CN116200538A - 纳米风筝传感器在制备多靶标病毒基因检测试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米风筝传感器在制备多靶标病毒基因检测试剂中的应用。该传感器为激活型DNA荧光传感器，包括绿色银纳米团簇信标、红色银纳米团簇信标和金纳米球三个组成单元。所述绿色银纳米团簇信标和红色银纳米团簇信标均为发夹结构，从5'端到3'端依次由荧光银纳米簇合成模板序列、靶标识别序列、茎部形成序列和间隔序列四个功能片段连接组成，在5'端原位生成荧光银纳米簇，3'末端修饰有巯基。本发明构建的纳米风筝传感器，能够同时连续实时检测多种基因，有效弥补单一基因检测结果不准确的缺陷。此外，由于靶标刺激响应后，荧光恢复值远远超出初始荧光强度，因此检测灵敏度得到了非常大的提升。
Description
技术领域
本发明是属于生物技术领域，具体涉及一种可激活多色纳米风筝传感器及其在制备多靶标病毒基因检测试剂中的应用。
背景技术
疾病尤其是重大疾病的早期诊断能够有效地提高患者的治愈率，而从基因水平监测跟疾病相关的重要生物标志物含量变化对于重大疾病的诊断及治疗具有重要的研究价值。临床疾病诊断中经常需要检测各种病毒基因含量，而病毒往往存在多个基因亚型，现有方法通常一次只能够检测一种亚型基因，需要重复操作多次才能完成检测，并需要结合多次检测的结果来进行临床诊断，不仅增加了操作步骤，而且多批次分开检测会对诊断结果的准确性产生较大影响，因此，开发能够多通道同时检测多个靶标病毒亚型基因的新方法具有重要的研究价值和实际意义。
荧光生物传感器由于其检测灵敏度高，被广泛地应用于蛋白质、核酸、药物、小分子、以及无机金属离子等目标分析物的含量测定，然而，已经报道的荧光方法大多基于荧光猝灭机理，该类方法存在假阳性这一不可避免的缺陷，极大地限制了该类传感器的应用范围。基于此，科研工作者开发出可激活型荧光传感器，传感器本身没有荧光信号，只有在加入靶标后，传感器的荧光信号才会恢复，能够很好地解决假阳性的问题，因此，引起了人们的广泛关注。
发明内容
解决的技术问题：为了解决疾病诊断中单基因检测不准确的问题，本发明提供了一种可激活多色纳米风筝传感器，该传感器能够高选择性和高灵敏性同时检测多种病毒亚型基因。
技术方案：
一种可激活多色纳米风筝传感器，包括绿色银纳米团簇信标、红色银纳米团簇信标和金纳米球三个组成单元；
所述绿色银纳米团簇信标为发夹结构，从5'端到3'端由荧光银纳米簇合成模板序列1、靶标识别序列1、茎部形成序列1以及间隔序列组成，在3'末端修饰有巯基；
所述红色银纳米团簇信标为发夹结构，从5'端到3'端由荧光银纳米簇合成模板序列2、靶标识别序列2、茎部形成序列2以及间隔序列组成，在3'末端修饰有巯基；
所述绿色银纳米团簇信标和红色银纳米团簇信标通过巯基与金纳米球表面的金原子形成S-Au配位键，自组装形成绿色/红色银纳米团簇信标/金纳米球复合材料，即为可激活多色纳米风筝传感器。
进一步地，所述绿色荧光银纳米簇合成模板序列1为CCCTTTAACCCC(SEQ IDNO.7)，靶标识别序列1为TTCTTCATCGAGAGTGTAGTCG(SEQ ID NO.8)，茎部形成序列1为GAAGAA，间隔序列为-TTTTT-(CH2)6。
进一步地，所述红色荧光银纳米簇合成模板序列2为CCTCCTTCCTCC(SEQ IDNO.9)，靶标识别序列2为AGACTCTTGAGTTCTCAGTATG(SEQ ID NO.10)，茎部形成序列2为GAGTCT，间隔序列为-TTTTT-(CH2)6。
发明人的前期研究发现发夹构型中5'端银纳米簇与3'端金纳米球之间存在的空间位阻效应，会影响纳米风筝在靶标刺激响应后荧光信号恢复的实现，因此增加了间隔序列设计。
所述可激活多色纳米风筝传感器，在445nm波长光的激发下，测试其在510nm波长处的荧光强度的变化值，同时在525nm波长激发下，测定其在590nm波长处的荧光强度的变化值。
上述可激活多色纳米风筝传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，绿色银纳米团簇信标的制备，先设计多嵌段DNA序列，包括四个功能区域荧光银纳米簇合成模板序列1、靶标识别序列1、茎部形成序列1以及间隔序列，通过将多嵌段DNA序列经过热变性及快速退火的方法，形成发夹构型的多嵌段DNA序列，然后以发夹构型的多嵌段DNA序列作为稳定剂，利用硼氢化钠还原硝酸银的氧化还原反应，在5'端原位生成荧光银纳米簇，最终得到能够特异性识别H1N1的绿色银纳米团簇信标；
步骤2，先设计多嵌段DNA序列，包括四个功能区域荧光银纳米簇合成模板序列2、靶标H5N1的识别序列2、茎部形成序列2以及间隔序列，采用步骤1相同的方法，制备出能够特异性识别H5N1的红色银纳米团簇信标；
步骤3，金纳米球的制备，利用经典的Frens方法制备得到粒径大约为10nm的金纳米球；
步骤4，可激活多色纳米风筝传感器的制备，将步骤1制得的绿色银纳米团簇信标和步骤2制得的红色银纳米团簇信标与步骤3合成的金纳米球共孵育，在室温条件下磁力搅拌至少12小时，使自组装反应完全，形成绿色/红色银纳米团簇信标/金纳米球复合材料，即为所述多色纳米风筝传感器。
进一步地，步骤1中多嵌段DNA序列、硝酸银和硼氢化钠的投料摩尔比为1:6:6。
上述多色纳米风筝传感器在制备同时检测不同病毒基因的试剂中的应用。
上述多色纳米风筝传感器在制备同时检测不同流感病毒亚型基因的试剂中的应用。
进一步地，所述应用的具体步骤为：
步骤1，将已知浓度的H1N1标准品与可激活多色纳米风筝传感器在室温条件下共孵育25～30分钟，同时设置与所述混合溶液相比不加标准品的空白体系，将所述混合溶液和所述空白体系在同一条件下进行测试，分别测定其荧光强度，计算所得所述混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值，根据H1N1标准品浓度对应的荧光强度差值绘制标准曲线；
步骤2，将已知浓度的H5N1标准品与可激活多色纳米风筝传感器在室温条件下共孵育25～30分钟，同时设置与所述混合溶液相比不加标准品的空白体系，将所述混合溶液和所述空白体系在同一条件下进行测试，分别测定其荧光强度，计算所得所述混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值，根据H5N1标准品浓度对应的荧光强度差值绘制标准曲线；
步骤3，将待测样品与可激活多色纳米风筝传感器在室温条件下共孵育25～30分钟，同时设置与所述混合溶液相比不加待测样品的空白体系，将所述混合溶液和所述空白体系在同一条件下进行测试，分别测定其荧光强度，计算所得实验混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值；将所述待测样品的荧光强度差值代入所述标准曲线，从而得到所述待测样品中H1N1和/或H5N1的含量。
本发明是以禽流感病毒基因亚型基因H1N1和H5N1为模型开展相应的研究，采用基于绿色/红色发光银纳米团簇信标/金纳米球自组装体系的多色纳米风筝传感器作为探针，当没有靶标基因序列存在情况下，发夹构型导致5'端银纳米簇非常接近金纳米球表面金原子，发生了从能量供体银纳米簇到能量受体金纳米球两种纳米材料之间的能量转移，因此，多色光闪耀纳米风筝传感器几乎没有荧光信号。但是，一旦加入靶标H1N1基因，其能够特异性识别绿色银纳米团簇信标发夹构型loop环中靶标识别序列并形成刚性双螺旋DNA链，以此破坏了其发夹构型，导致5'端绿色银纳米簇远离金纳米球表面，阻止了二者之间能量转移过程，因此，多色纳米风筝传感器会出现显著地绿色荧光增强现象；如果加入的是另外一种靶标H5N1，则会特异性识别红色银纳米团簇信标的loop环中靶标识别序列，破坏其发夹构型，干扰能量传递过程，最终出现红色荧光显著增强现象；此外，当同时存在两种靶标H1N1和H5N1时，由于双靶标同时破坏多色纳米风筝传感器中的绿色和红色银纳米团簇信标的发夹构型，阻止能量转移，最终同时激发绿色和红色两种颜色的荧光信号。由于靶标激活后5'端绿色或者红色银纳米簇虽然远离了金纳米球，但仍然通过双链DNA连接在金纳米球上，好比放飞的风筝，故将其称之为多色光闪耀纳米风筝。
有益效果：
1.本发明的可激活多色纳米风筝传感器仅仅在识别待测物后，原本熄灭的信号才被激活，从而进行可激活型荧光检测，可免去洗涤步骤，并避免未结合探针的背景干扰以提高检测的灵敏度，同时还可以解决假阳性问题，提高检测的准确性；
2.本发明是一种免标记的多元同时检测新方法，而且由于靶标刺激响应后荧光信号增强已经远远超出最初荧光信号强度，具体为绿色荧光信号恢复率为4379.2％，红色荧光信号恢复率为1300.4％，因此检测的灵敏度得到了非常大的提高。
3.本发明的可激活多色纳米风筝传感器能够同时检测多种靶标基因序列，为临床提高疾病诊断的准确性提供了新方法；
4.本发明的可激活多色纳米风筝传感器能够推广并应用于细胞成像及活体成像领域。
附图说明
图1为实施例1中可激活多色纳米风筝传感器多靶标同时检测示意图；
图2为实施例1中合成的多色银纳米团簇信标的荧光光谱图，左图为绿色，右图为红色；
图3为实施例2中可激活多色纳米风筝传感器与生物标志物禽流感病毒不同亚型基因H1N1和H5N1在室温条件下共孵育25～30分钟后的荧光发射光谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种可激活多色纳米风筝传感器，该传感器为可激活型DNA荧光传感器，是以多嵌段DNA序列为模板合成的发夹型发光银纳米团簇信标作为识别元件和报告单元，并以金纳米球作为荧光猝灭剂，通过自组装形成多色银纳米团簇信标/金纳米球复合材料，即为可激活多色纳米风筝。利用本发明的可激活多色纳米风筝传感器同时检测两种病毒亚型基因的过程如图1所示，其原理为：设计多嵌段DNA序列，5'端到3'端依次为银纳米簇合成模板序列、靶标识别序列作为loop环、茎部形成序列以及间隔序列四个功能片段，经过热变性并快速退火，形成发夹构型多嵌段DNA序列，作为稳定剂，基于硼氢化钠还原银离子的氧化还原反应，在5'端原位生成发光银纳米簇，即为发夹型绿色发光银纳米团簇信标。通过改变银纳米簇合成模板序列，结合另外一种靶标的识别序列，采用类似的方法，制备出具有不同靶向的发夹型红色发光银纳米团簇信标。所用的多功能DNA序列如NO.1和NO.2所示，分别制备得到可识别H1N1的发夹型绿色银纳米团簇信标和可识别H5N1的发夹型红色银纳米团簇信标。接下来，利用银纳米团簇信标3'端的巯基与金纳米球之间S-Au配位键，自组装在金纳米球表面，形成绿色/红色银纳米团簇信标/金纳米球复合材料，即为多色纳米风筝传感器。当不存在靶标基因时，发夹构型使得5'端银纳米簇与猝灭剂金纳米球十分接近，发生能量转移，荧光猝灭，多色纳米风筝传感器几乎没有任何荧光信号；当存在一种靶标H1N1(或H5N1)时，由于靶标基因与传感器环状区域的靶标识别序列发生特异性结合，形成刚性结构的双链DNA，从而打开发夹结构，使银纳米簇远离荧光猝灭分子，阻断能量转移过程，进而激活单一颜色绿色(或红色)银纳米簇的荧光信号，从而可实现对单一基因的高灵敏检测；当同时存在两种靶标基因H1N1和H5N1时，会同时识别绿色和红色银纳米团簇信标loop环上识别序列，会破坏DNA发夹构型，阻断能量转移的发生，因此会同时激活两种颜色银纳米簇的荧光信号，从而实现多通道多靶标基因同时检测。
SEQ ID NO.1
5'-CCCTTTAACCCC-TTCTTCATCGAGAGTGTAGTCG-GAAGAA-TTTTT-(CH2)6-SH-3'
SEQ ID NO.2
5'-CCTCCTTCCTCC-AGACTCTTGAGTTCTCAGTATG-GAGTCT-TTTTT-(CH2)6-SH-3'。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
基于多色银纳米团簇信标/金纳米球自组装体系的纳米风筝传感器的制备
1、实验所用溶液的准备：
称取0.284g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钠，用超纯水定容至100mL，调节溶液pH为7，即得20mM磷酸缓冲溶液。将0.1698g AgNO3溶解于100mL超纯水中配置成浓度为10mM的AgNO3工作溶液；称取0.0378g NaBH4溶解于100mL水中配制成浓度为10mM的NaBH4工作溶液；将购买的DNA链冻干粉3000转/分钟离心5分钟后，溶解于磷酸缓冲溶液(20mM,pH7)中，配制成100μM储备溶液。
2、多色纳米风筝传感器的制备：
步骤1，设计多嵌段DNA序列
多嵌段DNA序列共分为四个功能片段，从5'端到3'端依次为发光银纳米簇的合成模板片段、靶标识别序列、茎部形成序列以及间隔序列，3'末端修饰有巯基官能团。具体序列如SEQ ID NO.1和NO.2所示。
SEQ ID NO.1
5'-CCCTTTAACCCC-TTCTTCATCGAGAGTGTAGTCG-GAAGAA-TTTTT-(CH2)6-SH-3'SEQ IDNO.2
5'-CCTCCTTCCTCC-AGACTCTTGAGTTCTCAGTATG-GAGTCT-TTTTT-(CH2)6-SH-3'
步骤2，制备发夹构型多嵌段DNA序列
首先，在2.0mL规格离心管中加入500μL磷酸缓冲溶液(20mM,pH7)；然后，再加入90μL步骤1中所设计的多嵌段DNA序列储备溶液(100μM)，混合均匀后放入95℃水浴锅变性10～20分钟；接下来，将其快速放入冰水浴中40～60分钟，由于靶标识别序列与其部分互补序列组成的茎部形成序列发生特异性识别形成双螺旋茎部结构，最终形成茎-环构型多嵌段DNA序列。
步骤3，制备多色银纳米团簇信标
以通过步骤2方法形成的两种发夹构型多嵌段DNA序列分别作为稳定剂，放入冰水浴中保持10～15分钟，然后加入5.4μL硝酸银工作溶液并震荡2分钟使之混合均匀，避光放入冰水浴中继续冰浴15～20分钟；接下来，加入5.4μL新鲜制备的硼氢化钠工作溶液，快速混匀使之充分反应5～10分钟，避光放入4℃冰箱保存至少4小时，最后，通过透析法(截留分子量为3000规格的透析袋)除去未反应完全的原料，透析24小时，期间每隔4小时更换一次超纯水，并用磁力缓慢搅拌，最终可获得提纯银纳米团簇信标材料。实验过程中反应物投料的摩尔比如下：DNA模板：硝酸银：硼氢化钠＝1:6:6。
表征合成出的银纳米团簇信标的荧光，如图2所示：绿色银纳米团簇信标的激发波长为445nm，发射波长为520nm(图2A，左图)；红色银纳米团簇信标的激发波长为525nm，发射波长为588nm(图2B，右图)。
步骤4，制备基于多色银纳米团簇信标/金纳米球自组装体系的多色纳米风筝传感器
a1)金纳米球的制备：利用经典的Frens方法制备粒径大约10nm金纳米球，具体步骤如下：首先，取100mL的配制四氯金酸工作溶液(0.01％)加入到250mL烘干过的圆底烧瓶，并放入油浴锅中煮沸保持沸腾10分钟；然后，在磁力搅拌下快速加入5.0mL柠檬酸三钠工作溶液(1.0％)，并继续快速搅拌，大约7～10分钟，可观察到反应溶液颜色从亮黄色转变为酒红色，立刻停止搅拌，并自然冷却至室温；接下来，加入超纯水将溶液体积标定至100mL；最后，通过高速离心(12000转/分钟，离心15～20分钟)，弃上清液，加入离心前等体积的超纯水，重复离心3次，即可得到提纯的金纳米球溶液。
a2)基于多色银纳米团簇/金纳米球复合材料的多色纳米风筝传感器的制备：各取100μL步骤3制备得到的发夹构型绿色银纳米团簇信标和红色银纳米团簇信标工作溶液，加入到4mL提纯后的金纳米球工作溶液中，并在室温条件下进行磁力搅拌至少12小时，使自组装过程反应完全。为了提高自组装效率，绿色银纳米团簇信标和红色银纳米团簇信标3'末端巯基需要提前用刚配制的TCEP试剂激活(40mM)。接下来，将形成的粗的自组装体系溶液再利用高速离心(12000转/分钟，10～15分钟)，弃上清液，加入磷酸缓冲溶液配平到离心前等体积，重复3次，最终可获得提纯后的绿色/红色银纳米团簇信标/金纳米球复合材料，即为可激活多色纳米风筝传感器。
实施例2
可激活多色光闪耀纳米风筝传感器用于靶标刺激响应机制多通道同时检测病毒基因产品
(1)取100μL实施例1制备得到的可激活多色光闪耀纳米风筝传感器工作溶液到2.0mL规格的离心管中，加入一系列不同浓度的靶标禽流感病毒亚型基因序列H1N1(NO.3)或者H5N1(NO.4)，使之共孵育25～30分钟，设定激发波长为445nm，监测其在510nm波长处的荧光强度(绿色荧光)，或者设定激发波长为525nm，测定其在590nm波长处的荧光强度(红色荧光)，记为F。同时，以没有加入靶标情况下，测定的荧光强度，记为F0。
SEQ ID NO.3 5'-CGACTACACTCTCGATGAAGAA-3' (H1N1)
SEQ ID NO.4 5'-CATACTGAGAACTCAAGAGTCT-3' (H5N1)
(2)加入靶标基因并使之在室温条件下共孵育25～30分钟后，由于禽流感病毒亚型基因H1N1(H5N1)与多色光闪耀纳米风筝传感器的绿色(红色)银纳米团簇信标发夹环状区(loop环)的靶标识别序列发生特异性结合，形成刚性双链DNA，破坏了茎-环结构，使得5'银纳米簇远离3'荧光猝灭剂金纳米球，从而激活传感器绿色(红色)荧光信号，而且会随着加入靶标基因浓度的增大而逐渐增强(如图3A或3C所示)，根据加入不同浓度H1N1(或H5N1)基因标准品溶液后荧光强度的变化差值(F-F0)(图3B或3D)，计算出加入H1N1(或H5N1)基因前后基于多色光闪耀纳米风筝探针的荧光强度变化值与H1N1(或H5N1)基因浓度的线性关系，并各自绘制标准曲线，实验计算表明：本方法的H1N1检测限低至0.01nM，线性范围为1～20000nM(图3B)；H5N1检测限为0.1nM，线性范围为10～35000nM(图3D)。文献报道的常亮型银纳米簇传感器的检测限则大于10nM。
(3)将待测样品与多色纳米风筝传感器溶液在室温条件下共孵育25～30分钟后，在445nm波长光的激发下，实验发现激活后绿色最大发射波长蓝移至10nm，因此测试其在510nm波长处的荧光强度的变化值(绿色荧光)；同时在525nm波长激发下，红色最大发射波长红移2nm，因此测定其在590nm波长处的荧光强度的变化值(红色荧光)；然后根据步骤2得到的线性关系，计算出待测样品中H1N1基因和H5N1的具体浓度。
实施例3基于多色纳米风筝传感器的多重检测逻辑门的构建
为了进一步探索将本研究建立的多重检测新方法应用于临床实际样品检测的可行性，建立了多重检测逻辑门。本实施例是以禽流感病毒两种亚型基因H1N1和H5N1作为疾病诊断的生物标志物模型，来开展相应的研究。为了构建多重检测逻辑门，选择以H1N1(NO.3)，H5N1(NO.4)，CH1N1(NO.5)、CH5N1(NO.6)分别作为输入信号(input)1、2、3、4，构建过程如表1所示。
SEQ ID NO.5 5'-TTCTTCATCGAGAGTGTAGTCG-3' CH1N1
SEQ ID NO.6 5'-AGACTCTTGAGTTCTCAGTATG-3' CH5N1
表1基于可激活多色纳米风筝传感器的多重检测逻辑门的构建
第一种情形，将样品a与可激活多色纳米风筝传感器在室温条件下共孵育25～30分钟，该混合溶液没有加入任何一种输入信号，命名为input 0000，样品序列编号为No a1。实验结果表明，无任何恢复绿色或红色荧光信号，其输出信号(output)记为0。
第二种情形，当在样品No a1溶液中加入CH1N1(input 3)，使之共孵育25～30分钟，命名为input 0010，样品序列编号为No a2。实验测试发现，没有任何激活的荧光信号，其输出信号(output)记为0。
第三种情形，当在样品No a1混合溶液中加入CH5N1(input 4)，使之共孵育25～30分钟，命名为input 0001，样品序列编号为No a3。实验测试发现，仍然没有任何激活的绿色或者红色荧光信号，其输出信号(output)记为0。因此，综合以上三种情况的测试结果，可以推测(judgment)出样品a中无任何靶标基因(H1N1或H5N1)的存在。
第四种情形，将样品b与可激活多色纳米风筝传感器工作溶液在室温条件下共孵育25～30分钟，然后再加入H1N1作为输入信号(input 1)，命名为input 1000，样品序列编号为No b1。实验发现，在510nm波长处有显著增强的绿色荧光信号，其输出信号(output)记为“1绿色”。
第五种情形，当在样品No b1溶液中加入CH1N1(input 3)，使之共孵育25～30分钟，命名为input 1010，样品序列编号为No b2。实验测试发现，则没有任何恢复的荧光信号，其输出信号(output)记为0。
第六种情形，当在样品No b1溶液中加入CH5N1(input 4)，使之共孵育25～30分钟，命名为input 1001，样品序列编号为No b3。实验测试发现，在510nm波长处有显著增强的绿色荧光信号，其输出信号(output)记为“1绿色”。因此，综合以上三种输出信号的实验结果，可以得出如下结论(judgment)：样品b中仅含有H1N1一种基因，无H5N1。
第七种情形，将样品c与可激活多色纳米风筝传感器工作溶液在室温条件下共孵育25～30分钟，然后再加入H5N1作为输入信号(input 2)，命名为input 0100，样品序列编号为No c1。实验发现，在590nm波长处有显著增强的红色荧光信号，其输出信号(output)记为“1红色”。
第八种情形，当在样品No c1溶液中加入CH5N1(input 4)，使之共孵育25～30分钟，命名为input 0101，样品序列编号为No c2。实验表明，没有任何恢复的荧光信号，其输出信号(output)记为0。
第九种情形，当在样品No c1溶液中加入CH1N1(input 3)，使之共孵育25～30分钟，命名为input 0110，样品序列编号为No c3。实验测试发现，在590nm波长处有显著增强的红色荧光信号，其输出信号(output)记为“1红色”。因此，综合以上三种输出信号的实验结果，得出如下结论(judgment)：样品c中仅含有H5N1一种基因，无H1N1。
第十种情形，将样品d与可激活多色纳米风筝传感器工作溶液在室温条件下共孵育25～30分钟，然后再同时加入H1N1和H5N1作为双输入信号(input 1and 2)，命名为input1100，样品序列编号为No d1。实验发现，在510nm波长处有显著增强的绿色荧光信号，同时在590nm波长处也有明显恢复的红色荧光信号，其输出信号(output)记为“1黄色”，为“1绿色”和“1红色”两种输出信号的叠加颜色。
第十一种情形，当在样品No d1溶液中加入CH1N1(input 3)，使之共孵育25～30分钟，命名为input 1110，样品序列编号为No d2。实验表明，在590nm波长处有显著增强的红色荧光信号，其输出信号(output)记为“1红色”。
第十二种情形，当在样品No d1溶液中加入CH5N1(input 4)，使之共孵育25～30分钟，命名为input 1101，样品序列编号为No d3。实验测试发现，在510nm波长处有显著增强的绿色荧光信号，其输出信号(output)记为“1绿色”。
第十三种情形，当在样品No d1溶液中同时加入CH1N1(input 3)和CH5N1(input4)作为双输入信号，命名为input 1111，样品序列编号为No d4。实验发现，没有任何恢复的荧光信号，其输出信号(output)记为0。因此，综合以上四种输出信号的结果，可以得出如下结论(judgment)：样品d中同时存在两种靶标基因H1N1和H5N1。
本发明的多色纳米风筝传感器能够拓展到不同基因多重同时检测，为临床基因相关疾病的准确诊断提供了新方法。
Claims (8)
1.一种可激活多色纳米风筝传感器，其特征在于：包括绿色银纳米团簇信标、红色银纳米团簇信标和金纳米球；
所述绿色银纳米团簇信标为发夹结构，从5'端到3'端由荧光银纳米簇合成模板序列1、靶标识别序列1、茎部形成序列1以及间隔序列组成，在5'端原位生成荧光银纳米簇，在3'末端修饰有巯基；
所述红色银纳米团簇信标为发夹结构，从5'端到3'端由荧光银纳米簇合成模板序列2、靶标识别序列2、茎部形成序列2以及间隔序列组成，在5'端原位生成荧光银纳米簇，在3'末端修饰有巯基；
所述绿色银纳米团簇信标和红色银纳米团簇信标通过其3'末端巯基与金纳米球表面的金原子形成S-Au配位键，自组装在金纳米球表面。
2.根据权利要求1所述的可激活多色纳米风筝传感器，其特征在于：所述荧光银纳米簇合成模板序列1为CCCTTTAACCCC，靶标识别序列1为TTCTTCATCGAGAGTGTAGTCG，茎部形成序列1为GAAGAA，间隔序列为-TTTTT-(CH2)6。
3.根据权利要求1所述的可激活多色纳米风筝传感器，其特征在于：所述荧光银纳米簇合成模板序列2为CCTCCTTCCTCC，靶标识别序列2为AGACTCTTGAGTTCTCAGTATG，茎部形成序列2为GAGTCT，间隔序列为-TTTTT-(CH2)6。
4.权利要求1所述可激活多色纳米风筝传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，绿色银纳米团簇信标的制备，先设计多嵌段DNA序列，包括四个功能区域荧光银纳米簇合成模板序列1、靶标识别序列1、茎部形成序列1以及间隔序列，通过将多嵌段DNA序列经过热变性及快速退火的方法，形成发夹构型的多嵌段DNA序列，然后以发夹构型的多嵌段DNA序列作为稳定剂，利用硼氢化钠还原硝酸银的氧化还原反应，在5'端原位生成荧光银纳米簇，得到绿色银纳米团簇信标；
步骤2，采用步骤1相同的方法，先设计多嵌段DNA序列，包括四个功能区域荧光银纳米簇合成模板序列2、靶标识别序列2、茎部形成序列2以及间隔序列，制备得到红色银纳米团簇信标；
步骤3，金纳米球的制备，利用经典的Frens方法制备得到金纳米球；
步骤4，可激活多色纳米风筝传感器的制备，将等摩尔的步骤1制得的绿色银纳米团簇信标和步骤2制得的红色银纳米团簇信标与步骤3合成金纳米球在室温条件下共孵育，磁力搅拌反应至少12小时，形成绿色/红色银纳米团簇信标/金纳米球复合材料，即为所述多色纳米风筝传感器。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤1中多嵌段DNA序列、硝酸银和硼氢化钠的投料摩尔比为1 : 6 : 6。
6.权利要求1所述的可激活多色纳米风筝传感器在制备同时检测不同病毒基因的试剂中的应用。
7.权利要求1所述的可激活多色纳米风筝传感器在制备同时检测不同流感病毒亚型基因的试剂中的应用。
8.权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用的具体步骤为：
步骤1，将已知浓度的H1N1标准品与可激活多色纳米风筝传感器在室温条件下共孵育25~30分钟，同时设置与所述混合溶液相比不加标准品的空白体系，将所述混合溶液和所述空白体系在同一条件下进行测试，分别测定其荧光强度，计算所得所述混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值，根据H1N1标准品浓度对应的荧光强度差值绘制标准曲线；
步骤2，将已知浓度的H5N1标准品与可激活多色纳米风筝传感器在室温条件下共孵育25~30分钟，同时设置与所述混合溶液相比不加标准品的空白体系，将所述混合溶液和所述空白体系在同一条件下进行测试，分别测定其荧光强度，计算所得所述混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值，根据H5N1标准品浓度对应的荧光强度差值绘制标准曲线；
步骤3，将待测样品与可激活多色纳米风筝传感器在室温条件下共孵育25~30分钟，同时设置与所述混合溶液相比不加待测样品的空白体系，将所述混合溶液和所述空白体系在同一条件下进行测试，分别测定其荧光强度，计算所得实验混合溶液和所述空白体系的荧光强度差值；将所述待测样品的荧光强度差值代入所述标准曲线，从而得到所述待测样品中H1N1和/或H5N1的含量。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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