体固定在传感器表面，通过传感技术将抗原抗体发生吸附时产的电流变化转变成可检测的信号来测定样品中待测分子的浓度。经过多年的研究，该技术已经成功运用于药物如恩氟沙星；毒素如黄曲霉毒素B，黄曲霉毒素M1，赫曲毒素A，磷酸化乙酰胆碱酯酶；生物素；细菌如鼠伤寒沙门(氏)菌；病毒；激素如human chorionic gonadotrophin (hCG)，霍尔蒙17 β-雌二醇，睾酮；抗体如癌胚抗原，前列腺特异抗原，α-1-胎儿球蛋白；抗体如人体血清中IgG，针对组织转谷氨酰胺酶抗体；细胞因子如IL-12等的检测。这些电化学免疫传感器的检测最低浓度可达到纳克甚至皮克级，具有很高的灵敏度。

发明内容

免疫传感器是将免疫测定法与高灵敏的传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究。基于前期的抗原标记筛选工作，选定结核分枝杆菌Rv2175c基因编码蛋白（下称特异性抗原）作为特异性抗原，构建高灵敏度电化学免疫传感器, 通过检测人体血清中对应该特异抗原的抗体而实现结核病血清学诊断。

本发明提出的电化学免疫传感器含有结核菌特异性抗原以及电化学检测装置，所述的结核菌特异性抗原是结核菌特异性抗原Rv2175c。

其中结核菌特异性抗原Rv2175c是通过以下方式制备获得：⑴ 克隆结核分枝杆菌H37Rv中Rv2175c基因；⑵在大肠杆菌中异源表达纯化特异性抗原。

电化学免疫传感器是通过以下制备方式获得：首先，将奈酚分散的多壁碳纳米管修饰在裸玻碳电极表面（奈酚带负电）行成一层带负电荷的膜层；然后通过静电吸附作用将带正电荷的亚甲基蓝（起氧化还原探针的作用）固定在电极表面；接着在电极表面电沉积一层纳米金，能特异蛋白表面带有大量的氨基发挥键合作用而将其固载在电极表面；用牛血清白蛋白来封闭没有被特异蛋白没占据的纳米金活性位点。

本发明通过检测血清中是否含有与特异蛋白结合的特异性抗体，判断是否为结核病患者（当结核病特异性抗体与电极表面抗原结合时，其电堕性将阻碍电子传递，从而使得电极表面亚甲蓝所产生的氧化还原峰电流减小。通过结合前后电流的变化就可以定性检测血清中是否含有针对结核菌特意抗原的抗体）。

附图说明

图1的图1(a),图1(b),图1(c)电化学免疫传感器检测结果。

具体实施方式

1、Rv2175c基因的克隆

利用引物对2715a (5’-AGCCTAGGATCCATGCCTGGCC-3’，下划线部分为BamHI限制性酶切位点) 和 2715b (5’-GAGAAGCTTCTGCAACCCCGGT-3’; 下划线部分为HindIII限制性酶切位点)将开放阅读框Rv2175c从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出来；

扩增产物用BamHI和HindIII进行酶切，连接到经过相同内切酶酶切的pET28a质粒载体上；

转化大肠杆菌DH5α经过PCR鉴定，测序验证后得到得到重组质粒pET28a-rv2175c（测序结果显示蛋白质的第21位的天冬氨酸突变成了谷氨酸，目前的研究文献没有提及该氨基酸在该蛋白中发挥了特殊的功能，因此继续进行下一步的实验研究）。

2、 Rv2175c编码蛋白的表达及纯化

将重组质粒pET28a-rv2175c转化进入大肠杆菌BL-21(DE3)，PCR鉴定后；

用终浓度0.1 mM IPTG小规模诱导，检测发现其表达量较高，以可溶性和包涵体两种形式表达；

大规模诱导表达，并利用Qiangen公司的镍亲和层析柱，参考其方法进行纯化，其中上样缓冲液，杂蛋白系统液和目的蛋白洗脱也中的咪唑浓度分别为10mM, 20 mM和250 mM。

3、兔多克隆抗体制备

利用200ug特异性抗原（Rv2175c编码蛋白）皮下初次免疫1只新西兰大白兔；14天后再进行一次皮下加强免疫，免疫量为200ug；10天后再进行一次皮下加强免疫，免疫量为200ug；7天后耳静脉取血，测效价，效价未达要求；5天后再再进行一次皮下加强免疫，免疫量为200ug；9天后耳静脉取血，测效价，效价达到要求（大于1:51200），颈动脉取血，离心收集多抗血清，共收集30ml，按每ml量分装后于-80℃冻存备用。

4、电化学免疫传感器的制备

将3ul奈酚分散的多壁碳纳米管修饰于洁净玻碳电极表面，室温干燥；

将电极浸入5mM亚甲基蓝溶液20分钟；

在电极表面电沉积一层纳米金；

滴加10ul 30ug/ml特异抗原于电极表面，4℃孵育6小时；

将电极浸入0.25%牛血清白蛋白溶液20分钟；

用洗脱缓冲液充分洗脱电极并于潮湿环境下保存。

5、血清样品的检测

将制备好的电化学免疫传感器浸入10倍稀释血清，孵育1小时；

用洗脱缓冲液充分洗涤电极；

将电极放入含有3ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)的电化学小池（electrochemical cell）中；

以50 mV/s的扫描速度记录从-0.6~0 V区间的循环伏安图；

图形数据分析。

本发明利用特异抗原在兔子中制备抗体血清作为阳性对照。在对健康人和结核病人血清检测中，通过免疫传感器电流变化差异，该免疫传感器能很好的将健康人和结核病患者区分开，达到血清学诊断目的。

使用本电化学免疫传感器进行检测的结果如图1所示，(a),(b),(c)分别为利用电化学免疫传感器对健康人血清（10人份混合），结核病患者血清（10人份混合）和针对特异性抗原的兔免疫血清进行孵育半小时前后的循环伏安图：黑线代表孵育前电流，红线代表孵育后电流，可以看出三者的电流变化差异△I分别为：3μA，14μA和9μA。

Claims

1.一种用于结核病血清学诊断的特异电化学免疫传感器，其特征在于含有结核菌特异性抗原以及电化学检测装置，所述的结核菌特异性抗原是结核菌特异性抗原Rv2175c。

2.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，它是通过以下制备方式获得：首先将奈酚分散的多壁碳纳米管修饰在裸玻碳电极表面行成一层带负电荷的膜层；然后通过静电吸附作用将带正电荷的亚甲基蓝固定在电极表面；接着在电极表面电沉积一层纳米金，将结核菌特异性抗原Rv2175c固载在电极表面；最后用牛血清白蛋白来封闭没有被结核菌特异性抗原Rv2175c占据的纳米金活性位点；

据的纳米金活性位点；亚甲基蓝（起氧化还原探针的作用）。

3.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征是，所述结核菌特异性抗原Rv2175c是通过以下方式制备获得：

（1）克隆结核分枝杆菌H37Rv中Rv2175c基因；其利用的引物对是2715a (5’-AGCCTAGGATCCATGCCTGGCC-3’ )和 2715b (5’-GAGAAGCTTCTGCAACCCCGGT-3’);，将开放阅读框Rv2175c从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出来；将扩增产物用BamHI和HindIII进行酶切，连接到经过相同内切酶酶切的pET28a质粒载体上，得到重组质粒pET28a-rv2175c；

（2） Rv2175c编码蛋白的表达及纯化：将重组质粒pET28a-rv2175c转化进入大肠杆菌BL-21(DE3)，进行表达和纯化，得到结核菌特异性抗原Rv2175c。