CN104931475A - 一种药材中总重金属含量检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药材中总重金属含量检测的方法。首先建立药材中总重金属含量检测的模型,得到线性标准曲线Ⅰ的方程和线性标准曲线Ⅱ的方程;然后将待测药材与HEPES缓冲溶液和荧光探针溶液混合反应后,测定反应体系的荧光强度值,将其荧光强度比值I450/I380代入线性标准曲线Ⅰ的方程中,得到待测药材中金属离子浓度C值;再将待测药材中金属离子浓度C值代入线性标准曲线Ⅱ的方程中,即得到测药材中总金属含量。本发明中药材中重金属离子与荧光探针结合,对药材进行荧光标定,利用荧光探针的反应灵敏、快速的优点,测定药材中总重金属含量准确,操作简便、用时短。
Description
技术领域
本发明涉及一种药材中总重金属含量检测的方法,具体涉及一种建立荧光探针标记法药材中总重金属含量检测的数学模型的方法和利用模型测定药材中总重金属含量检测的方法,属于中药材质量全检测领域。
背景技术
重金属通常是指比重大于5g·cm-3的一类金属元素,如铜、镉、金、银、铅、锌、镍、钴、铬和汞等。目前随着城市化工业化进程的加快,环境污染日益加剧,使中药材重金属含量日益增高,中药材品质降低,严重危害人体健康。重金属可以通过空气、水、食物等渠道进入体内,与体内有机成分、蛋白质、核糖、维生素、激素、生物酶等结合成或反应,使其丧失或改变了原来的生理化学功能而产生病变或表现出毒性,从而对人体造成危害。
目前,重金属的检测方法仍以传统的重金属检测方法如紫外分光光度法、电感耦合等离子体质谱法和高效液相色谱法等为主,所用仪器基本为大型仪器。近年来对于特定金属离子的定性或半定量的荧光检测方法有报道,但不能够快速、简便的进行总重金属的定量测定。
发明内容
本发明的目的是提供一种建立药材中总重金属含量检测的模型的方法,同时本发明还提供了一种药材中总重金属含量检测的模型及其检测的方法,本发明能快速测定药材中总重金属含量。
本发明提供的建立药材中总重金属含量检测的模型的方法,包括如下步骤:
1)取已知等梯度浓度的铅离子溶液,与HEPES缓冲溶液和荧光探针溶液混合得混合液,然后分别测定所述混合液的荧光强度值,以所述混合液的荧光强度比值I450/I380为横坐标,铅离子浓度为纵坐标,绘制出线性标准曲线Ⅰ,得到线性标准曲线Ⅰ的方程;
2)将药材与HEPES缓冲溶液和荧光探针溶液混合反应后,测定反应后体系的荧光强度值,将所述反应后体系的荧光强度比值I450/I380代入所述线性标准曲线Ⅰ的方程,得到所述药材中金属离子浓度C值;
3)用现有方法测定与步骤2)中所述药材的同一批的药材中总重金属含量,以该药材中总重金属含量为纵坐标,以步骤2)中所述药材中金属离子浓度C值为横坐标,绘制出线性标准曲线Ⅱ,得到线性标准曲线Ⅱ的方程,所述线性标准曲线Ⅰ的方程和所述线性标准曲线Ⅱ的方程即为所述药材中总重金属含量检测的数学模型。
本发明中,步骤1)得到的所述线性标准曲线Ⅰ的方程,需要分别考察其稳定性、精密性和重现性。
上述的方法,所述铅离子溶液为硝酸铅溶液;
所述荧光探针溶液中荧光探针的结构式为式Ⅰ所示。
上述的方法,所述铅离子溶液的浓度可为0~5.0mg/L,具体可为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0mg/L,所述铅离子溶液的浓度梯度可为0~1.0mg/L,优选为0.5mg/L;
步骤1)中,所述荧光探针溶液的浓度可为1.6~2mM,优选为1.8mM;
所述HEPES缓冲溶液的浓度为0.75M~1.25M;
所述药材为天麻、丹参、木通、金银花、茯苓、白芥子、栀子、厚朴、青蒿和鹿茸中的至少6种;
步骤2)中,所述荧光探针溶液的浓度可为1.6~2mM,优选为1.8mM;
所述HEPES缓冲溶液(即羟乙基哌嗪乙硫磺酸的缓冲溶液)的浓度可为0.75~1.25M,优选为1.0M。
上述的方法,所述药材、所述荧光探针溶液和所述HEPES缓冲溶液的体积比可为5:3~5:0.5~1.5,优选为5:4:1。
步骤1)和步骤2)中,所述荧光强度值测定的激发波长可为340nm,所述荧光强度值测定的扫描波长可为350~600nm。
本发明中,步骤3)中,所述药材中总重金属含量采用紫外分光光度法测定。
上述的方法,所述药材中总重金属含量检测的数学模型中,所述线性标准曲线Ⅰ的方程如下式Ⅱ所示,
y=0.1165x+0.5413 式Ⅱ
式Ⅱ中,y为所述混合液的荧光强度比值I450/I380,x为所述铅离子的浓度;
所述线性标准曲线Ⅱ的方程如下式Ⅲ所示,
z=1.2335x+28.355 式Ⅲ
式Ⅲ中,x为与步骤2)中所述药材中金属离子浓度C值,z为与步骤2)中所述药材同一批的药材中总重金属离子浓度。
本发明还提供了一种载体,其上记载了上述的方法建立的药材中总重金属含量检测的模型。
本发明进一步提供了一种药材中总重金属含量检测的方法,包括如下步骤:1)将待测药材与HEPES缓冲溶液和荧光探针溶液混合反应后,测定反应体系的荧光强度值;
2)采用权利要求6所述药材中总重金属含量检测的数学模型,将所述待测药材的荧光强度比值I450/I380代入所述线性标准曲线Ⅰ的方程中,得到所述待测药材中金属离子浓度C值;再将所述待测药材中金属离子浓度C值代入所述线性标准曲线Ⅱ的方程中,即得到所述测药材中总金属含量。
上述的方法,所述待测药材可为天麻、丹参、木通、金银花、茯苓、白芥子、栀子、厚朴、青蒿或鹿茸;
所述荧光探针溶液中荧光探针的结构式为式Ⅰ所示;
所述荧光探针溶液的浓度可为1.6~2mM,优选为1.8mM;
所述HEPES缓冲溶液的浓度可为0.75~1.25M,优选为1.0M。
上述的方法,所述待测药材、所述HEPES缓冲溶液和所述荧光探针溶液的体积比可为5:3~5:0.5~1.5,优选为5:4:1;
所述反应体系的荧光强度值测定的激发波长可为340nm,所述反应体系的荧光强度值测定的扫描波长可为350~600nm。
本发明药材中总重金属含量检测的数学模型应用于采用荧光探针测定药材中重金属含量中。
本发明中,药材中重金属离子与荧光探针结合,对药材进行荧光标定,利用荧光探针的反应灵敏、快速的特点,建立了药材中重金属离子含量测定的模型,利用该模型测定待测药材中总重金属含量。
本发明具有以下优点:
本发明中药材中重金属离子与荧光探针结合,对药材进行荧光标定,利用荧光探针的反应灵敏、快速的优点,建立了药材中重金属离子含量测定的模型,利用该模型测定待测药材中总重金属含量,对药材含量进行测定;本发明测定药材中总重金属含量准确,操作简便、用时短。
附图说明
图1为本发明实施例1中线性标准曲线Ⅰ。
图2为本发明实施例1中线性标准曲线Ⅱ。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的仪器:LD-250中药打粉机(长沙长宏药机,中国),SB-800DTD超声仪(宁波新芝生物科技有限公司,中国),WD-9403C紫外分析仪(北京市六一仪器厂,中国),F-4500荧光光度计(日立,日本)。
下述实施例中试剂:乙腈(分析纯),硝酸铅标准品;
荧光探针结构如式Ⅰ。
实施例1、药材中总重金属含量检测的数学模型的建立
一、溶液的配制
荧光探针溶液的配制:精密称取荧光探针晶体0.380g使其完全溶于乙腈中,置于1L容量瓶中,然后加入乙腈定容,得到浓度为1.8mM的荧光探针溶液,在紫外光下该荧光探针溶液显绿色荧光。4℃避光保存,备用。
HEPES缓冲溶液配制:精密称取11.915g HEPES粉末,加入40ml纯水使其溶解,将pH值调至7.0,纯水定容至50ml,得到浓度为1.0M的HEPES缓冲溶液,4℃保存,备用。
硝酸铅溶液配制:称取不同质量的硝酸铅标准品分别溶于乙腈中,配制成硝酸铅溶液的浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5mg/L,备用。
药材溶液配制:分别称取0.5g的天麻、丹参、木通、金银花、茯苓、白芥子、栀子、厚朴、青蒿和鹿茸样品,加入50ml乙腈溶液使其溶解,超声1min后离心取上清液备用。
二、数学模型的建立
1、取上述一中制备的11份10μL荧光探针溶液,11份40μL HEPES缓冲液,依次加入50μL、浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5mg/L的硝酸铅溶液,使用WD-9403C紫外分析仪在365nm处观察荧光显色,均显蓝色荧光。取上述各自的混合液20μL,加入400μL乙腈,混合均匀,在激发波长为340nm,扫描波长为350~600nm,使用荧光光度计测量其荧光值。根据I450/I380与浓度关系得出线性标准曲线Ⅰ及其方程。线性标准曲线Ⅰ如图1所示,线性标准曲线Ⅰ的方程如式Ⅱ。
y=0.1165x+0.5413 式Ⅱ
式Ⅱ中,y为荧光探针标定的药材的荧光强度比值I450/I380,x为硝酸铅溶液的浓度。
2、取上述一制备的10μL荧光探针溶液于1.5ml EP管(Eppendorf公司生产的离心管)中,分别加入40μL HEPES缓冲液及50μL上述药材溶液,混合均匀;取混合液20μL与400μL乙腈溶液混合,在激发波长为340nm,扫描波长为350~600nm,使用荧光光度计测量其荧光值。根据步骤1中线性标准曲线Ⅰ的方程计算得出药材中金属离子C值。
3、使用紫外分光光度法(参照2010版《中国药典》附录ⅨE项下)测定同一批药材中总重金属含量,同一批药材中总重金属含量为纵坐标,步骤2中计算得出金属离子C值为横坐标,绘制线性标准曲线Ⅱ,如图2所示,线性标准曲线Ⅱ的方程如式Ⅲ所示。
z=1.2335x+28.355 式Ⅲ
式Ⅲ中,x为步骤2中根据曲线Ⅰ计算出的金属离子C值,z为紫外分光光度法测定步骤2中药材的同一批药材中重金属离子浓度。
实施例2、木通中总重金属含量的检测
一、溶液的配制
探针溶液配制:精密称取探针晶体0.380g使其完全溶于乙腈中,置于1L容量瓶中,然后加入乙腈定容,得到浓度为1.8mM的荧光探针溶液,在紫外光下该荧光探针溶液显绿色荧光。4℃避光保存,备用。
HEPES缓冲液配制:精密称取11.915g HEPES粉末,加入40ml纯水使其溶解,将PH调制7.0,纯水定容至50ml,得到浓度为1.0M的HEPES缓冲溶液,4℃保存,备用。
木通待测液配制:称取0.5g木通粉末样品,加入50ml乙腈溶液使其溶解,超声1min后离心取上清液备用。
二、木通中总重金属含量的检测
取10μL探针溶液于1.5ml EP管中,加入40μL HEPES缓冲液及50μL样品溶液,紫外下观察混合溶液呈现蓝光;取混合液20μL与400μL乙腈溶液混合,在激发波长为340nm,扫描范围为350~600nm,使用荧光光度计测量其荧光强度值,荧光强度比值I450/I380为0.630(即y的值)。
将0.630代入本发明实施例1的式Ⅱ中,得到木通中金属离子浓度为0.840μg·g-1(即x的值);再将x的值代入本发明实施例1的式Ⅲ中,即得到木通中总金属含量为29.392μg·g-1,结果如表1所示。
采用紫外分光光度法测量实际的木通中总重金属离子的含量结果如表1所示,结果显示本发明测得的木通中总重金属含量与实际含量相差无几,说明本发明测定的结果准确,但是本发明测定含量的时间短。
表1 不同药用部位药材中总金属离子检测结果
实施例3、厚朴中总重金属含量的检测
一、溶液的配制
探针溶液配制:精密称取探针晶体0.380g使其完全溶于乙腈中,置于1L容量瓶中,然后加入乙腈定容,得到浓度为1.8mM的荧光探针溶液,在紫外光下该荧光探针溶液显绿色荧光。4℃避光保存,备用。
HEPES缓冲液配制:精密称取11.915g HEPES粉末,加入40ml纯水使其溶解,将PH调制7.0,纯水定容至50ml,得到浓度为1.0M的HEPES缓冲溶液,4℃保存,备用。
厚朴待测液配制:称取0.5g厚朴粉末样品,加入50ml乙腈溶液使其溶解,超声1min后离心取上清液备用。
二、厚朴中总重金属含量的检测
取10μL探针溶液于1.5ml EP管中,加入40μL HEPES缓冲液及50μL样品溶液,紫外下观察混合溶液呈现蓝光;取混合液20μL与400μL乙腈溶液混合,在激发波长为340nm,扫描范围为350~600nm,使用荧光光度计测量其荧光强度值,荧光强度比值I450/I380为0.600(即y的值)。
将0.600代入本发明实施例1的式Ⅱ中,得到厚朴中金属离子浓度为0.606μg·g-1(即x的值);再将x的值代入本发明实施例1的式Ⅲ中,即得到厚朴中总金属含量为29.102μg·g-1,结果如表1所示。
采用紫外分光光度法测量实际的厚朴中总重金属离子的含量结果如表1所示,结果显示本发明测得的厚朴中总重金属含量与实际含量相差无几,说明本发明测定的结果准确,但是本发明测定含量的时间短。
实施例4、栀子中总重金属含量的检测
一、溶液的配制
探针溶液配制:精密称取探针晶体0.380g使其完全溶于乙腈中,置于1L容量瓶中,然后加入乙腈定容,得到浓度为1.8mM的荧光探针溶液,在紫外光下该荧光探针溶液显绿色荧光。4℃避光保存,备用。
HEPES缓冲液配制:精密称取11.915g HEPES粉末,加入40ml纯水使其溶解,将PH调制7.0,纯水定容至50ml,得到浓度为1.0M的HEPES缓冲溶液,4℃保存,备用。
栀子待测液配制:称取0.5g栀子粉末样品,加入50ml乙腈溶液使其溶解,超声1min后离心取上清液备用。
二、栀子中总重金属含量的检测
取10μL探针溶液于1.5ml EP管中,加入40μL HEPES缓冲液及50μL样品溶液,紫外下观察混合溶液呈现蓝光;取混合液20μL与400μL乙腈溶液混合,在激发波长为340nm,扫描范围为350~600nm,使用荧光光度计测量其荧光强度值,荧光强度比值I450/I380为0.740(即y的值)。
将0.740代入本发明实施例1的式Ⅱ中,得到栀子中金属离子浓度为1.728μg·g-1(即x的值);再将x的值代入本发明实施例1的式Ⅲ中,即得到栀子中总金属含量为30.486μg·g-1,结果如表1所示。
采用紫外分光光度法测量实际的栀子中总重金属离子的含量结果如表1所示,结果显示本发明测得的栀子中总重金属含量与实际含量相差无几,说明本发明测定的结果准确,但是本发明测定含量的时间短。
实施例5、金银花中总重金属含量的检测
一、溶液的配制
探针溶液配制:精密称取探针晶体0.380g使其完全溶于乙腈中,置于1L容量瓶中,然后加入乙腈定容,得到浓度为1.8mM的荧光探针溶液,在紫外光下该荧光探针溶液显绿色荧光。4℃避光保存,备用。
HEPES缓冲液配制:精密称取11.915g HEPES粉末,加入40ml纯水使其溶解,将PH调制7.0,纯水定容至50ml,得到浓度为1.0M的HEPES缓冲溶液,4℃保存,备用。
金银花待测液配制:称取0.5g金银花粉末样品,加入50ml乙腈溶液使其溶解,超声1min后离心取上清液备用。
二、金银花中总重金属含量的检测
取10μL探针溶液于1.5ml EP管中,加入40μL HEPES缓冲液及50μL样品溶液,紫外下观察混合溶液呈现蓝光;取混合液20μL与400μL乙腈溶液混合,在激发波长为340nm,扫描范围为350~600nm,使用荧光光度计测量其荧光强度值,荧光强度比值I450/I380为0.584(即y的值)。
将0.584代入本发明实施例1的式Ⅱ中,得到金银花中金属离子浓度为0.478μg·g- 1(即x的值);再将x的值代入本发明实施例1的式Ⅲ中,即得到金银花中总金属含量为28.945μg·g-1,结果如表1所示。
采用紫外分光光度法测量实际的金银花中总重金属离子的含量结果如表1所示,结果显示本发明测得的金银花中总重金属含量与实际含量相差无几,说明本发明测定的结果准确,但是本发明测定含量的时间短。
实施例6、鹿茸中总重金属含量的检测
一、溶液的配制
探针溶液配制:精密称取探针晶体0.380g使其完全溶于乙腈中,置于1L容量瓶中,然后加入乙腈定容,得到浓度为1.8mM的荧光探针溶液,在紫外光下该荧光探针溶液显绿色荧光。4℃避光保存,备用。
HEPES缓冲液配制:精密称取11.915g HEPES粉末,加入40ml纯水使其溶解,将PH调制7.0,纯水定容至50ml,得到浓度为1.0M的HEPES缓冲溶液,4℃保存,备用。
鹿茸待测液配制:称取0.5g鹿茸粉末样品,加入50ml乙腈溶液使其溶解,超声1min后离心取上清液备用。
二、鹿茸中总重金属含量的检测
取10μL探针溶液于1.5ml EP管中,加入40μL HEPES缓冲液及50μL样品溶液,紫外下观察混合溶液呈现蓝光;取混合液20μL与400μL乙腈溶液混合,在激发波长为340nm,扫描范围为350~600nm,使用荧光光度计测量其荧光强度值,荧光强度比值I450/I380为0.860(即y的值)。
将0.860代入本发明实施例1的式Ⅱ中,得到鹿茸中金属离子浓度为2.686μg·g-1(即x的值);再将x的值代入本发明实施例1的式Ⅲ中,即得到鹿茸中总金属含量为31.668μg·g-1,结果如表1所示。
采用紫外分光光度法测量实际的鹿茸中总重金属离子的含量结果如表1所示,结果显示本发明测得的鹿茸中总重金属含量与实际含量相差无几,说明本发明测定的结果准确,但是本发明测定含量的时间短。
Claims (10)
1.一种建立药材中总重金属含量检测的模型的方法,包括如下步骤:
1)取已知等梯度浓度的铅离子溶液,与HEPES缓冲溶液和荧光探针溶液混合得混合液,然后分别测定所述混合液的荧光强度值,以所述混合液的荧光强度比值I450/I380为横坐标,铅离子浓度为纵坐标,绘制出线性标准曲线Ⅰ,得到线性标准曲线Ⅰ的方程;
2)将药材与HEPES缓冲溶液和荧光探针溶液混合反应后,测定反应后体系的荧光强度值,将所述反应后体系的荧光强度比值I450/I380代入所述线性标准曲线Ⅰ的方程,得到所述药材中金属离子浓度C值;
3)用现有方法测定与步骤2)中所述药材的同一批的药材中总重金属含量,以该药材中总重金属含量为纵坐标,以步骤2)中所述药材中金属离子浓度C值为横坐标,绘制出线性标准曲线Ⅱ,得到线性标准曲线Ⅱ的方程,所述线性标准曲线Ⅰ的方程和所述线性标准曲线Ⅱ的方程即为所述药材中总重金属含量检测的数学模型。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述铅离子溶液为硝酸铅溶液;
所述荧光探针溶液中荧光探针的结构式为式Ⅰ所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述铅离子溶液的浓度为0~5.0mg/L,所述铅离子溶液的浓度梯度为0~1.0mg/L;
步骤1)中,所述荧光探针溶液的浓度为1.6mM~2mM;
所述HEPES缓冲溶液的浓度为0.75M~1.25M
所述药材为天麻、丹参、木通、金银花、茯苓、白芥子、栀子、厚朴、青蒿和鹿茸中的至少6种;
步骤2)中,所述荧光探针溶液的浓度为1.6mM~2mM;
所述HEPES缓冲溶液的浓度为0.75M~1.25M。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于:步骤2)中,所述药材、所述荧光探针溶液和所述HEPES缓冲溶液的质量比为5:3~5:0.5~1.5;
步骤1)和步骤2)中,所述荧光强度值测定的激发波长为340nm,所述荧光强度值测定的扫描波长为350~600nm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于:所述药材中总重金属含量检测的数学模型中,所述线性标准曲线Ⅰ的方程如下式Ⅱ所示,
y=0.1165x+0.5413 式Ⅱ
式Ⅱ中,y为所述混合液的荧光强度比值I450/I380,x为所述铅离子的浓度;
所述线性标准曲线Ⅱ的方程如下式Ⅲ所示,
z=1.2335x+28.355 式Ⅲ
式Ⅲ中,x为步骤2)中所述药材中金属离子浓度C值,z为与步骤2)中所述药材的同一批的药材中总重金属离子浓度。
6.一种载体,其特征在于:所述载体上记载了权利要求1-5中任一项所述的方法建立的药材中总重金属含量检测的模型。
7.一种药材中总重金属含量检测的方法,包括如下步骤:1)将待测药材与HEPES缓冲溶液和荧光探针溶液混合反应后,测定反应体系的荧光强度值;
2)采用权利要求6所述药材中总重金属含量检测的数学模型,将所述待测药材的荧光强度比值I450/I380代入所述线性标准曲线Ⅰ的方程中,得到所述待测药材中金属离子浓度C值;再将所述待测药材中金属离子浓度C值代入所述线性标准曲线Ⅱ的方程中,即得到所述测药材中总金属含量。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述待测药材可为天麻、丹参、木通、金银花、茯苓、白芥子、栀子、厚朴、青蒿或鹿茸;
所述荧光探针溶液中荧光探针的结构式为式Ⅰ所示;
所述荧光探针溶液的浓度为1.6~2mM;
所述HEPES缓冲溶液的浓度为0.75~1.25M。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于:所述待测药材、所述HEPES缓冲溶液和所述荧光探针溶液的体积比为5:3~5:0.5~1.5;
所述反应体系的荧光强度值测定的激发波长为340nm,所述反应体系的荧光强度值测定的扫描波长为350~600nm。
10.权利要求6所述药材中总重金属含量检测的模型在采用荧光探针测定药材中重金属含量中的应用。
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