JP5578525B2 - 新規土壌診断方法 - Google Patents
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Description
(I)対象土壌におけるアンモニア減少率、
(II)対象土壌におけるフィチン酸からのリン酸生成活性、及び
(III)対象土壌における堆肥からのカリウム生成活性
並びに(IV)土壌における土壌バクテリア数
を用いて土壌診断を行うことを特徴とする土壌の診断方法。
予め設定されたアンモニア減少率の基準値、フィチン酸からのリン酸生成活性の基準値及び堆肥からのカリウム生成活性の基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、
前記正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれた前記(I) アンモニア減少率、前記(II) フィチン酸からのリン酸生成活性、及び前記(III) 堆肥からのカリウム生成活性の測定点を頂点として形成される三角形の面積の割合である、項1に記載の診断方法。
(A-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(A-2)対象土壌におけるアンモニア減少率、及び
(A-3)対象土壌における亜硝酸減少率、
B)下記(B-1)〜(B-3)を用いて算出されるリン循環活性指標:
(B-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(B-2)対象土壌におけるフィチン酸からのリン酸生成活性、及び
(B-3)対象土壌における堆肥からのリン酸生成活性、
並びに、C)下記(C-1)〜(C-3)を用いて算出されるカリウム循環活性指標:
(C-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(C-2)対象土壌におけるカリウム遊離率、及び
(C-3)対象土壌における堆肥からのカリウム生成活性
を少なくとも用いて土壌診断を行うことを特徴とする土壌の診断方法。
予め設定された土壌バクテリア数の基準値、アンモニア減少率の基準値、及び亜硝酸減少率の基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、
前記正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれた前記(A-1)土壌バクテリア数、前記(A-2)アンモニア減少率、及び前記(A-3)亜硝酸減少率の測定点を頂点として形成される三角形の面積の割合である、項3に記載の診断方法。
予め設定された土壌バクテリア数の基準値、フィチン酸からのリン酸生成活性の基準値、及び堆肥からのリン酸生成活性の基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、
前記正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれた前記(B-1)土壌バクテリア数、前記(B-2)フィチン酸からのリン酸生成活性、及び前記(B-3)堆肥からのリン酸生成活性の各測定値を頂点として形成される三角形の面積の割合である、項3又は4に記載の診断方法。
予め設定された土壌バクテリア数の基準点、カリウム遊離率の基準値、及び、堆肥からのカリウム生成活性の基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、
前記正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれた前記(C-1)土壌バクテリア数、前記(C-2)カリウム遊離率、及び前記(C-3)堆肥からのカリウム生成活性の各測定値を頂点として形成される三角形の面積の割合である、項3〜5のいずれかに記載の診断方法。
1.1.土壌診断方法(1)
本発明の土壌の診断方法(1)は、下記(I)〜(III)を用いて算出される循環活性指標:
(I)対象土壌におけるアンモニア減少率、
(II)対象土壌におけるフィチン酸からのリン酸生成活性、及び
(III)対象土壌における堆肥からのカリウム生成活性
並びに(IV)土壌における土壌バクテリア数
を用いて土壌診断を行うことを特徴とする。
本発明において、対象土壌におけるアンモニア減少率とは、対象土壌に投与したアンモニア化合物濃度の減少割合を示す値である。
(式中、N1はアンモニア化合物投与日のアンモニア態窒素量を表す。N2はアンモニア化合物投与から一定期間後のアンモニア態窒素量を表す。)
アンモニア化合物投与日とは、対象土壌に対するアンモニア化合物の投与日を意味する。アンモニア化合物投与日のアンモニア態窒素量は、投与0日目のアンモニア態窒素量と表すことができる。
本発明において、対象土壌におけるフィチン酸からのリン酸生成活性とは、対象土壌に投与したフィチン酸の変換活性を示す値である。
(式中、P1はフィチン酸中のリン酸量を表す。P2はフィチン酸投与日の水溶性リン酸量を表す。P3はフィチン酸投与から一定期間後の水溶性リン酸量を表す。)
本発明において、対象土壌における堆肥からのカリウム生成活性とは、対象土壌に投与した堆肥中のカリウムの遊離カリウムへの変換活性を示す値である。
(式中、K4は堆肥中のカリウム含有量を表す。K5は堆肥投与日におけるカリウム遊離量を表す。K6は堆肥投与から一定期間後のカリウム遊離量を表す。)
本発明において、土壌バクテリア数とは、対象土壌から採取した試料単位重量当たりに存在するDNA量に基づいて求められる土壌バクテリア数を表す。
対象土壌から採取された試料とは、上記対象土壌から採取(サンプリング)される土壌のことである。採取方法は特に限定されず、適宜公知の方法に従って行うことができる。
前記(I)、(II)、(III)、及び(IV)は、土壌中の窒素、リン酸、カリウム循環においていずれも重要な因子であり、これらを組み合わせて解析することが、適切な診断のために重要である。
本発明の土壌診断方法は、少なくとも(A)窒素循環活性指標、(B)リン循環活性指標、及び(C)カリウム循環活性指標を用いて、土壌の評価乃至診断を行うことを特徴とする。
本発明において、窒素循環活性指標とは、硝化を含む窒素含有化合物の変換と土壌バクテリアの関係を解析するための指標である。
(A-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(A-2)対象土壌におけるアンモニア減少率、及び
(A-3)対象土壌における亜硝酸減少率
を用いて算出される値である。
対象土壌における土壌バクテリア数については、前記(IV)循環活性指標に記載したとおりである。
対象土壌におけるアンモニア減少率については、前記(I)循環活性指標に記載したとおりである。
本発明において、対象土壌における亜硝酸減少率とは、対象土壌に投与した亜硝酸態窒素(NO2 -)濃度の減少割合を示す値である。
(式中、N3は亜硝酸化合物投与日の亜硝酸態窒素量を表す。N4は亜硝酸化合物投与から一定期間後の亜硝酸態窒素量を表す。)
亜硝酸化合物投与日とは、対象土壌に対する亜硝酸化合物の投与日を意味する。亜硝酸化合物投与日の亜硝酸態窒素量は、投与0日目の亜硝酸態窒素量と表すことができる。
前記(A-1)、(A-2)、及び(A-3)は、土壌中の窒素循環においていずれも重要な因子であり、これらを組み合わせて解析することが、適切な診断のために重要である。
本発明において、リン循環活性指標とは、リン含有有機化合物からリン酸への変換活性、別言すると、植物が利用できないリン化合物を利用可能なリン酸に変換する活性、と土壌バクテリアの関係を解析するための指標である。
(B-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(B-2)対象土壌におけるフィチン酸からのリン酸生成活性、及び
(B-3)対象土壌における堆肥からのリン酸生成活性、
を用いて算出される値である。
対象土壌における土壌バクテリア数については、前記(IV)循環活性指標に記載したとおりである。
対象土壌におけるフィチン酸からのリン酸生成活性については、前記(II)循環活性指標に記載したとおりである。
本発明において、対象土壌における堆肥からのリン酸生成活性とは、対象土壌に投与した堆肥のリン酸への変換活性、換言すると、堆肥を変換・分解して水溶性リン酸を遊離させる活性を示す値である。
(式中、P4は堆肥中のリン酸量を表す。P5は堆肥投与日における水溶性リン酸量を表す。P6は堆肥投与から一定期間後の水溶性リン酸量を表す。)
前記(B-1)、(B-2)、及び(B-3)は、土壌中のリン循環においていずれも重要な因子であり、これらを組み合わせて解析することが、適切な土壌診断のために重要である。
本発明において、カリウム循環活性指標とは、カリウム含有化合物の変換と土壌バクテリアの関係を解析するための指標である。
(C-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(C-2)対象土壌におけるカリウム遊離率、及び
(C-3)対象土壌における堆肥からのカリウム生成活性
を用いて算出される値である。
対象土壌における土壌バクテリア数については、前記(IV)循環活性指標に記載したとおりである。
本発明において、対象土壌におけるカリウム遊離率とは、対象土壌の単位乾燥重量当たりのカリウム量を示す値である。
(式中、K1は測定開始日における対象土壌中のカリウム含有量を表す。K2は測定開始日におけるカリウム遊離量を表す。K3は測定開始日から一定期間後のカリウム遊離量を表す。)
下記式で求められる値:
対象土壌における堆肥からのカリウム生成活性については、前記(III)循環活性指標に記載したとおりである。
前記(C-1)、(C-2)、及び(C-3)は、土壌中のカリウム循環においていずれも重要な因子であり、これらを組み合わせて解析することが、適切な土壌診断のために重要である。
本発明において、対象となる土壌の種類は、特に限定されないが、例えば、農地や、バイオレメディエーション処理後の土壌等が挙げられる。
本発明においては、上記循環活性指標、又は、上記(A)窒素循環活性指標、(B)リン循環活性指標、(C)カリウム循環活性指標を用いて、土壌の診断を行う。
本発明によれば、上記本発明の診断方法を利用して、土壌の品質を管理する方法が提供される。
本発明によれば、上記本発明の診断方法を利用して、土壌の品質を改善する方法が提供される。
(1-1)実験方法
1a)硝化能の評価
土壌10 gをガラスシャーレに量り取り、110℃で2時間乾燥後、重量減少量から含水率を算出した。2 mmメッシュのふるいにかけた乾燥重量15 gの土壌を50 ml容UMサンプル瓶に入れ、硫酸アンモニウム水溶液(0.080 mM)もしくは亜硝酸カリウム水溶液(0.16 mM)をそれぞれ60 μg-N/g-dry soilとなるように添加した。土壌をよくかき混ぜた後、25℃、含水率一定で3日間静置した。
50 ml容遠心チューブに土壌サンプル2.0 gと1 M塩化カリウム水溶液20 mlを加え懸濁し、100 rpmで1時間振とうした。振とう後、10,000 rpmで5分間遠心分離し、その上清を無機態窒素抽出液とした。
土壌から抽出した無機態窒素抽出液1.0 mlを2.0 ml容マイクロチューブに分注し、表1に示す次亜塩素酸ナトリウム溶液500 μlを加えて撹拌し、室温で5分間静置した。静置後、表2に示すフェノール・ニトロプルシッドナトリウム溶液500 μlを加えて撹拌し、30℃で60分間静置した。静置後、640 nmの吸光度を測定した。吸光度測定時にアンモニア態窒素標準液を用いて検量線を作成し、得られた関係式を用いてアンモニア態窒素量(NH4 +-N)を測定した。
土壌から抽出した無機態窒素抽出液1.0 mlを1.5 ml容マイクロチューブに分注し、表3に示すジアゾ化剤100 μlを加えて撹拌した。室温で5分間静置した後、表4に示すカップリング剤100 μlを加えて再び室温で20分間静置し、540 nmの吸光度を測定した。亜硝酸態窒素標準液を用いて作成した検量線から亜硝酸態窒素量(NO2 --N)を測定した。
土壌から抽出した無機態窒素抽出液800 μlと、表5に示すブルシン・スルファニル酸溶液400 μlを試験管に分注し、硫酸溶液(硫酸:水 = 20:3) 4.0 mlを加えて撹拌した。冷暗所で40分間静置後、410 nmの吸光度を測定した。吸光度測定時に硝酸態窒素標準液を用いて検量線を作成し、得られた関係式を用いて硝酸態窒素量(NO3 --N)を測定した。
50 ml容遠沈管に土壌1.0 gを量り取り、表6に示すDNA抽出緩衝液(pH 8.0)を8.0 ml、20 %(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム溶液を1.0 ml加え、1,500 rpm、室温で20分間撹拌した。撹拌後、50 ml容遠沈管から滅菌済み1.5 mlマイクロチューブに1.5 ml分取し、16℃、8,000 rpmで10分間遠心分離した。水層を新たなマイクロチューブに700 μl分取し、クロロホルム・イソアミルアルコール(24:1、v/v)を700 μl加えて混和した後、16℃、13,000 rpmで10分遠心分離した。遠心分離後、水層を新たなマイクロチューブに500 μl分取し、2-プロパノールを300 μl加えて緩やかに混和し、16℃、13,000 rpmで15分遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、70 %(v/v)エタノールを500 μl加え16℃、13,000 rpmで5分遠心分離した。遠心分離後、上清を除去しアスピレーターで30分間減圧乾燥させた。これに表7に示すTE 10:1緩衝液(pH 8.0)を50 μl加えよく溶解させ、これをeDNA溶液とした。アガロース2.0 g、表8に示す50×TAE緩衝液(pH 8.0)4.0 ml及び0.1 mMエチジウムブロマイド溶液20 μlに蒸留水を加えて200 mlとし、1.0 %アガロースゲルを作製した。eDNA溶液5.0 μlにローディングダイ(東洋紡、大阪)1.0 μlを混合し、全量6.0 μl、既知量のDNAを含むスマートラダー(ニッポンジーン、富山)1.5 μlをアガロースゲルにアプライした。これを100 Vで40分間電気泳動を行った後アガロースゲルにUV照射し、DNAバンドを確認した。KODAK 1D Image Analysis software(KODAK、NY、USA)を用いてスマートラダーのDNAバンドを解析し、蛍光強度に対するDNA量の検量線を作成した。この検量線を用いて、各サンプルDNA溶液のDNAバンドの蛍光強度からDNA量を求め、各土壌1.0 g当たりのeDNA量を算出した。eDNA量をDAPI染色による土壌バクテリア数に換算する検量線によって土壌バクテリア数を求めた。定量したeDNA量を関係式
Y = 1.7 × 108 X(R2 = 0.96)[Y;土壌バクテリア数(cells/g-soil)、X;eDNA量(μg/g-soil)]を用いて土壌バクテリア数を算出した。
用途や施肥状況が異なる土壌10サンプル(No.1〜10)を用いて、無機態窒素量として、上記1b)〜1d)に従ってアンモニア態窒素量と亜硝酸態窒素量を測定し、土壌の硝化活性を解析した。各サンプルにおける静置0日目と3日目における無機態窒素量及びその減少量を表9に示す。
物質循環では土壌バクテリアが密接に関与していると考えられる。このため、各サンプルにおける土壌バクテリア数を前記1fの方法で解析した。また、農地土壌における土壌バクテリア数のデータベースの平均値となる3.25×109 cells/g-soilを100として、測定した土壌バクテリア数の相対値(以下、バクテリア量ともいう)を算出した。各サンプルにおける土壌バクテリア数とバクテリア量を表10に示す。
得られた土壌バクテリア数、アンモニア減少率、亜硝酸減少率の3項目に基づき、土壌における窒素循環活性を評価するために、図2に示すチャートを作成した。
硝化の活性、即ち、窒素循環活性が低い土壌には、アンモニアを酸化する微生物の投与が効果的であると考えられる。そこで、アンモニア酸化細菌の投与によって硝化が活性化するかを解析した。
用途や施肥状況が異なる土壌10サンプル(No.11〜20)を用いて、土壌のリン循環を解析した。
2a)土壌バクテリア数の解析
土壌バクテリア数は、前記1f)と同様に、eDNA解析法により定量した。
250 ml容UMサンプル瓶に土壌サンプル100 gを入れ、よく撹拌した。この土壌2.0 gを50ml容遠心チューブに量り取り、蒸留水20 ml加え、100 rpmで60分間振とうした。10,000 rpm、5分間遠心分離し、その上清を水溶性リン酸抽出液としてモリブデンブルー法に供した。水溶性リン酸抽出液1.0 mlを1.5 ml容マイクロチューブに分注し、表12に示すモリブデンブルー ストック溶液:0.41 M L(+)-アスコルビン酸水溶液 = 5:1の混合溶液100 μlを加えて撹拌後、30℃で30分静置した。静置後、720 nmにおける吸光度を測定し、リン酸標準液を用いて作成した検量線から、土壌中の水溶性リン酸を定量し、0日目の水溶性リン酸量とした。
250 ml容UMサンプル瓶に土壌サンプル100 gを入れ、よく撹拌した。この土壌2.0 gを50ml容遠心チューブに量り取り、蒸留水20 ml加え、100 rpmで60分間振とうした。10,000 rpm、5分間遠心分離後、抽出した水溶性リン酸をモリブデンブルー法に供し、リン酸量を定量して、0日目の水溶性リン酸量とした。
土壌バクテリア数、フィチン酸からのリン酸生成活性、および堆肥からのリン酸生成活性の3項目を用いて、図4に示すチャートを作成した。
用途や施肥状況が異なる土壌10サンプル(No.11〜20)を用いて、土壌のカリウム循環を解析した。
3a)土壌バクテリア数の解析
土壌バクテリア数は、前記1fと同様に、eDNA解析法により定量した。
土壌3.0 gを50 ml容三角フラスコに量り取り、0.5 M硝酸40 mlを加えて60分間スターラーで撹拌した。撹拌後、ろ過し、ろ液をカリウム抽出液とした。この抽出液を原子吸光光度計(Z-2300、日立ハイテクノロジーズ、東京)を用いて測定した。測定条件は、燃料ガスとしてアセチレンを、助燃ガスとして圧縮空気を用い、圧力は共に0.5 MPaで測定した。カリウム標準液を用いて作成した検量線から、土壌中のカリウム遊離量を定量し、測定開始日(0日目)のカリウム遊離量とした。
250 ml容UMサンプル瓶に土壌サンプル100 gを入れ、よく撹拌した。土壌3.0 gを50 ml容三角フラスコに量り取り、蒸留水40 mlを加えて60分間スターラーで撹拌した。撹拌後、ろ過し、ろ液をカリウム抽出液とした。この抽出液を、前記3b)と同様にして、原子吸光光度計に供し、カリウム量を定量して、0日目のカリウム遊離量とした。
土壌バクテリア数、カリウム遊離率、およびカリウムからのリン酸生成活性の3項目を用いて、図5に示すチャートを作成した。
窒素循環活性、リン循環活性、及びカリウム循環活性に基づく土壌の総合診断と、植物の生長の関係を以下の方法で解析した。土壌としては、用途や施肥状況が異なる土壌10サンプル(No.11〜20)を用いた。
4a)土壌バクテリア数の解析
土壌バクテリア数は、前記1fと同様に、eDNA解析法により定量した。
窒素循環活性は1項と同様にして解析した。
リン酸循環活性は2項と同様にして解析した。
カリウム循環活性は3項と同様にして解析した。
育苗ポットに各土壌サンプルを入れ、各ウェルにコマツナの種子10個を播種した。これを25℃、6,000ルクスで1週間生育させた。1/5,000 aポットに赤玉土を敷き詰め、土壌サンプル約1 kg加えて、ほぼ同じ大きさの苗を1ポット当たり3本移植した。これを25℃、6,000ルクスでさらに3週間生育させ、コマツナの地上部の生重量を測定した。なお、土壌1サンプルにつき3ポットで試験を行い、その平均値で評価した。
各土壌サンプルについて得られた指標の和から、土壌の総合診断を行った。即ち、各指標の和を3で割った値を算出し、得られた値が大きいほど土壌の品質に優れ、値が小さいほど土壌の品質が十分でないと診断した。
種々の土壌における硝化活性とバクテリア数との関係を調べた。図8に一日当たりの硝化量を示す。土壌バクテリア数は、前記1fと同様に、eDNA解析法により定量した。硝化量は、アンモニア態窒素が60 μg-N/g dry soilとなるように土壌に投与して1日間静置後に測定した亜硝酸態窒素量及び硝酸態窒素量の合計量を示している。その結果、微生物数が2億個/g以下になると、硝化反応が進まないことが明らかとなった。
アンモニア減少率、フィチンからのリン酸生成活性、及び堆肥からのカリウム生成活性について、それぞれ30、10、5以下であれば優れた土壌であると判断されない。基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれたこれらの下限値を頂点として形成される三角形の面積の割合は1.7点となる。そのため、この点未満であれば、良好な植物生長が期待出来ないと判断した。
従来技術では土壌中に含まれる栄養素の量やpH、CEC(塩基置換容量)などを測定し、農作物の生産に役立ててきたが、これらの値では堆肥などの有機物を多く含む肥料を添加した時の肥効が正確に把握できない。
Claims (8)
- 下記(I)〜(III)を用いて算出される循環活性指標:
(I)対象土壌におけるアンモニア減少率、
(II)対象土壌におけるフィチン酸からのリン酸生成活性、及び
(III)対象土壌における堆肥からのカリウム生成活性
並びに(IV)土壌における土壌バクテリア数
を用いて土壌診断を行うことを特徴とする土壌の診断方法。 - 循環活性指標が、
予め設定されたアンモニア減少率の基準値、フィチン酸からのリン酸生成活性の基準値及び堆肥からのカリウム生成活性の基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、
前記正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれた前記(I) アンモニア減少率、前記(II) フィチン酸からのリン酸生成活性、及び前記(III) 堆肥からのカリウム生成活性の測定点を頂点として形成される三角形の面積の割合である、請求項1に記載の診断方法。 - A)下記(A-1)〜(A-3)を用いて算出される窒素循環活性指標:
(A-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(A-2)対象土壌におけるアンモニア減少率、及び
(A-3)対象土壌における亜硝酸減少率、
B)下記(B-1)〜(B-3)を用いて算出されるリン循環活性指標:
(B-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(B-2)対象土壌におけるフィチン酸からのリン酸生成活性、及び
(B-3)対象土壌における堆肥からのリン酸生成活性、
並びに、C)下記(C-1)〜(C-3)を用いて算出されるカリウム循環活性指標:
(C-1)対象土壌における土壌バクテリア数、
(C-2)対象土壌におけるカリウム遊離率、及び
(C-3)対象土壌における堆肥からのカリウム生成活性
を少なくとも用いて土壌診断を行うことを特徴とする土壌の診断方法。 - 窒素循環活性指標が、
予め設定された土壌バクテリア数の基準値、アンモニア減少率の基準値、及び亜硝酸減少率の基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、
前記正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれた前記(A-1)土壌バクテリア数、前記(A-2)アンモニア減少率、及び前記(A-3)亜硝酸減少率の測定点を頂点として形成される三角形の面積の割合である、請求項3に記載の診断方法。 - リン循環活性指標が、
予め設定された土壌バクテリア数の基準値、フィチン酸からのリン酸生成活性の基準値、及び堆肥からのリン酸生成活性の基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、
前記正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれた前記(B-1)土壌バクテリア数、前記(B-2)フィチン酸からのリン酸生成活性、及び前記(B-3)堆肥からのリン酸生成活性の各測定値を頂点として形成される三角形の面積の割合である、請求項3又は4に記載の診断方法。 - カリウム循環活性指標が、
予め設定された土壌バクテリア数の基準点、カリウム遊離率の基準値、及び、堆肥からのカリウム生成活性の基準値を頂点として形成される正三角形の面積に対する、
前記正三角形の重心から対応する頂点を結ぶ線分上に置かれた前記(C-1)土壌バクテリア数、前記(C-2)カリウム遊離率、及び前記(C-3)堆肥からのカリウム生成活性の各測定値を頂点として形成される三角形の面積の割合である、請求項3又は4に記載の診断方法。 - 請求項1又は3に記載の診断方法を経時的に行って、前記指標の経時変化を解析することにより、土壌の品質を管理することを特徴とする、土壌の品質管理方法。
- 請求項1又は3に記載の診断方法を行って、得られた診断結果に基づき、前記指標を改善するための処理を行うことを特徴とする土壌の改善方法。
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