CN106290280A - 基于连接量子点和胶体金的y型dna结构快速检测三聚氰胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法，特点是包转移到高压反应釜中制备得到CdSe QDs溶液；（2）首先在发夹探针A的一端标记AuNPs，其次在发夹探针A的另一端标记CdSe QDs，得到probe A溶液，同理得到probe B溶液；（3）分别将DNA1、DNA2加入到PBS缓冲液中混匀反应，再加入三聚氰胺标准样品混匀反应；最后分别加入probe A、probe B和probe C混匀反应，通过酶标仪测得一系列不同浓度的三聚氰胺标准样品溶液的荧光光谱图，根据两者的定量关系，确定待测样品中三聚氰胺的含量，优点是简便快速、灵敏度高以及特异性强。

Description

基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的 方法

技术领域

本发明涉及一种三聚氰胺的检测方法，尤其是涉及一种基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法。

背景技术

2008年9月，我国爆发了三鹿婴幼儿奶粉污染事件，导致食用受污染奶粉的婴幼儿患上肾结石，原因是奶粉中掺杂了三聚氰胺，随后液态奶、奶糖、雪糕等制品中相继检测出三聚氰胺，这次的食品安全事故引起了人们对于食品安全的极大恐慌，国家质检总局紧急在全国开展婴幼儿奶粉中三聚氰胺含量的专项检查，对其余109家乳品企业进行了排查。结果显示，有22家婴幼儿奶粉生产企业的69批次产品检出了含有不同程度的三聚氰胺。时隔6年，2014年8月广东省潮州市含三聚氰胺的酸奶片事件又一次轰动全国。为了促进奶业健康、有序、可持续发展，保障人类身体健康，必须加大对食品中三聚氰胺的监测力度。

三聚氰胺（2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪，Melamine，英文缩写为 Mel），俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，其分子式为C₃H₆N₆，简称三胺。它是重要的氮杂环有机化工原料，主要用作生产三聚氰胺甲醛树脂，还可作为甲醛清洁剂、减水剂、阻燃剂等。目前国际上通常采用凯氏定氮法测定食品中粗蛋白质的含量，即以氮元素的含量乘以6.25计算出蛋白质含量。蛋白质的含氮质量分数为16.6%，而三聚氰胺的含氮质量分数高达66.6%，因此一些不法商家利用此原料，提高食品中的“蛋白质含量”。根据新的牛奶国家标准（GB-2010）可知，蛋白质的含量应不低于2.8%。由于每1 kg牛奶中添加0.1 g三聚氰胺，就能提高0.4%的蛋白质含量，而且用全氮测定法检测蛋白质含量时根本不会区分这种伪蛋白氮，因此许多不法商家为了使牛奶中所含蛋白质达到国家标准，就会非法添加三聚氰胺。三聚氰胺不能被人体代谢，严重损害了消费者的健康和利益，尤其是儿童，服用三聚氰胺超标的食品，会导致肾结石，更严重的会造成生殖系统的损害，如膀胱结石，并可进一步诱发膀胱癌。食物及药物管理局标准规定：三聚氰胺每日可容忍摄入量为0.63 mg/(kg·bw)，这对三聚氰胺的检测提出了新要求。因此，急需一种快速、简便，并能达到更高准确度和灵敏度的检测三聚氰胺的方法。

三聚氰胺的传统检测方法有重量法、升华法等，这些方法只能实现食品中三聚氰胺原料的检测；近几年发展起来的方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱/质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），这些方法通常需要昂贵的仪器和高素质的检验人员，而且检测成本较高，会浪费大量人力、物力，这些因素限制了大型仪器检测方法的大面积推广和批量检测，不适用于消费者对蛋白食品的快速筛选和诊断，也不适合快速检测。此外，一些快速检测三聚氰胺的方法也被建立，主要有拉曼光谱法、酶联免疫法，其中酶联免疫法是一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测方法，操作简便，被广泛应用于食品中三聚氰胺残留的检测。但是也存在一些缺陷，主要是受到抗体的一些性质的限制，比如抗体的制备依赖于细胞或活体，其制备麻烦、成本较高、靶目标范围较窄，这使得免疫分析法应用范围较小，同时，抗体因其生产制备工艺易产生批次差异，而且其保存、应用条件相对苛刻，这些不稳定的因素也影响着酶联免疫分析法检测的精确性。近年来出现的核酸适配体在很大程度上弥补了以上不足。核酸适配体（aptamer）作为一段人工设计的寡核苷酸序列，拥有和抗体一样高特异性识别靶目标物的能力。它作为一类新型识别分子探针，具有特异性高、亲和力强、易于生产和保存等一系列优越特性，已被认可为“化学抗体”，在食品安全检测领域得到了广泛关注和应用。同时伴随纳米技术的不断发展，多种多样的功能化纳米材料作为新型信号标记物不断涌现，在食品检测领域中引起了广泛的关注。其中，量子点（quantum dots，QDs）是一种荧光半导体纳米晶体，具有高荧光发射、宽的斯托克斯位移、荧光稳定性强、生物相容性好、易修饰等优点，为发展具有新型信号放大效应的食品检测方法提供了契机。

在核酸适配体荧光探针的设计中，量子点一般会与有机淬灭剂或染料分子联用，通过适配体与目标物结合后，所引起的核酸结构改变来影响它们之间的能量转移过程，从而实现荧光信号的输出。目前，利用胶体金（gold nanoparticles，AuNPs）比色法检测三聚氰胺的报道已经很多，比色方法与单纯依靠仪器检测的传统方法相比，其最大的优势是可以不需要借助仪器，只需要肉眼判断即可判定三聚氰胺的存在，或者采用常用的分光光度计即可进行准确的定量分析。因此与传统方法相比，以胶体金为基础检测三聚氰胺的比色方法具有省时省力便于现场应用等优点，但是胶体金比色法的缺点也比较明显。比色法受样品基质颜色干扰比较大，需要配合开发简单方便的样品前处理方法，减少样品基质的干扰。正如目前常用的胶体金试纸条一样，比色法相对其他方法诸如荧光法而言，灵敏度偏低，对于一些低含量物质的检测，需要考虑引入信号放大等方式进行高灵敏的检测。目前，国内外还没有公开任何关于将量子点与胶体金结合，再利用Y型DNA结构对三聚氰胺进行快速检测的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便快速、灵敏度高以及特异性强的基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法，包括以下步骤：

（1）CdSe QDs的制备

A．将390 mg硒粉和189 mg硼氢化钠加入到4 mL超纯水，将容器置于冰浴中反应24 h，得到硒前驱体，将其避光放置于4℃冰箱中备用；

B．将570 mg 2.5水合氯化镉完全溶解于148 mL超纯水中，再加入0.5 mL巯基丙酸，用1M氢氧化钠调节pH至7.5，得到镉前驱体；

C．先将制备的镉前驱体置于三颈烧瓶中，在N₂保护下，向三颈烧瓶中迅速注入制备好的硒前驱体上清液2 mL，10 min后将反应后的溶液快速转移到高压反应釜中，通过控制反应温度为180℃，反应时间为220 min，得到粒径为4-6 nm的CdSe QDs溶液；

（2）发夹探针两端标记AuNPs和CdSe QDs

A．发夹探针A两端相应标记AuNPs和CdSe QDs：

将10 μL 5 μM的发夹探针A、3 μL 1mM 的三(2-羧乙基)膦（TCEP）和3 μL 1.5 M的醋酸缓冲液（AB）分别加入到洁净的小玻璃瓶中，混匀，避光振荡反应1 h；然后加入200μL 胶体金溶液，混匀，振荡反应1 h；再加入20 μL 100 μM dATP（三磷酸脱氧腺苷）溶液，混匀，振荡反应1 h；再加入40 μL 0.1 M NaCl溶液，混匀，室温反应0.5 h，置于冰箱中4 ℃过夜；最后离心取沉淀，在沉淀中加入200 μL PBS缓冲液，混匀得到一端标记了AuNPs的发夹探针A；分别取70 μL CdSe QDs溶液、5 μL 100 ppb的碳化二亚胺盐酸盐（EDC）溶液和5 μL 100 ppb的羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液混匀，活化0.5 h后，用50 kDa的超滤离心管在13000 rpm下离心10 min，取超滤离心管中的溶液加双蒸水至原体积，放入4 ℃冰箱备用；

再将一端标记了AuNPs的发夹探针A与活化好的CdSe QDs溶液混匀，室温反应2 h，最后采用PBS缓冲液为重悬液，将混合液离心重悬，得到两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probeA溶液，于4 ℃冰箱备用；

B．取发夹探针B重复上述步骤，首先在发夹探针B的一端标记AuNPs，其次在发夹探针B的另一端标记CdSe QDs ，得到两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液，于4 ℃冰箱备用；

（3）三聚氰胺的检测

分别将20 μL1 μM DNA1溶液和20 μL 3 μM DNA2溶液加入到50 μL 0.01 M PBS缓冲液中混匀，室温反应30 min；再加入三聚氰胺标准样品（以水为空白对照），混匀，室温反应40min；最后分别加入30 μL 4 μM的两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe A溶液，30 μL 4μM的两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液和30 μL 4 μM的probe C溶液，混匀反应90 min，通过酶标仪测得一系列不同浓度的三聚氰胺标准样品溶液的荧光光谱图，扫描波长从450 nm到700 nm（激发波长为395 nm），得到三聚氰胺浓度与荧光强度之间的定量关系，根据两者的定量关系，确定待测样品中三聚氰胺的含量。

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液的具体步骤如下：将1 mL质量浓度为0.5%的氯金酸和60 mL的双蒸水加入到锥形瓶中加入，在加热磁力搅拌器上加热至沸腾，并维持1500 r/min的转速不变，向沸腾后的溶液中迅速加入850 μL质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液，溶液的颜色在2 min内发生明显变化，当颜色不再变化时继续加热煮沸5 min，冷却后补水至原体积，冷却后体积浓缩5倍得到胶体金溶液，放入4 ℃冰箱保存备用，其中所用的玻璃仪器都用王水浸泡过夜，再用双蒸水清洗，烘干备用。

所述的DNA1的碱基序列为：5' -GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC ACC CCGATG GCG GTC CAG TTC TAC GGT AAG CTC ATA TGC CGG ACG TAG AGA CTG GGG AG -3'；

所述的DNA2的碱基序列为：5' -CTG GAC CGC CAT CGG GGT GCT TGA -3'；

所述的probe A的碱基序列为：5' -SH-GCT TGA GAT GTT AGG GAG TAG TGC TCC AATCAC AAC GCA CTA CTC CCT AAC ATC-NH₂ -3'；

所述的probe B的碱基序列为：5'- NH₂-AGG GAG TAG TGC GTT GTG ATT GGA AAC ATCTCA AGC TCC AAT CAC AAC GCA CTA-SH-3'；

所述的probe C的碱基序列为：5'-GTT GTG ATT GGA GCT TGA GAT GTT GCA CTA CTCCCT AAC ATC TCA AGC TCC AAT-3'。

发明原理：如图1所示，采用的DNA1是含有三聚氰胺适配体的一段碱基序列，DNA2是与DNA1的部分序列互补的一段碱基序列。首先是含有目标物核酸适配体的DNA1与DNA2杂交，当目标物不存在时，DNA1与DNA2依然杂交，再加入一端标记CdSe QDs另一端标记AuNPs的发夹探针A和发夹探针B以及未标记的发夹探针C，发夹探针A、B、C的发夹不会打开，同一发夹探针上的QDs与AuNPs之间的距离小于10 nm，QDs与AuNPs之间发生荧光共振能量转移（FRET），QDs的荧光被淬灭；当目标物存在时，由于三聚氰胺与含有三聚氰胺适配体的DNA1亲和力更强，目标物与DNA1上的适配体结合，DNA2被置换下来，再加入一端标记QDs另一端标记AuNPs的发夹探针A和发夹探针B以及未标记的发夹探针C，结合有目标物的DNA1与发夹探针A的一部分序列杂交，发夹探针A的发夹打开，发夹探针A上的QDs荧光恢复，发夹探针A的另一部分序列与发夹探针B的一部分序列杂交，形成Y型结构的一端，发夹探针B上的QDs荧光恢复，发夹探针B的另一部分序列与发夹探针C的一部分序列杂交，形成Y型结构的另一端，由于发夹探针C与发夹探针A结合能力更强，因此，发夹探针C的另一部分序列与发夹探针A杂交，形成Y型结构的最后一端，含有目标物的DNA1脱落下来，继续参与下一个循环，这样就产生了信号放大。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法，包括胶体金和CdSe QDs的制备；在发夹探针A（发夹探针B）的两端分别标记AuNPs和CdSe QDs，即probe A（probe B）；链置换反应；Y型DNA结构的形成，快速检测三聚氰胺，首先在发夹探针A和发夹探针B的两端分别标记胶体金和量子点， DNA1与DNA2在适宜条件下杂交，当不存在三聚氰胺时，由于胶体金和量子点之间的距离接近，发生荧光共振能量转移（FRET），量子点的荧光被胶体金淬灭，当三聚氰胺存在时，才会形成Y型DNA结构，胶体金和量子点之间的距离增大，量子点的荧光逐渐恢复，从而建立量子点的荧光强度与三聚氰胺的浓度之间的关系，进而达到检测三聚氰胺的目的。本方法通过将量子点与胶体金结合，再利用Y型DNA结构用于信号放大，具有灵敏度高、反应时间短、操作简便，快速，时效性强，节省费用，适用范围广。

附图说明

图1为基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构对三聚氰胺的快速检测的原理示意图；

图2为本发明制备的胶体金的紫外吸收光谱图；

图3为本发明制备的胶体金的粒度分布图；

图4为本发明制备的CdSe量子点的荧光光谱图；

图5为本发明制备的CdSe量子点的粒度分布图；

图6为本发明制备的probe A的表征图；a，CdSe QDs；b，标记了CdSe QDs点的发夹探针A；c，两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe A-未重悬；d，两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe A -重悬后；

图7为实施例中不同条件下的荧光光谱图；a, no Mel，DNA1-DNA2, probe A, B, andC； b,0.2 μM Mel, DNA1-DNA2, probe A；c；0.2 μM Mel, DNA1-DNA2, probe A and B；d,0.2 μM Mel, DNA1-DNA2, probe A, B, and C；其中probe A, B的两端相应标记AuNPs和CdSe QDs，probe C两端未标记AuNPs和CdSe QDs；

图8为实施例中不同浓度的三聚氰胺标准样品检测的荧光光谱图；

图9为实施例中三聚氰胺的浓度与量子点荧光增强效率之间建立的标准曲线；三聚氰胺的浓度依次为0.01，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 μM；F：不同浓度的三聚氰胺的实际荧光强度，F₀：对照组荧光强度；

图10为实施例中三聚氰胺特异性检测图；横坐标依次为：对照（Blank），三聚氰胺（Mel），氯化镁（MgCl₂），氯化锌（ZnCl₂），氯化钙（CaCl₂），氯化钾（KCl），葡萄糖（Glucose），蔗糖（Sucrose），乳糖（Lactose），甘氨酸（Glycine），半胱氨酸（Cysteine），赖氨酸（Lysine）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

一种基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法，其原理如图1所示，具体包括以下步骤：

（1）胶体金溶液的制备（采用柠檬酸钠还原法）

将1 mL质量浓度为0.5%的氯金酸和60 mL的双蒸水加入到锥形瓶中加入，在加热磁力搅拌器上加热至沸腾，并维持1500 r/min的转速不变，向沸腾后的溶液中迅速加入850 μL质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液，溶液的颜色在2 min内发生明显变化，当颜色不再变化时继续加热煮沸5 min，冷却后补水至原体积，冷却后体积浓缩5倍得到胶体金溶液，放入4 ℃冰箱保存备用，其中所用的玻璃仪器都用王水浸泡过夜，再用双蒸水清洗，烘干备用；制备的胶体金的紫外吸收光谱图如图2所示，胶体金溶液的最大吸收峰为525 nm，吸收峰尖锐，没有杂峰出现，说明所制备胶体金粒径均一。制备的胶体金的粒度分布图如图3所示，胶体金的粒径大致分布在25-40 nm之间，满足实验要求；

（2）CdSe QDs的制备

A．将390 mg硒粉和189 mg硼氢化钠加入到4 mL超纯水，将容器置于冰浴中反应24 h，得到硒前驱体，将其避光放置于4℃冰箱中备用；

B．将570 mg 2.5水合氯化镉完全溶解于148 mL超纯水中，再加入0.5 mL巯基丙酸，用1M氢氧化钠调节pH至7.5，得到镉前驱体；

C．先将制备的镉前驱体置于三颈烧瓶中，在N₂保护下，向三颈烧瓶中迅速注入制备好的硒前驱体上清液2 mL，10 min后将反应后的溶液快速转移到高压反应釜中，通过控制反应温度为180℃，反应时间为220 min，得到粒径为4-6 nm的CdSe QDs溶液；

制备的CdSe量子点的荧光光谱图如图4所示，对称性好，且半峰宽窄，说明制备的量子点粒径均一；制备的CdSe量子点的粒度分布图如图5所示，平均粒径为4.85 nm，分布均匀，进一步证明所制备的CdSe量子点符合实验要求；

（3）发夹探针两端标记AuNPs和CdSe QDs

A．发夹探针A两端相应标记AuNPs和CdSe QDs：

将10 μL 5 μM的发夹探针A、3 μL 1mM 的三(2-羧乙基)膦（TCEP）和3 μL 1.5 M的醋酸缓冲液（AB）分别加入到洁净的小玻璃瓶中，混匀，避光振荡反应1 h；然后加入200μL 胶体金溶液，混匀，振荡反应1 h；再加入20 μL 100 μM dATP（三磷酸脱氧腺苷）溶液，混匀，振荡反应1 h；再加入40 μL 0.1 M NaCl溶液，混匀，室温反应0.5 h，置于冰箱中4 ℃过夜；最后离心取沉淀，在沉淀中加入200 μL PBS缓冲液，混匀得到一端标记了AuNPs的发夹探针A；分别取70 μL CdSe QDs溶液、5 μL 100 ppb的碳化二亚胺盐酸盐（EDC）溶液和5 μL 100 ppb的羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液混匀，活化0.5 h后，用50 kDa的超滤离心管在13000 rpm下离心10 min，取超滤离心管中的溶液加双蒸水至原体积，放入4 ℃冰箱备用；再将一端标记了AuNPs的发夹探针A与活化好的CdSe QDs溶液混匀，室温反应2 h，最后采用PBS为重悬液，将混合液离心重悬，得到两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe A溶液，于4 ℃冰箱备用；

制备的probe A的表征图如图6所示；其中a，CdSe QDs；b，标记了CdSe QDs的发夹探针A；c，两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的发夹探针A（即probe A）-未重悬；d，probe A-重悬后；由a和b可知，偶联发夹探针A的CdSe QDs的荧光光图谱相对于未偶联探针的CdSe QDs发生了红移，且荧光强度仅有微弱的减小；由a、c、d可知，c和d相对a发生了红移，说明CdSeQDs标记在发夹探针A上，由b、c和d可知，c和d的荧光强度相对b明显减弱，说明AuNPs也标记在发夹探针A上，且QDs和AuNPs之间发生了荧光共振能量转移，证明形成两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe A；

B．取发夹探针B重复上述步骤，首先在发夹探针B的一端标记AuNPs，其次在发夹探针B的另一端标记CdSe QDs ，得到两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液，于4 ℃冰箱备用；

（3）三聚氰胺的检测

分别取20 μL1 μM DNA1、20 μL 3 μM DNA2于50 μL 0.01 M PBS缓冲液中混匀，室温反应30 min；再加入三聚氰胺标准样品（以水为空白对照），混匀，室温反应40 min；最后分别加入30 μL 4 μM的probe A、probe B和probe C，混匀反应90 min，通过酶标仪测得一系列不同浓度的三聚氰胺标准样品溶液的荧光光谱图，扫描波长从450 nm到700 nm（激发波长为395 nm），得到三聚氰胺浓度与荧光强度之间的定量关系，独立重复实验3次，根据两者的定量关系，确定待测样品中三聚氰胺的含量。

上述DNA1、DNA2、probe A、probe B、probe C的碱基序列如下所示：

DNA1：5' -GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC ACC CCG ATG GCG GTC CAG TTC TACGGT AAG CTC ATA TGC CGG ACG TAG AGA CTG GGG AG -3'；

DNA2：5' -CTG GAC CGC CAT CGG GGT GCT TGA -3'；

probe A：5' -SH-GCT TGA GAT GTT AGG GAG TAG TGC TCC AAT CAC AAC GCA CTACTC CCT AAC ATC-NH₂ -3'；

probe B：5'- NH₂-AGG GAG TAG TGC GTT GTG ATT GGA AAC ATC TCA AGC TCC AATCAC AAC GCA CTA-SH-3'；

probe C：5'-GTT GTG ATT GGA GCT TGA GAT GTT GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCAAGC TCC AAT-3'。

由图8可知，在0-0.5 μM范围内，随着三聚氰胺浓度的增加，量子点的荧光强度逐渐增强；由图9可知，在0.01-0.3 μM范围内，三聚氰胺的浓度与量子点的荧光增强效率有良好的线性关系，即y=0.30577x+0.06576，且R²=0.97657，检测限为9.25 nM。

二、可行性实验

为了验证上述具体实施例所设计的检测三聚氰胺方法的可行性，测得在不同条件下溶液的荧光光谱图。如图7所示，当三聚氰胺不存在时，溶液中包括DNA1-DNA2、probe A、probeB和probe C，产生的微弱荧光是由于加入的probe A和probe B本身产生的背景信号，即曲线a；当加入三聚氰胺，溶液中包括DNA1-DNA2、probe A时，荧光强度明显增强，即曲线b，这是因为三聚氰胺和DNA1的结合物与probe A杂交，使probe A的发夹打开，量子点的荧光恢复；probe A和probe B都存在时，荧光强度进一步增强，即曲线c；当三聚氰胺、DNA1-DNA2、probe A、probe B和probe C都存在时，量子点的荧光急剧增强，即曲线d，这是因为probeA、probe B和probe C形成了一个循环，产生了信号放大。

综上所述，本发明三聚氰胺检测方法，首先，在发夹探针A和发夹探针B的两端相应标记胶体金和量子点，由于胶体金和量子点之间的距离接近，发生荧光共振能量转移（FRET），量子点的荧光被胶体金淬灭，当三聚氰胺以及probe A、probe B和probe C都存在时存在时，NA1和三聚氰胺的结合物在适宜条件下首先与probe A杂交，形成Y型结构的一端，再与probe B杂交形成另一端，最后由于probe A与probe C的亲和力强于probe A与DNA1，所以probe A和probe C杂交形成Y型结构的最后一端，胶体金和量子点之间的距离增大，量子点的荧光逐渐恢复，从而建立量子点的荧光强度与三聚氰胺的浓度之间的关系。该方法通过将量子点与胶体金结合，再利用Y型DNA结构用于信号放大， 从而大幅提高了灵敏度。其中probe A, B的两端相应标记AuNPs和CdSe QDs，probe C两端未标记AuNPs和CdSeQDs。

三、特异性试验

为了验证本发明方法对三聚氰胺检测的选择性，我们对一些潜在干扰物质，如一些常见的离子、氨基酸、有机分子等进行研究。试管1为空白对照（Blank），试管2中加入100 nM的三聚氰胺（Mel），试管3到试管12中依次加入10 μM Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、K⁺、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）、乳糖（Lactose）、甘氨酸（Glycine）、半胱氨酸（Cysteine）、赖氨酸（Lysine），按照本发明方法对三聚氰胺检测的具体步骤，对试管1到12进行相同操作。独立重复试验3次。

实验结果说明：图10显示了各种干扰物质对荧光增强效率的响应。从图10可以看出，这些高浓度的干扰物质对量子点荧光强度的恢复影响较小，进一步说明本发明方法对三聚氰胺检测有较高的选择性。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）CdSe QDs的制备

A．将390 mg硒粉和189 mg硼氢化钠加入到4 mL超纯水，将容器置于冰浴中反应24 h，得到硒前驱体，将其避光放置于4℃冰箱中备用；

B．将570 mg 2.5水合氯化镉完全溶解于148 mL超纯水中，再加入0.5 mL巯基丙酸，用1M氢氧化钠调节pH至7.5，得到镉前驱体；

C．先将制备的镉前驱体置于三颈烧瓶中，在N₂保护下，向三颈烧瓶中迅速注入制备好的硒前驱体上清液2 mL，10 min后将反应后的溶液快速转移到高压反应釜中，通过控制反应温度为180℃，反应时间为220 min，得到粒径为4-6 nm的CdSe QDs溶液；

（2）发夹探针两端标记AuNPs和CdSe QDs

A．发夹探针A两端相应标记AuNPs和CdSe QDs：

将10 μL 5 μM的发夹探针A、3 μL 1mM 的三(2-羧乙基)膦和3 μL 1.5 M的醋酸缓冲液分别加入到洁净的小玻璃瓶中，混匀，避光振荡反应1 h；然后加入200μL 胶体金溶液，混匀，振荡反应1 h；再加入20 μL 100 μM dATP溶液，混匀，振荡反应1 h；再加入40 μL 0.1 MNaCl溶液，混匀，室温反应0.5 h，置于冰箱中4 ℃过夜；最后离心取沉淀，在沉淀中加入200μL PBS缓冲液，混匀得到一端标记了AuNPs的发夹探针A；分别取70 μL CdSe QDs溶液、5 μL100 ppb的碳化二亚胺盐酸盐溶液和5 μL 100 ppb的羟基琥珀酰亚胺溶液混匀，活化0.5 h后，用50 kDa的超滤离心管在13000 rpm下离心10 min，取超滤离心管中的溶液加双蒸水至原体积，放入4 ℃冰箱备用；

再将一端标记了AuNPs的发夹探针A与活化好的CdSe QDs溶液混匀，室温反应2 h，最后采用PBS缓冲液为重悬液，将混合液离心重悬，得到两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probeA溶液，于4 ℃冰箱备用；

B．取发夹探针B重复上述步骤，首先在发夹探针B的一端标记AuNPs，其次在发夹探针B的另一端标记CdSe QDs ，得到两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液，于4 ℃冰箱备用；

（3）三聚氰胺的检测

分别将20 μL1 μM DNA1溶液和20 μL 3 μM DNA2溶液加入到50 μL 0.01 M PBS缓冲液中混匀，室温反应30 min；再加入三聚氰胺标准样品，混匀，室温反应40 min；最后分别加入30 μL 4 μM的两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe A溶液，30 μL 4 μM的两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液和30 μL 4 μM的probe C溶液，混匀反应90 min，通过酶标仪测得一系列不同浓度的三聚氰胺标准样品溶液的荧光光谱图，扫描波长从450 nm到700nm，得到三聚氰胺浓度与荧光强度之间的定量关系，根据两者的定量关系，确定待测样品中三聚氰胺的含量。

2. 根据权利要求1所述的基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法，其特征在于采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液的具体步骤如下：将1 mL质量浓度为0.5%的氯金酸和60 mL的双蒸水加入到锥形瓶中加入，在加热磁力搅拌器上加热至沸腾，并维持1500 r/min的转速不变，向沸腾后的溶液中迅速加入850 μL质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液，溶液的颜色在2 min内发生明显变化，当颜色不再变化时继续加热煮沸5 min，冷却后补水至原体积，冷却后体积浓缩5倍得到胶体金溶液，放入4 ℃冰箱保存备用，其中所用的玻璃仪器都用王水浸泡过夜，再用双蒸水清洗，烘干备用。

3.根据权利要求1所述的基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法，其特征在于：

所述的DNA1的碱基序列为：5' -GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC ACC CCG ATGGCG GTC CAG TTC TAC GGT AAG CTC ATA TGC CGG ACG TAG AGA CTG GGG AG -3'；

所述的DNA2的碱基序列为：5' -CTG GAC CGC CAT CGG GGT GCT TGA -3'；

所述的probe A的碱基序列为：5' -SH-GCT TGA GAT GTT AGG GAG TAG TGC TCC AATCAC AAC GCA CTA CTC CCT AAC ATC-NH₂ -3'；

所述的probe B的碱基序列为：5'- NH₂-AGG GAG TAG TGC GTT GTG ATT GGA AAC ATCTCA AGC TCC AAT CAC AAC GCA CTA-SH-3'；

所述的probe C的碱基序列为：5'-GTT GTG ATT GGA GCT TGA GAT GTT GCA CTA CTCCCT AAC ATC TCA AGC TCC AAT-3'。