CN113155794A - 一种定量检测单个原生质体和液泡内Cd2+的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种定量检测单个原生质体和液泡内Cd2+的方法，属于植物生理毒理技术领域。本发明所述定量检测单个原生质体和液泡内Cd2+的方法，包括如下步骤：(1)在待测原生质体或者液泡悬液中加入LeadmiumTM Green AM探针溶液，孵育，洗净，得到待测悬液；(2)将步骤(1)得到的待测悬液进行荧光图像的拍摄，得到悬液中单个原生质体或者液泡的总荧光强度；(3)将步骤(2)得到的总荧光强度带入原生质体或液泡的标准曲线中，得到单个待测原生质体或单个液泡中Cd2+的含量(质量)。利用本发明的方法可以精确检测每一个龙葵叶片原生质体或液泡中Cd2+的含量，且准确率达到95％以上。

Description

一种定量检测单个原生质体和液泡内Cd2+的方法
技术领域
本发明涉及一种定量检测单个原生质体和液泡内Cd2+的方法，属于植物生理毒理技术领域。
背景技术
超积累植物具有极高的重金属积累水平，受到Cd胁迫的植物会有一系列的解毒机制来应对，以维持植物生理稳态。
目前，关于镉吸收和转运已经有从根到茎、叶，从组织到细胞和基因范围的研究，主要集中在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、天蓝歇菜(Thlaspi caerulescens)、东南景天(Sedum alfredii Hance)等Cd的超积累品种中。迄今为止的研究表明，重金属Cd转移到地上后会以一个不损害重要的细胞器和参与细胞生命活动的细胞溶质的方式储存，也就是储存在液泡中。这种解毒机制称为液泡区室化，是超积累植物的一种重要的解毒机制。
然而目前对液泡区室化的过程了解并不透彻，因此，有必要从细胞甚至液泡水平更好地了解Cd的积累、运输和内部反应，从而为植物液泡区室化对Cd吸收和植物维持体内稳态的贡献提供见解。
发明内容
[技术问题]
目前关于植物中Cd的检测都是检测总的镉含量，并未有文献公开使用线性标准曲线定量检测Cd2+，特别是单个原生质体中或者单个液泡中Cd2+的含量。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题，本发明采用了高选择性、低检出限的荧光探针LeadiumTM Green AM和Cd2+相结合，通过荧光强度和Cd2+含量的对应关系，实现了原生质体和液泡内Cd2+的含量的检测。这是对单个原生质体或液泡中Cd2+的定量方法的一大改进。
本发明的第一个目的是提供一种定量检测单个原生质体和液泡内Cd2+的方法，包括如下步骤：
(1)在待测原生质体或者液泡悬液中加入LeadmiumTM Green AM探针溶液，孵育，洗净，得到待测悬液；
(2)将步骤(1)得到的待测悬液进行荧光图像的拍摄，得到悬液中单个原生质体或者液泡的总荧光强度；
(3)将步骤(2)得到的总荧光强度带入原生质体或液泡的标准曲线中，得到单个待测原生质体或单个液泡中Cd2+的含量(质量)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的待测原生质体或者液泡悬液和LeadmiumTM Green AM探针溶液的体积比为1～2mL：10μL，进一步优选为1.9mL：10μL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的LeadmiumTM Green AM探针溶液的制备方法为：
在50μg LeadmiumTM Green AM探针粉末中加入50μL二甲基亚砜(DMSO)，避光混匀，得到探针储备液；随后用0.01mol/L的NaCl溶液和探针储备液以10：1比例稀释制成LeadmiumTM Green AM探针溶液，备用；配制时全程避光，-20℃储存。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的孵育是常温(20～30℃)下避光孵育2h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的洗净是采用待测原生质体或者液泡悬液进行洗净。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述待测原生质体或者液泡悬液是龙葵的原生质体或者液泡悬液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述进行荧光图像的拍摄具体为：
取步骤(1)的待测悬液在荧光显微镜(10*10倍镜)明场下，在荧光显微镜488nm激发波长，525nm发射波长的通道下，放大400倍拍摄数张原生质体或液泡荧光图像；之后使用ImageJ软件处理测定荧光强度的图像，得到单个原生质体或者液泡的总荧光强度；
其中，所述的用ImageJ软件处理测定荧光强度具体为：
使用ImageJ软件直线工具测量拍摄的显微镜测微尺上100μm真实长度显示在显微镜图像上的长度，获得两者的比例值，将比例值输入到每一张显微镜图像中，获得显微镜图像的真实面积；使用ImageJ软件椭圆工具圈出每一个原生质体或液泡获取平均荧光强度，扣除该图像的背景平均荧光强度，得到单个原生质体或液泡的总荧光强度。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述的原生质体的标准曲线为y＝11298x+2773.9，R2＝0.9953；液泡的标准曲线为y＝33112x+351.87，R2＝0.9799；其中y是总的荧光强度，x是Cd2+的含量(质量)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述的原生质体或液泡的标准曲线的构建方法为：
将不同浓度(20～1000μmol/L)的CdCl2溶液(100μL)加入到原生质体或液泡悬液(1.9mL)中，使混合液中Cd2+的最终浓度为5、10、20、30、50μmol/L；之后向每个混合液中加入10μL的LeadmiumTM Green AM探针溶液，在黑暗、常温(25℃)孵育2h，洗净后，得到悬液；
之后取部分悬液(200μL)用于拍摄荧光图像，每次制作玻片标本取样12μL；将得到的荧光图像使用ImageJ软件进行图像分析，以50个原生质体或液泡作为一个数据点，数据点和误差棒分别表示50个原生质体或液泡的总荧光强度的平均值(n＝3)和标准误差SE；
再取悬液3次，每次拍摄图像5张，计算15张图片上原生质体或液泡的平均数量，依据图片的真实面积估算出单位体积悬液中原生质体或液泡的数量；其中每次采集的液体量(12μL)和盖玻片的尺寸(18×18mm2)都是恒定的，控制每个显微镜图像中悬液的体积相同，以保证计数准确；
同时，剩余的含有不同浓度的Cd2+的悬液通过8μm的滤膜过滤，(由于原生质体或液泡的直径(>8μm)大于滤膜的孔径，所以能在膜上保留原生质体或液泡)，然后用洗涤液轻轻冲洗原生质体或液泡三次，以去除各自表面的Cd2+；之后用15mL水冲洗滤膜上的原生质体和液泡，使其遇水破裂释放出吸收的Cd2+，然后用0.45μm滤膜过滤除去残渣，用荧光显微镜-原子吸收分光光度计AAS测定滤液中Cd2+的质量浓度；
以ImageJ软件获得的相应原生质体或液泡数量为基础，将荧光显微镜-原子吸收分光光度计检测计算出的原生质体和液泡悬液中Cd2+的质量平均到每一个原生质体或液泡上，得到单个原生质体或者液泡的Cd2+含量(质量)和相应的总荧光强度，根据两者线性关系得到原生质体或液泡的Cd2+的标准曲线。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的待测原生质体的制备方法为：
取龙葵叶片切成1mm2的小块浸入细胞酶解液中，经酶解、过滤、离心、清洗纯化后，重悬得到原生质体悬液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中待测原生质体的制备方法中酶解包括：
将叶片小块浸入15mL含有1.6％纤维素酶R10、0.3％离析酶R10、0.6mol/L甘露醇、pH值为6.0(1mol/L KOH调节)的细胞裂解液中，在黑暗的27℃、60r/min的恒温振荡器中震荡2h后过滤。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中待测原生质体的制备方法中离心条件为：
在120×g(加速度升降都为3)，4℃下离心5min，使用含有0.6mol/L甘露醇，20mmol/L MES，0.5mmol/L CaCl2，pH为6.5(1mol/L KOH溶液调节)的原生质体重悬液清洗两遍并重悬。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中待测原生质体的制备方法中所述的纯化方式为：
依次层叠0.8mmol/L蔗糖溶液、0.48mmol/L蔗糖溶液及含原生质体的原生质体重悬液，形成不连续的梯度，以240×g(加速度升降皆为3)，4℃下离心10min后，收集原生质体重悬液和0.48mol/L蔗糖溶液的相间部分，通过原生质体重悬液洗涤除去蔗糖，得到纯化的龙葵叶片原生质体悬液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的液泡悬液的制备方法为：
将原生质体悬液加入到装有原生质体裂解液的离心管中裂解、离心、清洗、纯化后重悬。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述液泡悬液的制备方法中裂解方法为：
将1mL原生质体悬液与10mL含有1.0mmol/L EGTA，0.3mmol/L CHAPS，0.7mol/L甘露醇，pH值7.5(2mol/L Tris溶液调节)的原生质体裂解液混合，轻轻倒转2～3min，37℃静置15min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述液泡悬液的制备方法中离心方法为：于900×g(加速度升降分别为6和7)，4℃下离心5min，使用含有0.5mol/L甘露醇，20mmol/LMES，pH 8.0(2mol/L Tris溶液调节)的液泡重悬液清洗两遍并重悬。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述液泡悬液的制备方法中离心方法为：
在装有1mL液泡悬液的离心管底部，用一次性吸管缓慢注入4～6mL的10％Ficoll-400溶液，使两种不同密度的溶液间形成明显的界限，以900×g(加速度的升降分别为6和7)，4℃的条件离心5min后，收集液泡悬液和Ficoll-400溶液的相间部分，再次用液泡重悬液洗涤2次除去Ficoll-400，重悬后得到纯化的龙葵叶片液泡悬液各2mL。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法在植物生理毒理领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是检测植物中Cd2+的含量(质量)。
[有益效果]
利用本发明的方法可以精确检测每一个龙葵叶片原生质体或液泡中Cd2+的含量，且准确率达到95％以上。
附图说明
图1为提取的龙葵叶片原生质体。
图2为提取的龙葵叶片液泡。
图3为Cd2+标准曲线的制作流程图。
图4为Cd2+标准曲线，其中(a)原生质体，(b)液泡。
图5为生长在50μM Cd浓度营养液中的原生质体和液泡中Cd2+含量，其中(a)原生质体，(b)液泡。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1原生质体的提取
一种原生质体的提取提取方法，包括如下步骤：
取龙葵叶片切成1mm2的小块浸入15mL细胞酶解液中，在黑暗环境27℃、60r/min的恒温振荡器中震荡2h后，经240目尼龙网过滤，以120×g，4℃，加速度升降都为3的条件离心5min；之后使用原生质体重悬液5mL清洗后依次层叠0.8mmol/L蔗糖溶液、0.48mmol/L蔗糖溶液及含原生质体的原生质体重悬液，形成不连续的梯度；之后在240×g，4℃下离心10min后，收集原生质体重悬液和0.48mol/L蔗糖溶液的相间部分，通过原生质体重悬液洗涤除去蔗糖，得到纯化的龙葵叶片原生质体悬液，纯化的原生质体如图1所示。
实施例2液泡的提取
一种液泡的提取提取方法，包括如下步骤：
将1mL实施例1得到的原生质体悬液与10mL原生质体裂解液混合，用手轻轻倒转3min，在37℃温水温育下静置15min，裂解结束后，将液泡混合物以900×g，4℃，加速度升降分别为6和7的条件下离心5min，使用5mL液泡重悬液清洗3次，最后定容至1mL，得到液泡悬液；
使用5mL塑料胖头吸管向液泡悬液底部缓缓注入4mL的10％Ficoll溶液，于900×g(加速度升降分别为6和7)，4℃下离心5min后，收集液泡悬液和10％Ficoll溶液相间的部分，通过液泡重悬液洗涤除去Ficoll溶液，得到纯化的龙葵叶片液泡悬液，纯化的液泡如图2所示。
实施例3标准曲线的构建
原生质体和液泡标准曲线的构建(如图3)，包括如下步骤：
将不同浓度(20～1000μmol/L)的CdCl2溶液(100μL)加入到原生质体或液泡悬液(1.9mL)中，使混合液中Cd2+的最终浓度为5、10、20、30、50μmol/L；之后向每个混合液中加入10μL的LeadmiumTM Green AM探针溶液，在黑暗、常温(25℃)孵育2h，洗净后，得到悬液；
之后取部分悬液(200μL)用于拍摄荧光图像，每次制作玻片标本取样12μL；将得到的荧光图像使用ImageJ软件进行图像分析，以50个原生质体或液泡作为一个数据点，数据点和误差棒分别表示50个原生质体或液泡的总荧光强度的平均值(n＝3)和标准误差SE；
再取悬液3次，每次拍摄图像5张，计算15张图片上原生质体或液泡的平均数量，依据图片的真实面积估算出单位体积悬液中原生质体或液泡的数量；其中每次采集的液体量(12μL)和盖玻片的尺寸(18×18mm2)都是恒定的，控制每个显微镜图像中悬液的体积相同，以保证计数准确；
同时，剩余的含有不同浓度的Cd2+的悬液通过8μm的滤膜过滤，(由于原生质体或液泡的直径(>8μm)大于滤膜的孔径，所以能在膜上保留原生质体或液泡)，然后用洗涤液轻轻冲洗原生质体或液泡三次，以去除各自表面的Cd2+；之后用15mL水冲洗滤膜上的原生质体和液泡，使其遇水破裂释放出吸收的Cd2+，然后用0.45μm滤膜过滤除去残渣，用荧光显微镜-原子吸收分光光度计AAS测定滤液中Cd2+的质量浓度；
以ImageJ软件获得的相应原生质体或液泡数量为基础，将荧光显微镜-原子吸收分光光度计检测计算出的原生质体和液泡悬液中Cd2+的质量平均到每一个原生质体或液泡上，得到单个原生质体或者液泡的Cd2+含量(质量)和相应的总荧光强度，根据两者线性关系得到原生质体或液泡的Cd2+的标准曲线。
根据上述方法得到的原生质体的标准曲线(如图4)为y＝11298x+2773.9，R2＝0.9953；液泡的标准曲线为y＝33112x+351.87，R2＝0.9799；其中y是总荧光强度，x是Cd2+的浓度。
实施例4
一种定量检测单个原生质体和液泡内Cd2+的方法，包括如下步骤：
(1)按照实施例1和2的方法提取得到待测的原生质体或者液泡悬液1.9mL，之后加入10μL的100μg/mL的LeadmiumTM Green AM探针溶液，在黑暗、常温(25℃)孵育2h，洗净后，得到待测悬液；
(2)将步骤(1)得到的待测悬液进行荧光图像的拍摄，得到悬液中单个原生质体或者液泡的总荧光强度；
取步骤(1)的待测悬液12μL在荧光显微镜(10*10倍镜)明场下，在荧光显微镜488nm激发波长，525nm发射波长的通道下放大400倍拍摄数张原生质体或液泡荧光图像；之后使用ImageJ软件直线工具测量拍摄的显微镜侧微尺上100μm真实长度显示在显微镜图像上的长度，获得两者的比例值，将比例值输入到每一张显微镜图像中，获得显微镜图像的真实面积；使用ImageJ软件椭圆工具圈出每一个原生质体或液泡获取平均荧光强度，扣除该图像的背景平均荧光强度，获得单个原生质体或液泡的总荧光强度；
(3)将步骤(2)得到的总荧光强度带入原生质体或液泡的标准曲线(实施例2)中，得到单个待测原生质体或单个液泡中Cd2+的含量。
步骤(2)计算得到单个原生质体中总的荧光强度为5520.0061，通过标准曲线计算得到Cd2+的浓度为0.2431pg，实际测试的Cd2+浓度为0.2539pg，准确率达到95.74％。
步骤(2)计算得到单个液泡中总的荧光强度为8057.0048，通过标准曲线计算得到Cd2+的浓度为0.2327g，实际测试的Cd2+浓度为0.2403pg，准确率达到96.84％。
可见，本发明的方法测试的准确率很高。
实施例5
利用与实施例1、2相同的方法和试剂进行原生质体和液泡的提取，但是提取的原生质体和液泡来自吸收含有50μM Cd的营养液的龙葵叶片；所述的吸收含有50μM Cd的营养液的龙葵叶片的处理方法为：
龙葵植株染毒：使用霍格兰营养液水培种植龙葵，培养15天后向其中加入CdCl2溶液使营养液中Cd浓度为50μM，三天更换一次营养液以避免Cd的损耗，处理30天之后取叶片进行测定。
利用实施例3获得的Cd2+标准曲线测定单个原生质体或液泡中的Cd2+含量。
测试结果如图5所示，从图5可以看出50μM Cd处理下，龙葵叶片单个原生质体和液泡吸收的Cd2+的含量。说明了本发明的方法适用于植物中Cd2+的含量的定量检测。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种定量检测单个原生质体和液泡内Cd2+的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在待测原生质体或者液泡悬液中加入LeadmiumTM Green AM探针溶液，孵育，洗净，得到待测悬液；
(2)将步骤(1)得到的待测悬液进行荧光图像的拍摄，得到悬液中单个原生质体或者液泡的总荧光强度；
(3)将步骤(2)得到的总荧光强度带入原生质体或液泡的标准曲线中，得到单个待测原生质体或单个液泡中Cd2+的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的待测原生质体或者液泡悬液和LeadmiumTM Green AM探针溶液的体积比为1～2mL：10μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述进行荧光图像的拍摄具体为：
取步骤(1)的待测悬液在荧光显微镜明场下，在荧光显微镜488nm激发波长，525nm发射波长的通道下，放大400倍拍摄数张原生质体或液泡荧光图像；之后使用ImageJ软件处理测定荧光强度的图像，得到单个原生质体或者液泡的总荧光强度；
其中，所述的用ImageJ软件处理测定荧光强度具体为：
使用ImageJ软件直线工具测量拍摄的显微镜侧微尺上100μm真实长度显示在显微镜图像上的长度，获得两者的比例值，将比例值输入到每一张显微镜图像中，获得显微镜图像的真实面积；使用ImageJ软件椭圆工具圈出每一个原生质体或液泡获取平均荧光强度，扣除该图像的背景平均荧光强度，得到单个原生质体或液泡的总荧光强度。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的孵育是20～30℃下避光孵育2h。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述待测原生质体或者液泡悬液是龙葵的原生质体或者液泡悬液。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的原生质体的标准曲线为y＝11298x+2773.9，R2＝0.9953；液泡的标准曲线为y＝33112x+351.87，R2＝0.9799；其中y是总的荧光强度，x是Cd2+的含量。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的原生质体或液泡的标准曲线的构建方法为：
将不同浓度的CdCl2溶液加入到原生质体或液泡悬液中，使混合液中Cd2+的最终浓度为5、10、20、30、50μmol/L；之后向每个混合液中加入10μL的LeadmiumTM Green AM探针溶液，在黑暗、25℃孵育2h，洗净后，得到悬液；
之后取部分悬液用于拍摄荧光图像，每次制作玻片标本取样12μL；将得到的荧光图像使用ImageJ软件进行图像分析，以50个原生质体或液泡作为一个数据点，数据点和误差棒分别表示50个原生质体或液泡的总荧光强度的平均值和标准误差SE；
再取悬液3次，每次拍摄图像5张，计算15张图片上原生质体或液泡的平均数量，依据图片的真实面积估算出单位体积悬液中原生质体或液泡的数量；其中每次采集的液体量和盖玻片的尺寸都是恒定的，控制每个显微镜图像中悬液的体积相同，以保证计数准确；
同时，剩余的含有不同浓度的Cd2+的悬液通过8μm的滤膜过滤，然后用洗涤液轻轻冲洗原生质体或液泡三次，以去除各自表面的Cd2+；之后用15mL水冲洗滤膜上的原生质体和液泡，使其遇水破裂释放出吸收的Cd2+，然后用0.45μm滤膜过滤除去残渣，用荧光显微镜-原子吸收分光光度计AAS测定滤液中Cd2+的质量浓度；
以ImageJ软件获得的相应原生质体或液泡数量为基础，将荧光显微镜-原子吸收分光光度计检测计算出的原生质体和液泡悬液中Cd2+的质量平均到每一个原生质体或液泡上，得到单个原生质体或者液泡的Cd2+含量和相应的总荧光强度，根据两者线性关系得到原生质体或液泡的Cd2+的标准曲线。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的LeadmiumTMGreen AM探针溶液的制备方法为：
在50μg LeadmiumTM Green AM探针粉末中加入50μL二甲基亚砜，避光混匀，得到探针储备液；随后用0.01mol/L的NaCl溶液和探针储备液以10：1比例稀释制成LeadmiumTMGreen AM探针溶液，备用；配制时全程避光，-20℃储存。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的洗净是采用待测原生质体或者液泡悬液进行洗净。
10.权利要求1～9任一项所述的方法在植物生理毒理领域的应用。
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